Produkcja premiksów w skali przemysłowej 13.1.
Na Rys. 9 przedstawiono uproszczony schemat blokowy produkcji premiksów. Na Rys. 10 pokazano linię technologiczną użytą do produkcji badanych premiksów.
Rys. 9 Schemat blokowy produkcji premiksów w skali przemysłowej
68 Rys. 10 Linia technologiczna produkcji premiksów
Przygotowanie premiksów w skali laboratoryjnej 13.2.
W Tabeli 22 przedstawiono skład 6 prób badawczych, każda próba o wadze 1 kg - surowce pobrano z magazynu zlokalizowanego w Kiszkowie na terenie Wytwórni Premiksów firmy Cargill.
Wytwarzane pasze lecznicze i produkty pośrednie powinny tworzyć jednolitą i stałą mieszaninę z premiksem leczniczym, który jest dopuszczony do obrotu handlowego na podstawie odpowiednich przepisów prawa farmaceutycznego. Metody oznaczania substancji czynnych w badaniach urzędowych pasz leczniczych zostały zawarte w instrukcjach metodycznych wydanych przez Głównego Lekarza Weterynarii. W zależności
69 od rodzaju substancji czynnej stosuje się odpowiednią metodę badania. W odniesieniu do niektórych substancji aktywnych metody zawarte są w Rozporządzeniu Ministra Rolnictwa i Rozwoju Wsi z dnia 6 marca 2006 r. w sprawie metodyki postępowania analitycznego w zakresie określania składników pokarmowych i dodatków paszowych w materiałach paszowych, premiksach, mieszankach paszowych i paszach leczniczych ((Dz. U. z dnia 3 kwietnia 2006 r. Nr 54, poz. 389).
Homogenność jest to badanie równomierności i stopnia wymieszania pasz, wykonane przez oznaczenie zawartości substancji czynnej w próbach pierwotnych. Próba pierwotna (n) – próba paszy leczniczej lub produktu pośredniego pobrana losowo z jednego miejsca partii. Partia – określona ilość paszy leczniczej, jednolita pod względem rodzaju i jakości, wytworzona według tej samej receptury.
Jeśli wartość stopnia wymieszania, którego miarą jest współczynnik zmienności (CV) wyników badania zawartości substancji czynnej w pięciu próbach pierwotnych wynosi poniżej 10% to uznaje się, że nastąpiło właściwe wymieszanie składników badanego premiksu. W tym celu należy [62, 63]:
Obliczyć wartość średnią z wyników oznaczeń zawartości substancji czynnej dla pięciu prób pierwotnych.
𝑥𝑖 - wynik kolejnego oznaczenia substancji czynnej dla próby pierwotnej, 𝑛 – liczba oznaczeń.
odchylenie standardowe SD dla tych wyników według wzoru:
𝑆𝐷 = √ 1
𝑛 − 1∑(𝑥𝑖− 𝑥̅)2
𝑛
𝑖=1
(12)
obliczyć współczynnik zmienności wyników CV według wzoru:
70 𝐶𝑉 [%] =𝑆𝐷
𝑥̅ ∙ 100% (13)
Po wymieszaniu materiały badane rozdzielono na 4 partie przy wykorzystaniu rozdzielacza prób firmy Retch, model PR100 (Rys. 11). Planowany czas trwania eksperymentu to 12 miesięcy. Daną partię badano w różnych kierunkach bezpośrednio po przygotowaniu oraz po 3, 6, 9 i 12 miesiącach przechowywania. Próby do analiz pobierano zgodnie z normą [64, 65, 66].
Rys. 11 Rozdzielacz prób firmy Retch
Próby opisano kolejno jako PR1, PR2, PR3, PR4, PR5 i PR6. Materiał badawczy przeniesiono do bezpiecznych kopert (bez dostępu światła) i przechowywano w obszarze magazynowym, w zmiennych warunkach temperatury (3,5-25,5oC) (Rys. 12) i wilgotności (40-75%) (Rys. 13).
