Bardzo ważnym etapem opisu procesu przemian jakim ulegają badane witaminy jest ich charakterystyka przy wykorzystaniu różnych technik.
Spektroskopia w podczerwieni z transformacją Fouriera 9.1.
Spektroskopia w podczerwieni z transformacją Fouriera (ang. Fourier Transform Infrared Spectroscopy, FTIR) to obszar widma elektromagnetycznego znajdujący się pomiędzy światłem widzialnym a falami mikrofalowymi. Promieniowanie IR dzieli się na trzy zakresy:
bliska, przedział liczby falowej od 12500 do 4000 cm-1,
podstawowa, przedział liczby falowej od 4000 do 400 cm-1,
daleka, przedział liczby falowej od 400 do 20 cm.
Do określenia struktury związków organicznych największe zastosowanie ma środkowy zakres, czyli podczerwień podstawowa. Oscylacje atomów cząsteczki zależą od:
rodzaju drgających atomów, sił wzajemnych oddziaływań pomiędzy atomami oraz od sposobu ułożenia atomów w cząsteczce. Wyróżnia się następujące rodzaje drgań:
rozciągające lub walencyjne, deformacyjne i szkieletowe. Widma absorpcyjne IR otrzymuje się mierząc zależność względnej intensywności światła przepuszczonego lub pochłoniętego od liczby falowej. Są wykresem zależności przepuszczalności (transmitancji)
53 lub absorpcji promieniowania od długości fali [μm] lub liczby falowej [cm-1].
Spektrofotometr IR składa się z: źródła promieniowania, komory, w której umieszcza się próbę, fotometru, monochromatora i detektora. Źródłem promieniowania podczerwonego jest zazwyczaj włókno Nernsta (mieszanina tlenków: cyrkonu, itru i erbu). Metodą tą można badać substancje zarówno w stanie gazowym, ciekłym jak i stałym. Ciecze można badać w postaci czystej lub w roztworze. W podobny sposób można oznaczyć widmo ciał stałych. Często wskazane jest oznaczenie widma substancji w roztworze. Najczęściej używanymi rozpuszczalnikami w spektroskopii IR są: czterochlorek węgla, dwusiarczek węgla i chloroform. Wybrany rozpuszczalnik musi być suchy, wykazywać możliwie mało pasm absorpcji własnej w badanym obszarze oraz nie reagować z substancją rozpuszczoną.
Ciała stałe zazwyczaj bada się w postaci zawiesiny, pastylki lub osadzonego szklistego filmu. Zawiesiny sporządza się ucierając ok. 5 mg ciała stałego kroplą odpowiedniej cieczy utrzymującej rozdrobnienie. Widmo tej zawiesiny można oznaczyć umieszczając ją pomiędzy dwoma płytkami z chlorku sodu. Widmo ciała stałego najlepiej oznaczyć w pastylce z halogenku pierwiastka alkalicznego. W tym celu próbę 0,5-1 mg oraz ok. 100 mg suchego sproszkowanego bromku potasu miesza się starannie, a następnie zgniata w prasie pod próżnią uzyskując przezroczystą pastylkę. Bromek potasu nie pochłania światła podczerwonego w przedziale 4000-667 cm-1 i dlatego obserwuje się cały zakres widma badanego ciała stałego. Widma ciał stałych można również wyznaczyć dla prób w postaci filmu otrzymanego przez odparowanie kropli roztworu badanej substancji na płytce z chlorku sodu [56, 57, 58]. Decydujący wpływ na postać widm (zwłaszcza ciał stałych i cieczy) mają wzbudzenia oscylacyjne, których energia jest większa od energii wzbudzeń rotacyjnych. Rotacje molekuł ciał stałych i cieczy są hamowane wskutek intensywnych oddziaływań międzycząsteczkowych, a wzbudzenia rotacyjne powodują jedynie zwiększenie szerokości pasm absorpcyjnych. Drgania oscylacyjne w cząsteczce można podzielić na rozciągające i deformacyjne. Największą wartość przy interpretacji widma IR mają pasma odpowiadające drganiom rozciągającym wiązań podwójnych, potrójnych i wiązań pojedynczych wodór – heteroatom, ponieważ pasma te pojawiają się w wąskich, nienakładających się na siebie obszarach widmowych (4000-1500 cm-1).
