OF A ERYTHROCYTE*
Klinika Nefrologii, Transplantologii i Chorób Wewnętrznych Pomorskiej Akademii Medycznej w Szczecinie al. Powstańców Wlkp. 72, 70-111 Szczecin
Kierownik: prof. dr hab. n med. Kazimierz Ciechanowski
1 Zakład Chemii Medycznej Pomorskiej Akademii Medycznej w Szczecinie al. Powstańców Wlkp. 72, 70-111 Szczecin
Kierownik: dr hab. n med., prof. PAM Joanna Bober
2 Samodzielna Pracownia Biochemii i Chemii Medycznej Pomorskiej Akademii Medycznej w Szczecinie al. Powstańców Wlkp. 72, 70-111 Szczecin
Kierownik: dr hab. n. med., prof. PAM Ewa Stachowska
3 Katedra Biochemii i Chemii Medycznej Pomorskiej Akademii Medycznej w Szczecinie al. Powstańców Wlkp. 72, 70-111 Szczecin
Kierownik: prof. dr hab. n med. Dariusz Chlubek
Summary
We examined the activity of sodium transporting systems (STS) in a cellular membrane of erythrocytes in a group of 21 patients under chronic hemodialysis treatment with the dialyzing fluid containing glucose HD-g(+), and 22 patients dialysed with the fluid not containing glucose HD-g(-), 21 patients with chronic kidney failure already not treated with dialysis and 21 control group. We examined the concentration of antioxidative system cofactors, such as zinc, copper and selenium in erythrocytes and plasma. The marker of oxidative stress in erythrocytes and plasma was the concentration of TBARS. Among all STS we examined the activity of Na+/K+ ATP-ase, Na+/K+/Cl−; co-transport, Na+/Li+ exchanger, Na+, K+-outflow.
Copper zinc and selenium as cofactors of antioxidative enzymes may reflect the antioxidative processes inside the organism undergoing the influence of free radicals.
K e y w o r d s: zinc – hemodialysis – copper – kidney failure – selenium – TBARS – sodium transporting systems.
Streszczenie
Badano aktywność systemów transportujących sód przez błonę komórkową erytrocytu w grupie 21 osób poddawanych przewlekłej hemodializie (HD) z płynem dializacyjnym zawierającym glukozę HD-g(+), 22 oób dializowanych z płynem dializacyjnym niezawierającym glukozy HD-g(-), 21 pacjentów z przewlekłą niewydolnością nerek w okresie przeddializacyjnym oraz w 21-osobowej grupie kontrolnej. Zbadano stężenia kofaktorów enzymów antyoksydacyjnych – cynku, miedzi i selenu w osoczu i ery-trocytach. Wskaźnikiem nasilenia stresu oksydacyjnego w osoczu i erytrocytach było stężenie substancji reagujących
* Praca finansowana z grantu KBN nr 6 P05A 065 20 oraz z grantu 6 P05A 066 20 / This work was supported by the grant.
destruktywnie na błony komórkowe elementów morfotycz-nych krwi. Pod ich wpływem uszkodzeniu ulegają zarówno lipidy błon, jak i białka błonowe, jakimi są m.in. STS. Tylko nieliczne prace dotyczą aktywności STS w elementach mor-fotycznych krwi pacjentów z niewydolnością nerek i pacjen-tów poddawanych hemodializie. Doniesienia literaturowe podają bardzo sprzeczne dane dotyczące aktywności STS u pacjentów z PNN leczonych zarówno zachowawczo, jak i poddawanych przewlekłej HD. Stwierdzano obniżenie [12, 13], jak i wzrost [14, 15] ATP-azy Na+/K+, obniżenie [16]
i wzrost [17] kotransportu Na+/K+/Cl− w stosunku do grupy kontrolnej. Także wpływ samej HD był różny – mogła ona wpływać [18] lub nie [19] na systemy transportowe. Wyniki tych badań są rozbieżne, tym trudniejsze do interpretacji, że nie zawsze podane są warunki dializy. U pacjentów diali-zowanych Kovacic i wsp. [20] łączyli obniżenie aktywności NHE przed HD z obniżeniem aktywności pompy sodowo--potasowej. Brak jest doniesień łączących aktywność STS ze wskaźnikami stresu oksydacyjnego oraz elementami obrony antyoksydacyjnej u pacjentów dializowanych.