71 Rys. 12 Zmiany temperatury otoczenia w obszarze magazynowym temperatura luty,
miesiąc przygotowania prób; temperatura czerwiec, warunki po trzecim miesiącu przechowywania; temperatura wrzesień, warunki po szóstym miesiącu
przechowywania.
Rys. 13 Zmiany wilgotności otoczenia w obszarze magazynowym wilgotność luty, miesiąc przygotowania prób; wilgotność czerwiec, warunki po trzecim miesiącu
przechowywania; wilgotność wrzesień, warunki po szóstym miesiącu przechowywania.
72
14. Stosowane metody pomiarowe
Oznaczanie wody, białka, tłuszczu i popiołu 14.1.
W celu oznaczania wilgotności [67, 68] pobrano co najmniej 50 g próby i odpowiednio rozdrobniono. Następnie odważono z dokładnością do 0,1 mg około 5 g próby w wysuszonym do stałej masy i wcześniej zważonym tyglu. Próbę suszono przez 2 godziny w temperaturze 130oC2oC (opcjonalnie 1 godzina w 103oC2oC). Po wyjęciu z suszarki tygle umieszczono w eksykatorze, a po wystygnięciu zważono; jako wzorzec roboczy użyto śrutę sojową z zawartością wody na poziomie 10-11%. Dla każdej próby wykonano 5 oznaczeń po określonym czasie przechowywania.
W celu oznaczenia białka pobrano co najmniej 50 g próby i odpowiednio rozdrobniono. Odważono określoną masę próby z dokładnością do 0,1 mg w zależności od spodziewanej zawartości białka. Materiał zamknięto dokładnie w kapsule cynowej.
Umieszczono w podajniku prób. Ustawiono parametry tj.: czas dozowania tlenu i kategorię spalania. Otrzymana w wyniku spalenia próby mieszanina gazów (N2, CO2, H2O i SO2) skierowana była do reaktora I, gdzie uległa utlenianiu (katalizator CuO+Pt/Al2O3).
Następnie w/w mieszanina trafiła do reaktora II, gdzie tlenki azotu zostały przekształcone w wolny (całkowity) azot, a proces utleniania zatrzymany. Następnie gaz przeszedł przez 2 filtry adsorpcyjne. Filtr 1(CaO+NaOH) zatrzymał tlenki węgla i siarki, a filtr 2 (sita molekularne 3Ǻ) wodę. Uzyskany w tym procesie azot eluował się na kolumnę chromatograficzną (kolumna PTFE 0,5 m; 8 mm na 6 mm), gdzie po oddzieleniu i oczyszczeniu przeszedł przez detektor TCD, gdzie wytworzony sygnał elektryczny zarejestrowany został przez program komputerowy EAGER 300. Wyświetlona została zawartość azotu i automatycznie przeliczona na procentową zawartość białka (przelicznik białkowy 6,25). Dla danej próby wykonano od 3 do 5 powtórzeń. Jako standard do wyznaczenia krzywej wzorcowej zastosowano kwas asparaginowy – 10,52% azotu; jako materiał referencyjny zastosowano pastę (makaron) o zawartości 10-11% białka, a jako wzorzec roboczy śrutę sojową 46-47% białka.
W celu oznaczania popiołu [69, 70] odważono z dokładnością do 0,1 mg około 3 g próby (w przypadku substancji pęczniejących mniej) w wyprażonym do stałej masy tyglu.
Następnie tygiel umieszczono w piecu muflowym z programowaną temperaturą
73 wynosząca docelowo 5500C. Spalano do uzyskania białego lub jasnoszarego popiołu.
Pozostawiono w eksykatorze do ochłodzenia i zważono. Substancje, które trudno się spopielają wstępnie spopielono ok. 3-4 godzin, a następnie po ochłodzeniu dodano ostrożnie kilka kropli 20% azotanu amonu, wysuszono i ponownie spopielono w piecu aż do uzyskania popiołu o odpowiedniej barwie. Jako materiał referencyjny zastosowano makaron a jako materiał odniesienia śrutę sojową.
