Rak prostaty jest jednym z najczęściej diagnozowanych nowotworów i jedną z głównych przyczyn śmierci z powodu nowotworów wśród mężczyzn. Diagnoza raka prostaty, jak również zdolność przewidywania progresji choroby, pozostaje problematyczna. Nowotwory są odpowiedzialne za wywoływanie zmian w organizmie na poziomie proteomicznym i metabolomicznym [143]. W związku z tym analiza białek, peptydów oraz metabolitów w płynach ustrojowych jest obiecującym narzędziem w poszukiwaniu diagnostycznych i prognostycznych biomarkerów raka prostaty.
Celem naukowym badań prowadzonych w ramach realizacji niniejszej rozprawy doktorskiej było zastosowanie nowoczesnej i złożonej strategii analityczno-bioinformatycznej w analizie związków endogennych w płynach ustrojowych (surowicy oraz moczu) w poszukiwaniu biomarkerów o wartości diagnostycznej mających znaczenie w wykrywaniu raka prostaty. Badania prowadzone były w oparciu o nowoczesną platformę analityczną, opartą na metodach spektrometrii mas (LC-ESI-QqQ-MS/MS, MALDI-TOF-MS) oraz testach immunologicznych. Nowatorski model poszukiwania biomarkerów raka prostaty w oparciu o powyższe techniki wsparty został zaawansowaną analizą chemometryczną. Rycina 3 przedstawia schemat badań przeprowadzonych w ramach rozprawy doktorskiej.
Oznaczanie małocząsteczkowych metabolitów, w tym aminokwasów, w płynach biologicznych (surowica, mocz) jest małoinwazyjną metodą o wysokim potencjale diagnostycznym. Na podstawie analizy ilościowej aminokwasów w surowicy lub moczu można stwierdzić obecność zaburzeń fizjologicznych, schorzeń neurologicznych, chorób metabolicznych, a także chorób nowotworowych. W niniejszej pracy planowano potwierdzić hipotezę mówiącą o tym, że rak prostaty wywołuje zmiany w profilach wolnych aminokwasów w wybranych płynach ustrojowych. Oceniony został także potencjał aminokwasów w surowicy i moczu jako biomarkerów raka prostaty i ich użyteczność w klasyfikacji pacjentów z rakiem prostaty i osób zdrowych. Badanie profili wolnych aminokwasów oparto o technikę LC-ESI-QqQ-MS/MS, czyli chromatografii cieczowej sprzężonej z tandemową spektrometrią mas, oraz o odczynnik aTRAQ. Technika LC-ESI-QqQ-MS/MS umożliwia globalne zobrazowanie aktualnego stanu fizjologicznego organizmu na poziomie metabolomicznym. Pozwala analizować różne klasy związków, przede wszystkim związki małocząsteczkowe, takie jak na przykład aminokwasy. Stwarza zatem nowe możliwości zarówno poszukiwania biomarkerów (między innymi raka prostaty), jak również diagnostyki bezinwazyjnej, opartej na analizie płynów ustrojowych łatwych do pozyskania od pacjentów i możliwej do zastosowania w badaniach przesiewowych. Do zalet metody wykorzystującej
44 odczynnik aTRAQ i technikę LC-ESI-QqQ-MS/MS w oznaczaniu aminokwasów w płynach ustrojowych należy wysoka specyficzność, skrócony czas analizy w porównaniu do innych technik analizy aminokwasów, mała objętość próbki biologicznej wymagana do wykonania oznaczeń, duża ilość analitów oznaczana w jednym cyklu analitycznym oraz niska granica wykrywalności [144, 145]. W celu potwierdzenia możliwości zastosowania metody w analizie aminokwasów została ona poddana walidacji.
Grupą związków, mogących potencjalnie pełnić rolę biomarkerów, są także peptydy i białka. Ekspresja tych związków zmienia się bowiem w różnych stanach patoloficznych [143]. Analiza peptydów i określenie korelacji jakościowych i ilościowych w obrębie peptydowych „odcisków palca” stwarza podstawy do opracowania szybkich i bezinwazyjnych metod diagnostycznych wielu chorób, w tym nowotworowych. Z tego względu w niniejszej pracy planowana była analiza profili peptydowych w wybranych płynach ustrojowych w celu potwierdzenia hipotezy mówiącej o tym, że profile peptydowe ulegają zmianie w raku prostaty. Oceniona została ponadto użyteczność profili peptydowych w surowicy i moczu w dyskryminacji mężczyzn cierpiących na raka prostaty i zdrowych. Ponieważ peptydy mają wyższe masy cząsteczkowe w porównaniu do aminokwasów, ich analiza wymaga innego podejścia analitycznego. Badanie profili peptydowych oparto o technikę MALDI-TOF-MS, czyli spektrometrię mas ze źródłem jonów typu MALDI i analizatorem czasu przelotu. Technika MALDI-TOF-MS pozwala globalnie zobrazować aktualny stan fizjologiczny organizmu na poziomie proteomicznym. Wieloskładnikowy peptydowy „odcisk palca” charakteryzuje się większą specyficznością w stosunku do pojedynczych markerów, a analizy wykorzystujące profile peptydowe mogą znacząco przyczynić się do polepszenia diagnostyki raka prostaty. Wśród zalet metody wykorzystującej technikę MALDI-TOF-MS w profilowaniu peptydów wymienić należy wysoką czułość, nieskomplikowaną procedurę przygotowania próbek, małą objętość płynu biologicznego wymaganego do wykonania analiz i możliwość automatyzacji procesu [143].
