Wpływ wielokrotnego M/R na średnicę fibryli kolagenowych

W celu ustalenia zależności między wymiarami włókien a liczbą cykli porównano ze sobą trzy grupy: grupę kontrolną oraz grupy próbek po 8 i 12 cyklach M/R. Przeprowadzona analiza korelacji r Pearsona potwierdziła silną i ujemną zależność pomiędzy ilością cykli M/R, a wartościami pomiarów – wraz ze wzrostem liczby cykli średnica fibryli maleje (r = -0,560;

p < 0,001). Test Levene’a wykazał homogeniczność wariancji (p = 0,055). Przeprowadzona

136

p < 0,001. Analiza post hoc testem Sidaka wykazała istotne statystycznie różnice między

wszystkimi grupami (p < 0,001). Wartości pomiarowe (średnice fibryli kolagenowych) dla grupy kontrolnej były znacząco wyższe niż dla grupy poddanej 8 i 12 cyklom M/R, natomiast dla grupy z 8 cyklami M/R – wyższe niż w przypadku 12 cykli. Wyniki analiz przedstawiono na Rys. 47.

Rys. 47. Spadek wartości średnicy fibryli kolagenowych analizowanych grupach, (***) p < 0,001.

Aby zbadać zmiany w zakresie i rozproszeniu wartości średnic fibryli ścięgien z każdej grupy, obliczono tzw. wskaźnik IQR, czyli rozstęp ćwiartkowy. Wskaźnik ten opisuje obszar pomiędzy trzecim a pierwszym kwartylem, w którym mieści się 50% obserwacji dla każdej z badanych grup, a więc stanowi miarę rozproszenia danych. Statystyki opisowe (Tab. 26) wskazują, że wskaźnik IQR dla każdej badanych grup znajduje się w pomiędzy 37,28 – 39,57nm co stanowi ok. 20 – 23% szerokości rozkładu danych. Ponad połowa zmierzonych wartości średnic dla każdej z grup jest zatem położona centralnie w rozkładzie pomiarów, a rozrzut wartości jest bardzo zbliżony dla każdej z grup. Fakt ten zaobserwować można również na histogramach pomiarów średnic fibryli kolagenowych Rys. 48, które wyraźnie wskazują na zbliżonych kształt rozkładu pomiędzy grupami oraz jego przesunięcie w stronę niższych wartości wraz ze wzrostem liczby cykli M/R.

0 8 12 0 50 100 150 200 250 Średn ic a włókienek (nm) Liczba cykli M/R *** *** ***

137

Rys. 48. Histogramy dla średnicy fibryli kolagenowych pokazujące przesunięcie rozkładu normalnego w stronę niższych wartości wraz ze wzrostem liczby cykli M/R.

Opublikowane dotychczas prace nt. zmian w mikroskopowej budowie ścięgna na skutek M/R, nie dają jednoznacznej odpowiedzi na pytanie: czy i w którym kierunku zachodzą zmiany średnicy fibryli kolagenowych na skutek wielokrotnego mrożenia i rozmrażania tkanki. Część wyników pozostaje w opozycji do wyników Autorki, które wskazują na istotne statystycznie zmniejszenie średnicy fibryli po 8 i 12 cyklach M/R w porównaniu do średnicy fibryli ze ścięgien

50 100 150 200 250 300 0 15 30 45 60 Grupa I (0 cykli M/R) cz ęs tość [-] 50 100 150 200 250 300 0 15 30 45 60 Grupa II (8 cykli M/R) 50 100 150 200 250 300 0 15 30 45 60 Grupa III (12 cykli M/R) średnica fibryli [nm]