Zawartość tłuszczu surowego oznaczono wykorzystując technikę NIR. Próby przygotowano zgodnie z wymaganiami metodyki na młynie Retsch z sitem 1 mm. Po kontroli homogenności napełniono nimi kasety pomiarowe. Pomiary wykonano przy użyciu spektrometru FOSS NIRSsystems 5000. Warunki pracy spektrofotometru:
spełniony zakres temperaturowo – wilgotnościowy w pomieszczeniu pracy aparatu. Pomiar wykonano na dedykowanych kalibracjach aplikacyjnych firmy Foss. Oznaczenia wody, białka, tłuszczu i popiołu wykonano w laboratorium firmy Cargill w Kiszkowie.
Oznaczanie pH i gęstości nasypowej 14.2.
Badania pH wodnych roztworów prób badawczych przeprowadzono przy użyciu pehametru firmy Titroline. Pomiar pH poprzedzony został kalibracją urządzenia z zastosowaniem buforowych roztworów o pH=4 i pH=7. Odważono 10 g próby, uzupełniono wodą destylowaną do objętości 100 ml. Po upływie 30 minut przesączono (jeśli było konieczne) i zmierzono pH. Pomiary wykonano trzy razy i jako ostateczny wynik podano średnią arytmetyczną z otrzymanych wartości.
Gęstość nasypowa została wyznaczona poprzez zważenie masy próby badanej w cylindrze miarowym klasy A o objętości 100 cm3. Ważenie wykonano co najmniej 3 razy i jako ostateczny wynik podano średnią arytmetyczną z otrzymanych wartości.
Uzyskany wynik przeliczono na jednostkę gęstości g/cm3. Oznaczenia pH i gęstości nasypowej wykonano w laboratorium firmy Cargill w Kiszkowie.
74 Oznaczanie chlorków i chlorku choliny
14.3.
Oznaczono chlorki rozpuszczalne w wodzie, w przeliczeniu na chlorek sodowy przy użyciu TitroLine Ralpha firmy Schott z elektrodą Ag6280. Badaną próbę w ilości 1-5 g (z dokładnością do 1 mg) rozpuszczono w wodzie dejonizowanej z dodatkiem stężonego kwasu azotowego (V) i wytrząsano przez 20 min na wytrząsarce CAT, model S 50 firmy Danlab. Pobrano odpowiednią ilość dokładnie sklarowanego przesączu i miareczkowano potencjometrycznie mianowanym 0,1 mol/dm3 roztworem azotanu srebra. Jeśli próba zawierała chlor pochodzący z chlorku choliny uzyskany wynik wykorzystano do obliczenia zawartości choliny w próbie. Ponieważ niektóre materiały badawcze zawierały chlor, który pochodził z innych źródeł niż chlorek choliny dodatkowe badania zawartości chlorku choliny zostały przeprowadzone przy użyciu metody spektrofotometrycznej BN-80/9160-18 (Krajowe Laboratorium Pasz w Lublinie, metoda nieakredytowana) oraz przy użyciu metody kolorymetrycznej (Zakład Higieny Weterynaryjnej w Poznaniu, metoda nieakredytowana).
Oznaczanie składników mineralnych 14.4.
Do oznaczenia zawartości minerałów zastosowano metodę atomowej spektrometrii absorpcynej (FAAS). Odważono od 1 do 5 g zmielonej i homogennej próby z dokładnością do 0,1 mg (w 5 powtórzeniach). Następnie próby spopielono w piecu muflowym w 550oC i roztworzono otrzymany popiół w roztworze HCl:H2O w stosunku 1:1 w ilości 20 ml.
Ogrzewano na płycie elektrycznej do uzyskania klarownego roztworu około 2 godzin.
