WYDZIAŁ TCHNOLOGII CHEMICZNEJ
INSTYTUT TECHNOLOGII I INŻYNIERII CHEMICZNEJ ZAKŁAD CHEMII ORGANICZNEJ
Joanna Maćkowiak
ROZPRAWA DOKTORSKA
Badanie stabilności wybranych witamin lipofilnych w premiksach stosowanych w żywieniu zwierząt
Promotor: prof. dr hab. inż. Adam Voelkel
Praca doktorska przedłożona Radzie Wydziału Technologii Chemicznej
Politechniki Poznańskiej
Poznań 2016
Wiele teorii zostało pogrzebanych, gdy tylko jakiś rozstrzygający eksperyment wykazał ich niepoprawność … zatem w każdej dziedzinie nauki skromną, lecz niezwykle ważną pracę wykonują praktycy, którzy zmuszają teoretyków do uczciwości.
Michio Kaku
Szczególne podziękowania kieruję do promotora rozprawy doktorskiej Pana prof. dr hab. inż. Adama Voelkela za opiekę naukową, nieocenioną pomoc i duże pokłady cierpliwości, których doświadczyłam w trakcie realizacji tej pracy
Serdecznie dziękuję dr inż. Joannie Zembrzuskiej, dr inż. Irenie Budnik oraz Mojemu Mężowi za poświęcony czas i wskazówki, które umożliwiły nadanie tej pracy ostatecznego kształtu
Pracę dedykuję moim synom Mikołajowi i Nikodemowi Warto uczyć się przez całe życie a im trudniej będzie po drodze tym więcej wartości ta nauka przyniesie
6
SPIS TREŚCI
SPIS TREŚCI ... 6
WYKAZ AKRONIMÓW... 10
WPROWADZENIE ... 12
CZĘŚĆ TEORETYCZNA ... 14
1. Pasze – podział i zastosowanie ... 14
2. Premiksy – podział i zastosowanie ... 15
3. Trwałość preparatów mineralno - witaminowych ... 17
4. Witaminy ... 18
Podział witamin ... 18
4.1. Stabilność witamin ... 22
4.2. 5. Minerały ... 23
6. Stabilność wyrobów premiksowych ... 24
7. Metody oznaczeń właściwości chemicznych i fizycznych oraz ocena jakości premiksów ... 35
Analiza podstawowa – weendeńska ... 36
7.1. 7.1.1. Oznaczanie wody ... 36
7.1.2. Oznaczanie białka ogólnego ... 36
7.1.3. Oznaczanie tłuszczu surowego techniką spektroskopii bliskiej podczerwieni ... 37
7.1.4. Oznaczanie popiołu ... 38
Oznaczanie pH i gęstości nasypowej luźnej ... 39
7.2. Analiza chlorków ... 39
7.3. Analiza składników mineralnych ... 40
7.4. 8. Techniki chromatograficzne ... 41
Chromatografia cieczowa ... 42
8.1. Budowa i zasada działania układu: chromatograf cieczowy – spektrometr mas ... 46
8.2. 8.2.1. Elektrorozpylanie ... 49
7
8.2.2. Analizator kwadrupolowy ... 49
8.2.3. Analiza ilościowa i jakościowa ... 51
9. Techniki charakterystyki materiałów ... 52
Spektroskopia w podczerwieni z transformacją Fouriera ... 52
9.1. Spektroskopia fotoelektronów w zakresie promieniowania X, XPS ... 54
9.2. Analiza elementarna ... 55
9.3. Powierzchnia właściwa, wielkość i rozkład porów ... 55
9.4. CEL I ZAKRES PRACY ... 58
CZĘŚĆ EKSPERYMENTALNA ... 59
10. Charakterystyka surowców wyjściowych zastosowanych w eksperymencie I, II, III ... 59
11. Skład poszczególnych układów eksperymentalnych ... 61
12. Odczynniki chemiczne ... 63
13. Sposoby otrzymywania premiksów ... 67
Produkcja premiksów w skali przemysłowej ... 67
13.1. Przygotowanie premiksów w skali laboratoryjnej ... 68
13.2. 14. Stosowane metody pomiarowe ... 72
Oznaczanie wody, białka, tłuszczu i popiołu ... 72
14.1. Oznaczanie pH i gęstości nasypowej ... 73
14.2. Oznaczanie chlorków i chlorku choliny ... 74
14.3. Oznaczanie składników mineralnych ... 74
14.4. Oznaczanie witamin ... 75
14.5. FTIR ... 76
14.6. XPS ... 76
14.7. Powierzchnia właściwa, wielkość i rozkład porów ... 78
14.8. Analiza elementarna ... 78
14.9. Mikrobiologia ... 78 14.10.
8 HPLC-MS/MS ... 79 14.11.
WYNIKI I DYSKUSJA ... 81 15. Charakterystyka stabilności materiałów premiksowych dostępnych handlowo –
eksperyment I ... 81 Oznaczenie zawartości witaminy A i E metodą HPLC-DAD ... 81 15.1.
Czynniki potencjalnie wpływające na zmianę zawartości badanych witamin 15.2.
lipofilnych ... 84 Analiza statystyczna ... 85 15.3.
16. Charakterystyka stabilności materiałów premiksowych dostępnych handlowo – eksperyment II ... 88 17. Charakterystyka stabilności materiałów premiksowych przygotowanych w skali
laboratoryjnej – eksperyment III ... 95 Ocena homogenności przygotowanych prób ... 95 17.1.
Analiza podstawowa weendeńska ... 97 17.2.
Wpływ mikroorganizmów na stabilność witamin lipofilnych ... 97 17.3.
Czynniki potencjalnie wpływające na zmianę zawartości witamin lipofilnych .... 98 17.4.
Oznaczenie zawartości witamin techniką HPLC-DAD ... 105 17.5.
Niskotemperaturowa adsorpcja azotu ... 111 17.6.
Analiza elementarna ... 113 17.7.
Spektroskopia w podczerwieni z transformacją Fouriera ... 114 17.8.
Spektroskopia elektronowa XPS ... 119 17.9.
Sprawdzenie przydatności techniki HPLC-MS/MS do oceny stabilności 17.10.
witamin lipofilnych ... 131 Optymalizacja warunków oznaczania izomerów witaminy E ... 146 17.11.
