Ogólna charakterystyka fluorescencyjnych chemosensorów

Wśród wielu metod analitycznych, które umożliwiają wykrywanie kationów metali, są takie techniki jak np. fotometria płomieniowa, atomowa spektroskopia absorpcyjna, elektrody jonoselektywne itp. Metody te są kosztowne, wymagają często cząsteczek o dużych rozmiarach i nie umożliwiają ciągłego ich monitoro-wania. Za to metody opierające się na fluorescencyjnych chemosensorach [1-6] oferują wiele korzyści takich jak selektywność, czułość, szybki czas odpowiedzi oraz możliwość obserwacji lokalnych. Co więcej, w przypadku metody fluore-scencji możliwe jest zdalne obserwowanie analitu przy użyciu optycznego świa-tłowodu z cząsteczkowym sensorem zakotwiczonym na jego końcu [7]. Biorąc pod uwagę powyższe cechy metody fluorescencji, wiele badań poświęcono pro-jektowaniu selektywnych fluorojonoforów kationów metali.

Kalorymetryczne oznaczanie kationów oparte na zmianach koloru w czasie kompleksowania przez czynniki barwne zdobyło popularność wiele lat temu. Szczególnie dla jonów berylowców, które są wydajnie chelatowane przez czyn-niki typu EDTA. Jednak technika fluorymetryczna jest bardziej czuła niż foto-metryczna. Fernandez-Gutierrez i Muños de la Peña w 1985 przebadali i znaleźli zastosowanie dla wielu fluorogennych czynników chelatujących [8]. Wśród nich ważne miejsce w analityce chemicznej zajmuje 8-hydroksychinolina i wiele jej pochodnych, ale brak im specyficzności. Natomiast fluorescencyjne sensory cząsteczkowe typu EDTA wykazują wysoką selektywność w kierunku jonów wapnia względem innych jonów obecnych w komórkach żywych.

otwo-Materiały supramolekularne

72

rzyło nowe możliwości rozpoznawania kationów w sposób bardziej selektywny, zwłaszcza w przypadków jonów potasowców, dla których brak jest selektyw-nych chelatów. Pomysł wiązania tych jonoforów z chromoforami lub fluorofo-rami, prowadzący odpowiednio do chromojonoforów i fluorojonoforów pojawił się kilka lat później. Pomysł ten wprowadzili w 1985 roku Löhr i Vögtle.

W projektowaniu fluorojonoforów [9] szczególną uwagę kładzie się na wła-ściwości części jonoforowej i na oczekiwane zmiany we wławła-ściwościach fluore-scencyjnych części fluoroforowej, następujące pod wpływem wiązania analitu. Wiadomo, że na trwałość kompleksu pomiędzy ligandem a kationem wpływa wiele czynników, takich jak rodzaj kationu, rodzaj rozpuszczalnika, tempera-tura, siła jonowa, a także w niektórych przypadkach pH środowiska. Dlatego w rozpoznaniu jonu, selektywność kompleksowania (tzn. preferowane komplek-sowania wybranego kationu w obecności innych kationów) jest bardzo ważne. W związku z tym, właściwości jonofora tj. topologia liganda i liczba oraz rodzaj kompleksujących heteroatomów czy grup, powinna pasować do właściwości kationu, tj. średnicy jonu, gęstości ładunku, liczby koordynacyjnej, „twardości” kationu metalu, rodzaju i struktury organicznych kationów, zgodnie z general-nymi zasadami chemii supramolekularnej. Jonoforem może być chelator, struk-tura z otwartym pierścieniem (podand), makrocykl (koronand, eter koronowy), związek makrobicykliczny (kryptand), pochodne kaliksarenów itd. Bardzo duża trwałość kryptatów wynika z trójwymiarowej struktury tych związków i selek-tywność kompleksowania jest zwykle dla tych związków większa ze względu na utrudnienie w deformowaniu struktury tych układów. W przypadku kompleksów z udziałem koronandów i kryptandów, najbardziej stabilne kompleksy powstają z jonami o średnicy jonowej zbliżonej do średnicy wnęki liganda. Inną generalną zasadą mającą zastosowanie w chemii jest teoria „twardych i miękkich” kwasów i zasad Pearsona [10,11]. Określa ona, że „twardy” tlen będący zasadą wiąże się z „twardym” kwasem, który może stanowić jon z grupy potasowców lub bery-lowców, a „miękka” siarka czy „miękki” azot z „miękkimi” kwasami, takimi jak jony metali przejściowych.