Pełna interpretacja widm IR jest trudna, ponieważ w obrębie jednej cząsteczki występuje wiele drgań deformacyjnych i rozciągających. Poszczególne rodzaje wiązań mając podobną różnicę energii pomiędzy poziomami oscylacyjnymi i absorbują promieniowanie o charakterystycznej częstotliwości dając pasmo w tym samym zakresie niezależnie od różnic w strukturze cząsteczki.
54 Spektroskopia fotoelektronów w zakresie promieniowania X, XPS 9.2.
Metody badania powierzchni ciał stałych wykorzystująca efekty oddziaływania elektronów, fotonów, jonów lub cząstek neutralnych z atomami badanej próby.
W zależności od rodzaju emitowanych sygnałów i rodzaju promieniowania wzbudzającego metody te można podzielić na:
ESCA (ang. Electron Spectroscopy for Chemical Analysis) spektroskopia elektronowa do analizy chemicznej,
XPS (ang. X-ray Photoelectron Spectroscopy) spektroskopia fotoelektronów wybijanych promieniowaniem rentgenowskim.Spektroskopia fotoelektronów analizuje elektrony wyrzucone z materiału próby pod wpływem jej naświetlania monoenergetycznym miękkim promieniowaniem X (< 8000 eV).
Energia kinetyczna fotoelektronów pozwala na identyfikację pierwiastków próby i analizę ich wiązania, natomiast natężenie fotoelektronów pozwala na określenie koncentracji pierwiastków i analizę udziału różnych wiązań. W użyciu są głównie elektrostatyczne analizatory hemisferyczne, które zapewniają dość dobrą zdolność rozdzielczą rzędu kilkudziesięciu milielektronowoltów. Promieniowanie rentgenowskie uzyskuje się poprzez wyhamowywanie rozpędzonych elektronów na materiale o dużej liczbie atomowej.
Efektem tego jest powstanie promieniowania o charakterystyce ciągłej, na którym widoczne są również piki pochodzące od promieniowania charakterystycznego anody.
Promieniowanie X powstaje także w wyniku wychwytu elektronu oraz w synchrotronach.
Główne części spektrometru:
lampa rentgenowska,
komora analityczna,
komora przygotowawcza,
wnętrze komory przygotowawczej z diamentowym pilnikiem do czyszczenia powierzchni,
pompa turbomolekularna,
pompa rotacyjna,
monochromator promieniowania X,
elektrostatyczny analizator hemisferyczny z systemem soczewek.
Metoda XPS wykorzystuje miękkie promieniowanie rentgenowskie o E>100 eV, pozwalając na wybicie elektronów z orbitali rdzenia. Umożliwia detekcję wszystkich
55 pierwiastków z warstwy o grubości ok. 1-8 nm (za wyjątkiem H i He) oraz możliwość ich ilościowego oznaczenia. Czułość tej metody pozwala na wykrycie pierwiastków o stężeniu powyżej 0,01%. Dodatkowo metoda XPS umożliwia uzyskanie profili głębokościowych oraz pozwala na sporządzenia przestrzennych map rozmieszczenia atomów w próbie z rozdzielczością 10-15 mm [59].
Analiza elementarna 9.3.
Podstawową zasadą ilościowej analizy CHN jest wysokotemperaturowe spalanie prób organicznych i nieorganicznych w stanie stałym jak i ciekłym. Gazowe produkty spalania są oczyszczane, a następnie rozdzielane na poszczególne składniki wykrywane w celi pomiarowej detektora TCD. Wprowadzenie próby odbywa się przez automatyczny podajnik prób, gdzie odbywa się płukanie próby helem w celu usunięcia azotu atmosferycznego. Spalanie odbywa się w temperaturze pieca 1150oC, ale w wyniku reakcji egzotermicznej w folii cynowej temperatura wynosi ok. 1800oC. W rurze spalań znajduje się granulat WO3, który pełni rolę katalizatora wiążącego pierwiastki alkaliczne. Produkty spalania tj. CO, CO2, NO, N2, SO, SO2, PO2, F, O2, H2O są wprowadzane do rury redukcyjnej gdzie w kontakcie z miedzią ulegają redukcji tlenki siarki i azotu SO2 i N2 i wiązany jest nadmiarowy tlen. Uzyskane składniki doprowadzane są do układu dynamicznej separacji na kolumnach.
Powierzchnia właściwa, wielkość i rozkład porów 9.4.