138

z grupy kontrolnej. Jednym z takich badań jest praca opublikowana przez Giannini et al. nad jednokrotnym mrożeniem ludzkiego ścięgna piszczelowego tylnego [100]. Jest to jedyny znaleziony w literaturze przykład dowodzący istotnie statystycznego wzrostu średnic fibryli z wartości 47nm (dla grupy niemrożonej) do 77nm (dla ścięgien mrożonych 1-krotnie), przy jednoczesnej obserwacji wzrostu sztywności tkanki i brak zmian w module sprężystości (obserwacja również sprzeczna do wyników Autorki z rozdz. 4 i 6). Wątpliwości budzi jednak zastosowany w badaniu Giannini et al. protokół rozmrażania, który obejmował szybkie rozmrażanie tkanek w podwyższonej temperaturze 37°C. Jak udowodnił Oswald et al. [73] temperatura rozmrażania może istotnie wpływać na właściwości mechanicznie tkanki, a te z kolei mogą wynikać ze struktury mikroskopowej tkanki. Ciężko zatem jednoznacznie stwierdzić czy obserwowany przez Giannini et al. wzrost średnicy fibryli miał związek z temperaturą protokołu rozmrażania (znacznie wyższą niż w badaniach Autorki) czy faktycznym wpływem pojedynczego cyklu M/R.

Kolejne publikacje autorstwa Chen et al. [102] oraz Park et al. [158] również sugerują wzrost średnic fibryli podczas mrożenia choć w obu publikacjach brak jest liczbowych dowodów potwierdzających tą obserwację. Chen et al., badający wielokrotne M/R na przykładzie króliczych ścięgien Achillesa, stwierdził jedynie, że fibryle ścięgien mrożonych 10 razy w porównaniu do tych mrożonych 1 raz „wydają się być powiększone i oddzielone od siebie szerszymi przestrzeniami międzyfibrylarnym, a procent fibryli o mniejszych średnicach jest niższy”. W artykule nie podano jednak żadnych wartości liczbowych opisujących kierunek czy istotność statystyczną tych zmian. Jednocześnie po 10 cyklach M/R, Chen et al. nie zanotował istotnie statystycznego spadku sztywności ani modułu sprężystości tkanek wielokrotnie mrożonych, co stanowi obserwację sprzeczną do wyników Autorki, Huang et al. [101] oraz innych prac opisywanych w rozdz. 2.3. i 4.2.1. Niewielkie przesunięcie wartości średnic fibryli w stronę wyższych wartości dla szczurzych ścięgien rzepkowych poddanych krioprezerwacji (mrożeniu w ciekłym azocie) zostało opisane także przez Park et al. [158]. Wykonane przez autorów pracy obrazowanie z użyciem mikroskopu TEM wykazało jednocześnie brak istotnie statystycznych różnic w procencie powierzchni przekroju zajmowanej przez fibryle w tkance świeżej w porównaniu do tkanki poddanej krioprezerwacji przy równocześnie zanotowanym, choć nieistotnie statystycznym, spadku modułu sprężystości o 10,5%.

139

Kolejne dwie prace, autorstwa Chang et al. [60] oraz Quirk et al. [104], badające zmiany zachodzące w ścięgnie Achillesa na skutek 5 cykli M/R stwierdziły brak wpływu tego procesu na wielkość średnicy fibryli kolagenowych. Quirk et al., obrazujący ścięgna szczurze z wykorzystaniem mikroskopu elektronowego, stwierdził, że fibryle kolagenowe we wszystkich testowanych przez niego grupach były „porównywalnej wielkości” choć wielokrotne M/R spowodowało zmiany w ich przestrzennym rozmieszczeniu. Chang et al., który dowiódł braku istotnych zmian czasów relaksacji T2 i T2* w obrazowaniu MRI ludzkich ścięgien Achillesa, stwierdził, że brak zmian pomiędzy testowanymi przez niego parametrami świadczy o niezmiennej zawartości wody oraz braku zmian orientacji struktur kolagenu wraz z kolejnymi cyklami M/R.