Otrzymany roztwór przesączono do kolby o poj. 100 ml. Pomiary wykonano przy użyciu spektrometru absorpcji atomowej – SpectrAA 220 FS VARIAN z korekcją tła. Warunki pracy spektrofotometru: płomień powietrzno-acetylenowy, automatyczne dozowanie modyfikatora – tlenku lantanu w ilości 10% bezpośrednio do płomienia palnika dla oznaczenia wapnia i magnezu. Absorbancja każdego pierwiastka określana jest przez porównanie z absorbancją roztworów kalibracyjnych tego samego pierwiastka. Aparat dokonywał pomiaru absorbancji 4 – krotnie i jej wynik automatycznie uśredniał. Jeśli było konieczne aparat samodzielnie dokonywał rozcieńczenia przy użyciu systemu SIPS; jako
75 wzorzec roboczy zastosowano tlenek manganu (II); jako materiał referencyjny mączkę sojową lub tabakę. Oznaczenia metali wykonano w laboratorium firmy Cargill w Kiszkowie.
Oznaczanie witamin 14.5.
W badanym materiale oznaczono zawartość witamin A i E metodą wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC) z własną modyfikacją. Pomiar poprzedzony był 2 etapowym przygotowaniem próby (5 powtórzeń). W I etapie hydrolizy odważono do 10 g homogennej próby z dokładnością do 1 mg, dodano kwas askorbinowy, 10% etanolowego roztworu pirogalolu oraz 50% roztwór KOH pod strumieniem azotu. Próbę pozostawiono w ciemnym miejscu do następnego dnia. W II etapie ekstrakcji próbę wytrząsano z n heksanem, z dodatkiem 0,05% 2,6-di-tert-butylo-p-krezolu (BHT) przez 20-30 minut.
Następnie dodano nasyconego roztworu NaCl i wytrząsano ok. 10 minut. Po rozdzieleniu faz, pobrano z górnej warstwy część wyciągu, przepuszczono przez bezwodny Na2SO4 i przefiltrowano do fiolki. Następnie oznaczono zawartość witamin na chromatografie cieczowym Agilent (HP) 1100 z detektorem UV-DAD przy długości fali 325 nm dla retinolu, 294 nm dla α-tokoferolu, w normalnym układzie faz. Wykorzystano termostatowaną kolumnę (25oC) z wypełnieniem LiChrospher 125-4, Si 60 o wielkości ziarna 5 µm. Fazę ruchomą stanowiła mieszanina n-heksanu i izopropanolu w stosunku 98:2. Wielkość nastrzyku wynosiła 10 µl, a przepływ 1,5 ml/min. Materiał odniesienia stanowił octan witaminy A oraz octan witaminy E - producent Alfa Aesar, Niemcy.
Oznaczenia witamin tą metodą wykonano w laboratorium firmy Cargill w Kiszkowie.
Zawartość witaminy A obliczono wg wzoru:
𝑤𝑖𝑡𝐴[𝑈𝐼/𝑘𝑔] =1000000 ∙ 𝑉𝑒∙ 𝑋𝐴
𝑚 ∙ 𝑉𝑛 (14)
Zawartość witaminy E obliczono wg wzoru:
𝑤𝑖𝑡𝐸[𝑚𝑔/𝑘𝑔] =1000 ∙ 𝑉𝑒∙ 𝑋𝐸
𝑚 ∙ 𝑉𝑛 (15)
76 gdzie:
𝑉𝑒- objetość ekstraktu [ml], 𝑉𝑛- objętość nastrzyku [µl],
𝑋𝐴,𝐸 - zawartość witamin odczytana z krzywej wzorcowej [w IU dla A, w μg dla E], 𝑚 - masa badanej próby [g].
FTIR 14.6.
Aby dokonać identyfikacji grup charakterystycznych dla badanych związków wykonano widma FTIR prób badanych w obszarze podczerwieni średniej (ang. Middle Infrared) w zakresie liczby falowej 400-4000 cm-1 przy wykorzystaniu aparatu firmy BRUKER, model VERTEX. Dla każdej próby wykonano 32 skanowania w funkcji transmitancji.
Zastosowano dwie techniki pomiarowe:
transmisyjną - próbki w postaci pastylki z KBr w proporcji 2 mg próby do 200 mg KBr były sprasowane w próżni pod ciśnieniem 7 MPa,
odbiciową - technika całkowitego wewnętrznego odbicia na krysztale diamentowym (ATR).
