Index of /rozprawy2/11647

Pełen tekst

(1)Katedra Robotyki i Mechatroniki Wydział Inżynierii Mechanicznej i Robotyki Akademia Górniczo - Hutnicza im. Stanisława Staszica w Krakowie. Praca doktorska ANALIZA WPŁYWU STRUKTURY MATERIAŁU ORAZ WARUNKÓW PRZECHOWYWANIA NA STABILNOŚĆ TKANEK KOLAGENOWYCH. mgr inż. Martyna Ekiert. Promotor dr hab. inż. Andrzej Młyniec. Lipiec 2019 Kraków, Polska.

(2) Department of Robotics and Mechatronics Faculty of Mechanical Engineering and Robotics AGH University of Science and Technology. PhD Dissertation. ANALYSIS OF INFLUENCE OF MATERIAL STRUCTURE AND STORAGE CONDITIONS ON COLLAGEN TISSUES STABILITY Martyna Ekiert M.Sc. Eng.. Supervisor dr hab. inż. Andrzej Młyniec. July 2019 Krakow, Poland.

(3)

(4) Podziękowania Nie sposób w tym miejscu wymienić wszystkich osób, które w mniejszym lub większym stopniu przyczyniły się do powstania niniejszej pracy, a tym samym do szczęśliwego zakończenia tak ważnego dla mnie etapu mojej naukowej podróży. W sposób szczególny i osobisty chciałabym podziękować:. Promotorowi niniejszej pracy – Panu dr hab. inż. Andrzejowi Młyńcowi Andrzeju – dziękuję, że od początku naszej współpracy byłeś dla mnie prawdziwym mentorem. Dziękuję za nasze wszystkie merytoryczne dyskusje, każde motywujące do działania słowo oraz za to, że nauczyłeś mnie jak stać się najlepszym naukowcem na miarę swoich możliwości. Panu prof. dr hab. inż. Tadeuszowi Uhlowi, Panie Profesorze – dziękuję wieloletnie wsparcie i przychylność w trakcie całego doktoratu, a przede wszystkim za możliwość podjęcia badań w gronie znamienitych naukowców Katedry Robotyki i Mechatroniki AGH.. Niemniejsze podziękowania należą się mojej rodzinie, najbliższym i przyjaciołom: Mamo – dziękuję za bezgraniczne i nieustające wsparcie. Dziękuję za Twoją miłość, cierpliwość i wieloletnie poświęcenie, abym mogła dotrzeć do miejsca, w którym dzisiaj jestem, Bracie, Agnieszko, Dziadku – dziękuję za wszystkie wyrazy wsparcia i otuchy oraz za to, że zawsze byliście moimi najwierniejszymi kibicami, Marto, Paulino – dziękuję za wszystkie nasze naukowe i pozanaukowe rozmowy, które niejednokrotnie podnosiły mnie na duchu i motywowały do dalszego działania, Rafale – dziękuję za nasze ‘jest jak jest’, które z uśmiechem pomogło mi przetrwać niejeden kryzys w takcie ostatnich miesięcy mojej doktoranckiej podróży.. Wszystkim niewymienionym wyżej osobom, bez pomocy i wsparcia których ta praca nie mogłaby powstać – jeszcze raz serdecznie dziękuję. Martyna Ekiert.

(5) Badania prowadzone w ramach niniejszej pracy doktorskiej zostały zrealizowane przy wsparciu finansowym w ramach programów Narodowego Centrum Nauki w tym: . projektu PRELUDIUM (UMO-2015/17/N/ST7/03729),. . projektu OPUS (UMO-2014/13/B/ST7/00690),. . stypendium doktorskiemu ETIUDA (UMO-2018/28/T/ST7/00361).. Praca powstała także przy udziale Centrum Energetyki AGH..

(6) STRESZCZENIE Niniejsza praca doktorska porusza niezwykle ważny, choć dotychczas nierozwiązany w literaturze interdyscyplinarny problem wpływu warunków przechowywania i przetwarzania tkankowych przeszczepów allogenicznych na ich właściwości biomechaniczne. Tkanki miękkie, przeznaczone do przeszczepów allogenicznych, konserwowane są w bankach tkanek poprzez przechowywanie ich w warunkach głębokiego mrożenia, tj. w temperaturze −80 °C. W najbardziej typowych przypadkach, przetwarzanie tkanki od momentu pobrania jej od dawcy do chwili wszczepienia jej do organizmu biorcy, wymaga przynajmniej dwukrotnego jej rozmrożenia. Niestety, istnieją także przypadki, w których liczba zastosowanych cykli mrożenia i rozmrażania (M/R) wynosi trzy lub więcej. W sytuacji tej powstaje uzasadniona wątpliwość czy lub w jakim stopniu wielokrotne mrożenie tkanki będzie wpływać na jej właściwości biomechaniczne. Rozpatrując potencjalne skutki, jakie może wywołać wielokrotne M/R tkanek miękkich na przykładzie ścięgien, należy odnieść się do ich budowy strukturalnej i chemicznej. Ścięgna, w przeważającej większości (95%) składają się z kolagenu, natomiast wartość ta jest właściwa tylko w odniesieniu do suchej masy ścięgna. W masie mokrej ścięgna 60 – 80 % stanowią molekuły wody „uwięzione” w porowatej strukturze ścięgna. Nieunikniony wzrost objętości cząsteczek wody podczas krzepnięcia oraz formowanie się kryształów lodu może prowadzić do zmian strukturalnych tkanki i stanowić bezpośrednią przyczynę degradacji jej właściwości biomechanicznych. Przegląd dotychczas opublikowanych w tym zakresie prac nie daje jednoznacznej odpowiedzi na pytanie: jaki jest wpływ wielokrotnego mrożenia i rozmrażania na stabilność właściwości biomechanicznych tkanek przeznaczonych do przeszczepów allogenicznych? Niniejsza praca doktorska podejmuje zatem próbę wypełnienia tej luki, poprzez analizę warunków przechowywania tkanek kolagenowych pod kątem ich wielokrotnego mrożenia i rozmrażania, a w szczególności wpływu tego procesu na wybrane właściwości lepkosprężyste ścięgna Achillesa. Badania przeprowadzono na tkankach ludzkich jak i tych pochodzenia zwierzęcego, ze szczególnym uwzględnieniem ich wieloskalowej, hierarchicznej budowy. Dodatkowo, z uwagi na specyficzną, trójdzielną budowę ścięgna Achillesa, badania prowadzone w ramach rozprawy zostały rozszerzone o analizę wpływu struktury materiału na właściwości biomechaniczne tego ścięgna – wiedza ta może okazać się kluczowa przy wyborze obszaru ścięgna, z którego pobierane będą przeszczepy, wykorzystywane przy rekonstrukcjach więzadła krzyżowego kolana bądź innych struktur ścięgnistych. Praca składa się z 9 rozdziałów. Pierwszy z nich opisuje motywację Autorki do podjęcia badań nad wielokrotnym M/R ścięgna Achillesa w kontekście braku odgórnych regulacji prawnych, które byłby w stanie w sposób jednoznaczny zapewnić wymagane właściwości mechaniczne tkankowych przeszczepów allogenicznych. Kolejno w pracy przedstawiono przegląd aktualnej literatury z dziedziny biomechaniki ścięgna Achillesa w tym szczegółowo i.

(7) omówiono budowę strukturalną tego ścięgna, jego kompozycję chemicznej oraz wyjaśniono nomenklaturę zastosowaną do opisu poszczególnych poziomów jego hierarchii. Przegląd prac opisuje także informacje nt. właściwości mechanicznych ścięgna w fizjologicznych i poza fizjologicznych zakresach jego odkształcenia. Ostatnią część rozdziału 2 stanowi przegląd prac z zakresu wpływu warunków przechowywania ścięgien dedykowanych do przeszczepów allogenicznych na stabilność ich właściwości mechanicznych. Wnioski z dokonanych przeglądów dobitnie uwidaczniają brak spójności właściwie w każdym aspekcie metodyki dotychczas opublikowanych badań. Eksperyment prowadzone były na różnych ścięgnach, dla różnej liczby cykli mrożenia i rozmrażania, stosując odmienne czasy, temperatury i tempa protokołów mrożenia i rozmrażania, a także różne procedury testów wytrzymałościowych. Dodatkowo w literaturze nie znaleziono publikacji kompleksowo opisujących wpływ wielokrotnego M/R na właściwości lepkosprężyste ścięgien – istnieją nieliczne prace opisujące wpływ M/R na zdolność do relaksacji naprężeń i pełzania tkanki, brak jest natomiast badań wpływu tej procedury na wielkość histerezy mechanicznej. W ramach pracy doktorskiej przeprowadzono 3 eksperymenty oparte na testach mechanicznych, prowadzonych w warunkach ex vivo oraz obrazowanie wewnętrznej struktury ścięgna z wykorzystaniem skaningowej mikroskopii elektronowej. Pierwszy z prowadzonych eksperymentów, opisany w rozdziale 4, dotyczył wpływu wielokrotnego mrożenia i rozmrażania na zmianę właściwości sprężystych ludzkiego ścięgna Achillesa. Badania w tej części pracy prowadzone były dla najwyższego makroskopowego poziomu hierarchii ścięgna (jedna niepodzielna jednostka). Badania nad wpływem anatomicznego podziału struktury ścięgna Achillesa tj. podziału na trzy pęczki główne, na jego właściwości lepkosprężyste były przedmiotem drugiego z trzech eksperymentów. Wyniki tych badań, opisane w rozdz. 5, przedstawiają również indywidualny wpływ czynników tj. wiek czy wymiary geometryczne pęczków głównych na ich właściwości mechaniczne, które mogą stanowić przyczynę rozbieżności wyników uzyskiwanych w badaniach in vivo i ex vivo biomechaniki ścięgien. Ostatni eksperyment, opisany w rozdz. 6, dotyczył wpływu wielokrotnego mrożenia i rozmrażania na właściwości lepkosprężyste tkanki i został opisany dla poziomu wiązek pęczkowych, które reprezentują pośredni, pomiędzy mikro a makroskalą, poziom hierarchii ścięgna Achillesa. Badania z użyciem testów wytrzymałościowych zostały uzupełnione o obrazowanie mikrostruktury ścięgna Achillesa z wykorzystaniem obrazowania metodą skaningowej mikroskopii elektronowej. Badania opisane w rozdz. 7 opisują wpływ wielokrotnego mrożenia tkanki na średnicę fibryli kolagenowych, reprezentujących poziom mikrostruktury ścięgna. Ostatnie dwa rozdziały podsumowują wnioski płynące z przeprowadzonych badań, wskazują dalsze kierunki rozwoju prac nad podjętym zagadnieniem oraz przedstawiają listę referencji, do których odwoływano się w pracy. Wyniki badań prowadzonych na całych ścięgnach Achillesa potwierdziły spadek średniej wartości modułu sprężystości wraz ze wzrostem liczby cykli M/R. Zależność ta jest silna i istotna statystycznie zarówno w całej próbie, jak i wewnętrznie pomiędzy większością grup. Pierwszy istotnie statystyczny spadek modułu sprężystości obserwowany jest po 2 cyklach ii.