18. Porównanie chromatogramów oraz widm badanych prób PR1-PR3 skanowanych w różnych trybach: MRM, EPI, Q ... 155 19. Prawdopodobne drogi przemian witamin ... 166 20. Podsumowanie ... 170
9
WNIOSKI ... 175
LITERATURA ... 176
SPIS TABEL ... 184
SPIS ILUSTRACJI ... 187
STRESZCZENIE ... 193
ABSTRACT ... 195
DOROBEK NAUKOWY ... 197
10
WYKAZ AKRONIMÓW
AOAC Międzynarodowa Organizacja Chemii Analitycznej
ang. Association of Analytical Communities
APCI Jonizacja chemiczna pod ciśnieniem atmosferycznym
ang. Atmospheric Pressure Chemical Ionization
APPI Fotojonizacja ang. Atmospheric Pressure Photoionization
ATR Spektroskopia osłabionego całkowitego odbicia promieniowania
ang. Attenuated Total Reflectance
BET Izoterma BET Izoterma Brunauera-Emmetta-Tellera
BHT butylowany hydroksytoluen
2,6-bis(1,1-dimetyoetylo)-4-metylofenol
ang. Butylated hydroxytoluene
CEN Europejski Komitet Normalizacyjny ang. European Committee for Standardization
CI Jonizacja chemiczna ang. Chemical Ionization
CV Współczynnik zmienności ang. Coefficient of variation DAD Detektor z matrycą diodową ang. Diode Array Detector EDL Lampa z wyładowaniem bezelektrodowym ang. electrodeless discharge lamp EI Jonizacja elektronowa ang. Electron Ionization
EPI ang. enhanced product ion scan
ESCA Spektroskopia elektronowa do analizy chemicznej
ang. Electron Spectroscopy for Chemical Analysis
ESI Elektrorozpylanie ang. Electrospray Ionization
FAAS Płomieniowa atomowa spektrometria absorpcyjna
ang. Flame Atomic Absorption Spectrometry
FAB Jonizacja bombardowania szybkimi atomami
ang. Fast Atom Bombardment,
FI Jonizacja polem ang. Field Ionization
FSVs Witaminy lipofilne ang. fat soluble vitamins FTIR Spektroskopia w podczerwieni z
transformacją Fouriera
ang. Fourier Transform Infrared Spectroscopy
GML Ogólny model liniowy wielu zmiennych ang. General Linear Model HCL Lampa z katodą wnękową ang. hollow cathode lamp HDL Lipoproteina wysokiej gęstości ang. high-density lipoprotein
11 HPLC Wysokosprawna chromatografia cieczowa ang. High Performance Liquid
Chromatography HPLC-
DAD
Chromatografia cieczowa z detektorem diodowym
ang. High-Performance Liquid Chromatography with Diode-Array Detection
HPLC-MS Wysokosprawna chromatografia cieczowa z detektorem masowym
ang. High Performance Liquid Chromatography-Mass Spectrometry ISO Międzynarodowa Organizacja
Normalizacyjna
ang. International Organization for Standardization
IU Jednostka międzynarodowa ang. International Unit LDL Lipoproteina niskiej gęstości ang. low-density lipoprotein LOD Granica wykrywalności ang. Limit of Detection LOQ Granica oznaczalności ang. Limit of Detection
MALDI Jonizacja laserowa ang. Matrix Assisted Laser Desorption Ionization
MIR Spektroskopia podczerwieni z zakresu fal średnich
ang. Middle Infrared Spectroscopy
MRM Monitorowanie wybranej reakcji ang. Multiple Reaction Monitoring NIR Spektroskopia bliskiej podczerwieni ang. Near Infrared Spectroscopy
NP Faza normalna ang. normal phase
ODS Faza oktadecylosilanowa PCA
PCR
Analiza składowych głównych Reakcja łańcuchowa polimerazy
ang. Principal Component Analysis ang. polymerase chain reaction
RE Równoważnik retinolu ang. Retinol Equivalent
RP Faza odwrócona ang. reversed phase
SCAN ang. Scanning
SIMS Spektrometria jonów wtórnych ang. Secondary Ion Mass Spectrometry SIPS System automatycznego rozcieńczania ang. Sample Introduction Pump System TCD Detektor termokonduktometryczny ang. thermal conductivity detector TIC
WSVs
Całkowity prąd jonowy
Witaminy rozpuszczalne w wodzie
ang. Total Ion Current ang. Water soluble vitamins XPS Spektroskopia fotoelektronów
wybijanych promieniowaniem rentgenowskim
ang. X-ray Photoelectron Spectroscopy
12
WPROWADZENIE
Problem jakości zdrowotnej żywności zarówno dla ludzi jak i zwierząt od dawna wzbudza szerokie zainteresowanie społeczne, a obecnie w czasach daleko posuniętej ingerencji człowieka w szeroko rozumiane środowisko, nabiera to szczególnego znaczenia.
Ogromna presja handlu i olbrzymia konkurencyjność zmusza producentów premiksów stosowanych w żywieniu zwierząt do ciągłego obniżania kosztów wytwarzania tej żywności przy jednoczesnym zachowaniu jej atrakcyjności w oczach konsumenta oraz skuteczności żywieniowej. Cele te nie mogłyby być zrealizowane bez użycia dodatków paszowych.
Premiksy i pasze stosowane w żywieniu zwierząt powinny zapewniać zaspokojenie potrzeb żywieniowych zwierząt oraz oczekiwania hodowców co do deklarowanych właściwości odżywczych i technologicznych. Korzystny wpływ na cechy paszy i środków spożywczych pochodzenia zwierzęcego, zaspokojenie potrzeb żywieniowych zwierząt umożliwia zastosowanie w składzie premiksu, a później paszy, odpowiednio dobranych dodatków paszowych, wśród których ważne miejsce zajmują witaminy.
Już w latach trzydziestych XX wieku opisywano problem zaniku witaminy A w wyniku utleniania ozonem [1]. Przez następnych kilkadziesiąt lat przedstawiono wiele badań dotyczących braku stabilności witamin lipofilnych. Naukowcy opublikowali dotychczas szereg różnych czynników wpływających negatywnie na stabilność witamin w różnych matrycach. W tym czasie techniki ich oznaczeń ulegały ciągłemu udoskonalaniu.
Przemysł paszowy od wielu lat poszukuje przyczyn zmniejszania zawartości witamin w czasie przechowywania premiksów. O ile wskazanie takich niekorzystnych czynników nie jest trudne, to o wiele więcej trudności sprawia znalezienie sposobu ograniczenia wpływu tych czynników na stabilność witamin oraz poznanie dróg przemian, jakim wówczas witaminy podlegają. Witaminy, zwłaszcza lipofilne, są substancjami labilnymi. Metody oraz warunki procesów technologicznych jakim poddaje się materiały i mieszanki paszowe, warunki przechowywania oraz inne składniki paszy warunkują tempo przemian aktywności biologicznej tych witamin.
Żywy organizm potrzebuje do swego istnienia dostarczania z pokarmem różnych składników odżywczych, gdzie każdy spełnia inną funkcję. Tak też jest w przypadku badanych premiksów. Wpływają one bezpośrednio na stan np. zdrowia prosiąt, laktację
13 macior czy też rozrodczość krów. Wdrożenie wyników badań pozwoli na uniknięcie rozwijania się chorób u zwierząt spowodowanych niedoborem witamin. Takie właśnie zjawisko może wystąpić w przypadku zastosowania w gospodarstwach premiksów, w których dochodziłoby do niekontrolowanego i znaczącego rozkładu witamin.
Poruszona problematyka badawcza została wybrana z uwagi na możliwość połączenia aspektów o dużym znaczeniu aplikacyjnym z wątkami o wartości poznawczej.
Tematyka ta, skupiająca się na próbie określenia czynników wpływających na brak stabilności przechowalniczej witamin lipofilnych wpisuje się w przemysłowy aspekt ułatwiający technologię wytwarzania, przetwarzania i przechowywania premiksów. W związku z coraz większymi restrykcjami pojawiającymi się w dyrektywach dotyczących ochrony zdrowia ludzi poprzez odpowiednio zbilansowane żywienie zwierząt obrana problematyka wydaje się istotna, gdyż przekłada się na możliwość opracowania efektywnej techniki wyeliminowania związków potencjalnie niebezpiecznych powstających w procesie niekontrolowanego rozkładu analizowanych witamin a następnie ich utleniania.
Według definicji podanej przez Unię Europejską (Art. 1 Rozp. Rady nr 315/93//EWG) zanieczyszczeniem żywności, zarówno dla ludzi jak i dla zwierząt jest każda substancja, która nie jest celowo dodawana do żywności, a jest w niej obecna w następstwie procesu produkcji (w tym etapy uprawy roślin, chowu zwierząt), a także jej wytwarzania, przetwarzania i przygotowywania.
14
CZĘŚĆ TEORETYCZNA
1. Pasze – podział i zastosowanie
Chów zwierząt to jedna z gałęzi produkcji rolnej. Na jej opłacalność wpływają takie czynniki jak wartość genetyczna materiału hodowlanego (30%), warunki zoohigieniczne (10%) i żywienie zwierząt (60%). Istotnym czynnikiem, warunkującym zysk rolnika, jest więc prawidłowo zbilansowane pożywienie. Do właściwego rozwoju zwierząt gospodarskich i hodowlanych konieczne jest stosowanie odpowiednio przygotowanych pasz. W skład pasz wchodzą odpowiednio zbilansowane naturalne produkty pochodzenia roślinnego, zwierzęcego i mineralnego oraz produkty syntetyczne, które muszą zawierać strawne składniki pokarmowe. Istnieje kilka kryteriów podziału pasz.