Otrzymane widma rejestrowane były w programie OPUS-Operator. Widma z transmisyjnej techniki pomiarowej okazały się bardziej przydatne podczas interpretacji wyników i tylko one zostały omówione w dalszej części niniejszej pracy.
XPS 14.7.
Badania powierzchni prób przeprowadzono za pomocą spektroskopii elektronowej XPS. Zastosowanie tej techniki pozwoliło na analizę jakościową i ilościową badanych prób.
Skład chemiczny warstwy wierzchniej został ustalony na podstawie identyfikacji linii spektralnych charakterystycznych dla danego pierwiastka. Do analizy prób właściwych wykorzystano wielokomorowy system ultra wysokiej próżni UHV (ciśnienie bazowe w komorach analitycznych nie wyższe niż 2x10-8 Pa). Umożliwia on wykonywanie analiz
77 powierzchni prób litych i proszkowych różnymi technikami spektroskopii elektronowej, w tym: spektroskopii fotoelektronów (XPS) wzbudzanych monochromatycznym źródłem MX-650 firmy Gammadata Scienta (anoda Kα-Al.) lub achromatycznym promieniowaniem rentgenowskim (anoda dualna: Mg/Al lub Ag) z detektorem hemisferycznym: R4000, VG Scienta. Przedmiotem badania było potwierdzenie składu chemicznego prób (porównanie z wynikami z analizy elementarnej i określenie rodzaju chemicznych wiązań - FTIR), pod kątem sprawdzenia stabilności danej próby na zawartość witamin A i E. Próba proszku była analizowana w temperaturze pokojowej. Przed analizą spektralną próba została sprasowana. Po zamontowaniu tabletki na molibdenowym uchwycie, próba była odgazowana do stałej, wysokiej próżni w śluzie załadowczej systemu UHV. Następnie, po transferze do komory analitycznej systemu UHV wykonano właściwą analizę XPS. Próba była analizowana bez użycia neutralizatora ładunków EFG (Flood Gun). Do obróbki zarejestrowanych widm XPS oraz obliczeń stanu ilościowego i składu powierzchniowego badanego materiału użyto oprogramowania CasaXPS. W celu normalizacji pomiarów spektroskopowych oś X widm XPS (energia wiązania EB) kalibrowano na pik C1s neutralnego węgla (EB=284,5 eV). Po analizie otrzymuje się stężenie ogólne atomów, które wylicza się z widma szerokopasmowego (survey) z pola powierzchni pod odpowiednimi pikami. Ponieważ położenie pasm spektralnych zależy od typu wiązań chemicznych, to te same atomy, ale w różnych otoczeniach chemicznych zmieniają nieznacznie swoje położenie zachodzi tzw. efekt przesunięcia chemicznego.
Następnie wykonano widma szczegółowe (wysokiej rozdzielczości) tylko w wąskim zakresie energii wiązania (niebieskie pasy na widmie survey). W kolejnym etapie interpretacji otrzymanych widm dokonano dekonwolucji pasm i na podstawie bazy danych oraz odpowiednich tablic korelacyjnych wyciągnięto wnioski, jakie wiązania chemiczne są odpowiedzialne za poszczególne piki. Znając skład atomowy policzono jakie są stosunki atomowe i w ten sposób dopasowano do formy związku chemicznego (fazy), która znajduje się na powierzchni. Badania wykonano w Laboratorium Analitycznym na Uniwersytecie Marii Curie-Skłodowskiej w Lublinie.
78 Powierzchnia właściwa, wielkość i rozkład porów
14.8.