(8) M/R. Badania opisane w rozdz. 5 potwierdziły wpływ anatomicznego podziału ludzkiego ścięgna Achillesa na zróżnicowanie właściwości jego trzech pęczków głównych tj. pęczka pochodzącego od mięśnia płaszczkowatego łydki (soleus muscle, SOL) oraz dwóch pęczków pochodzących od głowy przyśrodkowej (gastrocnemius muscle/medial head, GM) i bocznej (gastrocnemius muscle/lateral head, GL) mięśnia brzuchatego łydki. Różnice pomiędzy pęczkami dotyczą przede wszystkim modułu sprężystości, który jest istotnie mniejszy dla pęczka SOL w porównaniu do pęczków GL i GM. Moduł sprężystości jest jednak niezróżnicowany pomiędzy pęczkami GL i GM, które pochodzą od dwóch głów tego samego mięśnia. Pętla histerezy mechanicznej, świadcząca o ilości energii rozproszonej przez tkankę, jest istotnie większa dla pęczka SOL niż pęczka GL oraz GM. Podobnie jak w przypadku modułu sprężystości, nie stwierdzono różnic w histerezie pomiędzy pęczkami GL i GM, pochodzącymi od dwóch głów tego samego mięśnia. Podział ścięgna Achillesa na pęczki główne nie wpływa na poziom relaksacji ich naprężeń, zarówno w obszarze małych odkształceń nieliniowych jak i fizjologicznym obszarze odkształceń liniowych. Badania nad wpływem wielokrotnego M/R na właściwości lepkosprężyste tj. moduł sprężystości, histerezę oraz relaksację naprężeń, wiązek pęczkowych ścięgna Achillesa wykazały ujemną i silną korelację tych właściwości z liczbą cykli M/R. Oznacza to, że wraz ze wzrostem liczby cykli obserwowany jest spadek wartości modułu sprężystości oraz właściwości lepkosprężystych materiału objawiający się zmniejszeniem pola powierzchni histerezy i wartości spadków naprężeń podczas relaksacji tkanki. W przypadku modułu sprężystości istotny statystycznie spadek wartości modułu obserwowany jest już od 3 lub 4 cyklu M/R (w zależności od wartości odkształcenia). W przypadku histerezy oraz relaksacji znaczący spadek ich wartości obserwowany jest przy dużo wyższej liczbie cykli (8 w przypadku histerezy i 10 cykli w przypadku relaksacji). Zmiany właściwości lepkosprężystych pęczków ścięgna Achillesa na skutek wielokrotnego procesu M/R mogą zostać opisane z wykorzystaniem modeli nieliniowych. Wpływ wielokrotnego M/R na moduł sprężystości opisano z wykorzystaniem dwuparametrowej funkcji wykładniczej. Modele do predykcji zmian histerezy oraz relaksacji naprężeń pęczków na podstawie liczby cykli M/R zostały zdefiniowane w oparciu o modele wielomianowe III stopnia. Wyniki badań prowadzonych na pęczkach ścięgna Achillesa (rozdz. 6), w zestawieniu z wynikami badań prowadzonych na całych ścięgnach Achillesa oraz jego pęczkach głównych (rozdz. 4 i 5) potwierdzają spotykaną w literaturze hipotezę o silnej zależności niektórych właściwości mechanicznych i materiałowych ścięgien od rozpatrywanego poziomu ich hierarchii. Wyniki badań z wykorzystaniem obrazowania SEM z rozdz. 7 potwierdziły, że wielokrotne M/R w sposób znaczący wpływa na strukturę wewnętrzną tkanki powodując zmianę wymiarów geometrycznych (średnic) oraz orientację ułożenia włókien i fibryli kolagenowych. Fibryle ścięgna Achillesa poddanego 8 i 12 cyklom M/R wykazują znacznie mniejsze średnice w porównaniu do fibryli ścięgna niemrożonego – zmiana ta jest istotna statystycznie i nie ma na nią wpływu wybór analizowanego obszaru ścięgna.. iii.

(9) Podsumowując, przedstawione w pracy badania są pierwszymi w literaturze eksperymentami ex vivo, które analizują wpływ wielokrotnego M/R na moduł sprężystości ludzkiego ścięgna Achillesa, traktowanego jako jedna niepodzielna jednostka oraz wpływ na właściwości lepkosprężyste (moduł sprężystości, histerezę mechaniczną oraz relaksację naprężeń) tego ścięgna na poziomie wiązek pęczkowych. W rozprawie opracowano także, niespotykane dotąd w literaturze, modele predykcji zmian właściwości lepkosprężystych wiązek pęczkowych ścięgna Achillesa na podstawie liczby cykli M/R dla różnych zakresów odkształcenia. Dodatkowo, rozdział dotyczący wpływu struktury materiału biologicznego na jego właściwości mechaniczne i materiałowe, opisuje oryginalne badania w warunkach ex vivo nad właściwości lepkosprężystymi indywidualnie wypreparowanych pęczków głównych ludzkiego ścięgna Achillesa. Wnioski płynące z tych badań po raz pierwszy w literaturze weryfikują hipotezę nt. bezpośredniego związku trójdzielnej budowy ścięgna Achillesa z powstającym w nim niejednorodnym polem odkształceń w trakcie ruchu człowieka. Autorka pracy jest głęboko przekonana, że przedstawione w rozprawie wyniki, a w szczególności wyznaczenie dopuszczalnej granicy liczby cykli mrożenia i rozmrażania tkanek, która nie dopuści do pogorszenia jej właściwości biomechanicznych, jest informacją kluczową do przeprowadzenia w przyszłości optymalizacji protokołów przetwarzania tkanek kolagenowych w bankach tkanek oraz zdefiniowania prawnych uregulowań, które zapewnią możliwie najwyższą jakość dystrybuowanych przeszczepów tkankowych.. iv.

(10) ABSTRACT This dissertation raises an important, although still unresolved in the field, interdisciplinary issue concerning the impact of storage and processing conditions of tissue allogeneic grafts on their biomechanical properties. Soft tissues, which are intended for allogeneic grafts, are preserved in tissue banks by undergoing deep freezing procedure at −80° C. In the most typical case, tissue graft requires at least two freezing/thawing (F/T) cycles between collection from the donor to the moment of its implantation into the patient's body. Unfortunately, there are reported cases in which the number of applied freezing/thawing cycles was three or even more. This in turn raises a justified doubt whether or how repeated freezing and thawing of tissue will affect its biomechanical properties. A potential effects which can be caused by multiple F / T of soft tissues like tendons, should be considered through their structural and chemical composition. Tendons, which dry mass predominantly includes collagen type I, consist about 60 − 80% of water in the wet mass. This water molecules are "trapped" in the porous structure of the tendon. During freezing and ice crystals formation, an inevitable increase in volume of water molecules may potentially lead to structural changes inside tissue and thus can be a direct cause of deterioration of its biomechanical properties. A review of papers published so far in this field does not give a definite answer to research question: what is the effect of repeated freezing and thawing on the stability of biomechanical properties of tissues intended for allogenic transplants? Therefore, this thesis attempts to fill this gap by studying storage conditions of collagen tissues in terms of repeated freezing and thawing cycles and in particular the impact of this process on selected viscoelastic properties of the Achilles tendon. The studies were carried out on human as well as animal tendon tissues with particular emphasis on their multiscale and hierarchical structure. In addition, due to the specific triple-twisted structure of the Achilles tendon, studies included in this dissertation were expanded to analysis of the impact of material structure on the biomechanical properties of Achilles tendon. This may be a key issue when choosing the area of tendon for graft dissection and its later use for reconstruction of knee cruciate ligament or other tendon structures. The thesis consists of 9 chapters. The first one describes author’s motivation to consider the issue of multiple F/T of Achilles tendon due to the lack of legal regulations to provide appropriate biomechanical properties of allogenic tissue grafts. The second chapter presents a review on Achilles tendon biomechanics and discusses in details its chemical composition and nomenclature used to describe levels of tendon hierarchy. The chapter also describes current state of the art concerning mechanical properties of the tendon subjected to physiological as well as non-physiological range of strains. The last part of chapter 2 sums up the latest reports dealing with the impact of storage conditions of tendon allogeneic grafts on the stability of their mechanical properties. The conclusions from chapter 2 clearly showed a lack of methodological consistency in almost every aspect of studies published in the field so far. The studies were v.