W zależności od miejsca ich wytworzenia wyróżniamy pasze gospodarskie np. zboża, zielonki, siano, słoma, okopowe (ziemniaki i buraki) oraz pasze przemysłowe tj. mieszanki pasz treściwych, koncentraty, premiksy. Biorąc pod uwagę pochodzenie możemy pasze podzielić na pasze roślinne (zielonki, siano, zboża i nasiona motylkowych), a także ich susze; również odpady przemysłu młynarskiego, cukrowniczego, fermentacyjnego oraz pasze pochodzenia zwierzęcego tj. mączki mięsno – kostne, mączki rybne, krwinki wieprzowe, serwatka i pasze pochodzenia mineralnego (sól i kreda pastewna, fosforany).
Możliwy jest również podział pasz uwzględniający stopień koncentracji energii oraz ich strukturę fizyczną. Wyróżniamy wówczas pasze objętościowe soczyste (np. kiszonki, zielonki) i suche np. (słoma, plewy) oraz pasze treściwe np. (zboża, susze z roślin zielonych, mączki zwierzęce, mieszanki paszowe przemysłowe) i dodatki specjalne. Ze względu na strukturę mówimy o paszach sypkich, granulowanych, płynnych, suchych i wilgotnych. Ze względu na przeznaczenie gatunkowe pasze dzielimy na drobiowe, dla trzody chlewnej, dla bydła itp. Uwzględniając grupę technologiczną zwierząt wyróżniamy pasze typu prestarter, starter, grower, finiszer, preparaty mleko zastępcze. Natomiast biorąc pod uwagę sposób stosowania/skarmiania/dawkowania mówimy o paszach pełnoporcjowych, uzupełniających, premiksach, dodatkach paszowych i materiałach paszowych [2, 3, 4]. Rys. 1 przedstawia schematyczny podział pasz.
15 Rys. 1 Podział pasz
2. Premiksy – podział i zastosowanie
Premiksy to mieszanki dodatków paszowych lub mieszanki jednego lub więcej dodatków paszowych z materiałami paszowymi lub wodą stosowanymi jako nośniki, nie są przeznaczone do bezpośredniego żywienia zwierząt.
Premiksy dzielą się na:
premiksy jednorodne – składające się wyłącznie z witamin lub minerałów (mikroelementów),
premiksy kompleksowe – stanowią mieszaninę witamin, minerałów i dodatków paszowych.
Dodatki paszowe to substancje, drobnoustroje lub preparaty, inne niż materiał paszowy i premiksy, które są celowo dodawane do paszy lub wody w celu pełnienia jednej lub więcej funkcji między innymi muszą one korzystnie wpływać na cechy paszy, na cechy środków spożywczych pochodzenia zwierzęcego (dodatki zootechniczne), na ubarwienie ozdobnych ryb lub ptaków (dodatki sensoryczne). Powinny one zaspokajać potrzeby żywieniowe zwierząt (dodatki dietetyczne) i mieć korzystne skutki dla środowiska
16 (produkcja premiksów). Dodatki paszowe powinny pozytywnie wpływać na hodowlę lub dobrostan zwierząt, szczególnie wskutek wpływu na florę żołądkowo jelitową lub na strawność paszy oraz dobrze jeśli wykazują działanie kokcydiostatyczne lub histomonostatyczne. Jako dodatki paszowe stosuje się np. witaminy, ziele koniczyny, korę wierzby, olejek czosnkowy, chlorek choliny. Materiały paszowe są przeznaczone w formie nieprzetworzonej lub przetworzonej do żywienia zwierząt albo do sporządzania mieszanek paszowych zawierających dodatki paszowe lub niezawierających tych dodatków albo jako nośniki premiksów (np. fosforany, węglany, śruta sojowa, otręby pszenne). Są to produkty pochodzenia roślinnego np. melasa buraczana lub zwierzęcego (mączki) występujące w stanie naturalnym, świeże lub konserwowane albo przetworzone substancje organiczne i nieorganiczne (np. cukry, drożdże).
Podsumowując, premiksy paszowe to specjalne przedmieszki zawierające niezbędne dla zwierząt mikroskładniki w dużych ilościach (witaminy, mikroelementy, związki mineralne), których zadaniem jest wzbogacać mieszanki paszowe i koncentraty.
Premiksy mają najszersze zastosowanie w produkcji mieszanek i koncentratów, zawierają oprócz minerałów i witamin także stymulatory wzrostu, enzymy, aminokwasy, probiotyki i przeciwutleniacze. Stosowane są tylko w mieszalniach pasz i mogą stanowić maksymalnie tylko 0,5% udziału w typowej paszy [3, 4].
Premiksy powinny być przechowywane w chłodnym, ciemnym i suchym miejscu.
Długość ich przechowywania nie powinna przekraczać trzech miesięcy. Zawartość bardziej stabilnych witamin ulega zmniejszeniu o 1% miesięcznie. Natomiast utrata zawartości mniej stabilnych witamin może wynosić od 4 do 6% miesięcznie, a po ich zmieszaniu z mikroelementami nawet do 30% w skali miesiąca [5].
Zgodnie z Normą Branżową (BN-88/8189-01) premiksy paszowe powinny podlegać kontroli jakościowej obejmującej: postać, zapach, rozdrobnienie, wilgotność, zanieczyszczenia mineralne, zanieczyszczenia ciałami obcymi szkodliwymi dla zdrowia zwierząt, poziom witaminy A i E, poziom mikroelementów i aminokwasów, zawartość stymulatorów wzrostu i kokcydiostatyków. Kontrola jakościowa obejmuje badania pełne, przeprowadzane wyrywkowo, w przypadkach wątpliwych, na żądanie stron oraz badania niepełne, które konieczne są dla każdej partii gotowego wyrobu w celu sprawdzenia zgodności z normą. Standardowy okres trwałości premiksów wynosi 6 miesięcy od daty produkcji, natomiast w przypadku premiksów aminokwasowych 12 miesięcy.
17
3. Trwałość preparatów mineralno - witaminowych
Premiksy do mieszanek paszowych dodaje się na drodze wielu procesów fizykochemicznych. Ma to na celu podniesienie walorów odżywczych tych pasz, ale jednocześnie w wyniku tych procesów często dochodzi do rozkładu naturalnych składników, w tym witamin, a niekiedy do powstawania nowych, często szkodliwych związków chemicznych. Także podczas przechowywania pasz rozkład witamin może być znaczny, mniej istotna jest więc informacja o ilości dodanych witamin a bardziej o ich trwałości. Wysokie zawartości wapnia i magnezu wpływają na destrukcję witamin, głównie E i K, choliny i kwasu askorbinowego i w mniejszym stopniu witaminy B12 oraz witaminy A w formie octanu. Alkoholowe formy witamin są bardziej wrażliwe na rozkład niż ich estry (np. octan tokoferolu). Zwiększona wilgotność i zawartość nadtlenków lipidowych (powstających głównie z wielonienasyconych kwasów tłuszczowych) w obecności Cu i Zn lub innych minerałów są czynnikami przyspieszającymi rozkład witamin. Produkty reakcji witaminy E z rodnikami nadtlenków lipidów to mniej reaktywne rodniki tokoferolowe. Te wolnorodnikowe pochodne tokoferolu wpływają na proces utlenienia lipidów reagując z rodnikiem nadtlenkowym lub z rodnikiem tokoferylowym.
Rodnik ten może zostać usunięty przez inne antyoksydanty, tj.: glutation czy witaminę C.