Wykorzystując niskotemperaturową adsorpcję azotu w temperaturze –196°C w przedziale ciśnień względnych p/p0=0–1,0 wyznaczono izotermy adsorpcji-desorpcji w celu scharakteryzowania właściwości adsorpcyjnych. Badanie wielkości powierzchni właściwej na podstawie równania BET (Brunauer–Emmett–Teller) oraz ocenę wielkości i objętości porów wykonano za pomocą aparatu ASAP 2020 firmy Micromeritics Instrument Co. Przed pomiarem próby odgazowano w temp. 60°C przez 4 h. Do wyznaczenia funkcji rozkładu wielkości porów oraz ich średniej wielkości wykorzystano metodę BJH (Barrett–Joyner–Halenda). Badania wykonano w Instytucie Technologii i Inżynierii Chemicznej na Wydziale Technologii Chemicznej Politechniki Poznańskiej.
Analiza elementarna 14.9.
Analizę wykonano przy zastosowaniu aparatu firmy Vario ELIII w temperaturze 1200oC z katalizatorem WO3 (naważka 0,02-1 mg). Czas pomiaru, przy jednoczesnym oznaczaniu CHN wynosił 10-20 minut (powtarzalność powyżej 99,7%). Wynik dla danego pierwiastka stanowi średnią z minimum 4 pomiarów. Oznaczenia wykonano na Uniwersytecie A.
Mickiewicza w Poznaniu, Wydział Chemii, Środowiskowe Laboratorium Unikalnej Aparatury Chemicznej.
Mikrobiologia 14.10.
Badania mikrobiologiczne zostały wykonane w Laboratorium firmy Wessling w Poznaniu w celu wykluczenia obecności mikroorganizmów mogących mieć wpływ na stabilność badanych witamin. Istnieją bowiem przesłanki naukowe [71, 72, 73], że taki proces może mieć miejsce. Pleśnie i drożdże oznaczono zgodnie z normą PN-ISO 21527-2:
2009, badanie Salmonella metodą PCR, bakterie beztlenowe przetrwalnikowe w paszach według normy PN-R-64791:1994 oraz ogólną liczbę drobnoustrojów zgodnie PN-EN ISO 4833:2004+Ap1:2005.
79 HPLC-MS/MS
14.11.
Analizę jakościową i ilościową wykonano techniką łączoną HPLC-MS/MS. W badaniu wykorzystano chromatograf cieczowy Ultimate 3000 RSLC firmy Dionex, Dania.
Jako detektor zastosowano tandemowy spektrometr mas API 4000 (Biosystems, MDS Sciex). Rozdzielenie chromatograficzne prowadzono na kolumnie HyperSil Gold C18 (100 mm x 2, 1 mm x 1,9 µm) firmy ThermoScientifix. W pierwszej kolejności analizie poddano wzorzec analityczny tj. octan witaminy E, 97% producent Alfa Aesar, Niemcy oraz octan witaminy A w żelatynie, 100% proszek, producent Alfa Aesar, Niemcy. Jako fazę ruchomą zastosowano mieszaninę złożoną z metanolu (MeOH) (B) i 5 mM octanu amonu (A). Rozdzielenie chromatograficzne prowadzono w temperaturze 35ºC, objętość próby wprowadzanej do kolumny wynosiła 5 µL.
Tabela 26 Gradient oraz przepływ fazy ruchomej
Anality z kolumny eluowano stosując elucję gradientową: 0 min 95% B, 3 min 100%
B, 7 min 100% B. Przepływ fazy ruchomej wynosił 0,3 ml/min (Tabela 26).
Jako detektor zastosowano tandemowy spektrometr mas API 4000 QTRAP (Biosystems, MDS Sciex, USA). Analizę ilościową przeprowadzono stosując tryb pracy spektrometru masowego MRM (monitorowania wybranych reakcji). Jonizację prowadzono poprzez elektrorozpraszanie (ESI) w trybie jonów dodatnich. W ramach badań wykonano także widma masowe rozdzielonych mieszanin w zakresie mas od 50 do 600 amu.
Warunki pracy spektrometru masowego: temperatura źródła jonów 450ºC, ciśnienie gazu osłonowego 10 psi, ciśnienie gazu w rozpylaczu 45 psi, ciśnienie gazu suszącego 45 psi, napięcie przyłożone do kapilary 5500 V (Tabela 27). Monitorowane jony badanych związków w trybie pracy MRM, potencjał fragmentacji (DP) oraz energię zderzeń (CE) przedstawiono w Tabeli 28 i 29. Identyfikacji badanych witamin dokonano na podstawie porównania czasów retencji składnika próby z czasami retencji wzorców analitycznych, rejestracji widm masowych oraz widma fragmentacyjnego wybranego jonu molekularnego.
