Optymalizacja parametrów HPLC

W trakcie opracowywania metody oznaczania kreatyniny w moczu przetestowano elucję izokratyczną i gradientową (przy różnych gradientach). Celem było uzyskanie jak najbardziej satysfakcjonujących wyników. Zastosowanie elucji gradientowej pozwoliło uzyskać lepsze kształty pików niż w przypadku elucji izokratycznej. Czas retencji dla kreatyniny wynosił 1,93 min, natomiast dla wzorca wewnętrznego 2,61 min. Rycina 9 przedstawia chromatogramy otrzymane dla roztworu wzorca kreatyniny i dla próbki moczu pacjenta z rakiem prostaty uzyskane w analizie LC-MS/MS. Rozdział gradientowy wykorzystany w opracowanej metodzie stwarza

132 możliwość włączenia do metody analizy innych klinicznie ważnych związków o szerokim zakresie polarności w jednym cyklu analitycznym.

6.2.3. Walidacja metody

Przed wykorzystaniem do analizy próbek rzeczywistych metoda LC-MS/MS oznaczania kreatyniny w moczu została zwalidowana. Walidacji poddano następujące parametry: selektywność, dokładność, precyzję (powtarzalność i odtwarzalność), liniowość, zakres, granicę wykrywalności, granicę oznaczalności oraz stabilność. Dobre parametry walidacji potwierdziły, że nafazolina może być wykorzystana jako wzorzec wewnętrzny w oznaczaniu kreatyniny w moczu.

Identyczne chromatogramy roztworów wzorcowych kreatyniny i próbek rzeczywistych dla każdego przejścia MRM potwierdziły brak interferujących pików w czasie retencji kreatyniny i wzorca wewnętrznego na chromatogramach próbek moczu (Rycina 9). Świadczy to o wysokiej selektywności metody. Co więcej, monitorowanie dwóch przejść masowych (ilościowego i jakościowego) i wyznaczenie stosunku intensywności odpowiadających im pików pozwala odróżnić analizowane związki od interferencji i potwierdzić tożsamość związków. Stosunek przejścia ilościowego do jakościowego (Q/q) jest bowiem wartością charakterystyczną dla każdego związku. Takie podejście wykorzystujące jon macierzysty i dwa jony potomne zapewnia uzyskanie 4 punktów identyfikacyjnych dla analizowanego związku, co spełnia wytyczne Unii Europejskiej [152]. Wyznaczone stosunki Q/q porównywano ze średnim stosunkiem Q/q wyznaczonym dla roztworów wzorcowych. Każdorazowo mieściły się one w zakresie tolerancji 20 %, co pozwoliło potwierdzić otrzymane wyniki analiz próbek moczu.

Metoda jest liniowa w zakresie stężeń od 5 do 1500 ng/ml, co odpowiada zakresowi stężeń kreatyniny od 1 do 300 mg/dl w nierozcieńczonych próbkach moczu. Szeroki zakres liniowości metody jest pożądany w przypadku oznaczania kreatyniny ze względu na to, że związek ten występuje w moczu w dużym zakresie stężeń [159]. Dobrą liniowość opracowanej metody potwierdzają współczynniki regresji, które były wyższe niż 0,995 dla każdej przygotowanej krzywej wzorcowej. Krzywe wzorcowe zapewniły dobrą dokładność pomiarów kreatyniny, gdyż stężenia roztworów do krzywych wzorcowych obliczone na ich podstawie mieściły się w zakresie 15 % rzeczywistej wartości.

Granica wykrywalności metody wynosi 2 ng/ml, natomiast granica oznaczalności wynosi 5 ng/ml. Granica oznaczalności jest porównywalna z opracowanymi wcześniej metodami LC-MS/MS oznaczania kreatyniny w moczu [121,

133 133]. Możliwość pomiaru niższych stężeń kreatyniny nie wydaje się konieczna ze względu na to, że metabolit ten nie występuje w moczu w śladowych ilościach nawet uwzględniając 2000-krotne rozcieńczenie próbki. Ważniejsza z punktu widzenia spektrometrii mas jest możliwość oznaczeń w małych objętościach próbek biologicznych. Technika chromatografii cieczowej sprzężonej ze spektrometrią mas jest podatna na występowanie efektów matrycy, związanych ze składnikami matrycy opuszczającymi kolumnę chromatograficzną w czasie retencji analitów i wpływających na wydajność jonizacji analitów w źródle jonów. Jednym z najprostszych sposobów ograniczenia efektów matrycy jest rozcieńczenie próbki [160]. Ze względu na niską granicę oznaczalności opracowanej metody próbka moczu może być rozcieńczona 2000-razy, co redukuje wpływ składników matrycy.