(11) performed on different type of tendons, for different numbers of F/T cycles, using various time, temperature and rate of F/T protocols as well as biomechanical testing procedures. In addition, none of existing reports comprehensively describes the effect of multiple F/T on viscoelastic properties of tendons. Although there is a few papers describing an influence of multiple F/T on tissue stress relaxation and creeping, there is a lack of papers proving the impact of this procedure on the size of mechanical hysteresis loop. For the purpose of this doctoral thesis, the author performed 3 three experiments based on tissue ex vivo mechanical testing supplemented with imaging of tendon internal structure using scanning electron microscopy. The first experiment, described in chapter 4, concerned the effect of repeated freezing and thawing on the change of elastic properties of the human Achilles tendon. This part of work was carried out for the highest macroscopic level of tendon hierarchy (one indivisible unit). The second experiment recognized an issue of influence of anatomical division of Achilles tendon structure into three distinct subtendons, on theirs viscoelastic properties. The results of this study, discussed in details in chapter 5, also presents an individual influence of factors such as age or subtendons geometry, on theirs mechanical properties. This in turn may be a reason of discrepancy in the results reported in literature for in vivo and ex vivo studies on tendon biomechanics. The last experiment, described in chapter 6, concerned an impact of repeated F/T on viscoelastic properties of bovine fascicle bundles which represent a merge between micro and macroscale of Achilles tendon hierarchy. The ex vivo biomechanical tests were supplemented with scanning electron microscopy imaging of Achilles tendon microstructure. Therefore chapter 7, discussed in details an influence of multiple F/T on diameter of collagen fibrils which represent microstructure of Achilles tendon. The last two chapters (8 and 9) summarize conclusions from all experiments, indicate possible scope of future studies and present a list of literature references. The results of studies performed for macroscale units of Achilles tendons (chapter 4) confirmed decrease in mean modulus of elasticity with increase in the number of F/T cycles. This dependency is strong and statistically significant both for all samples together and internally between most tested groups. The first significantly statistical decrease in modulus of elasticity is observed after second cycle of F/T. The studies described in chapter 5 confirmed an influence of anatomical division of human Achilles tendon on biomechanical properties of its three subtendons, namely SOL (derived from soleus muscle), GM (derived from medial head of gastrocnemius muscle) and GL (derived from lateral head of gastrocnemius muscle). The differences in biomechanical properties of subtendons primarily relate to modulus of elasticity, which is significantly smaller for SOL compared to GL and GM subtendons. However, modulus of elasticity does not exhibit any statistically significant differences between GL and GM subtendons, which come from two heads of the same gastrocnemius muscle. The hysteresis, indicating the amount of energy dispersed by the tissue, is significantly higher for the SOL subtendon than for GL and GM units. However, the amount of hysteresis between GL and GM subtendons, originating from the same muscle, does not exhibit any statistically vi.

(12) significant differences. The anatomical division of human Achilles tendon for three distinct subtendons does not differentiate their ability to stress relaxation both for small non-linear as well as physiological linear range of strains. Study on the influence of multiple F/T on viscoelastic properties (modulus of elasticity, hysteresis and stress relaxation) of Achilles tendon bovine fascicle bundles showed a negative and strong correlation of these properties with the number of F/T cycles. This means that increase in number of F/T cycles results in decrease in modulus of elasticity as well as decrease in hysteresis loop area and value of stress drop during tissue relaxation. In case of elasticity modulus, a statistically significant decrease is observed just after the 3rd or 4th F/T cycle (depending on the strain range). A significant decrease in hysteresis and stress relaxation drop is observed after much higher number of cycles (8 cycles for hysteresis and 10 cycles for relaxation). A cycle-dependent changes in value of viscoelastic properties of the Achilles tendon fascicle bundles are further defined using non-linear models − two-parameter exponential function for modulus of elasticity and cubic functions for prediction of changes in hysteresis and stress relaxation. The results of experiment based on fascicles bundles (chapter 6) in comparison with results of tests based on whole tendon units and subtendons (chapters 4 and 5) confirmed hypothesis of strong dependency between mechanical and material properties of tendon tissue with considered level of tendon hierarchy. Additionally, the results from SEM imaging described in chapter 7, also confirmed a significant influence of multiple F/T cycles on tissue internal structure such as geometric dimensions (diameters) and orientation of collagen fibers and fibrils. A fibrils from Achilles tendon subjected to 8 and 12 F/T cycles exhibit statistically significant smaller diameters compared to non-frozen tendon fibrils and this phenomenon is independent from measured tendon area. To sum up, the studies presented in this thesis are the first in the biomechanics field ex vivo experiments investigating an influence of multiple F/T cycles on modulus of elasticity of human Achilles tendon, treated as one indivisible unit, as well as an influence on viscoelastic properties of this tendon at fascicle bundle level. The thesis also presents a unique models of prediction of changes of viscoelastic properties occurring in fascicle bundles as a function of number of F/T cycles for physiological and non-physiological range of strains. In addition, the chapter concerning an influence of biological material structure on its mechanical and material properties describes an original ex vivo research on viscoelastic properties of individually dissected subtendons of human Achilles tendon. The conclusions from this study verify the hypothesis of direct relationship between tripartite structure of the Achilles tendon with nonhomogeneous strain field occurring within AT during tendon movement. The author is deeply convinced that results presented in this dissertation, in particular a defined limit of number of freezing and thawing cycles applied on tissue, will be the key issue for future optimization of collagen tissue storage protocols and will help to clarified legal regulations which will ensure the highest possible quality of tissue grafts. vii.

(13) Spis treści STRESZCZENIE ...................................................................................................................................................... I ABSTRACT ............................................................................................................................................................. V. 1.. WSTĘP ............................................................................................................................................................ 1. 2.. BIOMECHANIKA ŚCIĘGNA ACHILLESA .............................................................................................. 6 2.1.. ŚCIĘGNO ACHILLESA – STRUKTURA, KOMPOZYCJA CHEMICZNA, NOMENKLATURA POZIOMÓW HIERARCHII . 6. 2.2.. WŁAŚCIWOŚCI MECHANICZNE ŚCIĘGNA ACHILLESA ................................................................................... 12. 2.3.. WPŁYW WARUNKÓW PRZECHOWYWANIA NA STABILNOŚĆ WŁAŚCIWOŚCI BIOMECHANICZNYCH TKANEK. MIĘKKICH. 3.. 19. CEL I ZAKRES PRACY ............................................................................................................................. 29 3.1.. CEL PRACY .................................................................................................................................................. 29. 3.2.. ORYGINALNOŚĆ ROZWIĄZANIA PROBLEMU NAUKOWEGO ........................................................................... 30. 3.3.. ZAKRES PRACY ........................................................................................................................................... 31. WPŁYW WIELOKROTNEGO MROŻENIA NA MODUŁ SPRĘŻYSTOŚCI ŚCIĘGNA ACHILLESA. 4.. (POZIOM CAŁEGO ŚCIĘGNA) ............................................................................................................................. 33 4.1.. 4.2.. 4.3.. MATERIAŁY I METODY ................................................................................................................................ 33 4.1.1.. Preparacja i przygotowanie próbek .................................................................................................. 33. 4.1.2.. Biomechaniczne testy wytrzymałościowe ........................................................................................... 34. 4.1.3.. Obliczenia modułu sprężystości ......................................................................................................... 35. 4.1.4.. Statystyka ........................................................................................................................................... 36. WYNIKI I DYSKUSJA .................................................................................................................................... 37 4.2.1.. Wpływ liczby cykli M/R na wartość modułu sprężystości ścięgna Achillesa ..................................... 37. 4.2.2.. Związek między wiekiem dawców, a wartością modułu sprężystości i liczbą cykli M/R ................... 44. 4.2.3.. Geometria próbek, a wartość modułu sprężystości ........................................................................... 46. WNIOSKI ..................................................................................................................................................... 47.