W gotowych mieszankach pełnoporcjowych, rozkład witamin jest wolniejszy niż w premiksach witaminowo-mineralnych. Dzieje się tak dlatego, że w mieszance pełnoporcjowej czynniki przyspieszające rozkład witamin są bardziej rozcieńczone.
Nadmierne rozdrobnienie pasz jest niewskazane, gdyż pasze takie zmniejszają wydzielanie soków trawiennych i niższe jest ich wykorzystanie przez zwierzęta. Rozdrobnienie nasion roślin oleistych przyspiesza destrukcję witamin rozpuszczalnych w tłuszczach i witaminy C. Zwiększona dostępność tlenu w rozdrobnionych nasionach nasila utlenianie wielonienasyconych kwasów tłuszczowych, a powstałe nadtlenki lipidowe dezaktywują witaminy rozpuszczalne w tłuszczach. W czasie granulowania przeciskanie paszy przez otwory w matrycy powoduje wzrost ciśnienia, temperatury, wilgotności względnej, potencjału oksydoredukcyjnego, co nasila destrukcję witamin. Podczas procesu ekstruzji i ekspansji głównym czynnikiem destrukcyjnym dla witamin jest wysokie ciśnienie i temperatura, 100% wilgotność względna oraz wysoki potencjał oksydoredukcyjny [4, 6, 7].
Oba procesy służą przetworzeniu materiałów pochodzenia biologicznego na cele spożywcze lub paszowe i polegają na ich przetłaczaniu w podanych powyżej warunkach.
18
4. Witaminy
Witaminy to grupa organicznych związków chemicznych, tzw. substancje egzogenne tj. takie, które są niezbędne dla prawidłowego funkcjonowania organizmu żywego i które muszą być dostarczone z pożywieniem, gdyż sam organizm nie potrafi ich wytworzyć. Są związkami naturalnymi lub sztucznymi, działającymi głównie jako koenzymy, katalizują one lub aktywują reakcje chemiczne zachodzące w całym organizmie, a bez ich udziału życie nie jest możliwe. Niektóre witaminy mają również właściwości podtrzymywania wielu procesów biochemicznych, ochrony przed rodnikami tlenowymi i toksynami, przywracania równowagi kwasowo-zasadowej i odporności.
Początek rozwoju witamin datuje się wraz z odkryciem przez K. Funka na początku XX wieku związku, zaliczonego później do grupy witamin B, któremu nadał nazwę witamina oraz odkrycie w 1928 r. przez A. Szent Györgyi kwasu organicznego, nazwanego kwasem askorbinowym [8].
Podział witamin 4.1.
Z punktu widzenia chemicznego witaminy należą do różnych grup związków organicznych, a jedynie ich znaczenie dla organizmów żywych pozwala opisywać je pod wspólną nazwą. Z tego też powodu tradycyjnie witaminy dzieli się na:
rozpuszczalne w wodzie (ang. water soluble vitamins, WSVs) - nie są gromadzone, ale nie ma też zatruć, bo łatwo wydalane są z moczem; witamina C (kwas askorbinowy), witamina B1 (tiamina), witamina B2 (ryboflawina), witamina B3
(niacyna, witamina PP, kwas nikotynowy, amid kwasu nikotynowego), witamina B5 (kwas pantotenowy), witamina B6 (pirydoksyna, pirydoksal, adermina), witamina B7 (biotyna, witamina H), witamina B9/B11 (kwas foliowy), witamina B12 (cyjanokobalamina), witamina P (mieszanina pochodnych flawonoidowych np.
hesperydyna),
rozpuszczalne w tłuszczach (witaminy lipofilne, ang. fat soluble vitamins, FSVs ) - są gromadzone w lipidach organizmu i w wątrobie; w pokarmie występują zazwyczaj w śladowych ilościach i wymagają suplementacji, zwłaszcza, że występuje niska biodostępność dodatków, obecność antywitamin, niestabilność
19 podczas obróbki; witamina A (retinol i jego pochodne), witamina D (cholekalcyferol i pochodne), witamina E (tokoferol), witamina K (fitochinon, menadion).
Ze względu na tematykę badań szczegółowej charakterystyce poddane zostały 2 wybrane witaminy [9, 10, 11].
Witamina A – zbiorcza nazwa grupy organicznych związków chemicznych retinoidów, z których najważniejszy jest retinol. W pożywieniu pochodzenia zwierzęcego podstawową formą w jakiej występuje witamina A jest ester – palmitynian retinolu, który w jelicie cienkim ulega deestryfikacji do alkoholu – retinolu. Inne ważne pochodne związane z aktywnością witaminy A to: retinal (aldehyd) i kwas retinowy (tretynoina).
Rys. 2 Wzory półstrukturalne wybranych pochodnych witaminy A kwasu retinowego (A), retinalu (B), retinolu, głównej postaci aktywnej witaminy A (C)
Retinol ma wolną grupę hydroksylową i 5 wiązań podwójnych – estryfikacja kwasem octowym daje produkt bardziej stabilny, bo zawierający zablokowaną grupę hydroksylową choć posiadający nadal 5 wiązań podwójnych – potencjalnych miejsc utleniania. Dlatego też nawet czysty olej octanu retinolu musi być emulgowany przy użyciu żelatyny lub cukru [12]. Najczęściej używa się suplementów w postaci otoczkowanych preparatów zawierających estry octanowe lub palmitynianowe retinolu o większej stabilności podczas przechowywania i przetwarzania. Preparaty dodatkowo zabezpieczone są przed utlenianiem syntetycznymi antyutleniaczami (etoksyquin, BHT).
Wchłanianie odbywa się w formie zestryfikowanego retinolu, z jelita cienkiego do limfy w około 80%. W tkankach odkłada się 30-60% witaminy pobranej z pokarmem. Obecność witaminy E i tłuszczu ułatwia wchłanianie witaminy A i karotenów, przy czym w
20 przypadku tłuszczów duże znaczenie ma stopień jego emulgacji. W wątrobie zmagazynowane jest około 90% witaminy A. Zwierzęta są mało wrażliwe na jednorazowe, duże dawki witaminy A, natomiast długotrwały nadmiar jest szkodliwy, ponieważ powoduje hamowanie wchłaniania witaminy K. Powtarzające się dawki witaminy A, bez wywoływania zjawiska braku efektu dawki, są zależne od gatunku zwierząt i leżą w zakresie od 5000 do 10000 IU witaminy A na kilogram masy ciała na dzień. Działanie toksyczne z możliwością upadków, przy powtarzającej się dawce, może wystąpić przy ilości 100000 IU i więcej witaminy A na kg masy ciała. Witamina A jest bardziej wrażliwa na wysoką wilgotność niż na wysoką temperaturę. Granulowanie, ekstruzja i ekspansja paszy niszczą duży procent witaminy A, stąd witaminy A i D dodawane są do paszy w postaci mikrokapsułek z dodatkiem antyoksydantów chroniących je nawet po naruszeniu otoczki – wadą jest wysoka cena. Stosuje się również roztwory żelowe do rozpylania – mogą być rozpylane na wychodzące z ekstrudera produkty.
Do wyrażenia aktywności witaminy A i witaminy E stosuje się pojęcie jednostki międzynarodowej – j.m. (ang. International Unit, IU) lub równoważnik (ekwiwalent). Dla witaminy A jest to równoważnik retinolu RR (ang. Retinol Equivalent, RE), który wynosi:
1µg RR = 1 µg retinolu = 6 µg β – karotenu = 12 µg innych karotenoidów 1 j.m. witaminy A = 0,3 µg trans retinolu lub 0,6 µg β – karotenu.
Witamina E należy do grupy organicznych związków chemicznych, w skład której wchodzą tokoferole i tokotrienole. Ich wspólną cechą jest dwupierścieniowy szkielet 6-chromanolu oraz łańcuch boczny zbudowany z 3 jednostek izoprenowych. Wyróżnia się 4 formy witaminy E: α, β, γ i δ, różniące się liczbą podstawników metylowych na pierścieniu fenylowym. Każda z 8 form witaminy E wykazuje nieco inną aktywność biologiczną.
