8.1. Główne osiągniecia i wnioski z badań przeprowadzonych w ramach pracy doktorskiej
Przedstawiona praca doktorska porusza niezwykle ważny, choć dotychczas nierozwiązany w literaturze, problem wpływu warunków przechowywania i przetwarzania tkankowych przeszczepów allogenicznych, na ich właściwości biomechaniczne. Zagadnienia poruszane w ramach rozprawy stanowią interdyscyplinarne połączenie tematów istotnych zarówno z punktu widzenia medycyny transplantacyjnej, jak również inżynierii tkankowej i mechaniki materiałów. Analizy warunków przechowywania tkanek kolagenowych pod kątem ich wielokrotnego mrożenia i rozmrażania, a w szczególności wpływu tego procesu na wybrane właściwości biomechaniczne ścięgna Achillesa, zostały przeprowadzone z wykorzystaniem tkanek ludzkich jak i pochodzenia zwierzęcego. Badania prowadzone były ze szczególnym uwzględnieniem wieloskalowej, hierarchicznej budowy ścięgna Achillesa oraz jego mechaniki działania w różnych zakresach odkształcenia. Dodatkowo, z uwagi na specyficzną, trójdzielną budowę tego ścięgna, badania prowadzone w ramach rozprawy zostały rozszerzone o analizę wpływu struktury materiału na właściwości lepkosprężyste pęczków głównych. Wiedza nt. wpływu anatomicznie uzasadnionej podzielności struktury ścięgna Achillesa na biomechanikę jego poszczególnych struktur może okazać się kluczowa przy wyborze obszaru tkanki, z którego pobierane będą przeszczepy, wykorzystywane przy rekonstrukcjach więzadła krzyżowego kolana bądź innych struktur ścięgnistych.
Głównym celem rozprawy było wyznaczenie granicznej liczby cykli mrożenia i rozmrażania, którym może zostać poddane ścięgno Achillesa przeznaczone do zastosowań operacyjnych jako przeszczep allogeniczny oraz próba wyjaśnienia przyczyn pogarszania się właściwości biomechanicznych ścięgna w trakcie M/R. Graniczna liczba cykli została zdefiniowana jako taka liczba zamrożeń i rozmrożeń tkanki, która nie spowoduje istotnych zmian jej właściwości mechanicznych i materiałowych, a tym samym nie pogorszy jej zdolności do przenoszenia obciążeń w zakresie odkształceń fizjologicznych. Odpowiedź na pytanie o graniczną liczbę cykli może zostać sformułowana w oparciu o wyniki płynące z badań opisanych w rozdz. 4 i 6 nad wpływem wielokrotnego M/R na właściwości sprężyste całego ścięgna Achillesa oraz właściwości lepkosprężyste jego wiązek pęczkowych. Oba przeprowadzone eksperymenty
144
potwierdzają spadek średniej wartości modułu sprężystości wraz ze wzrostem liczby cykli M/R i zależność ta jest silna i istotna statystycznie zarówno w całych próbach, jak i wewnętrznie pomiędzy testowanymi grupami. W przypadku badań nad całymi ścięgnami Achillesa wykazano istotny spadek modułu sprężystości już po 2 cyklu M/R, w przypadku badań na pęczkach po 3 lub 4 cyklach w zależności od zakresu odkształcenia. Badania prowadzone na całych ścięgnach posiadały jednak dużo mocniejsze ograniczenia w porównaniu do badań prowadzonych na pęczkach tj. ponad dwukrotnie słabszą statystykę, mniejszą liczbę testowanych grup badawczych oraz brak właściwej grupy kontrolnej. Biorąc zatem pod uwagę wyniki obu eksperymentów wraz z ich ograniczeniami stwierdzono, że graniczna liczba zamrożeń i rozmrożeń tkanki, która nie spowoduje istotnej zmiany jej modułu sprężystości, wynosi 3. Liczba ta dotyczy jednak wyłącznie właściwości sprężystych ścięgna pracującego do granicy zakresu odkształceń fizjologicznych. Pogorszenie właściwości sprężystych tkanki na skutek jej wielokrotnego M/R może mieć związek ze zjawiskiem anomalnej rozszerzalności temperaturowej molekuł wody, uwięzionych w porowatej strukturze ścięgna. Podczas zamarzania tkanki, uwięzione w niej cząsteczki wody zaczynają zwiększać swoją objętość, wywierając naprężenia ściskające na struktury kolagenowe na najniższych poziomach hierarchii ścięgna. Tym samym, formowanie się kryształów lodu może powodować zmianę geometrii wewnętrznej ścięgna np. poprzez zmniejszenie średnic włókien (opisane w rozdz. 7) i zwiększenie obszarów międzywłókienkowych. Wielokrotne mrożenie tkanki spowodować może zatem nieodwracalne osłabienie jej przekroju poprzecznego, co tłumaczy obserwowany w badaniach spadek sztywności tkanki.
