Przeprowadzone badania w ramach rozprawy doktorskiej pt. „Proteomiczna i metabolomiczna analiza surowicy krwi i moczu w poszukiwaniu biomarkerów raka prostaty” pozwoliły na sformułowanie następujących wniosków:
1. Zastosowana w badaniach złożona strategia analityczno-bioinformatyczna do analizy związków endogennych w płynach ustrojowych (surowicy oraz moczu) potwierdziła, że analiza białek, peptydów oraz metabolitów w płynach ustrojowych jest obiecującym narzędziem w poszukiwaniu biomarkerów raka prostaty. Otrzymane wyniki dowodzą, że istnieje korelacja pomiędzy stanem biologicznym pacjenta a jego statusem proteomicznym i metabolomicznym.
2. Zoptymalizowano i zwalidowano metodę rozdziału i oznaczania 42 aminokwasów w jednym cyklu analitycznym w surowicy i moczu przy wykorzystaniu zestawu LC-ESI-QqQ-MS/MS oraz odczynnika aTRAQ. Zastosowana metoda oznaczania aminokwasów charakteryzuje się wysoką specyficznością, skróconym czasem analizy w porównaniu do innych technik analizy aminokwasów, małą objętością próbki biologicznej wymaganej do wykonania oznaczeń, dużą ilością analitów oznaczanych w jednym cyklu analitycznym oraz niską granicą wykrywalności.
3. Przeprowadzone badania potwierdziły, że aminokwasy to grupa metabolitów, która posiada wysoki potencjał wykorzystania jako biomarkery raka prostaty. Prezentowane badania są pierwszymi, w których przeprowadzono kompleksową analizę profili aminokwasowych w dwóch różnych płynach ustrojowych pobranych od pacjentów z rakiem prostaty i zdrowych mężczyzn, analizując aż 42 metabolity w jednym cyklu analitycznym. Więcej aminokwasów oznaczono w moczu niż w surowicy i więcej związków pojawiało się na istotnie zmienionych poziomach w moczu w porównaniu do surowicy.
169 4. Na podstawie przeprowadzonych jednozmiennowych analiz statystycznych wykazano, że rak prostaty wywołuje zmiany w profilach wolnych aminokwasów w surowicy i moczu. W próbkach surowicy oznaczono 32 aminokwasy. Wykazano, że statystycznie istotne różnice dotyczyły 18 z 32 oznaczonych związków, spośród których 4 były obecne na istotnie wyższych poziomach w grupie badanej (sarkozyna, 3-metylo-L-histydyna, β-alanina oraz kwas asparaginowy). Natomiast 14 aminokwasów wykazywało poziomy istotnie niższe w grupie badanej w porównaniu z grupą kontrolną (między innymi: metionina, etanoloamina, glutamina, izoleucyna, arginina oraz leucyna).
5. W próbkach moczu oznaczono 39 aminokwasów. Różne statystycznie poziomy stwierdzono dla 26 z 39 związków, spośród których jeden (tauryna) był obecny na istotnie wyższym poziomie w grupie badanej, natomiast poziomy 25 były istotnie niższe w grupie badanej w porównaniu z grupą kontrolną (między innymi: kwas γ-amino-n-masłowy, fosfoetanoloamina, etanoloamina, homocytrulina, arginina, δ-hydroksylizyna i asparagina). Nie wykazano natomiast istotnych statystycznie różnic w poziomach sarkozyny w moczu pomiędzy grupą pacjentów z rakiem prostaty a grupą kontrolną.
6. W pracy wykazano, że poziomy aminokwasów w obu płynach ustrojowych, zarówno w surowicy, jak i w moczu, są użyteczne w klasyfikacji pacjentów z rakiem prostaty i osób zdrowych. Na podstawie przeprowadzonych analiz wielozmiennowych stwierdzono, że zmienione obecnością raka prostaty profile aminokwasowe w obu płynach ustrojowych pozwalają osiągnąć grupowanie się pacjentów (analizy PLS-DA) oraz uzyskać wysoką poprawność klasyfikacji próbek do grupy pacjentów z rakiem lub grupy kontrolnej.