Rys. 3 Wzór półstrukturalny wszystkich izomerów witaminy E
21 𝛼 − 𝑡𝑜𝑘𝑜𝑓𝑒𝑟𝑜𝑙, 𝑅1 = 𝑅2 = 𝑅3 = 𝐶𝐻3
𝛼 − 𝑡𝑜𝑘𝑜𝑡𝑟𝑖𝑒𝑛𝑜𝑙, 𝑅1 = 𝑅2 = 𝑅3 = 𝐶𝐻3 𝛽 − 𝑡𝑜𝑘𝑜𝑓𝑒𝑟𝑜𝑙, 𝑅1 = 𝑅3 = 𝐶𝐻3; 𝑅2 = 𝐻 𝛽 − 𝑡𝑜𝑘𝑜𝑡𝑟𝑖𝑒𝑛𝑜𝑙, 𝑅1 = 𝑅3 = 𝐶𝐻3; 𝑅2 = 𝐻
𝛾 − 𝑡𝑜𝑘𝑜𝑓𝑒𝑟𝑜𝑙, 𝑅1 = 𝑅2 = 𝐶𝐻3; 𝑅3 = 𝐻 𝛾 − 𝑡𝑜𝑘𝑜𝑡𝑟𝑖𝑒𝑛𝑜𝑙, 𝑅1 = 𝑅2 = 𝐶𝐻3; 𝑅3 = 𝐻
𝛿 − 𝑡𝑜𝑘𝑜𝑓𝑒𝑟𝑜𝑙, 𝑅1 = 𝑅2 = 𝑅3 = 𝐻 𝛿 − 𝑡𝑜𝑘𝑜𝑡𝑟𝑖𝑒𝑛𝑜𝑙, 𝑅1 = 𝑅2 = 𝑅3 = 𝐻
Za podatność na działanie oksydacyjne odpowiedzialna jest wolna hydroksylowa grupa fenolowa. Jeśli grupa ta jest chroniona w wyniku utworzenia estru to otrzymany związek jest odporny na działanie tlenu, ponieważ nie ma wolnej grupy hydroksylowej.
Octan witaminy E jest stabilny w paszach w neutralnym lub lekko kwaśnym pH. Przy czym nawet lekko zasadowe warunki mogą przyczynić się do zmniejszenia stabilności.
Taka sytuacja występuje gdy jako nośnik zastosowana jest kreda lub w obecności dużych ilości tlenku magnezu. W tych warunkach chronione grupy w octanie ulegają hydrolizie i wówczas powstaje wolny tokoferol, który może być szybko utleniony. Zawartość witaminy E wyraża się w tabelach żywieniowych jako "równoważnik α-tokoferolu" w miligramach [mg], który wykazuje 100% bioaktywności. 1 [mg] równoważnika α- tokoferolu odpowiada:
1 [mg] czystej formy α-tokoferolu, 2 [mg] β-tokoferolu (beta-tokoferolu), 4 [mg] γ-tokoferolu (gamma-tokoferolu), 5 [mg] α-tokotrienolu (alfa-tokotrienolu), 25 [mg] β-tokotrienolu (beta-tokotrienolu), 25 [mg] γ-tokotrienolu (gamma-tokotrienolu).
1 [mg] równoważnika α-tokoferolu = 1,5 jednostek międzynarodowych [IU].
Najczęściej stosowany jest octan D-α-tokoferolu – względnie stabilny przy przechowywaniu i przetwarzaniu. Główną jego funkcją jest ochrona tłuszczu, kwasów nukleinowych przed reaktywnymi formami tlenu, zarówno w tkankach jak i w paszach.
Wobec tego utlenia się on szybciej niż ochraniane składniki. Półokres trwania witaminy E w osoczu, wątrobie i nerkach wynosi 2-5 dni, zaś w tkance nerwowej – 28-80 dni.
Wchłaniana jest w jelitach do limfy wraz z tłuszczami, w obecności soku trzustkowego i kwasów żółciowych, we krwi krąży związana z frakcjami LDL i HDL lipoprotein. Formy
22 octanowe są rozkładane przez enzymy trzustkowe, co ułatwia wchłanianie. Wchłaniane jest około 10-70% witaminy podanej w pokarmie. Zwiększona zawartość włókna obniża wchłanianie. Wbudowywana jest we wszystkie błony komórkowe więc gromadzi się we wszystkich tkankach, również w wątrobie; duże ilości magazynowane są w tkance tłuszczowej [2, 13, 14].
Stabilność witamin 4.2.
Z punktu widzenia kupującego materiały paszowo – premiksowe ważniejsza będzie informacja dotycząca formy chemicznej, w jakiej dodane witaminy występują, bo w zależności od tego zmienia się tempo jej rozkładu w czasie przechowywania i przetwarzania (Tabela 1). Badane w niniejszej pracy witaminy są stabilne w zakresie pH zaznaczonego w Tabeli 2 kolorem zielonym. Podsumowując najważniejsze jest określenie przez producenta, jaka będzie minimalna zawartość witamin pod koniec okresu przydatności do spożycia.
Tabela 1 Wpływ czynników zewnętrznych na trwałość wybranych witamin
Tabela 2 Zakres pH a stabilność witamin
światło czynnik utleniający
czynnik
redukujący temperatura wilgotność środowisko kwasowe
środowisko zasadowe
witamina A +++ +++ + ++ + ++ +
witamina D +++ +++ + ++ + ++ ++
witamina E ++ ++ + ++ + + ++
witamina K +++ ++ + + + + +++
witamina C + +++ + ++ ++ ++ +++
niacyna + + ++ + + + +
witamina B6 ++ + + + + ++ ++
witamina B12 ++ + +++ + ++ +++ +++
kwas foliowy ++ +++ +++ + + ++ ++
+ brak wpływu lub słaby wpływ ++ średni wpływ +++ silny wpływ
1 2 3 4 5 6 7 9 10 11 12 13 14
A E D3
Witaminy pH
8
23
5. Minerały
Jednym z dodatków paszowych są składniki mineralne znajdujące zastosowanie w żywieniu wielu gatunków i grup produkcyjnych zwierząt gospodarskich. Ze względu na ilość potrzebną do życia zwierząt podzielono je na 2 grupy [4, 15]:
makroelementy – ich ilość w organizmie wynosi powyżej 50 mg/kg masy ciała i zaliczamy do nich przede wszystkim: wapń, fosfor, magnez, potas, sód, chlor i siarkę,
mikroelementy – ich ilość w organizmie wynosi poniżej 50 mg/kg masy ciała i należą do nich: żelazo, chrom, cynk, fluor, jod, kobalt, mangan, miedź, molibden i selen.
Pierwiastki te są niezbędne do życia zwierząt, gdyż biorą udział w przemianie materii. Z tego względu warto wiedzieć, jakie jest ich działanie w zależności od tego, w jakich ilościach i proporcjach występują w paszy. W odróżnieniu od witamin są to związki nieorganiczne. Ilość i jakość składników mineralnych zawartych w paszach roślinnych zależy w dużym stopniu od prawidłowego nawożenia, uprawy gleby i sposobu przygotowania pasz. Jednak nawet pasze wysokiej jakości pokrywają zapotrzebowanie na składniki mineralne tylko u zwierząt o małej wydajności użytkowej. Duży wysiłek organizmu (np. produkcja mleka) sprawia, że w organizmie wzrasta zapotrzebowanie na różne składniki mineralne i witaminy, a ich niedobór w paszy może doprowadzić w konsekwencji do wielu chorób. Aby uniknąć zaburzeń spowodowanych niedostatkiem któregoś z opisanych składników oraz wyeliminować niepotrzebne straty wskutek spadku produkcji, należy stosować odpowiednio dobrane do wieku, gatunku i sposobu użytkowania dodatki paszowe.