Wyniki badań z rozdziału 6 dotyczące wpływu wielokrotnego M/R na stabilność właściwości lepkosprężystych pęczków ścięgna Achillesa jako pierwsze w literaturze dowodzą, że wielokrotne mrożenie może również istotnie wpłynąć wykazywaną przez nie histerezę mechaniczną oraz relaksację naprężeń. Dla obu badanych właściwości, istotny statystycznie spadek wartości został zanotowany dopiero po 8 (w przypadku histerezy) lub 10 (w przypadku relaksacji) cyklu M/R. Wyniki te świadczą o tym, że „lepka” części właściwości lepkosprężystych ścięgna Achillesa jest zdecydowanie mniej wrażliwa na wielokrotne M/R niż część „sprężysta”. Zjawisko to może wytłumaczyć faktem, iż za lepkosprężystość tkanek odpowiadają także procesy przepływu cieczy fizjologicznej przez macierz międzypęczkową, podczas gdy za właściwości sprężyste tkanek w fizjologicznym zakresie odkształcenia odpowiadają właściwości mechaniczne
145
wszystkich jej składowych (tj. zarówno włókien jak i macierzy). Wnioskować można zatem, że o ile wielokrotne M/R może powodować zmianę właściwości mechanicznych macierzy, o tyle jej przepuszczalność zmienia się jedynie w nieznacznym stopniu nie zmieniając znacząco właściwości lepkosprężystych czyli histerezy oraz relaksacji. Uzyskane wyniki sugerują zatem, że do celów ustalenie granicznej liczby cykli M/R, w pierwszej kolejności należy zwracać uwagę na obserwowany spadek modułu sprężystości. Biorąc pod uwagę wpływ M/R zarówno na właściwości sprężyste (rozdz. 4) jak i lepkosprężyste tkanki (rozdz. 6) podtrzymano wcześniejsze stwierdzenie, że liczba zamrożeń, gwarantująca pełne zachowanie stabilności jej właściwości biomechanicznych nie powinna przekraczać 3 cykli.
Aby umożliwić predykcję zmian wartości modułu sprężystości, histerezy mechanicznej oraz poziomu relaksacji naprężeń na poziomie wiązek pęczkowych ścięgna Achillesa w zależności od liczby cykli M/R sformułowano odpowiednie modele matematyczne dla trzech przedziałów zakresów odkształceń. Najdokładniejszą predykcję zmian modułu sprężystości opisano za pomocą 2-parametrowego modelu wykładniczego, natomiast zmiany wartości histerezy oraz obserwowanego spadku naprężeń podczas relaksacji zamodelowano funkcją wielomianową III stopnia. Na podstawie zdefiniowanych modeli oszacować można zmiany wartości poszczególnych właściwości lepkosprężystych ścięgien na poziomie wiązek pęczkowych. Wiedza ta może być niezwykle pomocna dla naukowców wykonujących testy biomechaniczne tkanek, w przypadku, gdy liczebność próbek w grupach badawczych uniemożliwia wykonanie wszystkich niezbędnych czynności w trakcie jednej sesji pomiarowej i konieczne jest powtórne zamrożenie części tkanek. Znajomość względnego spadku wartości właściwości lepkosprężystych tkanki pomiędzy poszczególnymi cyklami M/R może okazać się również istotna w badaniach wykorzystujących obrazowanie mikroskopowe SEM/TEM, gdzie preparatyka próbek wymaga ich wcześniejszego zamrożenia, a także w przypadku awarii urządzeń podtrzymujących ultraniską temperaturę wymaganą przy przechowywaniu przeszczepów allogenicznych.
