II. CZĘŚĆ EKSPERYMENTALNA
II.3. Metodologia badań
II.3.7. Pomiary cytotoksyczności
Wszystkie komórki były hodowane w sterylnych butelkach hodowlanych (Nunc) o pojemności 10 ml i przechowywane w inkubatorze w temperaturze 37°C, w atmosferze powietrza zawierającego 5% CO2.
Linia komórkowa MCF-7. Komórki ludzkiego raka piersi MCF-7 hodowane były w medium hodowlanym IMDM (500 ml), zawierającym L-glutaminę, do którego dodano płodową surowicę bydlęcą FBS (55 ml), 5 ml roztworu zawierającego antybiotyki (penicylinę, streptomycynę, amfoterycynę), roztwór aminokwasów (5 ml) oraz 40% roztwór glukozy (5 ml). Przesiew (pasaż) komórek przeprowadzano 2 razy w tygodniu w celu utrzymania odpowiedniej gęstości komórek oraz w celu dostarczenia pożywek i antybiotyków Przesiewanie polegało na odciągnięciu pożywki, przepłukaniu komórek solą fizjologiczną, dodaniu trypsyny (1,5-2 ml) w celu oderwania komórek od podłoża (trypsynizacja), odciągnięciu trypsyny, dodaniu 10 ml świeżej pożywki oraz pobraniu jałową pipetą serologiczną odpowiednio 2,5 ml lub 3 ml zawiesiny komórek (w zależności od stopnia konfluencji czyli stopnia zagęszczenia), przeniesieniu jej do nowej butelki, a następnie uzupełnieniu odpowiednio 7,5 lub 7 ml świeżej pożywki hodowlanej.
Linie komórkowe PC-3 oraz CCRF SB. Komórki ludzkiego raka prostaty PC-3 oraz komórki limfoblastoidów białaczki ludzkiej CCRF hodowane były na pożywce w medium hodowlanym RPMI-1640 (500 ml), do którego dodawano płodową surowicę bydlęcą FBS (odpowiednio 55 ml do linii PC-3 i 110 ml do CCRF), L-glutaminę (5 ml), rozwtór
61
antybiotyków (penicylina, streptomycyna, amfoterycyna) (5 ml), roztwór aminokwasów (5 ml) oraz 40% roztwór glukozy (5,2 ml do PC-3 i 5,5 ml do CCRF). Pasaż komórek PC-3, tak jak w przypadku komórek MCF-7, był wykonywany 2 razy w tygodniu. W zależności od stopnia konfluencji, po trypsynizacji, pobierano jałową pipetą serologiczną odpowiednio 1,5 lub 2 ml zawiesiny komórek, przenoszono ją do nowej butelki hodowlanej, a następnie uzupełniano odpowiednio 8,5 lub 8 ml świeżej pożywki hodowlanej. Pasaż komórek CCRF wykonywano 2 razy w tygodniu – pobierano z butelki hodowlanej 3 ml zawiesiny komórek, przenoszono ją do nowej i uzupełniano 7 ml świeżej pożywki hodowlanej.
Sporządzanie roztworów kompleksów palladu(II) oraz wzorców.
Kompleksy PdCl2(XnPy)2 rozpuszczono w N,N-dimetyloformamidzie (DMF), uzyskując roztwory nasycone. Zakres stężeń badanych związków Pd(II) w otrzymanych roztworach (w zależności od rozpuszczalności związku) wynosił pomiędzy 1,4 mmol a ok. 50 mmol/dm3. Roztwory substancji wzorcowych (cytostatyków używanych w chemioterapii: cis-DDP i 5-Fu) uzyskano przygotowując nasycony roztwór cis-DDP w DMF o stężeniu 80 mmol/dm3, oraz sporządzono roztwór 5-Fu w wodzie dejonizowanej o maksymalnym stężeniu wynoszącym 7,4 mmol/dm3.
Uzyskane roztwory stanowiły tzw. roztwory wyjściowe, których stężenia są zestawione w Tabeli 2. Do badania aktywności przeciwnowotworowej związków PdCl2(XnPy)2 sporządzano szereg rozcieńczonych roztworów o różnych stężeniach.
Tabela 2. Wartości stężeń badanych związków palladu (II) i wzorców w roztworach wyjściowych.
Związek c [mmol/dm3] Związek c [mmol/dm3]
PdCl2(2-MePy)2 36,0 PdCl2(3-ClPy)2 53,6
PdCl2(3-MePy)2 40,4 PdCl2(2,6-Cl2Py)2 3,7
PdCl2(4-MePy)2 15,9 PdCl2(2,4-Cl2Py)2 30,9
PdCl2(2,6-Me2Py)2 5,5 PdCl2(3,5-Cl2Py)2 1,4
PdCl2(2,4-Me2Py)2 18,9 PdCl2(Py)2 42,6
PdCl2(3,5-Me2Py)2 7,0 cis-DDP 80,0
PdCl2(2-ClPy)2 36,4 5-Fu 7,4
Badanie aktywności cytotoksycznej - test MTT [238,239]
Test MTT to metoda kolorymetryczna powszechnie wykorzystywana do określenia żywotności komórek. Metoda ta wykorzystuje proces redukcji bromku 3-(4,5-dimetylotiazolo-2-ilo)-2,5-difenylotetrazolowego (MTT) o żółtych kryształach do fioletowego formazanu [240]. Reakcja ta, przedstawiona za pomocą równania 42, jest
62
katalizowana przez enzymy – dehydrogenazy mitochondrialne, i zachodzi tylko w żywych komórkach.