Magnez (Mg) – bardzo ważny pierwiastek chroniący serce, ponadto bierze udział w przemianach biochemicznych organizmu poprzez aktywację około 300 enzymów w uwalnianiu energii z białek, węglowodanów i tłuszczy. Jest aktywatorem enzymów, hormonów i witamin. Uczestniczy w pracy mięśni i przesyłaniu impulsów nerwowych.
Magnez współdziała z witaminą B1 i B6, przy nadmiarze cukrów następuje zwiększenie wydzielania tego pierwiastka z organizmu wraz z moczem. W premiksach występuje najczęściej w postaci MgO. Jego wysokie stężenia mają wpływ na zaburzenia stabilności witamin lipofilnych w tych mieszankach.
24 Żelazo (Fe) – pełni podstawową funkcję w tworzeniu enzymów biorących udział w łańcuchu oddechowym komórek mięśniowych. Jest nośnikiem tlenu w krwi wchodząc w skład hemoglobiny. Nadmiar w paszy miedzi, wapnia i magnezu ogranicza wchłanianie tego mikroelementu. W premiksach występuje najczęściej w postaci siarczanu (VI) żelaza (II) lub diglicynianu żelaza (II).
Miedź (Cu) – wpływa na metabolizm żelaza w organizmie zwierzęcym. Jednak do ważniejszych jej ról można zaliczyć udział w podtrzymywaniu i rozwoju czynności układu naczyniowo-sercowego, kostnego i nerwowego poprzez aktywację szeregu enzymów.
Razem z żelazem i kobaltem jest niezbędna do produkcji czerwonych krwinek. Nadmiar w organizmie zwierzęcym takich pierwiastków jak wapń, cynk, molibden czy kadm hamuje wchłanianie miedzi. Należy jednak pamiętać, że nadmiar miedzi jest w organizmie toksyczny, szczególnie, że jest ona dość łatwo kumulowana w wątrobie i mięśniach.
W premiksie występuje w postaci CuSO4 lub diglicynianu miedzi.
Cynk (Zn) – jest obecny w centrach aktywnych ok. 200 enzymów; m. in. bierze udział w przemianie metabolicznej, w procesie gojenia się ran, wspomaga odporność, wpływa na stężenia witaminy A. Do premiksu dodawany jest jako ZnSO4 lub ZnO lub diglicynian cynku.
Zarówno żelazo jak i miedź oraz cynk podejrzewane są o wpływ na obniżenie zawartości witamin lipofilnych w premiksach. Być może jest to spowodowane zachodzeniem reakcji redoks o ile nośnikiem jest substancja o wysokiej wilgotności.
6. Stabilność wyrobów premiksowych
Zbadano stabilność witaminy A w różnych układach żywieniowych i w zmiennych warunkach magazynowych. Witamina A dodana była w formie tranu (oleju z wątroby dorsza). W ten sposób uzyskano większą stabilność układu badanego dla paszy o średniej wielkości cząstek w porównaniu z paszą gruboziarnistą. Efekt ten pozostał stały pomimo wpływu światła, utleniania atmosferycznego, temperatury i rodzaju pojemnika.
Potwierdzono destrukcyjny wpływ soli mineralnych na witaminę A i zastosowano dodatek żelatyny. Stabilność witaminy A w tranie jest większa w obecności mączki rybnej i mączki z wątroby, ale jednocześnie jest mniejsza w obecności suszonych drożdży piwnych, w porównaniu do wpływu różnych produktów zbożowych. W szczególnych warunkach
25 przeprowadzonego eksperymentu stabilność palmitynianu witaminy A jest większa niż w postaci oleju z wątroby dorsza nawet po dodaniu zmieszanych mączek [16].
Naukowcy Politechniki Łódzkiej analizowali również stopień degradacji witaminy C w wybranych warzywach. Mechanizm rozkładu witaminy C w badanych warzywach zależał od warunków ich przechowywania. W warzywach przechowywanych na powietrzu rozkład witaminy C odpowiadał kinetyce rzędu I, natomiast przechowywanych w kontrolowanej atmosferze (4% CO2, 3% O2, 93% N2, w temp. 0–1oC) kinetyce rzędu „0”.
Zastosowanie kontrolowanej atmosfery pozwala zachować w większym stopniu witaminę C, jak i ogólne właściwości przeciwutleniające warzyw. Wyznaczone równania kinetyczne pozwoliły określić stopień degradacji witaminy C w dowolnym okresie przechowywania oraz ustalić, w jakim stopniu zachowane są właściwości przeciwutleniające [17].
Grupa innych badaczy podjęła się analizy trwałości witamin podczas obróbki krewetek jak i ich magazynowania. Do badań przygotowano 8 prób o takiej samej zawartości białka, ale różnym udziale witamin A, E i C. Maksymalna temperatura obróbki wynosiła 70oC, a czas przechowywania 60 dni. Najbardziej trwała okazała się być witamina A, a największą stratę odnotowano dla witaminy C – ok. 30% w stosunku do początkowej zawartości [18, 19] .
Badano również stabilność tokoferoli i tokotrienoli ekstrahowanych z niezmydlonej frakcji otrąb ryżowych. Przeprowadzono badanie stabilności termicznej (maksymalna temperatura 95oC, 24 godziny), zdolności do utleniania, test mieszania roztworów rozpuszczalników organicznych (izooktan i heksan) lub olejów jadalnych oraz analizę HPLC. Wszystkie izomery tokoferolu i tokotrienolu wykazują różną stabilność w obecności zwiększonych ilości tlenu i w zmiennych warunkach temperatury. α- tokotrienol jest bardziej czuły na ogrzewanie. Forma α-tokoferoli i tokotrienoli odznacza się mniejszą degradacją przy dużej zawartości tlenu w porównaniu do izomerów gamma.
Rozpuszczalniki organiczne były bardziej skuteczne dla utrzymania stabilności izomerów
-tokotrienoli w porównaniu do olejów jadalnych. Natomiast olej kukurydziany był bardziej skuteczny niż olej sojowy i ryżowy [20]. Badania nad wpływem światła i temperatury na stabilność witamin rozpuszczalnych w tłuszczach przeprowadzono również w krwi [21].
Analizowano wpływ ołowiu, miedzi, kadmu i rtęci na zawartość chlorofilu, proliny, retinolu, α-tokoferolu i kwasu askorbinowego u 17-dniowych siewek fasoli (Phaseolus vulgaris L.) uprawianych w ziemi wzbogaconej różnymi stężeniami roztworów soli PbCl2,
26 CuCl2, CdCl2•H2O and HgCl2. Całkowita zawartość chlorofilu, proliny, retinolu, α- tokoferolu i kwasu askorbinowego była mierzona w pierwszych liściach po 10 dniach ekspozycji w roztworze metali. Uzyskane wyniki wykazały, że toksyczność ołowiu, miedzi, kadmu i rtęci wpływa na zmniejszenie całkowitej ilości chlorofilu zawartego w liściach siewek fasoli. W reakcji na warunki stresowe, wzrosła natomiast zawartość proliny, retinolu, α-tokoferolu i kwasu askorbinowego. Największy ich wzrost zanotowano w roślinach wystawionych na działanie rtęci i następnie kadmu i miedzi a najmniejszy wpływ odnotowano dla soli ołowiu [22].
Stabilność witaminy E została również zbadana w pieczywie (świeżym, 3 i 7- dniowym) oraz w cieście przechowywanym w temperaturze pokojowej. Wyniki oznaczeń witaminy E jednoznacznie pokazują, że w cieście nie nastąpił jej ubytek. Natomiast podczas wypiekania straty witaminy E były znaczące (spadek o 1/3) i obserwowane w obu zestawach wykonanych eksperymentów. Inne rezultaty pokazały badania z wykorzystaniem świeżo wypieczonego chleba zawierającego początkowo 100 mg octanu tokoferolu. Odnotowano spadek witaminy E o 4%. Jest to zastanawiające, ale może być spowodowane inną techniką wypiekania i różnymi źródłami witaminy E [23].