Badania Autorki pozostają w zgodzie z obserwacjami opublikowanymi przez Gelber et al. [159], który dowiódł istotnie statystycznego spadku w średnicy fibryli kolagenowych w mrożonych jednokrotnie alloprzeszczepach łąkotek. Istotny spadek średnic fibryli został zanotowany w pomiarach na podstawie zarówno poprzecznych jak i wzdłużnych przekrojów tkanki, a ich wartość wyniosła odpowiednio 22,4% i 17.5%. Obserwacja przez Autorkę malejących średnic fibryli wraz ze wzrostem liczby cykli M/R, a także odmienność kierunku tych zmian w porównaniu do opisanych powyżej publikacji, wyjaśniona może być na podstawie artykułu Tsuchida et al. [160]. Autorzy tej pracy, badając wpływ długości mrożenia na królicze ścięgno rzepkowe, stwierdzili, że po trzech tygodniach mrożenia struktura kolagenu w ścięgnie jest zbliżona do struktury tkanki niemrożonej, choć obserwowane są proliferacje fibryli o małych średnicach i zwiększenie luk międzyfibrylarnych (co zgodne jest z obserwacjami Giannini et al., Chen et al. i Quirk et al.). Po kolejnych 3 tygodniach mrożenia (tj. 6 tygodni mrożenia w porównaniu do grupy niemrożonej kontrolnej) następuje jednak kolejne przesunięcie rozkładu mierzonych średnic fibryli – tym razem w stronę wartości niższych (co z kolei obserwowane jest w badaniach Autorki oraz Gelber et al. [159]). Przesunięcie się rozkładu mierzonych wartości średnic fibryli wraz z czasem trwania mrożenia, tłumaczone jest przez Tsuchida et al. zjawiskiem rozdzielania pęczków włókienek na mniejsze jednostki na skutek formowania się kryształów lodu. Proces wielokrotnego M/R tkanki, a zatem wielokrotnego formowania się kryształów, wyjaśnia zwiększenie procentowego odsetku fibryli o mniejszych średnicach, ale tylko w przypadku, kiedy łączny czas mrożenia będzie wystarczający na zajście zjawiska separacji struktur kolagenowych

140

na najniższych poziomach hierarchii ścięgna. Zjawisko to uzasadnia zatem rozbieżność wyników zgłaszanych w literaturze przez różne grupy badawcze, a jego dokładny opis stanowi ciekawe zagadnienie warte pogłębienia w przyszłości.

Rys. 49. Wygląd granicy międzywłókienkowej w powiększeniu 30 000 x. Po lewej: ścięgno z grupy kontrolnej (I – AT1). Po prawej: ścięgno po 12 cyklach M/R (III – AT1).

Niezależnie od kierunku zmian wartości średnic fibryli, większość zespołów w swoich badaniach nad wpływem mrożenia na strukturę wewnętrzną ścięgien zaobserwowała zmianę orientacji i wyglądu wiązek kolagenowych wraz ze wzrostem liczby cykli M/R. Zjawisko to także zostało zaobserwowane przez Autorkę – na Rys. 49 przestawiono przykładową różnicę w wyglądzie granicy międzywłókienkowej dla ścięgna z grupy kontrolnej oraz ścięgna mrożonego i rozmrażanego 12 razy. Porównując zdjęcia wyraźnie widać, że granica między włókienkami w przypadku ścięgna z grupy kontrolnej jest wyraźna, ostra, a widoczne fibryle, budujące daną jednostkę są względem siebie równoległe. Próbka ścięgna wielokrotnie mrożona nie wykazuje tak ostrej granicy pomiędzy włókienkami, a budujące daną jednostkę fibryle są ułożone w sposób bardziej chaotyczny. Podczas obrazowania próbek zaobserwowano także przypadki większych uszkodzeń na poziomie pęczków oraz przypadki nieregularnego przekroju poprzecznego włókienek obserwowane na ich długości (Rys. 50). Zaobserwowane zmiany struktur kolagenowych mogą prowadzić także do zwiększonej porowatości tkanek miękkich – zjawisko to zostało opisane w pracach Poornejad et al. [161], Giannini et al. [100] czy O’Leary et al. [162].