(14) WPŁYW ANATOMICZNEJ STRUKTURY ŚCIĘGNA ACHILLESA NA JEGO WŁAŚCIWOŚCI. 5.. LEPKOSPRĘŻYSTE (POZIOM PĘCZKÓW GŁÓWNYCH) ............................................................................. 48 5.1.. 5.2.. 5.3.. MATERIAŁY I METODY ................................................................................................................................ 49 5.1.1.. Preparacja i przygotowanie próbek .................................................................................................. 49. 5.1.2.. Biomechaniczne testy wytrzymałościowe ........................................................................................... 51. 5.1.3.. Obliczenia modułu sprężystości, histerezy mechanicznej i poziomu relaksacji naprężeń ................. 52. 5.1.4.. Statystyka ........................................................................................................................................... 54. WYNIKI I DYSKUSJA .................................................................................................................................... 55 5.2.1.. Wpływ anatomicznie podzielnej struktury materiału na moduł sprężystości pęczków głównych ...... 56. 5.2.2.. Wpływ wieku i geometrii próbek na wartość modułu sprężystości pęczków głównych ..................... 61. 5.2.3.. Wpływ anatomicznie podzielnej struktury ścięgna i wieku dawców na histerezę .............................. 64. 5.2.4.. Wpływ anatomicznie podzielnej struktury ścięgna i wieku dawców na relaksację naprężeń ............ 68. WNIOSKI ..................................................................................................................................................... 75. WPŁYW. 6.. WIELOKROTNEGO. MROŻENIA. NA. STABILNOŚĆ. WŁAŚCIWOŚCI. LEPKOSPRĘŻYSTYCH TKANEK KOLAGENOWYCH (POZIOM PĘCZKÓW) ......................................... 77 6.1.. 6.2.. 6.3.. BADANIA WSTĘPNE ..................................................................................................................................... 78 6.1.1.. Materiały i metody ............................................................................................................................. 79. 6.1.2.. Dobór grup testowych ....................................................................................................................... 82. 6.1.3.. Wpływ prędkości obciążenia na moduł sprężystości.......................................................................... 86. 6.1.4.. Wpływ wielokrotnego pomiaru próbki na wyniki pomiaru modułu sprężystości ............................... 87. 6.1.5.. Wnioski z badań wstępnych ............................................................................................................... 89. BADANIA WŁAŚCIWE ................................................................................................................................... 90 6.2.1.. Materiały i metody ............................................................................................................................. 90. 6.2.2.. Wyniki i dyskusja ............................................................................................................................... 95. WNIOSKI ................................................................................................................................................... 125. WPŁYW WIELOKROTNEGO MROŻENIA NA STRUKTURĘ WEWNĘTRZNĄ TKANKI ........ 127. 7. 7.1.. MATERIAŁY I METODY .............................................................................................................................. 127 7.1.1.. Preparacja, przygotowanie próbek, protokół chemiczny ................................................................. 127. 7.1.2.. Obrazowanie SEM i obliczenia średnicy fibryli kolagenowych ....................................................... 130. 7.1.3.. Statystyka ......................................................................................................................................... 131.

(15) 7.2.. 7.3.. 8.. 9.. WYNIKI I DYSKUSJA .................................................................................................................................. 132 7.2.1.. Wpływ obszaru ścięgna na mierzone wartości średnic fibryli kolagenowych ................................. 134. 7.2.2.. Wpływ wielokrotnego M/R na średnicę fibryli kolagenowych ......................................................... 135. WNIOSKI ................................................................................................................................................... 141. PODSUMOWANIE .................................................................................................................................... 143 8.1.. GŁÓWNE OSIĄGNIECIA I WNIOSKI Z BADAŃ PRZEPROWADZONYCH W RAMACH PRACY DOKTORSKIEJ ....... 143. 8.2.. PROPOZYCJA PRZYSZŁYCH BADAŃ ............................................................................................................ 146. BIBLIOGRAFIA ........................................................................................................................................ 148.

(16) WYKAZ SKRÓTÓW I OZNACZEŃ:. ACL. –. więzadło krzyżowe przednie (z ang. Anterior Cruciate Ligament). AIC. –. kryterium informacyjne Akaikego (z ang. Akaike Information Criterion). AT. –. ścięgno Achillesa (z ang. Achilles Tendon). BIC. –. Bayesowskie kryterium informacyjne (z ang. Bayesian Information Criterion). CSA. –. przekrój poprzeczny (z ang. Cross Sectional Area). ECM. –. macierz pozakomórkowa (z ang. ExtraCellular Matrix). GAG. –. glikozoaminoglikany (z ang. Glycosaminoglycans). GL. –. głowa boczna mięśnia brzuchatego łydki (z ang. Gastrocnemius muscle – Lateral head). GM. –. głowa przyśrodkowa mięśnia brzuchatego łydki (z ang. Gastrocnemius muscle – Medial head). IQR. –. rozstęp ćwiartkowy (z ang. InterQuartile Range). M/R. –. mrożenie/rozmrażanie. MRI. –. obrazowanie rezonansem magnetycznym (z ang. Magnetic Resonance Imaging). NPRMT –. Narodowy Program Rozwoju Medycyny Transplantacyjnej. PBS. –. sól fizjologiczna buforowana fosforanem (z ang. Phosphate-Buffered Saline). PG. –. proteoglikany (z ang. ProteoGlycans). SEM. –. skaningowa mikroskopia elektronowa (z ang. Scanning Electron Microscopy). SLRP. –. małe proteoglikany zasobne w leucynę (z ang. Small Leucine-Rich Proteoglicans). SOL. –. mięsień płaszczkowaty (z ang. Soleus Muscle). TEM. –. transmisyjna mikroskopia elektronowa (z ang. Transmission Electron Microscopy). TNC. –. tenascyna C (z ang. Tenascin C). USG. –. ultrasonografia (z ang. UltraSonoGraphy). WD. –. odległość robocza (z ang. Working Distance).

(17) 1. Wstęp Ruch, czyli zdolność do przemieszczania się, jest naturalną i fizjologiczną potrzebą każdego człowieka. Ruch jest fundamentem zdrowego życia, a regularna aktywność fizyczna skutecznie wspomaga nie tylko biologiczny, ale także psychiczny i społeczny rozwój człowieka. Przytłaczająca liczba publikacji naukowych dowodzi, że regularna aktywność fizyczna znacząco redukuje ryzyko przedwczesnej śmierci na skutek otyłości, cukrzycy typu II, nowotworów, chorób serca, układu krążenia czy chorób neurodegeneracyjnych [1]. Niestety, na skutek wypadków wynikających z kontaktowości niektórych dyscyplin sportowych, a także czynników tj. brak odpowiedniej rozgrzewki czy nadmierna intensywność wykonywanych ćwiczeń, aktywność fizyczna może być bezpośrednią przyczyną wielu dolegliwości związanych z układem ruchu człowieka [2], [3]. Z najnowszego, opublikowanego w styczniu 2019r., raportu Narodowego Instytutu Zdrowia Publicznego – Państwowego Zakładu Higieny, nt. sytuacji zdrowotnej polskiego społeczeństwa, wynika, że jedynymi z najczęstszych przyczyn (ok. 15%) absencji chorobowej w kraju są choroby układu mięśniowo-szkieletowego oraz tkanki łącznej. Z tego samego źródła wiadomo też, iż urazy tkanek i narządów stanowią drugą (obok chorób układu krążenia) najczęstszą przyczynę hospitalizacji (8,9%) w Polsce. Co więcej, dynamika wzrostu notowanych w kraju urazów układu ruchu nieustannie wzrasta – pomiędzy 2015 a 2017 rokiem wzrost ten wyniósł 8.6 % [4]. Wśród urazów układów ruchu, dominują uszkodzenia tkanek miękkich tj. naciągnięcia i naderwania mięśni, więzadeł i ścięgien. W tej grupie najliczniejsze uszkodzenia zachodzą w obrębie stawu kolanowego (uszkodzenia łąkotek i więzadeł kolana – w sumie ponad 35% urazów) oraz stawu skokowego i stopy (ścięgno Achillesa, ścięgno strzałkowe – ok. 12% urazów) [5]. Jednym z najszerzej opisywanych w literaturze medycznej urazów dotyczących stawu kolanowego jest uszkodzenie przedniego więzadła krzyżowego kolana (ang. Anterior Cruciate Ligament – ACL). Corocznie na świecie wykonuje się od 200 000 do 300 000 zabiegów rekonstrukcji tego więzadła, przy czym w samych Stanach Zjednoczonych liczba ta wynosi ok. 100 000, a w Polsce szacowana jest na ok. 15 000 [6], [7]. Do rekonstrukcji ACL, obok coraz popularniejszych przeszczepów syntetycznych, wykorzystywane są przeszczepy tkankowe, w postaci ścięgien auto- lub allogenicznych. Przeszczep autogeniczny wykonywany jest w obrębie tego samego organizmu, (do rekonstrukcji ACL pobierane jest od pacjenta np. ścięgno mięśnia półścięgnistego czy więzadła rzepkowego), natomiast do przeszczepu allogenicznego wykorzystuje się tkankę pobraną od dawcy (np. ścięgno Achillesa). Obie powyższe metody dają ponad 90% szansę. 1.

(18) na pełne przywrócenie stabilności stawu oraz powrót do regularnej aktywności fizycznej [8]. Każda z metod posiada jednak wady i przeciwwskazania (Tab.. 1), które powinny być. rozpatrywane przy podjęciu decyzji o wyborze metody przeszczepu [9], [10]. Z uwagi na fakt, że w przypadku autotransplantacji znaczny odsetek pacjentów skarży się na późniejsze dolegliwości bólowe związane z przewlekłym osłabieniem mięśnia, z którego pobierana była tkanka, preferowane są, zwłaszcza u osób starszych, rekonstrukcje z wykorzystaniem ścięgna allogenicznego [9]. Te z kolei, pomimo ryzyka związanego z potencjalnym przeniesieniem chorób z dawcy na biorcę, minimalizują czas operacji, a tym samym czas powrotu pacjenta do sprawności po zabiegu. Tab. 1. Wady i zalety stosowania przeszczepów biologicznych [11].. Alloprzeszczep. Autoprzeszczep. Zalety gotowość tkanki do użycia brak możliwości przeniesienia choroby z dawcy na biorcę  brak konieczności sterylizacji tkanki  natychmiastowe przyjęcie przeszczepu przez organizm biorcy  . mniejsze nacięcia podczas zabiegu skrócenie czasu operacji brak dolegliwości bólowych dawcy w miejscu pobrania przeszczepu  możliwość stosowania dużych przeszczepów  przydatne w operacjach rewizyjnych   . Wady wydłużony czas operacji przewlekle dolegliwości bólowe w miejscu pobrania przeszczepu  brak możliwości pobrania dużych przeszczepów bez upośledzenia relacji zginacz – prostownik  . dostępność tkanek koszt przeszczepu możliwość przeniesienia choroby z dawcy na biorcę (HIV, WZW)  opóźnione przyjęcie przeszczepu przez organizm biorcy  konieczność sterylizacji (osłabienie wytrzymałość przeszczepu)   . Ścięgna przeznaczone do przeszczepów allogenicznych przechowywane są w bankach tkanek, których tradycja w Polsce sięga roku 1963, kiedy powołano do życia Centralny Bank Tkanek działający przy Akademii Medycznej w Warszawie. Obecnie na terenie kraju, działa ponad 20 banków tkanek i komórek w tym zarówno banki wielospecjalistyczne (Zabrze, Warszawa), banki monospecjalistyczne tkanek miękkich (Kraków i Warszawa – zastawki serca, Lublin i Warszawa – rogówka oka, Bydgoszcz i Siemianowice Śląskie – banki skóry) jak i banki komórek macierzystych (Poznań, Kraków, Szczecin, Warszawa) [12]. Banki te, razem z Krajowym Centrum Bankowania Tkanek i Komórek (jednostką budżetową podległą Ministerstwu Zdrowia) i Centrum Organizacyjno-Koordynacyjnym ds. Transplantacji „Poltransplant”, są zobowiązane do realizacji zadań Narodowego Programu Rozwoju. 2.