A
80 Tabela 27 Warunki pracy detektora masowego
Tabela 28 Optymalne parametry pracy detektora MS/MS dla wybranych witamin
Tabela 29 Optymalne parametry pracy detektora MS/MS dla poszczególnych izomerów witaminy E
Badania dotyczące analizy jakościowej i ilościowej HPLC-MS/MS zostały wykonane na Wydziale Technologii Chemicznej Politechniki Poznańskiej w Instytucie Chemii i Elektrochemii Technicznej pod kierunkiem dr inż. Joanny Zembrzuskiej.
sposób jonizacji ESI
witaminy E 473,3 146 473,3207,1 25 473,3165,2 49 473,3431,4 25
octan
witaminy A 269,6 50 269,6213 17 269,6107 24 269,695 15
związek jon pseudomolekularny
β – tokoferol 411 51 411327 37 411369 23
γ – tokoferol 418 101 416151 39 418191 35
δ – tokoferol 404 51 404387 13 404105 25
octan α - tokoferolu 473 146 473207 29 473165 57
81
WYNIKI I DYSKUSJA
Badania trwałości witamin w produktach premiksowych jako substancji leczniczych, są niezbędne do prowadzenia prawidłowego, skutecznego i bezpiecznego żywienia zwierząt. Testy stabilnościowe pozwalają określić podatność tych witamin na zmiany w warunkach stresowych (utlenianie, hydroliza w środowisku o różnych zakresach pH, wilgotność względna powietrza, temperatura oraz fotoliza), co w konsekwencji umożliwia określenie mechanizmu ich rozkładu oraz pozwala ocenić liczbę powstających produktów rozkładu i dokonać ich identyfikacji. Otrzymane wyniki dostarczają informacji o warunkach, w jakich powinny być przechowywane premiksy witaminowe oraz umożliwiają określenie terminu ważności gwarantującego skuteczność działania takich produktów.
15. Charakterystyka stabilności materiałów premiksowych dostępnych handlowo – eksperyment I
Oznaczenie zawartości witaminy A i E metodą HPLC-DAD 15.1.
Przedstawione poniżej wyniki dotyczą prób premiksów analizowanych w latach 2009-2011. Wstępnym badaniom stabilnościowym poddano próby premiksów handlowych (oznaczone jako p1, p2, p3, p4, p5, p6, p7 i p8). Określono ilościowo zawartość witamin lipofilnych oraz sprawdzono wpływ różnych czynników mogących potencjalnie wpływać na zanik tych witamin w czasie przechowywania.
Interpretując wynik badania zawartości witaminy A i E należało wziąć pod uwagę różnicę pomiędzy przedziałami zawartości określonymi jako limity tolerancji w przepisach prawa, które należy traktować jako dopuszczalne odchylenia techniczne wynikające z natury procesu wytwarzania produktu premiksowego, a analitycznym odchyleniem wyniku badania, określanym jako niepewność metody (pomiaru). Witamina A należy do tych dodatków paszowych, dla których określono maksymalną zawartość w mieszankach paszowych, zgodnie z informacją Komisji [74], rozporządzeniem 1831/03 [75] i rejestrem dodatków paszowych UE [76]. Zgodnie z Rozporządzeniem Komisji UE nr 939/2010 – załącznik IV określono granice tolerancji technicznej dla zakresu zawartości powyżej
82 1 000 000 IU/kg dla witaminy A oraz powyżej 1000 mg/kg dla witaminy E na poziomie
±10%. W Tabeli 30 odpowiada to wartościom min-max w stosunku do deklaracji producenta. Niepewność rozszerzona odpowiada odchyleniu analitycznemu i została ustalona na poziomie ±15%.