Dokładność metody została sprawdzona przy użyciu próbek kontrolnych moczu obciążonych trzema różnymi poziomami wzorca kreatyniny (niskim, średnim i wysokim). Otrzymane wyniki odzysku dla wszystkich próbek kontrolnych spełniały kryteria akceptowalności i mieściły się w zakresie od 90,3 % do 97,7% (Tabela 15). Można zatem wnioskować, że dokładność metody jest dobra niezależnie od stężenia kreatyniny w próbce moczu.

Opracowana metoda charakteryzuje się zadowalającą precyzją oznaczania kreatyniny. Precyzja została zmierzona dla trzech poziomów stężeń kreatyniny (niskiego, średniego i wysokiego). Powtarzalność metody oraz jej odtwarzalność wyrażone jako współczynniki zmienności (CV) nie przekraczały 15 %. Wartości te dla poszczególnych poziomów stężeń mieściły się w zakresie od 1,17 % do 12,74 % (Tabela 16). Metoda zapewnia zatem powtarzalne pomiary stężenia kreatyniny w próbkach moczu w całym zakresie liniowości.

Warunki testowane w badaniach stabilności odpowiadały możliwym sytuacjom występującym podczas przygotowywania próbek i ich analizy. Potwierdzono stabilność kreatyniny w moczu po trzech cyklach zamrażania i rozmrażania. Różnice w zawartości kreatyniny nie przekraczały bowiem 12 % w porównaniu do świeżych próbek moczu. Badania stabilności krótkoterminowej wykazały stabilność kreatyniny w moczu po przechowywaniu w temperaturze pokojowej przez 4 godziny. Różnice w zawartości kreatyniny nie przekraczały bowiem 15 % w porównaniu do świeżych próbek moczu. Wykazano stabilność roztworów podstawowych kreatyniny i wzorca wewnętrznego przechowywanych w temperaturze pokojowej przez 6 godzin oraz w temperaturze -20 °C przez 4 miesiące. Różnice w zawartości kreatyniny i wzorca wewnętrznego wynosiły poniżej 10 % w porównaniu do świeżo przygotowanych roztworów podstawowych. Na podstawie przeprowadzonych eksperymentów można również wyciągnąć wniosek o dobrej stabilności kreatyniny w przygotowanych

134 próbkach przechowywanych przez 24 i 48 godzin w autosamplerze. Różnice w zawartości kreatyniny znajdowały się w granicach od -1,6 % do 10,1 % oraz od -14,0 % do 4,9 % dla próbek przechowywanych odpowiednio przez 24 i 48 godzin w porównaniu do tych samych próbek moczu analizowanych bezpośrednio po przygotowaniu.

6.2.4. Porównanie z metodą wykorzystującą reakcję Jaffe’go

Wyniki oznaczeń kreatyniny w moczu otrzymane przy wykorzystaniu opracowanej metody LC-MS/MS zostały porównane z wynikami uzyskanymi laboratoryjną metodą kolorymetryczną. W tym celu określono zawartość kreatyniny w 20 próbkach moczu za pomocą metody kolorymetrycznej wykorzystującej reakcję Jaffe’go. Pomimo że współczynnik korelacji R2 pomiędzy dwoma zbiorami wyników wynosił 0,9844, wykazano że metoda Jaffe’go zawyżyła stężenia kreatyniny w moczu w 80 % przetestowanych próbek (Rycina 10). Stężenia te były średnio o 4,6 % wyższe niż oznaczone w metodzie LC-MS/MS. Te wyniki są zgodne z wynikami uzyskanymi przez inne zespoły badawcze [161, 162], które również wskazują na zawyżanie stężeń kreatyniny przez metodę Jaffe’go. Można zatem wyciągnąć wniosek, iż metoda kolorymetryczna powinna zostać zrewidowana jako złoty laboratoryjny standard w oznaczaniu kreatyniny. Natomiast metoda LC-MS/MS może być rozważona jako nowa potencjalna metoda oznaczania kreatyniny w moczu w laboratoriach.