Dokonano oceny stabilności przechowalniczej witamin A i E w granulowanych mieszankach paszowych z udziałem ekstrudatu nasion lnianki oraz preparatu zakwaszającego. Próby umieszczono w warunkach modelowych – temperatura 25°C, przy wilgotności 50-55% na 6 miesięcy. Straty witaminy A w czasie trwania eksperymentu wyniosły średnio około 10% na miesiąc, a dla witaminy E około 4% na miesiąc. Nie odnotowano wpływu zastosowanych dodatków na zmiany zawartości oznaczanych witamin [24].
W trakcie XVIII Sympozjum na Florydzie na temat żywienia zwierząt omówiono problematykę stabilności witamin podczas wytwarzania paszy i jej magazynowania [25], wpływu premiksów oraz skutki pelletyzacji i ekstruzji [26]. Stosowanie witamin chronionych czy też w formie kapsułek doskonale poprawia ich stabilność, nawet podczas drastycznej obróbki technologicznej np. stabilność witaminy A w chronionej pszenicy i mące kukurydzianej jest zadawalająca. Przedstawiono badania pokazujące, że mąka pszenna i mąka kukurydziana, przechowywane w normalnych warunkach, zachowują ponad 95% witaminy A po sześciu miesiącach w temperaturze pokojowej. Stabilność witaminy A przy wysokiej temperaturze składowania nie jest tak dobra. Mąka pszenna przechowywana przez trzy miesiące w 45°C zachowała tylko 72% witaminy A. Stabilność
27 witaminy E zależy od jej izomeru. Octan α-tokoferolu jest najbardziej stabilny. Witamina E występująca naturalnie utlenia się wolno podczas ekspozycji na powietrzu. Natomiast witamina E dodana w postaci octanu zachowuje swoje właściwości.
Podsumowując - istnieje wiele fizycznych i chemicznych czynników, które mają negatywny wpływ na stabilność witamin. W witaminowo - mineralnych premiksach dominujący wpływ na stabilność witamin mają składniki sprzyjające występowaniu reakcji redoks. Największy wpływ wywierają pierwiastki śladowe o strukturze molekularnej tj.
miedź, cynk, żelazo; nieco mniejszy wpływ wykazują mangan i selen. Najbardziej reaktywne są siarczany, węglany i tlenki tych metali, najmniej ich chelaty (są niezdolne do tworzenia wolnych rodników). Zauważono również, że rozdrabnianie, mielenie nie jest wskazane, ponieważ uszkodzona zostaje powłoka chroniąca witaminy. Formy estrowe witamin rozpuszczalne w tłuszczach są bardziej stabilne niż ich formy alkoholowe.
Witamina A jest bardziej stabilna w premiksie witaminowym niż w premiksie z dodatkiem minerałów, ponieważ katalizują one utlenianie 5 wiązań podwójnych. Takie utlenienie nie jest kontrolowane. W zależności od czynników zewnętrznych możemy otrzymać aldehyd i keton albo już sam alkohol jeśli utlenieniu ulegnie część octanowa lub inne produkty utlenienia jeśli reakcje zachodzić będą w łańcuchu. Przedstawiono mechanizm reakcji zachodzącej podczas utleniania wybranego wiązania nienasyconego w łańcuchu węglowodorowym octanu witaminy A (Rys. 4). Możliwe jest, że taki mechanizm zachodzi również w badanych w niniejszej pracy premiksach.
28 Rys. 4 Mechanizm wybranej reakcji utlenienia octanu witaminy A
29 Przedstawiono wyniki oznaczania stabilności witaminy A w paszy – po 3 miesiącach magazynowania retencja wynosiła 88% w warunkach niskiej temperatury i wilgotności, 86% w warunkach wysokiej temperatury i niskiej wilgotności oraz 2% w wysokiej temperaturze i wilgotności. Stwierdzono, że większy wpływ na zawartość witaminy A ma wilgotność niż temperatura [27]. W pelletyzacji najważniejszymi czynnikami mającymi wpływ na destrukcję witamin są: tarcie, temperatura, wilgotność i czas kondycjonowania. Shields i in. zmierzyli stabilność witaminy A w mieszance i w granulacie. Po 3 miesiącach magazynowania retencja witaminy A spadła z 50% w niskiej temperaturze do 39% w wysokiej temperaturze w mieszance i od 65% do 20% w granulacie [28].
Innym czynnikiem, który może wpływać na obniżenie zawartości witamin w czasie przechowywania może być chlorek choliny. Główne funkcje choliny, dawniej zwanej witaminą B4, której źródłem jest chlorek choliny są następujące: wchodzi w skład fosfolipidów, jest prekursorem syntezy acetylocholiny, jest źródłem grup metylowych wymaganych w wielu procesach biologicznych. Niedobór choliny u zwierząt doświadczalnych prowadzi do nagromadzenia tłuszczu w wątrobie, rozległego krwotocznego zapalenia nerek i zaniku grasicy. Badania na psach wykazały, że po kilkudziesięciu daniach trzymania ich na diecie bez choliny nastąpiło silne pogorszenie funkcji wątroby. Podawanie choliny przez 5-10 dni przywracało czynności wątroby do stanu normalnego. Jednocześnie prowadzone badania pokazują, że chlorek choliny istotnie wpływa na brak stabilności witamin w premiksach. Dlatego też trwają również prace badawcze nad wyeliminowaniem chlorku choliny i zastąpieniem go betainą, która jest dawcą grup metylowych. Taka zamiana daje wymierne obniżenie kosztów paszy. Za zamianą całego chlorku choliny na betainę (za wyjątkiem indyków do 6 tygodnia życia) przemawiają następujące fakty:
cholina, by stać się dawcą grup metylowych musi przejść w betainę. Proces ten zachodzi w wątrobie dodatkowo ją obciążając, a wydajność tego procesu waha się w granicach 35-70%;
betaina gwarantuje stabilność witamin w magazynowanych paszach i premiksach (po 70 dniach przechowywania premiksu drobiowego z chlorkiem choliny aktywność witaminy A spada do 7%, witaminy B6 do 37%, a witaminy K3 do 6%
już po 42 dniach przechowywania) [29].
Podjęto próbę oceny wpływu chlorku choliny i w związku z tym przeprowadzono roczne badania stabilności witamin A, E i K3 w premiksach magazynowanych
30 w kontrolowanych warunkach. W okresie 12 miesięcy stężenie analizowanych witamin spadło dla A - do 53%, dla E - do 59%, dla K3 –do 80% w premiksie bez chlorku choliny.
Natomiast dodatek chlorku choliny istotnie wpłynął na zawartość witamin. Odnotowano spadek dla witaminy A do 39%, dla witaminy E do 9% i dla witaminy K3 do 9% ich początkowej zawartości [30].
Norwesko-belgijski zespół badawczy przeprowadził badania stabilności wybranych witamin w różnych materiałach certyfikowanych (mleko w proszku, mączka mięsna i liofilizowana fasola). Obserwacje długoterminowe prowadzono przez okres 24 miesięcy w temperaturze 18oC i +4oC, krótkoterminowe w 25oC i w 30oC. Nie odnotowano znaczących strat witamin. Natomiast magazynowanie w temperaturze 42oC powoduje rozkład retinolu, α-tokoferolu i witaminy C [31].