Materiał i metody
Badaniu poddano grupę 21 osób (10 kobiet i 11 męż-czyzn) w wieku 67,4 ± 12,31, z przewlekłą niewydolnością nerek, u których stosowano hemodializę 3 razy w tygodniu po 4 godziny. Stosowano dializator polisulfonowy, bufor wodorowęglanowy i płyn dializacyjny zawierający glukozę HD-g(+). Niewydolność nerek spowodowana była: kłębko-wym zapaleniem nerek – 8, odmiedniczkokłębko-wym zapaleniem nerek – 9, przyczynami innymi – 4. Średni czas od pierwszej hemodializy wynosił 8,28 ± 6,42 miesiąca, a dializatory używane były 7,9 ± 6,54 razy.
Drugą grupę badaną stanowiło 22 pacjentów (11 K i 11 M) w wieku 55,9 ± 14,8, u których stosowano hemodializę 3 razy w tygodniu po 4 godziny. Stosowano dializator po-lisulfonowy, bufor wodorowęglanowy i płyn dializacyjny niezawierający glukozy HD-g(-). Niewydolność nerek spo-wodowana była kłębkowym zapaleniem nerek – 8, prze-wlekłym odmiedniczkowym zapaleniem nerek – 9, przy-czynami innymi – 5. Średni czas od pierwszej hemodializy wynosił 9,45 ± 6,63 miesiąca, a dializatory używane były 8,78 ± 6,42 razy (tab. 1).
Aby uwzględnić tylko wpływ hemodializy na przezbło-nowe systemy transportowe, wyniki grupy dializowanej porównywano z dwiema grupami kontrolnymi. W celu wyeliminowania czynników związanych z samą niewy-dolnością nerek, takich jak np. obecność toksyn mocznico-wych, zbadano transport sodu przez błonę RBC w grupie 21 osób (7 K, 14 M) leczonych zachowawczo z powodu PNN. Przyczynami niewydolności były: kłębkowe zapalenie nerek – 8, przewlekłe odmiedniczkowe zapalenie nerek – 9, inne – 4.
Grupa kontrolna liczyła 21 osób (10 kobiet i 11 męż-czyzn) w wieku 56 ± 16,6 lat. U osób z grupy kontrolnej z kwasem tiobarbiturowym (TBARS). Wśród systemów
transportujących sód zbadano aktywność ATP-azy Na+/K+; kotransportu Na+/K+/Cl−; wymieniacza Na+/Li+, swobodny wypływ Na+ i K+ z komórki (Na+, K+-outflow).
Miedź, cynk i selen jako kofaktory enzymów mogą odzwierciedlać procesy antyoksydacyjne zachodzące w or-ganizmie narażonym na działanie aktywnych form tlenu.
H a s ł a: cynk – hemodializa – miedź – przewlekła nie-wydolność nerek – selen – TBARS – systemy transportujące sód.
Wstęp
Jony sodowy i potasowy są transportowane przez błonę erytrocytu na zasadzie transportu aktywnego lub dyfu-zji ułatwionej. Za aktywny transport potasu do wnętrza erytrocytu i sodu na zewnątrz odpowiedzialna jest pompa sodowo-potasowa (ATP-aza Na+/K+). Transportem biernym są natomiast kotransport sodowo-potasowy (co-Na+/K+/Cl−) – odpowiedzialny m.in. za regulacyjny wzrost objętości, wymieniacz sodowo-litowy (ex-Na+/Li+)i swobodny wy-pływ sodu.
Ze wszystkich systemów transportujących sód (STS) w literaturze najwięcej uwagi poświęcono wymieniaczowi sodowo-protonowemu (NHE). Wśród wielu czynników mogących wpływać na jego aktywność wymienia się stres oksydacyjny [1, 2, 3, 4]. Inni autorzy zaobserwowali obni-żenie aktywności NHE w komórkach śródbłonka aorty zachodzący pod wpływem rodników hydroksylowych [5, 6, 7]. Efekt ten był znoszony po dodaniu do medium inku-bacyjnego zmiatacza wolnych rodników – zredukowanego glutationu. Zbieżne wyniki otrzymano, działając na hodo-wane astrocyty nadtlenkiem t-butylu (t-BOOH); lipofilowe antyoksydanty zabezpieczały komórki przed działaniem t-BOOH [8]. Oczywiste powiązanie zmian aktywności NHE z nasileniem stresu oksydacyjnego sugeruje istnie-nie potencjalnych związków między aktywnością innych STS a elementami układu antyoksydacyjnego. Matteucci i Giampietro [9] udowadniają związek między zreduko-wanym glutationem, substancjami reagującymi z kwasem tiobarbiturowym (TBARS) i opornością osmotyczną erytro-cytów (RBC) a aktywnością NHE u pacjentów z cukrzycą, a więc chorobą o podłożu wolnorodnikowym. Nie został ustalony wpływ mikroelementów, w tym kofaktorów en-zymów antyoksydacyjnych, na aktywność STS. Jedynie Bogdanova i wsp. [10, 11] stwierdzili indukowany jonami miedzi (II) wzrost aktywności wymieniacza sodowo-pro-tonowego.