(19) Medycyny Transplantacyjnej (NPRMT) na lata 2011 – 2020 [13]. Rocznie, w Polsce, wykorzystywanych jest ok. 11 000 – 12 000 allogenicznych przeszczepów tkankowych, z czego ok. 25% dotyczy tkanek miękkich (pozostałe 75% stanowią przeszczepy kostne). Z tego względu jednym z głównych zadań zdefiniowanych w ramach NPRMT jest przygotowanie do operacji tkanek allogenicznych w postaci przeszczepów biowitalnych lub biostatycznych. Przeszczepy biostatyczne, wykorzystywane np. w rekonstrukcjach ACL, są pozyskiwane od osób zmarłych, a następnie (w przeciwieństwie do przeszczepów biowitalnych) poddawane procesowi sterylizacji radiacyjnej i konserwacji w celu eliminacji komórek żywych znajdujących się w tkance. W konsekwencji, zastosowanie do przeszczepu tkanki nieaktywnej biologicznie, eliminuje potrzebę dopasowania biologicznego między dawcą, a biorcą oraz wymóg stosowania leków immunosupresyjnych po zabiegu [12]. W Polsce, w 2015 roku, liczba procedur przygotowania do przeszczepów ścięgien od dawców zmarłych wyniosła jedynie 19 [13]. Rok później (2016r.) do przeszczepienia przygotowano 20 allogenicznych ścięgien pobranych od osób zmarłych [14]. W zeszłym roku (2018r.) tkanki miękkie przeznaczone do przeszczepów pobrano łącznie od 288 dawców, w tym jedynie od 17 z nich pobrano tkanki mięśniowo – szkieletowe (w tym ścięgna) [15]. Jak wynika z powyższych danych, w ostatnich latach w Polsce, pobieranych i przygotowywanych do przeszczepów allogenicznych jest nie więcej niż 20 sztuk ścięgien rocznie, co stanowi jedynie niewielki odsetek liczby wykonywanych zabiegów, które wymagają ich użycia. W świetle tych danych, wysoce uzasadnioną wydaje się zatem potrzeba, aby wszelkie procedury, którym podlega tkanka od momentu pobrania jej od dawcy do momentu przeszczepienia jej do organizmu biorcy, były ściśle sprecyzowane. Najważniejszym aktem prawnym w Polsce regulującym kwestie związane z transplantacjami, jest Ustawa z dnia 1 lipca 2005r. w sprawie pobierania, przechowywania i przeszczepiania komórek, tkanek i narządów [16]. Ustawa ta, określa jednak w większości kwestie czysto formalne związane m.in.: z działaniem banków tkanek, zasady dopuszczenia osoby żywej lub zmarłej do bycia dawcą czy też wymagania dotyczące identyfikacji ludzkich tkanek i narządów. Dokument ten, w żaden sposób nie uszczegóławia niestety kwestii związanych z protokołami przechowywania przeszczepów, a jedynie podaje iż „bank tkanek i komórek jest zobowiązany […] zapewniać najwyższą jakość tkanek i komórek podczas dystrybucji” oraz “zapewnić, aby wszystkie czynności związane z przechowywaniem tkanek i komórek były przeprowadzane w warunkach kontrolowanych właściwych dla każdej czynności” (art .32). Kolejne, choć również ogólnikowe, zalecenia dotyczące protokołów 3.

(20) przechowywania tkanek, znaleźć można w jednym z rozporządzeń podlegających w/w ustawie tj. Rozporządzeniu Ministra Zdrowia z dnia 9 października 2008 r. w sprawie wymagań, jakie powinien spełniać system zapewnienia jakości w bankach tkanek i komórek [17]. W rozporządzeniu tym można przeczytać m.in. że transport i przechowywanie tkanek powinien odbywać się w temperaturze „zachowującej wymagane ich właściwości i funkcje biologiczne” (§3, pkt.13a), a także, że „warunki i maksymalny czas przetwarzania i przechowywania komórek lub tkanek, z uwzględnieniem możliwości pogorszenia się ich właściwości” (§5, pkt 7a, §6, pkt.1) muszą być zgodne z tzw. Standardowymi Procedurami Operacyjnymi. Te z kolei, jako nadrzędne źródło szczegółowych informacji nt. protokołów pobierania, przechowywania i przetwarzania tkanek, wskazują dwie dyrektywy Komisji Europejskiej (2006/17/WE z dnia 8 lutego 2006 r. oraz 2006/86/WE z dnia 24 października 2006 r.). Najbardziej „precyzyjne” zapisy tych dyrektyw, w zakresie warunków przechowywania tkanek, stanowią jedynie, iż: „Po pobraniu wszystkie pobrane tkanki i komórki muszą być pakowane w sposób minimalizujący ryzyko zakażenia i przechowywane w temperaturze zachowującej. wymagane. właściwości. i. funkcje. biologiczne. komórek/tkanek”. (dyr. 2006/17/WE, zał. IV) [18] oraz, że temperatura jest jednym z „krytycznych parametrów przetwarzania lub przechowywania” (dyr. 2006/86/WE) [19]. Wniosek płynący z analizy aktów prawnych dotyczących zabiegów transplantacji tkanek jest zatem jednoznaczny: w polskim prawie nie istnieją odgórne regulacje dotyczące procedur zamrażania i rozmrażania tkanek przeznaczonych do przeszczepów allogenicznych. W żadnym z przeanalizowanych dokumentów, nie występują słowa tj. „zamrażanie” czy „rozmrażanie”, nie zdefiniowane są dokładne czasy tych procesów, temperatury im odpowiadające, ani graniczna liczba cykli mrożenia/rozmrażania, która nie dopuści do pogorszenia właściwości mechanicznych tkanki w stopniu, dyskwalifikującym ją do celów przeszczepienia. Co więcej, dyrektywa 2006/86/WE podkreśla fakt, że procedury przechowywania i przetwarzania, które „nie mogą sprawiać, że tkanki lub komórki są klinicznie nieskuteczne lub szkodliwe dla biorcy” powinny być nieustannie walidowane, a „walidacja ta może być przeprowadzona w oparciu o badania wykonane przez sam bank tkanek lub dane pochodzące z opublikowanych prac […]”. Przegląd opublikowanych prac (szczegółowo omówiony w rozdz. 2) w żaden sposób nie daje jednak jednoznacznej odpowiedzi na pytanie: jaki jest wpływ wielokrotnego mrożenia i rozmrażania na stabilność właściwości biomechanicznych tkanek przeznaczonych do przeszczepów allogenicznych? Niniejsza praca doktorska podejmuje zatem próbę wypełnienia tej luki, poprzez analizę warunków 4.

(21) przechowywania tkanek kolagenowych pod kątem ich wielokrotnego mrożenia i rozmrażania, a w szczególności wpływu tego procesu na wybrane właściwości biomechaniczne. Badania przeprowadzono na ścięgnie Achillesa, wykorzystując w tym celu zarówno tkanki ludzkie jak i te pochodzenia zwierzęcego, ze szczególnym uwzględnieniem ich wieloskalowej, hierarchicznej budowy. Dodatkowo, z uwagi na specyficzną, trójdzielną budowę ścięgna Achillesa, badania prowadzone w ramach rozprawy zostały rozszerzone o analizę wpływu struktury materiału na właściwości biomechaniczne tego ścięgna – wiedza ta może okazać się kluczowa przy wyborze obszaru ścięgna, z którego pobierane będą przeszczepy, wykorzystywane przy rekonstrukcjach więzadła krzyżowego kolana bądź innych struktur ścięgnistych. Podjęcie tematu niniejszej rozprawy wymagało podejścia interdyscyplinarnego, obejmującego nie tylko niezbędną wiedzę z zakresu medycyny i nauk przyrodniczych (anatomia, fizjologia, biochemia), ale przede wszystkim wiedzę z zakresu inżynierii mechanicznej i materiałowej. Synergiczne połączenie nauk medycznych z technikami i metodami badań inżynierskich, stanowi podstawę badań w dziedzinie biomechaniki tkanek, a fakt ten został podkreślony także w założeniach Narodowego Programu Rozwoju Medycyny Transplantacyjnej na lata 2011 – 2020, gdzie stwierdzono, że „Przyszłość substytucji narządów i tkanek będzie wykorzystywała inżynierię narządową i tkankową” [12]. Autorka pracy jest głęboko przekonana, że w myśl zasady: „narządy przeszczepiamy po to, aby ratować życie, tkanki natomiast, aby poprawiać jego jakość”, podjęcie tematu rozprawy było w pełni uzasadnione, a uzyskane wyniki mogą istotnie przyczynić się do optymalizacji procesów przechowywania tkanek miękkich przeznaczonych do przeszczepów allogenicznych.. 5.