Podobne badania jak Tavcar-Kalcher [30] oraz Hollmann [31], przeprowadzono dla układów zawierających typowy premiks mineralny, nieorganiczne mikroelementy i metaliczne specyficzne kompleksy aminokwasowe i określono ich wpływ na stabilność witamin w premiksach. Wszystkie próby badane były przechowywane w warunkach kontrolowanych. Po upływie 1 miesiąca nie odnotowano istotnych strat witamin poza witaminą B12 i chlorkiem choliny. Kompleksy aminokwasowe istotnie zmniejszają straty badanych witamin w porównaniu do strat aktywności witamin w premiksach zawierających mikroelementy. Wyznaczono również pH analizowanych materiałów. Dla premiksu witaminowego ok. 5, dla premiksu mineralno-witaminowego ok. 4, a dla kompleksu witaminowego ok. 2 [32].
W pracy autorstwa Sroka i in. [33] oraz Gałecka i in. [34] podjęto dyskusję nad działaniem antyoksydacyjnym i prooksydacyjnym wybranych utleniaczy pochodzenia naturalnego m.in. badania dotyczyły tokoferoli, witaminy C i karotenoidów. Analizowano różne mechanizmy rodnikowych przemian tych związków oraz przedstawiono możliwe konsekwencje tych reakcji dla organizmów żywych. Witamina E jest zmiataczem rodników ponadtlenkowych, jest prawdopodobnie najważniejszym, choć nie jedynym, inhibitorem łańcuchowej reakcji wolnorodnikowej przebiegającej podczas utleniania (peroksydacji) lipidów. -tokoferol działając jako przeciwutleniacz lub zmiatacz wolnych rodników przechodzi w postać rodnikową (-T•). Może ona zostać zredukowana ponownie do -tokoferolu w reakcji z substancjami, takimi jak glutation i witamina C. W literaturze spotyka się doniesienia o istnieniu synergizmu między -tokoferolem i askorbinianem [35]
oraz prace, które nie potwierdzają udziału askorbinianu w regeneracji rodnikowej postaci
31 tokoferolu (-T•) [36]. Możliwa jest też inna konwersja rodników witaminy E do - tokoferylochinonu i innych produktów, które są wydalane z moczem. Tokoferole wykazują również pewne właściwości prooksydacyjne w układach in vitro. Podobnie jak witamina C podczas redukcji Fe (III) do Fe (II) i Cu (II) do Cu (I), tokoferole stymulują powstawanie rodników OH•. Poza tym rodnik -T• poprzez stosunkowo wolną reakcję jest zdolny oderwać wodór z cząsteczki wielonienasyconego kwasu tłuszczowego
𝛼 − 𝑇·+ 𝑅𝐻 𝑅·+ 𝛼 − 𝑇
i w ten sposób działa jako słaby promotor utleniania tłuszczów bogatych w nienasycone kwasy tłuszczowe [33].
Podobne badania jak Coelho przedstawił Dove. Analizował paszę typu grower stosowaną w żywieniu trzody chlewnej. Eksperyment trwał 12 tygodni. Użyto wysokich zawartości mikroelementów (250 ppm Cu, 1,000 ppm Fe, 1,000 ppm Zn, 100 ppm Mn). Zawartość octanu α-tokoferolu zmniejszała się liniowo. Dodatek oleju sojowego nie miał wpływu na ubytek α-tokoferolu [37].
Wśród czynników powodujących brak stabilności witamin w premiksach podczas różnych procesów wytwarzania np. podczas pelletyzacji i magazynowania można wymienić temperaturę, wilgotność, czas przechowywania, reakcje redoks, wpływ światła.
Reakcje te mogą się różnić. Utlenianie witamin może być spowodowane postępem autooksydacji tłuszczów, zachodzeniem reakcji Fentona w obecności minerałów, hydrolitycznym lub mikrobiologicznym utlenianiem. Dlatego ważne jest, aby określając stabilność witamin wziąć pod uwagę każdy etap wytwarzania (pasze proste, premiksy, przedmieszki) i przetwarzania (pelletyzacja, ekstruzja) danego materiału żywieniowego i czas ich przechowywania, ponieważ witaminy ulegają zmianom na każdym z tych etapów.
Dobrą ilustracją są wyniki Coelho [28, 5] dotyczące średniej stabilności witamin w premiksach w różnych procesach (Tabela 3 do Tabela 12).
32 Tabela 3 Czynniki wpływające na poziom witamin w zależności od sposobu wytwarzania paszy [28]
Tabela 4 Przeciętna przemysłowa stabilność wybranych witamin w premiksie witaminowym, bez choliny [28]
Tabela 5 Wpływ źródła mikroelementu na przeciętną przemysłową stabilność wybranych witamin w premiksach [28]
Retencje witamin [%]
Witaminy
Miesiąc
[%]
Przeciętna strata/miesiąc Źródło
mikroelementu 0,25 0,5 1 2 3 4 5 6
A chroniona, z otoczką
chelat 99 97 93 89 85 81 76 74 4
tlenek 98 96 92 87 82 78 73 71 5
węglan 97 95 89 83 89 70 66 62 7
siarczan 95 93 86 74 65 57 53 47 11
wolny metal 94 92 83 71 62 54 50 43 12
Octan witaminy E,
50%
chelat 100 99 97 96 95 93 92 90 2
tlenek 99 98 96 95 94 92 90 88 2,3
węglan 99 98 96 95 93 91 89 87 2,4
siarczan 98 97 95 92 88 86 83 80 3
wolny metal 97 96 94 91 86 84 80 77 3,4
Premiks witaminowy
Premiks mineralny
z choliną
Mieszanie Pelletyzacja Ekstruzja
Ogrzewanie + + + ++ +++
Ciśnienie + + + ++ +++
Wilgotność + ++ + ++ +++
Reakcje redoks + ++ ++ ++ +++
Tarcie + ++ ++ +++ +
+ brak wpływu lub słaby wpływ ++ średni wpływ +++ silny wpływ
0,25 0,5 1 2 3 4 5 6
A chroniona, z otoczką 100 99 99 98 96 96 94 95 0,9
A bez otoczki 99 97 95 93 91 87 84 80 2,9
Octan witaminy E 50% 100 99 99 99 98 98 98 98 0,2
Witamina E alkoholowa,
naturalna 90 80 64 36 21 13 7 0 35
Witaminy [%] Przeciętna
strata/miesiąc Retencja witamin [%]
Miesiąc
33 Tabela 6 Przeciętna przemysłowa stabilność wybranych witamin w premiksie witaminowym z choliną [28]
Tabela 7 Przeciętna przemysłowa stabilność wybranych witamin w premiksie witaminowo – mineralnym bez choliny [28]
Tabela 8 Przeciętna przemysłowa stabilność wybranych witamin w premiksie witaminowo – mineralnym z choliną [28]
0,25 0,5 1 2 3 4 5 6
A chroniona, z otoczką 99 98 97 96 95 94 92 90 2
A bez otoczki 98 96 90 86 80 74 68 60 8,1
Octan witaminy E 50% 100 100 99 99 99 98 98 98 0,3
Witamina E alkoholowa,
naturalna 89 77 52 30 18 10 5 1 40
Witaminy [%] Przeciętna
strata/miesiąc Miesiąc
Retencja witamin [%]
0,25 0,5 1 2 3 4 5 6
A chroniona, z otoczką 98 97 94 93 90 87 84 80 2,9
A bez otoczki 97 94 90 86 80 74 68 60 8,1
Octan witaminy E 50% 99 98 96 95 93 90 87 84 2,7
Witamina E alkoholowa,
naturalna 90 78 50 28 14 7 4 0 46
Witaminy Miesiąc [%] Przeciętna
strata/miesiąc Retencja witamin [%]
0,25 0,5 1 2 3 4 5 6
A chroniona, z otoczką 98 96 94 90 84 79 75 70 3,9
A bez otoczki 94 85 68 59 50 42 32 25 20
Octan witaminy E 50% 99 98 96 92 88 85 81 77 2,4
Witamina E alkoholowa,
naturalna 85 76 35 20 7 0 0 0 57
Witaminy Miesiąc [%] Przeciętna
strata/miesiąc Retencja witamin [%]