7. Opracowano i zwalidowano nową metodę oznaczania kreatyniny w moczu przy wykorzystaniu zestawu LC-ESI-QqQ-MS/MS. Opracowana metoda oznaczania kreatyniny charakteryzuje się prostą procedurą przygotowania próbek, krótkim czasem analizy, wysoką selektywnością, czułością, dokładnością i precyzją.
170 8. Zoptymalizowano metodę profilowania peptydów obecnych w surowicy i moczu w zakresie mas od 1 do 10 kDa przy wykorzystaniu zestawu MALDI-TOF-MS. Wśród zalet metody należy wymienić wysoką czułość, nieskomplikowaną procedurę przygotowania próbek oraz małą objętość płynu biologicznego wymaganego do wykonania analiz.
9. Wykorzystując technikę MALDI-TOF-MS otrzymano profile peptydowe próbek surowicy i moczu. Na podstawie przeprowadzonych analiz statystycznych wykazano, że rak prostaty wywołuje zmiany w profilach peptydowych w surowicy i moczu. Analizy wykorzystujące intensywności peptydów otrzymane w wyniku profilowania peptydowego wykazały statystycznie istotne różnice dotyczące 65 ze 136 peptydów w przypadku surowicy i 108 ze 149 w przypadku moczu. Pięć peptydów, dla których wartość p była najniższa w przypadku surowicy to peptydy o masach: 1288,69 Da, 1099,41 Da, 1866,53 Da, 1888,55 Da i 1779,38 Da. Natomiast w przypadku moczu najniższe wartości p uzyskano dla peptydów o masach: 1793,20 Da, 2444,56 Da, 2235,57 Da, 1237,03 Da i 2050,43 Da.
10. Na podstawie przeprowadzonych badań wykazano użyteczność profili peptydowych w surowicy i moczu w dyskryminacji mężczyzn cierpiących na raka prostaty i zdrowych. Przeprowadzenie analizy profili peptydowych w dwóch różnych płynach ustrojowych pobranych od pacjentów z rakiem prostaty i zdrowych mężczyzn wskazuje jednak, że większy potencjał dyskryminacyjny w raku prostaty charakteryzuje peptydy w próbkach surowicy. Zostało to wykazane na podstawie takich analiz wielozmiennowych, jak PLS-DA, analiza dyskryminacyjna i krzywe ROC. Jedynie w analizach statystycznych wykorzystujących algorytmy QC, SNN i GA otrzymano podobne wartości czułości, swoistości oraz ogólnej poprawności klasyfikacji dla obu zbiorów danych (peptydów w surowicy i moczu).
171 11. Przeprowadzone analizy PLS-DA, w których analizowano trzy grupy pacjentów z rakiem prostaty wyodrębnione według wzrastającego stopnia złośliwości histologicznej (z sześcioma, siedmioma oraz ośmioma lub dziewięcioma punktami w skali Gleasona) wykazały grupowanie się pacjentów w zależności od przyporządkowania próbki do jednej z grup. Zatem stopień złośliwości histologicznej raka prostaty ma swoje odbicie w profilu aminokwasowym i peptydowym płynów ustrojowych. W związku z tym uzasadnione jest poszukiwanie biomarkerów prognostycznych raka prostaty, które pozwoliłyby na dyskryminację pacjentów w zależności od poziomu agresywności nowotworu.
12. Wykorzystując metodę separacji magnetycznej i cytometrii przepływowej przy użyciu zestawu Bio-Plex analizowano panel 16 biomarkerów nowotworowych, którymi były białka uczestniczące w procesie angiogenezy. Na podstawie przeprowadzonych analiz statystycznych wykazano, że 10 z 16 białek było obecnych na istotnie wyższych poziomach w grupie badanej. Białkami tymi były: sVEGFR-1, HGF, osteopontyna, FGF-basic, G-CSF, PDGF-AB/BB, SCF, sEGFR, PECAM-1 i sVEGFR-2. Wśród tej grupy białek należy poszukiwać biomarkerów, które mogą znaleźć zastosowanie w diagnostyce raka prostaty.
172