(22) 2. Biomechanika ścięgna Achillesa 2.1.. Ścięgno Achillesa – struktura, kompozycja chemiczna, nomenklatura poziomów. hierarchii Ścięgno Achillesa jest przykładem tkanki miękkiej tj. tkanki, która łączy, wspiera bądź ochrania działanie organów i innych struktur naszego ciała. W przeciwieństwie do tkanek twardych (zmineralizowanych), ścięgna cechują się wysoką elastycznością, zapewniającą optymalne połączenie struktur mięśniowych i kostnych, a tym samym przeniesienie powstających podczas ruchu sił na układ szkieletowy. Ścięgno jest wieloskalową strukturą hierarchiczną, której budowa rozpoczyna się w skali atomowej od pojedynczych cząsteczek kolagenu. Te, połączone ze sobą trójkami, tworzą tzw. helisy tropokolagenowe, czyli sploty śrubowe o długości 260-300nm, skoku 0,3 i średnicy 1,5nm. Za pomocą wiązań kowalencyjnych, pojedyncze helisy tropokolagenu agregują się tworząc mikrofibryle – ściśle sprecyzowane pod względem geometrycznym struktury, w których każda z pięciu równolegle ułożonych względem siebie helis jest przesunięta względem poprzedniej i następnej o charakterystyczny odstęp 67nm [20]. Powstała w ten sposób „zakładka” (w literaturze znana również jako okres prążkowania, D-band) tworzy widoczne na zdjęciach mikroskopowych mikrofibryli, widoczne prążki.. Rys. 1. Strukturalna budowa fibryli kolagenowych. Opr. własne na podstawie: [21].. 6.

(23) Mikrofibryle, poprzez wiązania krzyżowe tworzące mostki interfibrylarne, łączą się ze sobą tworząc kolejno wyższe struktury – fibryle, których średnica wynosi 50 – 500 nm. Fibryle, grupują się następnie ze sobą tworząc włókna (10 – 50 μm średnicy), które otoczone macierzą międzywłókienkową tworzą widoczne już gołym okiem pęczki (średnica 50 – 400 μm). Pęczki, połączone macierzą międzypęczkową, tworzą makroskopową jednostkę (całe ścięgno) o średnicy kilkunastu milimetrów (Rys. 2).. Rys. 2. Hierarchiczna budowa ścięgna Achillesa. Opr. własne na podst: [22].. Interesującym, choć stosunkowo niedawno usystematyzowanym w literaturze, pojęciem w kontekście budowy ścięgna, są tzw. pęczki główne [22]. Struktury te występują w przypadku ścięgien wielomięśniowych tj. ścięgien, pochodzących od kilku mięśni lub więcej niż jednej głowy tego samego mięśnia np. ścięgno Achillesa lub ścięgno mięśnia czworogłowego. W przypadku ścięgna Achillesa, które jest przedmiotem badań niniejszej rozprawy, wyróżnić można trzy pęczki główne – pęczek pochodzący od mięśnia płaszczkowatego łydki (soleus muscle, SOL) oraz dwa pęczki pochodzące kolejno od głowy przyśrodkowej (gastrocnemius muscle/medial head,. GM) i bocznej (gastrocnemius. muscle/lateral head, GL) mięśnia brzuchatego łydki (Rys. 3). Pomimo, iż pęczki główne są ściśle ze sobą związane i makroskopowo tworzą jedną spójną jednostkę, pod względem morfologicznym są rozróżnialne w sposób, który pozwala na dokonanie ich dysekcji [23], [24].. 7.

(24) Istnieją. także. badania. wielomięśniowych. dowodzące,. umożliwia. że. wzajemny,. „podzielny”. układ. niezależny. ruch. strukturalny pęczków. ścięgien głównych. przy jednoczesnym zachowaniu integralności ruchu całej jednostki ścięgna [25], [26].. Rys. 3. Ścięgno Achillesa z podziałem na pęczki główne pochodzące od mięśnia płaszczkowatego łydki (SOL), głowy przyśrodkowej (GM) i bocznej (GL) mięśnia brzuchatego łydki. Z punktu widzenia mechaniki materiałów, ścięgno Achillesa może być traktowane jako dwufazowy materiał kompozytowy wzmacniany włóknami długimi. Pierwszą z faz stanowi kolagen, którego koncentracja w ścięgnie Achillesa wynosi ok. 868,2 ± 10,2 mg na gram suchej masy tkanki (Tab. 2). Drugą fazę stanowi macierz pozakomórkowa (ECM, z ang. extracellular matrix). W macierzy wyróżnić można składniki o stałym stanie skupienia, które stanowią 30% składu macierzy oraz wodę, która stanowi 70% fazy pozakomórkowej [27].. 8.

(25) Tab. 2. Ilościowe zestawienie zawartości kolagenu i GP w ścięgnie Achillesa oraz innych przykładowych ścięgnach i więzadłach. Opr. na podstawie [28]. ścięgno Achillesa. ścięgno rzepkowe. więzadło poboczne piszczelowe. więzadło krzyżowe przednie/ tylne. 868,2 ± 10,2. 867,2 ± 8,9. 797,1 ± 11,1. 802,6 ± 9,8. % kolagen typu I. > 95. > 95. 91 ± 2. 88 ± 2. % kolagen typu III. <5. <5. 9±2. 12 ± 2. koncentracja DNA. 1,74 ± 0,04. 1,40 ± 0,05. 2,56 ± 0,06. 2,73 ± 0,05. 2,75 ± 0,20. 3,92 ± 016. 4,56 ± 0,26. 9,89 ± 0,56. 0,15 ± 0,04. 0,16 ± 0,06. 1,86 ± 0,17. 2,77 ± 0,73. 1,32 ± 0,06. 1,47 ± 0,213. 3,17 ± 0,37. 4,64 ± 0,73. całkowita zawartość kolagenu (mg/g suchej masy tkanki). (mg DNA/mg suchej masy tkanki). koncentracja GAGów (mg heksozaminy/mg suchej masy tkanki). wiązania krzyżowe typu I (DHLNL / HLNL)*. wiązania krzyżowe typu II (DHLNL + HLNL / HHMD)*. * DHLNL – dihydroksylysinonorleucyna, HLNL – hydroksylysinonorleucyna, HHMD – histydinohydroksymerodesmozyna.. Wśród składników fazy stałej macierzy (Rys. 4), wyróżnić można składniki kolagenowe oraz glikoproteinowe (GP), czyli związki zbudowane z długiego rdzenia białkowego połączonego kowalencyjnie z łańcuchami węglowodanowymi GAG (glikozoaminoglikany).. Rys. 4. Podział składników fazy stałej macierzy pozakomórkowej ścięgna.. 9.

(26) Zdecydowaną większość glikoprotein występujących w macierzy ścięgna stanowią proteoglikany (PG), czyli glikoproteiny, w których zawartość węglowodanowych GAGów w stosunku do rdzenia białkowego przekracza 80 – 90%. Do PG występujących w macierzy pozakomórkowej ścięgna zaliczamy [29]: I.. Agrekan – białko, którego działanie jest silnie zróżnicowane w zależności od typu, obszaru i poziomu hierarchii ścięgna, w którego macierzy się znajduje. Akumulacje agrekanu rozciąganych obszarach w ścięgien wielopęczkowych (np. w ścięgna Achillesa) skutkują wzrostem modułu sprężystości i osłabieniem miejsc przyczepów kostnych ścięgna, nie wpływając jednocześnie na zdolność do relaksacji naprężeń czy zmianę średnicy ścięgna. Przeciwnie, w ścięgnach jednopęczkowych, wzrost koncentracji agrekanu powoduje wzrost przekroju poprzecznego ścięgna, spadek sztywności, modułu sprężystości i wytrzymałości tkanki [30]. Zwiększone koncentracje agrekanu znajdują się w także w miejscu insercji ścięgna Achillesa do kości piętowej [31]. Proteolitycznie zdegradowany agrekan został również zidentyfikowany w obszarach naprężeń rozciągających w ścięgnach osobników dorosłych [32].. II.. Wersikan. –. białko. okołokomórkowych. osiągające. macierzy. najwyższą. [33].. Wersikan. koncentrację w. w. ścięgnach. okolicach uczestniczy. w połączeniach mikrofibryli z innymi PG, dobrze łączy się także z elastyną [34]. Wersikan ma duży potencjał pęcznienia – energicznie wiąże i oddaje wodę, co potencjalnie czyni go istotnym PG z punktu widzenia mrożenia i rozmrażania tkanek. Jest także kluczowym białkiem w stanach zapalnych – reguluje interakcje pomiędzy leukocytami, a chemokinami.. III.. Grupę SLRP (ang. small leucine-rich proteoglicans) czyli tzw. małe proteoglikany zasobne w leucynę, stanowiące 80% PG macierzy ścięgna. Do białek SLRP zaliczamy:  dekorynę – w ścięgnach rozwijających się odpowiedzialna jest za prawidłowe ułożenie i wyrównanie fibryli kolagenowych w czasie fibrilogenezy. Dekoryna nazywana jest także inhibitorem bocznego wzrostu fibryli, ponieważ jej wysoka koncentracja w macierzy skutkuje tworzeniem się fibryli o mniejszych średnicach. 10.