6.2.5. Analiza próbek rzeczywistych

Wykorzystując opracowaną metodę LC-MS/MS oznaczono stężenie kreatyniny w moczu pacjentów ze zdiagnozowanym rakiem prostaty (grupa badana) i w moczu osób zdrowych (grupa kontrolna). Potwierdzenie tożsamości kreatyniny przeprowadzono w oparciu o obliczenie stosunku intensywności pików przejścia ilościowego do jakościowego (Q/q) i porównanie ze średnim stosunkiem Q/q wyznaczonym dla roztworów wzorcowych kreatyniny. We wszystkich przeanalizowanych próbkach moczu różnica wartości stosunku Q/q w porównaniu ze stosunkiem średnim wynosiła poniżej 3 %. Rycina 11 pokazuje zgodność stosunku Q/q dla kreatyniny pomiędzy roztworem wzorcowym kreatyniny a wybraną próbką moczu.

Średnie stężenia kreatyniny oznaczone w próbkach moczu pacjentów z grupy badanej i z grupy kontrolnej wynosiły odpowiednio 121,4 mg/dl i 79,7 mg/dl, natomiast średnie stężenie tego metabolitu we wszystkich próbkach wynosiło 102,6 mg/dl. Zgodnie z danymi literaturowymi stężenia te odpowiadają przeciętnym poziomom

135 kreatyniny w moczu w populacji ludzkiej [134, 159]. Arndt [159] podaje, że średnie stężenie kreatyniny w moczu wyznaczone dla próbek pochodzących od 12456 mężczyzn wynosiło 97,5 mg/dl. Najniższe stężenie kreatyniny oznaczone dla grupy badanej wynosiło 32,2 mg/dl, natomiast dla grupy kontrolnej 30,9 mg/dl. Dowodzi to, że nie ma potrzeby opracowywania metody o większej czułości. Najwyższe stężenie kreatyniny wynosiło z kolei 298,0 mg/dl dla grupy badanej i 218,0 mg/dl dla grupy kontrolnej. Według Światowej Organizacja Zdrowia (WHO) należy unikać zarówno zbyt stężonych, jak i zbyt rozcieńczonych próbek moczu pobieranych do badań związanych z monitorowaniem ekspozycji na czynniki chemiczne w miejscu pracy [163]. Zgodnie z rekomendacją WHO, aby uznać próbkę moczu za ważną, powinna ona charakteryzować się stężeniem kreatyniny w zakresie od 30 do 300 mg/dl. Te wytyczne można wykorzystać do selekcji próbek moczu również w innych aplikacjach dotyczących analizy moczu. Można zatem wnioskować, że wszystkie próbki moczu przeanalizowane z wykorzystaniem opracowanej metody LC-MS/MS mogą zostać użyte w dalszych badaniach związanych z analizą innych związków wydalanych z moczem (oznaczanie aminokwasów i profilowanie peptydowe w próbkach moczu).

Technika LC-MS/MS stwarza możliwości identyfikacji i oznaczania wielu związków w małej objętości próbki biologicznej i w jednym cyklu analitycznym. W związku z tym, że opracowana metoda wykorzystuje rozdział gradientowy i detekcję MS oraz nie wymaga derywatyzacji, może ona zostać zaadaptowana do jednoczesnego oznaczania innych związków wydalanych z moczem obok kreatyniny.

Przygotowana została publikacja doświadczalna pt. „Creatinine determination in urine by liquid chromatography-electrospray ionization-tandem mass spectrometry method” prezentująca opracowaną metodę oznaczania kreatyniny w moczu przy wykorzystaniu zestawu LC-MS. Praca została przyjęta do druku w czasopiśmie Acta Poloniae Pharmaceutica. Drug Research.

136

6.3. Profilowanie peptydów obecnych w surowicy i moczu przy wykorzystaniu