S N N N N N
CH3
CH3 +
S N N N N HN
CH3
CH3
(42)
MTT Formazan
Powstający formazan (fioletowe kryształki) są rozpuszczalne w izopropanolu i na podstawie absorbancji mierzonej przy długości fali λ = 570 nm można wyznaczyć liczebność żywych komórek.
Przygotowanie odczynników. Sporządzono roztwór MTT w odpowiedniej objętości soli fizjologicznej (PBS), uzyskując stężenie 5mg/ml. Otrzymany roztwór MTT rozcieńczano roztworem PBS w stosunku objętościowym 1:20 (roztwór wyjściowy MTT/PBS).
Roztwory kontrolne były mieszaniną DMF i medium hodowlanego (IMDM lub RPMI wzbogacone w składniki odżywcze i antybiotyki) w stosunku objętościowym 1:500 oraz 1:250 oraz roztwór będący mieszaniną wody dejonizowanej i medium hodowlanego w stosunku objętościowym 1:50 (tylko dla linii PC-3). Z przygotowanych, wyjściowych roztworów kompleksów PdCl2(XnPy)2, cis-DDP (stężenia podane w Tabeli 2) sporządzono szereg rozcieńczeń w DMF (lubw wodzie dejonizowanej dla 5-Fu). Otrzymane roztwory związków palladu(II) i cis-DDP rozcieńczano medium hodowlanym w stosunku objętościowym 1:500 (również 1:250, po to by osiągnąć możliwie największe stężenie końcowe związku). Roztwory 5-Fu rozcieńczano medium hodowlanym w stosunku objętościowym 1:50.
Przygotowanie komórek. Pobierano niewielką ilość zawiesiny odpowiednich komórek (sposób przygotowania zawiesiny opisano w punkcie II.3.8) i określano ich liczebność [ilość komórek/ml], używając w tym celu komory Bürkera bądź licznika komórek Beckman Coulter Z1 Dual. Po wykonaniu obliczeń, doprowadzano zawiesiny komórek do gęstości 5×104 komórek/ml (linia MCF-7), 6×104 komórek/ml (linia PC-3) oraz 5×105 komórek/ml (linia CCRF), rozcieńczając je pożywką hodowlaną.
63 Wykonanie testu MTT
Przygotowane roztwory komórek wysiewano na płytki 96-dołkowe, do każdego dołka dozując po 100µl. Płytki z komórkami MCF-7 i PC-3 wstawiano do inkubatora (37°C) na 24h, natomiast komórki CCRF po wysianiu na płytki nie wymagały inkubacji. Do każdego dołka zawierającego komórki dodawano 100 µl roztworu badanych substancji (kompleksów lub związków wzorcowych). Po 48 lub 72 godzinach inkubacji (zależnie od rodzaju linii komórkowej) zlewano pożywkę z płytek. W eksperymentach wykorzystujących linie komórkowe CCRF przed usunięciem pożywki płytki wirowano przez 5 minut przy 3000 rpm.
Następnie po zlaniu pożywki ze związkami każdy dołek na płytce przepłukiwano roztworem PBS (komórki CCRF ponownie wirowano z prędkością 3000 rpm przez 5 min.) i dodawano do każdego dołka po 100 µl (MCF-7 i PC-3) lub po 50 µl przygotowanego roztworu MTT (CCRF). Płytki wstawiano ponownie do inkubatora (37°C) na 3h – przez ten czas zachodziła redukcja MTT do formazanu przeprowadzana przez żywe komórki. Następnie wirowano płytki w wirówce przez 5min. / 3000 rpm (tylko MCF-7 i PC-3, CCRF nie wirowano), odlewano roztwór MTT (oprócz CCRF) i dodawano po 200µl izopropanolu na każdy dołek w celu rozpuszczenia powstałych kryształów formazanu. Mierzono absorbancję przy długości fali λ = 570 nm za pomocą spektrofotometru mikropłytkowego Power Wave XS (Biotek Instruments, USA).
W celu określenia aktywności przeciwnowotworowej kompleksów palladu(II) w odniesieniu do badanych wzorców: cis-DDP (MCF-7, CCRF) oraz 5-Fu (PC-3), wykonano niezależne doświadczenia dla każdej linii komórkowej (pomiary wykonano w czterech powtórzeniach dla każdego stężenia związku). Dla linii MCF-7 przeprowadzono po cztery oddzielne doświadczenia dla niższych stężeniach stężeń wybranych kompleksów (każdorazowo w czterech powtórzeniach), mające na celu porównanie aktywności cytotoksycznej badanych związków i cis-DDP. Wyniki uśredniano i poddawano analizie statystycznej.
Analiza statystyczna wyników. Dla każdego stężenia badanego związku oraz dla wzorców cis-DDP i 5-Fu obliczono średnie z czterech pomiarów absorbancji, używając programu komputerowego Microsoft Excel i porównano je ze średnimi obliczonymi dla roztworu kontrolnego. Przyjęto, że wartość średnia absorbancji roztworu kontrolnego odpowiada 100%
żywotności komórek. Obliczono także odchylenia standardowe i przeprowadzono analizę istotności statystycznej za pomocą testu t-Studenta, przyjmując poziom ufności 0,05.
Dla wzorców (cis-DDP i 5-Fu), przy pomocy programu komputerowego SigmaPlot®, określono wartości indeksu IC50 (ang. inhibitory concentration) – oznaczającego stężenie
64
hamujące, dla którego wzrost i proliferacja komórek w hodowli zostają zahamowane w 50%
w stosunku do wzrostu komórek kontrolnych [241].