(27) Brak dekoryny skutkuje natomiast wysoce nieuporządkowaną strukturą kolagenu. W ścięgnach dojrzałych dekoryna pomaga w przenoszeniu odkształceń pomiędzy nieciągłymi fibrylami poprzez mostki interfibrylarne [35],  biglikan – białko wykrywalne głównie w rozwijających się ścięgnach o działaniu zbliżonym, choć słabszym, do dekoryny (odpowiada za uporządkowanie struktury kolagenu) [36]. Istnieją badania potwierdzające, że w warunkach niedoboru dekoryny zachodzi zwiększona synteza biglikanu [37], co prowadzi do nieudowodnionej do dziś hipotezy badawczej, że PG o podobnych funkcjach mogą wzajemnie kompensować swój brak i swoje działanie,  lumikan i fibromodulinę – proteoglikany oddziałujące z fibrylarnym kolagenem, wykrywalne w macierzy rozwijających się ścięgnach. Oba białka są inhibitorami fuzji interfibrylarnych, a ich brak w macierzy skutkuje fibrylami o większej i nieregularnej średnicy (choć działanie to jest zdecydowanie słabsze niż w przypadku biglikanu i dekoryny) [38]. Poza proteoglikanami, w macierzy znajdują się także białka odpowiadające za elastyczność włókien tj. elaunina i oksytalan, a w szczególności także elastyna, której zawartość wynosi do 2% fazy stałej macierzy. Elastyna jest proteiną, o wysokich właściwościach sprężystych, która zdolna jest do ponad 2-krotnego wydłużenia swojej długości i powrotu do oryginalnego kształtu bez zjawiska histerezy. Elastyna wykazuje zatem wysoką odporność zmęczeniową i zdolność do magazynowania energii odkształcenia [39]. Cząsteczki elastyny usytuowane są zwykle pomiędzy pęczkami lub otaczają je cienką warstwą [40], [41]. Do istotnych GP, z punktu widzenia mechaniki macierzy i ścięgna, zaliczamy także lubrycynę i białko TNC (Tenascyna C). Lubrycyna jest białkiem obecnym we obszarach tkanki łącznej wymagających smarowania (np. w płynie stawowym). W ścięgnach zlokalizowana jest bliżej powierzchni, zmniejsza opór wzajemnego ślizgania się między ścięgnami lub między ścięgnami, a stawami [42], [43]. Wyższa koncentracja lubrycyny znajduje się w ściskanych obszarach ścięgien. Białko TNC jest z kolei składnikiem, wykrywalnych głównie w ścięgnach chorych i regenerujących się. Udowodniono, że TNC wspomaga zachowania sprężyste w tkankach poddanych dużym obciążeniom rozciągającym, a samo obciążenie mechaniczne tkanki jest w stanie regulować występowanie tego białka [44], [45].. 11.

(28) Zachowanie mechaniczne ścięgna silne zależy zatem zarówno od jego struktury jak i koncentracji wszystkich jego składników tj. kolagenu, elastyny oraz silnie uwodnionej macierzy proteoglikanowej. Kompozycja macierzy podlega jednak nieustannym zmianom wraz z wiekiem osobnika skutkując odmienną kompozycją i funkcją białek w ścięgnach rozwijających się, względem ścięgien dojrzałych.. Zawartość PG w macierzy jest także. zróżnicowana w zależności od poziomu hierarchii ścięgna – inna będzie zatem jej charakterystyka na poziomie międzyfibrylarnym, od tej na poziomie międzypęczkowym [29]. W końcu, skład macierzy będzie różnił się i będzie ulegał dynamicznym zmianom w przypadku ścięgien chorych, uszkodzonych lub w których obserwowany jest stan zapalny. Jednocześnie istnieje szereg publikacji dowodzących, że PG mogą regulować zachowania sprężyste, lepkosprężyste ścięgien, a także zmiany w ich wytrzymałości zmęczeniowej [46]–[51]. Biorąc pod uwagę powyższe argumenty (zmienność kompozycji macierzy oraz jej kluczowy wpływ na mechanikę ścięgna), niezwykle istotnym jest, aby wybór tkanek przeznaczonych do badań mechanicznych prowadzony był w sposób przemyślany i rzetelny. W przypadku badań na tkankach ludzkich należy upewnić się czy pozbawione są makroskopowo widocznych uszkodzeń ciągłości struktury, a także dysponować wywiadem nt. świeżych urazów, wad wrodzonych, chorób chronicznych czy przeprowadzonych interwencji chirurgicznych u dawcy. Korzystnym dla późniejszej interpretacji wyników, jest też możliwie jak największe ujednolicenie grupy badawczej pod względem płci i wieku. W przypadku badań na tkankach pochodzenia zwierzęcego, większość z powyższych trudności jest automatycznie rozwiązana poprzez użycie do badania tkanek pochodzących z jednej hodowli, zapewniającej identyczne warunki rozwoju osobników oraz ich zbliżony wiek.. 2.2.. Właściwości mechaniczne ścięgna Achillesa. Tkanki kolagenowe, ze względu preferowane podłużne ułożenie włókien kolagenowych, wykazują silną anizotropię właściwości mechanicznych. Testy rozciągania tkanek są zatem zwykle wykonywane jednoosiowo, zgodnie z kierunkiem ułożenia włókien, która stanowi główną oś obciążenia tkanki w warunkach in vivo. Odpowiedź tkanek miękkich, a w szczególności ścięgien, na rozciąganie jest silnie podyktowana ich wewnętrzną budową – zwłaszcza ułożeniem struktury na poziomie mikrofibrylarnym, fibrylarnym i pęczkowym.. 12.

(29) Typowa krzywa naprężenie – odkształcenie rejestrowana w czasie testu jednoosiowego rozciągania jest przedstawiona na Rys. 5 [20].. Rys. 5. Krzywa naprężenie – odkształcenie dla ścięgna Achillesa rozciąganego wzdłuż osi włókien.. Istnieją trzy rozróżnialne przedziały odkształceń, dzielące krzywą naprężenie – odkształcenie na następujące zakresy [52]: I.. Zakres małych nieliniowych odkształceń sprężystych (z ang. toe region) – obszar reprezentujący a. początkową,. odkształceniem,. nieliniową. odpowiadający za. relację. pomiędzy. rozprostowanie. naprężeniem,. pofałdowanych. fibryli. kolagenowych. Z uwagi na fakt, że naciągnięcie fibryli wymaga znacznie mniejszych sił niż właściwe rozciąganie włókien, sztywność charakteryzująca ten odcinek krzywej jest znacznie niższa niż w zakresie odkształceń liniowych.. Zakres odkształceń. nieliniowych kończy się po osiągnięciu ok. 2% odkształceń tkanki (choć w zależności od ścięgna może być przesunięty) w momencie, gdy wszystkie fibryle są w całości rozprostowane i może rozpocząć się właściwy proces rozciągania włókien [27]. II.. Zakres liniowych odkształceń sprężystych (z ang. linear region) – obszar zaczynający się powyżej 2% odkształcenia tkanki, reprezentujący postępującą sprężystą deformację włókna wzdłuż jego osi na skutek międzycząsteczkowego ślizgania się względem siebie. 13.

(30) potrójnych helis kolagenowych. Jeśli nie zostanie przekroczona górna granica fizjologicznego zakresu odkształceń (przyjęta powszechnie jest wartość 4% choć niektóre badania sugerują, że dla ścięgna Achillesa granica ta może sięgać 6%, a nawet 8% [53]), zachowanie tkanki w tym obszarze uznawane jest za sprężyste, a po usunięciu obciążenia powraca ona do początkowego kształtu. Krzywa naprężenie – odkształcenie w tym zakresie jest linią prostą, na podstawie której obliczyć można moduł sprężystości materiału czy sztywność testowanej próbki. Powyżej wartości 4% mogą wystąpić uszkodzenia pojedynczych fibryli, które zaczynają się kumulować na poziomie ok. 6% odkształceń. Wraz z dalszym wzrostem odkształceń dochodzi do lokalnych zerwań wiązań krzyżowych pomiędzy poszczególnymi włókienkami, w wyniku czego globalnie spada sztywność tkanki, która zaczyna wchodzić w zakres nieodwracalnych odkształceń plastycznych. III.. Zakres odkształceń plastycznych i zniszczenia materiału (z ang. yield and failure. region) – obszar reprezentujący zachowanie ścięgna od momentu powstania pierwszych mikrouszkodzeń włókien, które propagując powodują nieodwracalne odkształcenia plastyczne tkanki. Relacja naprężenie – odkształcenie w tym zakresie ponownie przybiera charakter nieliniowy, a dalsze rozciąganie tkanki na poziomie 8 – 10% odkształcenia. powoduje. przekroczenie. granicy. wytrzymałości. materiału. i makroskopowe przerwanie jego ciągłości (zniszczenie) [54]. Odkształcenia powyżej 10%, znacznie wykraczają poza fizjologiczny zakres działania ścięgna i mogą pojawić się w jedynie przypadkach np. ostrego urazu sportowego (zerwania) [55] . Właściwości mechaniczne ścięgna Achillesa (Tab. 3), badane były dotychczas zarówno w eksperymentach in vivo (bezinwazyjnie na organizmach żywych) jak i ex vivo (pozaustrojowo, z wykorzystaniem tkanek od dawców) [56]. Badania in vivo obejmowały najczęściej medyczne techniki obrazowania tj. ultrasonografia, elastografia fal poprzecznych czy rezonans magnetyczny [57]–[60]. Badania ex vivo wykorzystywały inżynierskie metody testowania wytrzymałości materiałów tj. testy rozciągania jednoosiowego, wieloosiowego czy testy z wykorzystaniem obciążeń cyklicznych [27], [61], [62]. Średnia sztywność ludzkiego ścięgna Achillesa, obliczona jako nachylenie krzywej siła – przemieszczanie, raportowana jest pomiędzy 180,2 ± 42,5 N/mm [63], a 2622 ± 534 N/mm [64]. Średni moduł sprężystości waha się od 51,5 ± 25,1 kPa (moduły rzędu kPa uzyskiwane są zwykle w badaniach in vivo) zwykle do wartości około 750 – 910 MPa [52], [65], [66], [67], [68]. Istnieją także publikacje, gdzie zgłoszono moduł sprężystości rzędu GPa [64]. 14.