Tabela 30 Wyniki oznaczeń zawartości witamin A i E metodą HPLC-DAD w premiksach handlowych
Wynik badania jest niezgodny z deklaracją producenta, gdy górna granica niepewności wyniku leży poniżej dolnego przedziału tolerancji technicznej (niedobór witaminy), lub odwrotnie, gdy dolna granica niepewności wyniku jest wyższa od górnej granicy przedziału tolerancji (nadmiar witaminy). W Tabeli 30 czerwoną czcionką zaznaczono te zawartości witaminy E (próba p8), których dopuszczalna tolerancja techniczna nie ma części wspólnej z niepewnością rozszerzoną, co oznacza spadek zawartości witaminy E w czasie przechowywania. W pozostałych przypadkach (próby p1-p7) zawartość poszczególnych witamin była zgodna z deklaracją producenta [77].
nr
* zawartość witaminy E przeliczona na α-tokoferol
83 W próbach p1, p2, p3, p4, p7 nastąpiło obniżenie ilości witaminy A odpowiednio do 90%, 97%, 92%, 92%, 96% początkowej jej zawartości. W próbach p5 i p8 nastąpiło zwiększenie ilości witaminy A odpowiednio o 10% i 3% początkowej jej zawartości. W próbach p1, p4, p5, p6, p7 i p8 nastąpiło obniżenie zawartości witaminy E odpowiednio do 93%, 94%, 89%, 89%, 99% i 89% początkowej jej ilości (Rys. 14 i Rys. 15).
Rys. 14 Zmiana zawartości witaminy A w próbach p3, p7 i p8 po 3 miesiącach przechowywania
Rys. 15 Zmiana zawartości witaminy E w próbach p2, p3, p5 i p7 po 3 miesiącach przechowywania zawartość witaminy A w premiksie [IU/kg]
czas przechowywania [miesiąc]
zawartość wtaminy E w premiksie [mg/kg]
czas przechowywania [miesiąc]
p3 p5 p2 p7
84 Zarówno spadek zawartości badanych witamin jak i ich wzrost jest niekorzystny w żywieniu zwierząt. Niekorzystny wpływ nieodpowiedniej ilości obu witamin został omówiony w części teoretycznej niniejszej pracy. Brak stabilności obu witamin daje potencjalnie niebezpieczną sytuację związaną z niekontrolowanym pojawieniem się innych, niepożądanych substancji zarówno w wyniku utleniania się tych witamin, podczas ich rozkładu naturalnego czy też w wyniku reakcji chemicznych zachodzących pomiędzy związkami obecnymi w badanych premiksach.
Czynniki potencjalnie wpływające na zmianę zawartości badanych 15.2.
witamin lipofilnych
Podejmując próbę określenia tych przemian badano wymienione układy premiksowe uwzględniając różne czynniki mogące te zmiany powodować. W Tabeli 31 przedstawiono zmiany wilgotności badanych materiałów, gdyż to woda stanowić może środowisko dla potencjalnych reakcji oraz wyniki oznaczeń zawartości metali (możliwe reakcje redoks).
85 Tabela 31 Wyniki zawartości wybranych metali w badanych premiksach i wyniki wilgotności wybranych surowców w czasie 3 miesięcy przechowywania w warunkach magazynowych
Zawartość badanych metali (Cu, Mg) oraz wilgotność badanych materiałów pozostały na stałym poziomie, poza otrębami w wyrobie p4, gdzie odnotowano spadek wilgotności o ponad 3% w okresie 3 miesięcy.
Analiza statystyczna 15.3.
Na podstawie uzyskanych wyników (Tabela 30 i Tabela 31) dokonano oceny statystycznej przy użyciu pakietu Statistica wykorzystując analizę składowych głównych (ang. Principal Component Analysis, PCA) oraz ogólny model liniowy wielu zmiennych
nr
-86 (ang. General Linear Model, GML) i stworzono macierz, która była podstawą do analizy składowych głównych.
-86 (ang. General Linear Model, GML) i stworzono macierz, która była podstawą do analizy składowych głównych.