W surowicy krwi znajduje się wiele białek nieposiadających znaczenia diagnostycznego (np. albuminy czy globuliny), które dodatkowo utrudniają analizę i detekcję peptydów i białek o potencjalnym znaczeniu w diagnostyce chorób. Także w moczu niektóre białka, np. uromoduliny, są obecne w dużym stężeniu i mogą utrudniać analizę innych białek, występujących w mniejszych stężeniach [42]. W przeprowadzonych w ramach niniejszej pracy doktorskiej badaniach wykorzystano końcówki ZipTip w celu zatężenia peptydów w surowicy i moczu oraz oczyszczenia próbek z zanieczyszczających ją składników utrudniających dalszą analizę. Wykorzystane końcówki ZipTip wypełnione były złożem C18, a ich technologia opiera
45 się na ekstrakcji do fazy stałej. Zatężanie i oczyszczanie próbek surowicy i moczu stanowiło jeden z etapów przygotowania próbek przed profilowaniem peptydowym wykorzystującym technikę MALDI-TOF-MS.
Analiza moczu jest procedurą, która wymaga specyficznego podejścia ze względu na różnice w objętości moczu w próbkach pobieranych jednorazowo. Od objętości moczu zależą bowiem stężenia związków w nim obecnych. Konieczna jest zatem kompensacja różnic w objętości moczu poprzez normalizację stężeń oznaczanych związków do stężenia kreatyniny w moczu [42]. W tym celu stężenia oznaczanych związków dzieli się przez stężenie kreatyniny oznaczone w tej samej próbce moczu [117, 132-134], a w przypadku profilowania peptydów w moczu oznaczenie kreatyniny w każdej próbce poprzedza rozcieńczenie próbek do najniższego stężenia kreatyniny w danej populacji próbek [136, 137]. W ramach pracy doktorskiej opracowano i zwalidowano metodę oznaczania kreatyniny w moczu z wykorzystaniem techniki LC-ESI-QqQ-MS/MS oraz nafazoliny jako wzorca wewnętrznego. Opracowaną metodę wykorzystano następnie do normalizacji stężeń aminokwasów w próbkach moczu uzyskanych z wykorzystaniem techniki LC-ESI-QqQ-MS/MS oraz odpowiedniego rozcieńczenia próbek moczu przed profilowaniem peptydowym wykorzystującym technikę MALDI-TOF-MS.
Proces angiogenezy, czyli tworzenia się nowych naczyń krwionośnych, jest jednym z fundamentalnych procesów zachodzących w organizmie i jest ściśle związany ze wzrostem guzów nowotworowych [98, 146, 147]. W procesie angiogenezy uczestniczy wiele białek, a ich ekspresja ulega zmianie w związku z toczącym się procesem nowotworowym [148]. Białka te mogą pełnić rolę biomarkerów chorób nowotworowych. W prezentowanej pracy podjęto się analizy panelu markerów nowotworowych w surowicy w celu oceny, jak poziomy wybranych białek kształtują się w raku prostaty, i określenia ich potencjalnej użyteczności klinicznej w diagnostyce raka prostaty. Oznaczono w tym celu 16 makrerów nowotworowych z wykorzystaniem metody separacji magnetycznej i cytometrii przepływowej przy użyciu zestawu Bio-Plex. Metoda jest przykładem testu immunologicznego oraz techniki multipleksowej i pozwala równocześnie analizować wiele analitów w jednym cyklu analitycznym. Do zalet tej metody w porównaniu do standardowych analiz techniką ELISA należy mała objętość próbki biologicznej wymagana do wykonania oznaczeń, prosta procedura przygotowania próbek, zwiększona przepustowość oraz obniżenie kosztów analiz. Wykorzystana metoda została zwalidowana i cechuje się dobrymi parametrami, między innymi wysoką precyzją, czułością i szerokim zakresem oznaczalności, co pozwala na jej zastosowanie w analizie panelu markerów nowotworowych [149].
46 Rycina 3. Schemat badań prowadzonych w ramach rozprawy doktorskiej.