141

Rys. 50. Uszkodzenia struktury ścięgna powstałe w procesie wielokrotnego M/R. Po lewej: rozległe uszkodzenia na poziomie pęczków ścięgna w obszarze macierzy międzypęczkowej (próbka II – AT3, pow. 5000 x).

Po prawej: nieregularność kształtu włókienek wzdłuż ich długości (próbka III – AT2, pow. 30 000 x)

Zaobserwowane przez Autorkę istotne zmniejszenie średnic fibryli kolagenowych po 8 i 12 cyklach M/R znajduje również odzwierciedlenie w zmianach właściwości mechanicznych pęczków ścięgien Achillesa badanych w rozdz. 6.2, gdzie istotne pogorszenie właściwości lepkosprężystych tkanki zostało stwierdzone w okolicy 8 cyklu M/R. Zmiany właściwości mechanicznych tkanki na skutek M/R mogą być bezpośrednio związane z uszkodzeniem mikrostruktury ścięgna w procesie formowania kryształów lodu, a także z kompresyjnym zniszczeniem komórek występujących w żywej tkance [158], [163].

7.3. Wnioski

Badania opisane w niniejszym rozdziale miały na celu analizę wpływu procesu wielokrotnego mrożenia i rozmrażania na strukturę wewnętrzną tkanki. Analizy te zostały przeprowadzone w oparciu o pomiary dokonane na zdjęciach mikrostruktury ścięgien wykonanych metodą skaningowej mikroskopii elektronowej. Przedstawione wyniki prowadzą do następujących wniosków:

 wielokrotne M/R w sposób znaczący wpływa na strukturę wewnętrzną tkanki powodując zmianę wymiarów geometrycznych (średnic) oraz orientację ułożenia włókien i fibryli kolagenowych,

142

 fibryle ścięgna Achillesa poddanego 8 i 12 cyklom M/R wykazują znacznie mniejsze średnice w porównaniu do fibryli ścięgna niemrożonego i zmiana ta jest istotna statystycznie,

 zmiany zachodzące w geometrii fibryli są niezależne od analizowanego obszaru ścięgna,  wielokrotne mrożenie tkanek miękkich prowadzi do pogorszenia właściwości

mechanicznych (w szczególności lepkosprężystych) tej tkanki poprzez zmiany i/lub uszkodzenia jej struktury wewnętrznej na skutek formowania się w tej strukturze kryształów lodu.

Przeprowadzone badania posiadają ograniczenia związane głównie z liczebnością testowanych próbek. Z uwagi na wysoki koszt obrazowania metodą SEM badaniu zostały poddane dwie grupy testowe (tj. 8 i 12 cykli M/R), w których prawdopodobieństwo zaobserwowania zmian struktury było największe. Pomimo ograniczonej liczebności grup i próbek wewnątrz grup, Autorka starała się zapewnić odpowiednio wysoką statystykę pomiarów fibryli w liczbie 200 pomiarów na próbkę. Z uwagi na fakt, że uzyskanie tak znaczącej liczby pomiarów wymagało zwymiarowania kilku zdjęć dla każdej próbki, możliwe było także zbadanie wpływu obszaru ścięgna na uzyskiwane wartości pomiarów. Biorąc pod uwagę wszystkie powyższe wnioski, należy jednak stwierdzić, że analizy wpływu procesu wielokrotnego M/R na strukturę wewnętrzną tkanki wykonane z pomocą obrazowania SEM stanowiły istotne uzupełnienie badań opisywanych w poprzednich rozdziałach pracy, a także stanowią merytoryczną podstawę do wyjaśnienia opisywanych wcześniej zmian właściwości lepkosprężystych pęczków ścięgna Achillesa.

143