Dobrym modelem do badania in vivo relacji między elementami układu antyoksydacyjnego i wytwarzaniem wolnych rodników a aktywnością STS są pacjenci z prze-wlekłą niewydolnością nerek (PNN) leczeni hemodializami (HD). Powstające w przewlekłej niewydolności nerek oraz w procesie hemodializy reaktywne formy tlenu działają
nie stwierdzono obecności chorób mogących mieć wpływ na aktywność NHE (m.in. nadciśnienie tętnicze, cukrzyca i nefropatie cukrzycowe, choroby nadnerczy, zaburzenia hormonalne), nie miały one także zaburzeń gospodarki mi-neralnej organizmu i w okresie poprzedzającym badanie nie przyjmowały substancji mogących zwiększyć stężenie mikroelementów w organizmie.
Wiek i płeć, we wszystkich badanych grupach, nie róż-niły się istotnie statystycznie. Wszystkie osoby wyraziły zgodę na udział w badaniu. Badania uzyskały akceptację Komisji Bioetycznej przy Pomorskiej Akademii Medycznej w Szczecinie.
Przygotowanie materiału do badań
W grupie kontrolnej i u pacjentów z PNN krew do badań pobierano rano i na czczo. U pacjentów dializowanych krew pobierano bezpośrednio przed rozpoczęciem oraz bezpośred-nio po zakończeniu hemodializy. Ze względu na różną porę rozpoczynania dializ, długi czas trwania dializy oraz zwięk-szone ryzyko hipoglikemii w trakcie HD, pacjenci poddawani dializie w chwili pobierania krwi nie byli na czczo.
Krew w ilości 10 mL pobierano, stosując jako antyko-agulant heparynę (50 IU/mL). Krew wirowano (1850 g, 4°C) i oddzielano osocze od krwinek. Erytrocyty, po odciągnięciu
„kożuszka” leukocytów, płukano 3 razy zbuforowanym roztworem chlorku sodu o składzie: NaCl 150 mmol/L, bufor fosforanowy 5 mmol/L; pH 7,4 w 4°C. Oznacze-nie aktywności systemów transportowych wykonywano w ciągu 3 godz. od chwili pobrania krwi, przechowując RBC do chwili rozpoczęcia badań w 4oC. Osocze i RBC przeznaczone do innych badań przechowywano zamrożone w temp. −80°C.
Oznaczanie TBARS w osoczu i erytrocytach
Substancje reagujące z kwasem tiobarbiturowym w osoczu i erytrocytach oznaczano metodą spektroflu-orymetryczną [21]. Osocze lub erytrocyty, po odbiałczeniu
za pomocą kwasu nadchlorowego o stężeniu 1,5 mol/L, ogrzewano z kwasem tiobarbiturowym (w kwasie octowym) w 95–100°C w ciągu 1 godz. Po ostudzeniu i zakwasze-niu do pH 1,6–1,7 przeprowadzano ekstrakcję butanolem.
We frakcji organicznej mierzono fluorescencję barwnego kompleksu przy długościach fali 529 nm dla wzbudzenia i 547 nm dla emisji.
Oznaczanie stężenia pierwiastków śladowych
Selen w osoczu i erytrocytach oznaczano metodą spektro-fluorymetryczą [22]. Osocze lub RBC mineralizowano w roz-tworze kwasu nadchlorowego. Powstałe seleniany (Se vI) redukowano do seleninów (Se Iv) w reakcji z kwasem solnym.
Otrzymane seleniny reagowały z 2,3-diaminonaftalenem (związek kompleksujący selen). Po ekstrakcji cykloheksanem mierzono fluorescencję warstwy organicznej przy długościach fali 378 nm dla wzbudzenia i 519 nm dla emisji.