Wielkościami stosowanymi do opisu materiałów ziarnistych jest zazwyczaj skład ziarnowy względnie powierzchnia właściwa. Z punktu widzenia licznych procesów technologicznych znajomość tych parametrów odgrywa istotną rolę.
Powierzchnia właściwa determinuje właściwości powierzchniowe materiału, z czym wiąże się energia powierzchni, w tym zdolność do adsorpcji lub chemisorpcji.
Powierzchnia właściwa ciała stałego to pole powierzchni granicy faz jednego grama ciała porowatego lub sproszkowanego z otaczająca go fazą gazową lub ciekłą. Wielkość
56 powierzchni właściwej jest jednym z parametrów, według którego można sądzić o niektórych właściwościach fizycznych lub fizykochemicznych surowców, półproduktów i produktów, decydujących o ich cechach użytkowych. Istnieje szereg metod, przy pomocy których możemy oznaczyć wielkość powierzchni właściwej materiałów drobno uziarnionych [60, 61].
Pole powierzchni właściwej ma sens fizyczny i sensowne jest jej określanie w przypadku materiałów nieporowatych oraz materiałów makro- i mezoporowatych. Do grupy bezpośrednich metod pomiarowych należy metoda BET, która opiera się na uniwersalnej teorii adsorpcji przedstawionej przez Brunauera-Emmetta-Tellera (BET).
Równanie izotermy BET, stosowane w pomiarach sprowadza się do postaci:
𝑝
𝑝 - ciśnienie zewnętrzne pary [mmHg], 𝑝0 - prężność pary nasyconej [mmHg], 𝑛𝑎 - całkowita ilość zaadsorbowanej pary,
𝑛𝑚 - ilość adsorbatu (pary) pokrywającego powierzchnię adsorbentu monowarstwą [m2/g],
𝐶 - stała zależna od ciepła adsorpcji pierwszej warstwy i ciepła kondensacji.
Zależność (8) powinna przedstawiać linię prostą zgodnie z równaniem y = ax + b, co
Graficznie lub za pomocą regresji liniowej (mając dane wartości a i b) można wyznaczyć wówczas pojemność monowarstwy nm i stałą C korzystając ze wzoru:
𝑎𝑠 = 𝑛𝑚∙ 𝑎𝑚∙ 𝑁 (9)
Przyjmując założenie, że pole przekroju poprzecznego cząsteczki azotu w temperaturze 77 K wynosi 0,162 [nm2] to równanie (9) można przedstawić w postaci:
𝑎𝑠 = 9,76 ∙ 104𝑛𝑚 (10)
57 Natomiast w celu wyznaczenia wielkości i objętości porów wykorzystano metodę t-plot, która opiera się na porównaniu graficznym eksperymentalnej izotermy adsorpcji na danym adsorbencie z teoretyczną izotermą adsorpcji, przy tych samych wartościach ciśnienia adsorbatu.
58
CEL I ZAKRES PRACY
Celem pracy jest śledzenie dróg przemiany wybranych witamin w czasie przechowywania wyrobów w obszarze magazynowym oraz ocena przydatności do jego realizacji różnych technik analitycznych. Realizacja pracy wiąże się z udzieleniem odpowiedzi na trzy pytania: 1) czy możliwe jest wyznaczenie czynników wpływających istotnie na brak stabilności przechowalniczej analizowanych witamin lipofilnych w premiksach? 2) czy jest możliwe wskazanie wśród istniejących i/lub opracowanie efektywnej metody umożliwiającej prawidłową i szybką ocenę stabilności badanych witamin? 3) czy możliwe jest utrzymanie stabilności octanowych form analizowanych witamin w czasie dłuższym niż 6 miesięcy?
59
CZĘŚĆ EKSPERYMENTALNA
Badania realizowano w następujących etapach:
badanie stabilności krótkoterminowej witamin lipofilnych w premiksach handlowych (eksperyment I),
badanie stabilności długoterminowej witamin lipofilnych w premiksach handlowych (eksperyment II),
przygotowanie premiksów w skali laboratoryjnej,
badanie stabilności długoterminowej witamin lipofilnych w próbach premiksów przygotowanych w skali laboratoryjnej (eksperyment III),
porównanie przydatności dwóch metod chromatograficznych do oceny stabilności,
przedstawienie reakcji jakim mogą ulegać badane witaminy.