Dynamiczny rozwój wiedzy z zakresu biomechaniki ścięgna Achillesa, a w szczególności doniesienia literaturowe sugerujące związek anatomicznego podziału struktury ścięgna Achillesa na indukujące się w nim podczas ruchu człowieka niejednorodne pole odkształceń, były podstawą decyzji o rozszerzeniu tematyki pracy doktorskiej. Dodatkowo przeprowadzone badania miały na celu jako pierwsze w literaturze, stwierdzić występowanie różnic
146
we właściwościach lepkosprężystych pęczków głównych ludzkiego ścięgna Achillesa w warunkach ex vivo. Wyniki badań potwierdziły istotne zróżnicowanie tych właściwości pomiędzy pęczkiem głównym SOL pochodzącym od mięśnia płaszczkowatego, a pęczkami GL i GM przyczepiających się do mięśnia brzuchatego łydki. Obserwacja ta wskazuje, że przyszłe badania nad mechaniką ścięgna Achillesa powinny uwzględniać różnice właściwości materiałowych wynikające z anatomicznego podziału struktury tego ścięgna.
Niewielka liczba pobieranych corocznie w Polsce ścięgien do celów przeszczepień allogenicznych wymaga, aby wszelkie procedury, którym podlega tkanka od momentu pobrania jej od dawcy do chwili przeszczepienia jej do organizmu biorcy, były ściśle sprecyzowane. Niniejsza praca jednoznacznie wskazuje, że wielokrotne mrożenie i rozmrażanie ścięgien wpływa na pogorszenie stabilności ich właściwości biomechanicznych, a istotne utrata właściwości sprężystych (modułu sprężystości) widoczna jest już po 3 cyklu mrożenia i rozmrażania. Wyznaczenie dopuszczalnej granicy liczby cykli mrożenia i rozmrażania tkanek, która nie dopuści do pogorszenia jej właściwości biomechanicznych, jest informacją kluczową do przeprowadzenia w przyszłości prawidłowej ewaluacji i optymalizacji protokołów przygotowania i przechowywania tkanek kolagenowych w bankach tkanek, a także zdefiniowania prawnych uregulowań, które zapewnią możliwie najwyższą jakość dystrybuowanych przeszczepów tkankowych.
8.2. Propozycja przyszłych badań
Dyskusja wyników prowadzona w ramach rozprawy uwypukliła kilka zagadnień, które mogą stanowić istotne i warte do zgłębienia tematy na polu badawczym biomechaniki ścięgien. Pierwszym z nich jest analiza i dokładny opis stosunku objętościowego i powierzchniowego zawartości macierzy międzypęczkowej do włókien kolagenowych na różnych poziomach hierarchii ścięgna. Poznanie wzajemnej relacji tych komponentów pomogłoby w porównaniu między sobą dotychczasowych wyników badań publikowanymi przez różne grupy badawcze pracujące na próbkach reprezentujących różne poziomy struktury ścięgna. Kolejnym ważnym, z punktu widzenia biomechaniki tkanek, zagadnieniem jest mechanika macierzy międzypęczkowej. O ile istnieją już publikacje dowodzące złożonego stanu naprężeń w macierzy, a także jej kluczowego wkładu w zachowanie lepkosprężyste tkanek, o tyle brak jest dokładnych
147
charakterystyk wytrzymałościowych samej macierzy. Interesującym zagadnieniem, dotyczącym zarówno tematu samej macierzy ścięgna jak i procesu wielokrotnego mrożenia tkanek wydaje się być także opis obecności i koncentracji poszczególnych proteoglikanów odpowiadających za wiązanie wody w tkance na tempo degradacji właściwości lepkosprężystych tkanek wielokrotnie mrożonych.
Propozycje zagadnień wartych do zgłębienia w przyszłości dotyczą także bezpośredniej kontynuacji zrealizowanych w ramach rozprawy badań, w tym w szczególności uzupełnienie wieloskalowego opisu wpływu M/R na biomechanikę najniższych poziomów hierarchii ścięgna (pojedyncze włókienka, poziom fibryli etc.). Uzupełnienie opisu na wszystkich poziomach struktury ścięgna może pozwolić w przyszłości na wyznaczenia współczynnika skali, dzięki któremu będzie możliwe oszacowanie wpływu wielokrotnego mrożenia na biomechanikę makroskopowychprzeszczepówallogenicznych,wyłącznienapodstawietestów przeprowadzonych na mikroskopowych wycinkach tkanek.
148