(31) Tab. 3. Przegląd opublikowanych prac w zakresie modułu sprężystości i sztywności ludzkiego ścięgna Achillesa. wiek [lata] (średnia ± SD). sztywność [N/mm] (średnia ± SD). moduł sprężystości [MPa] (średnia ± SD). rodzaj badania. metoda. ref. publikacja. rok. liczba ścięgien. Lewis G et al.. 1997. 29. 38,4 ± 18,7. 685 ± 262. 375 ± 102. ex vivo. TM. [70]. Wren et al.. 2001. 22. 56.8 ± 13.3. bd. 816* ± 218 (1%s-1) 822* ± 211 (10% s-1). ex vivo. TM. [52]. Louis-Ugbo et al.. 2004. 20. 80 ± 10.5. bd. 559,2 ± 250,8. ex vivo. TM. [69]. Lichtwark et al.. 2005. 10. 30,9 ± 8,2. 188 ± 43,2. 870 ± 200. in vivo. USG/SWE. [65]. Arampatzis et al.. 2007. 10. 28.6 ± 4.5. 180,2 ± 42,5. bd. in vivo. USG/SWE/MRI. [63]. Shin et al.. 2008. 5. 24.2 ± 5.4. bd. 140,5 ± 29,3. in vivo. USG/SWE/MRI. [59]. Maganaris et al.. 2008. nd. nd.. nd. 300 - 2000. in vivo ex vivo. USG/SWE/TM. [56]. Arda et al.. 2011. 127. 37.72 ± 9.11. bd. 51,5 ± 25,1 kPa. in vivo. USG/SWE. [57]. Kongsgaard et al.. 2011. 10. 30,6 ± 6,1. 2622 ± 534 2497 ± 584. 2000 ± 400 1900 ± 500. in vivo. USG/SWE. [64]. Waugh et al.. 2011. 19. 27.0 ± 2.0 (M) 24.8 ± 3.2 (K). bd. 871,5 ± 162,4 755,8 ± 226,7. in vivo. USG/SWE. [66]. Peltonen J et al.. 2012. 12. 37 ± 13. 197 ± 62. 780 ± 330. in vivo. USG/SWE. [67]. Kurihara et al.. 2012. 7. 21,6 ± 1,8. 221 ± 111 (P) 184 ± 78 (L). 910 ± 420 (P) 840 ± 320 (L). in vivo. USG/SWE. [68]. Chen et al.. 2013. 36. bd. bd. 291,91 ± 4,38 kPa. in vivo. USG/SWE. [58]. Obuchowicz et al.. 2019. 6. 64.2 ± 11.2. bd. 264,78* ± 55,11. ex vivo. TM/SWE. [51]. (art. przeglądowy). TM – testy mechaniczne, USG/SWE – ultrasonografia/elastografia fali poprzecznej, MRI – rezonans magnetyczny, P/L – prawa/lewa kończyna, M/K – mężczyzna/kobieta, (*)- ścięgna typu fresh-frozen, bd – brak danych, nd – nie dotyczy. 15.

(32) Wartość modułu jest zależna od wyboru do obliczeń zakresu krzywej naprężenie – odkształcenie (także wewnątrz obszaru liniowego [66]), natomiast nie on zależy od wyboru kończyny (prawa/lewa) [68]. Wykazano także, że korelacja Spearmana pomiędzy sztywnością i modułem sprężystości ścięgna Achillesa jest pozytywna i silna, zarówno w przypadku badania ścięgien z kończymy lewej, kończyny prawej jak i obu kończyn razem [69]. W praktyce oznacza to, że im niższa sztywność tkanki, tym niższy jest także obliczany dla niej moduł sprężystości. Graniczna wartość naprężenia, określana w testach zniszczeniowych ex vivo, znajduje się w zakresie pomiędzy 50 – 100 MPa [52], [70], [71]. Graniczne odkształcenie w momencie zniszczenia ścięgna Achillesa wynosi 10 – 22% [52], [70], [71], natomiast maksymalne odkształcenie zarejestrowane podczas dynamicznego obciążania ścięgna w testach in vivo wynosi około. 8.3%. [65].. Znaczny. rozrzut. wszystkich. badanych. dotychczas. właściwości. biomechanicznych ścięgna Achillesa może wynikać ze zróżnicowanego wieku badanych tkanek – badania prowadzone były bowiem dla grup stosunkowo młodych 21,6 ± 1,8 lat [68], w wieku średnim 37 ± 13 lat [67] a także ścięgien dojrzałych 80 ± 10.5 [69]. Ścięgno Achillesa, jako przykład kolagenowej tkanki miękkiej, wykazuje również właściwości lepkosprężyste – podlega zjawisku relaksacji naprężeń i pełzaniu, które silnie wynikają z kompozycji chemicznej (obecności proteoglikanów) w macierzy pozakomórkowej ścięgna opisanej szczegółowo w rozdz. 2.1. Dodatkowo, uzyskiwane wartości modułu sprężystości i sztywności tkanki, jako materiału lepkosprężystego, zależą od zadanej prędkości jej odkształcenia [52], [70]. Właściwości lepkosprężyste tkanek przejawiają się także pojawieniem się pętli histerezy mechanicznej – tj. różnicy pomiędzy ścieżką krzywej naprężenie – odkształcenie rejestrowanej podczas obciążania względem odciążania próbki. Pole powierzchni powstałej pętli histerezy reprezentuje ilość energii rozproszonej utraconej w cyklu obciążania – odciążania ścięgna i zwykle wyrażana jest jako procent całkowitej pracy wykonanej nad tkanką w czasie jej rozciągania. Wartość histerezy dla ścięgna Achillesa była dotychczas zgłaszana jedynie w publikacjach dot. ultrasonograficznych badań in vivo – jej średnia wartość wynosiła 11 – 19 % [56], a w przypadku badań z dynamicznie zmiennym obciążeniem (skoki na jednej nodze) wartość ta dochodziła nawet do 26% [65]. Wartość histerezy w testach ex vivo rejestrowana była tylko dla zwierzęcych ścięgien Achillesa, a jej wartość zależy od wieku osobników – dla tkanek młodych wynosi ok. 25%, dla tkanek dojrzałych wartość ta spada nawet do 9% [72].. 16.

(33) Mnogość technik stosowanych do badań biomechaniki ścięgna Achillesa oraz wynikająca z nich różnorodność analizowanych parametrów, implikuje jednak istotne trudności we wzajemnym porównaniu wyników dotychczas opublikowanych badań. W ujęciu ogólnym, analizowane w badaniach parametry biomechaniczne ścięgna, charakteryzują jego wytrzymałość oraz relację pomiędzy naprężeniem, a odkształceniem w testowanych próbkach. W zależności od wykonywanych testów i uzyskanych danych, właściwości mechaniczne ludzkiego ścięgna Achillesa były w szczególności opisywane poprzez jego: sztywność, moduł styczny, moduł sprężystości, maksymalnie uzyskiwane siły i wydłużenia, wartości histerezy mechanicznej, a także graniczne odkształcenia i naprężenia w momencie zniszczenia tkanki. Niestety, w wielu publikacjach, dyskusje uzyskanych wyników prowadzone są w sposób mylący dla czytelnika. Istotnym błędem jest bowiem porównywanie uzyskanych wartości modułów sprężystości tkanek, z wartościami ich sztywności. Moduł sprężystości materiału nie jest jednak tym samym, co sztywność próbki, która jest wykonana z tego materiału. Moduł sprężystości jest własnością samego materiału, czyli jest wielkością intensywną (niezależną od wielkości i kształtu próbki). Sztywność jest natomiast parametrem charakteryzującym daną strukturę – jest zatem wielkością ekstensywną, na wartość której oprócz samego materiału mają wpływ także kształt i wielkość próbki. Bezpośrednie porównanie wyników publikacji raportujących moduły sprężystości tkanki z wynikami innych publikacji badających sztywność próbek jest zatem podejściem niewłaściwym. Zdecydowanie bardziej uzasadnione wydaje się porównanie kierunku zmian tych parametrów na skutek procesu wielokrotnego M/R tkanki, które powinno być zbieżne w obu przypadkach, zwłaszcza w przypadku badań na próbkach reprezentujących ten sam poziom hierarchii w strukturze ścięgna. Kolejną trudnością w analizie dotychczas opublikowanych wyników badań jest użycie określenia „moduł Younga”, w odniesieniu do relacji pomiędzy naprężeniem, a odkształceniem pojawiającym się podczas testów rozciągania tkanki. Określenie „moduł Younga”, który w istocie jest jednym (lecz nie jedynym) z modułów sprężystości jaki może charakteryzować materiał, zarezerwowane jest w mechanice dla materiałów liniowo sprężystych. Ścięgna, jako przykład tkanki miękkiej, wykazują zachowanie liniowo – sprężyste, ale tylko w określonym zakresie odkształceń. Zakres ten (jak opisano na początku rozdziału) rozpoczyna się powyżej 2% odkształceń i dotyczy zachowania ścięgna od momentu „rozprostowania” pofałdowanych fibryli. 17.