Warunki środowiska mają ogromne znaczenie zarówno na trwałość powsta-jących kompleksów, jak i selektywność procesu kompleksowania kationów. Głównymi czynnikami są: różnica między energią koordynacji liganda a energią solwatacji tj. siła solwatacji liganda w porównaniu do rozpuszczalnika; różni-ca w oddziaływaniu z powłoką liganda i dielektrycznym środowiskiem poza pierwszą otoczką solwatacyjną. W przypadku roztworów wodnych, główną rolę odgrywa pH i siła jonowa.

Połączenie pomiędzy jonoforem a fluoroforem jest bardzo ważnym aspek-tem w projektowaniu sensora, biorąc pod uwagę poszukiwanie silniejszych za-burzeń właściwości fotofizycznych fluorofora przez kation. Jonofor może być

Chemosensory fluorescencyjne w rozpoznawaniu jonów metali

połączony z fluoroforem bezpośrednio lub poprzez łącznik (Rys.1), ale w wielu przypadkach kilka atomów lub grup uczestniczących w kompleksowaniu należy do fluorofora. Zatem selektywność wiązania często wynika z całej struktury, włączając część sygnalizującą i część rozpoznającą.

W strukturę fluorojonofora może być włączony więcej niż jeden jonofor i/ lub więcej niż jeden fluorofor.

Rysunek 1. Budowa fluorojonoforów. A-fluorofor połączony z receptorem poprzez łącznik i B-fluorofor połączony bezpośrednio z receptorem.

Należy zwrócić uwagę na możliwość istnienia kilku kompleksów o różnej stechiometrii. Konieczność wstępnych badań składających się z zarejestrowa-nia fluorescencyjnych i/lub wzbudzeniowych widm w warunkach pomiarowych (rodzaj rozpuszczalnika, składniki środowiska, siła jonowa, pH-jeśli wpływa na

Materiały supramolekularne

74

trwałość kompleksu) jak najbliżej jak to możliwe do środowiska, w którym ka-tion będzie wykrywany. Zmiany w intensywności fluorescencji dla odpowiednich par długości fali wzbudzenia i emisji ( lub dla kilku długości fali wzbudzenia i emisji) w funkcji stężenia kationu muszą zostać zanalizowane, jeśli chcemy wy-znaczyć stechiometrię i stałą trwałości kompleksu. Rekomenduje się wykonanie pomiarów względnych, tzn. wyznaczenie stosunku intensywności fluorescencji zmierzonych przy dwóch długościach fal zgodnie z następującymi metodami:

METODA 1 - jedna długość fali emisji i dwie długości fali wzbudzenia. Metoda ta wykorzystywana jest w przypadku większości wskaźników i stoso-wana w konwencjonalnej mikroskopii fluorescencyjnej.

METODA 2 - jedna długość fali wzbudzenia i dwie długości fal emisji. Ten stosunek emisji ma zastosowanie tylko do wskaźników pH wykazujących podwójną emisję (emisja formy kwasowej i zasadowej występuje przy różnych długościach fal). Zmiany w widmie fluorescencji względem pH wynikają z wid-ma absorpcji. Ta metoda preferowana jest dla cytometrii i mikroskopii współo-gniskowej, a pozwala na zobrazowanie stosunku emisji.

METODA 3 -dwie długości fal wzbudzenia i emisji. Ta metoda jest rów-nież możliwa dla wskaźników pH wykazujących podwójną emisję. Główną korzyścią tej metody jest to, że intensywności emisji są znacznie większe, po-nieważ obie formy kwasowa i zasadowa są wzbudzone blisko ich maksimów absorpcji powodując w rezultacie silniejszą emisję dwóch związków.

Pomiary względne są preferowane, ponieważ stosunek intensywności flu-orescencji przy dwóch długościach fal jest w istocie niezależny od całkowitego stężenia fluorojonofora, zmian intensywności źródła, czułości instrumentu itp. Pomiary przy jednej długości fali wzbudzenia i emisji są również możliwe, ale nie oferują korzyści, które daje metoda względna. Są stosowane przy badaniu równowag w układach fluorojonoforów.

Projektuje się wiele fluorescencyjnych chemosensorów, z których większość jest słabo rozpuszczalna w wodzie, a ich zdolności kompleksujące prezentowa-ne są zatem w rozpuszczalnikach organicznych. Zastosowanie tych chemosen-sorów w środowiskach wodnych i w wodnych środowiskach komórek nie jest możliwe. Za to są one użyteczne w monitorowaniu procesów ekstrakcyjnych, na przykład wyznaczenie wartości stężenia kationu w fazie organicznej. Ponadto hydrofobowy charakter tych chemosensorów nie jest wadą, ale korzyścią, kiedy używa się je do pokrywania czułych części ( polimer lub zol-żel) optycznych urządzeń sensorowych dla celów biomedycznych lub w celu monitorowania związków w środowisku.

Chemosensory fluorescencyjne w rozpoznawaniu jonów metali