Miedź, cynk i żelazo w erytrocytach i osoczu oznaczano metodą spektrometrii absorpcji atomowej (absorpcjometr PU 9100X firmy Philips). Oznaczenia metali w osoczu wy-konywano po jego 3-krotnym rozcieńczeniu. Hemolizat erytrocytów (otrzymany w wyniku mrożenia RBC) roz-cieńczano odpowiednio 6-, 12- i 100-krotnie. W badanych rozcieńczonych hemolizatach oznaczano hemoglobinę, a na-stępnie stężenia metali. Stosowano następujące długości fali:
324,8 nm dla miedzi, 213,4 nm dla cynku i 248,3 nm dla żelaza. Stężenia sodu i potasu oznaczano metodą atomowej spektroskopii emisyjnej.
Oznaczanie aktywności systemów transportujących sód Aktywność systemów transportowych oznaczano wg metody Garaya i wsp. [23]. Erytrocyty płukano 4 razy w zimnym (4oC) roztworze zawierającym 110 mmol/L MgCl2. Następnie płukano je roztworem o składzie (mmol/L): 75 MgCl2, 85 sacharoza, 10 glukoza, 10 MOPS-Tris (pH 7,4 w 37°C). Zawiesinę erytrocytów umieszczano w różnych roztworach (temp. 4°C) zawierających
zbuforo-T a b e l a 1. Charakterystyka badanych grup T a b l e 1. Characteristic of the examined gropus
Parametry Parameters
Pacjenci dializowani / Dialysed patients
(n = 21)PNN bez glukozy / without glucose
(n = 21) z glukozą / with glucose (n = 22) przed HD
before HD po HD
after HD przed HD
before HD po HD after HD
Mocznik / Urea (mmol/L) 46,9 ± 13,7 20,4 ± 9,8 46,2 ± 9,9 19,4 ± 7,1 34,9 ± 30,3 Kreatynina / Creatinine (µmol/L) 767,6 ± 252,0 396,2 ± 156,5 731,4 ± 176,9 359,1 ± 102,6 258,8 ± 124,7 Potas / Potassium (mmol/L) 5,41 ± 0,83 4,13 ±0,39 5,36 ± 0,85 3,94 ± 0,60 4,4 ± 0,3 Sód / Sodium (mmol/L) 142,0 ± 4,42 142,84 ± 4,61 139,4 ± 3,24 140,5 ± 2,65 142 ± 2 Białko / Protein (g/L) 72,4 ± 10,5 75,8 ± 12,4 63,3 ± 6,2 69,3 ± 10,4 62,9 ± 9,7 Glukoza / Glucose (mmol/L) 4,83 ± 0,47 3,74 ± 0,31 5,61 ± 0,70 5,92 ± 0,76 5,45 ± 1,12
Hematokryt / Hematocrit (L/L) 0,28 ± 0,05 – 0,29 ± 0,036 – 33,7 ± 0,07
Wiek (lata) / Age (years) 55,9 ± 14,8 – 64,3 ± 12,1 – 56,8 ± 16,0
Użycie dializatora / The use of the dialyser 7,08 ± 7,46 – 7,90 ± 6,54 – –
Czas od rozpoczęcia dializ (miesiące)
Time from the start od dialyses (months) 9,45 ± 6,62 – 8,78 ± 6,42 – –
wany roztwór MgCl2 oraz następujące dodatki (mmol/L):
1) 2 KCl, 2) 0,1 strofantynę G, 3) 0,1 strofantynę G i 0,02 bumetanid, 4) 10 LiCl, 0,1 strofantynę G i 0,02 bumetanid.
Osmolarność roztworów wynosiła 295 ± 10 mOsm. Końcowe stężenie krwinek czerwonych wynosiło 4–5%. Probówki z zawiesinami erytrocytów umieszczano w łaźni o temp.
37°C. Po 30 min probówki nr 1 i 2, a po 60 min probówki nr 3 i 4 wyjmowano z łaźni i szybko oddzielano erytro-cyty poprzez wirowanie przy 2000 g w 4°C przez 10 min.
W supernatancie oznaczano stężenie sodu (probówki nr 1, 2, 3 i 4) oraz stężenie potasu (probówka nr 3). Na podstawie otrzymanych stężeń oraz znajomości hematokrytu obliczano aktywność pompy sodowo-potasowej (transport wrażliwy na strofantynę G), aktywność kotransportu sodowo-potaso-wego (wrażliwy na bumetanid wypływ sodu), przeciwtran-sportu sodowo-litowego (jako stymulowany litem wypływ sodu), wypływ odpowiednio sodu i potasu (wrażliwe na bu-metanid i strofantynę G). Stężenia wewnątrzkomórkowe sodu i potasu mierzono po 4-krotnym przepłukaniu krwinek roztworem chlorku choliny (140 mmol/L) i zhemolizowaniu erytrocytów poprzez zamrożenie w −20°C.