Medycyna Wet. 2006, 62 (11) 1298
Praca oryginalna Original paper
Pasa¿owalne g¹bczaste encefalopatie (TSEs) zwie-rz¹t domowych, do których zalicza siê, miêdzy inny-mi, BSE byd³a i trzêsawkê owiec, nale¿¹ do chorób prionowych, w przebiegu których dominuj¹ zmiany neurodegeneracyjne. D³ugi okres inkubacji oraz brak objawów klinicznych w latentnej fazie rozwoju cho-roby sprawiaj¹, ¿e przy¿yciowa diagnostyka laborato-ryjna na obecnym etapie wiedzy w³aciwie nie istnie-je. Powszechne uznanie istnienia zwi¹zku miêdzy spo-¿ywaniem produktów od byd³a chorego na BSE, a po-jawieniem siê wariantu choroby Creutzfeldta-Jakoba u ludzi zwróci³o uwagê na zagro¿enie dla konsumenta (4, 13). W przeciwieñstwie do BSE, znana od kilkuset lat trzêsawka ma³ych prze¿uwaczy nie stanowi³a za-gro¿enia i dotychczas nie opisano zachorowañ typo-wych dla chorób prionotypo-wych u ludzi, które mo¿na by ³¹czyæ ze spo¿ywaniem produktów pochodzenia owczego lub koziego. W zwi¹zku z powszechnym sto-sowaniem m¹czek miêsno-kostnych w ¿ywieniu ma-³ych prze¿uwaczy istnieje ryzyko transmisji BSE do pog³owia owiec i kóz. Potwierdzaj¹ to wyniki zaka-¿eñ eksperymentalnych owiec i kóz homogenatem tkanki nerwowej krów z potwierdzonym BSE (6). Po-danie 0,5 g materia³u BSE drog¹ doustn¹ prowadzi³o do zachorowañ zarówno owiec, jak i kóz, przy czym okres inkubacji choroby u kóz by³ d³u¿szy. Zagro¿e-nie mo¿e wynikaæ z odmiennego rozmieszczenia pa-tologicznego bia³ka prionowego u owiec. Patologicz-ne bia³ko prionowe u owiec gromadzi siê nie tylko w orodkowym uk³adzie nerwowym, jak ma to miejs-ce w przypadku BSE u byd³a, ale tak¿e w uk³adzie
limfatycznym, co mo¿e zwiêkszaæ ryzyko transmisji choroby do cz³owieka. Na pocz¹tku 2005 r., opisano pierwszy przypadek g¹bczastej encefalopatii u kozy, który zarówno w próbie biologicznej na myszkach, jak i w badaniach molekularnych wykazywa³ cechy typo-we dla czynnika BSE byd³a (5). Oznacza³o to, ¿e BSE w warunkach naturalnych mo¿e przekraczaæ barierê gatunkow¹ byd³o/koza. Pod koniec lat 90. XX w. w Wielkiej Brytanii, pojawi³y siê obawy, ¿e BSE wnik-nê³o do pog³owia owiec i pozostaje nierozpoznane ze wzglêdu na podobieñstwo objawów klinicznych za-równo w przypadku naturalnie wystêpuj¹cej trzêsaw-ki owiec, jak i po zaka¿eniu dowiadczalnym owiec czynnikiem BSE (3). Ponadto, od 2003 r. notuje siê przypadki atypowej trzêsawki owiec w Europie o nie-znanym pochodzeniu (1, 2, 7, 12). W zwi¹zku z tym próbki mózgowia, w których wykryto obecnoæ pato-logicznego bia³ka prionowego powinny byæ poddane badaniu w tecie ró¿nicuj¹cym, czy jest to czynnik ty-powy dla trzêsawki, czy dla BSE. Badanie to ma okre-liæ ewentualne zagro¿enie dla cz³owieka pochodz¹ce od obecnoci czynnika BSE w populacji ma³ych prze-¿uwaczy. Mo¿liwoæ prowadzenia takich badañ wi¹-za³a siê to z koniecznoci¹ opracowania nowych me-tod diagnostycznych, poniewa¿ badanie kliniczne, jak równie¿ dostêpne w tym okresie testy diagnostyczne nie pozwala³y odró¿niæ naturalnych przypadków trzê-sawki owiec od BSE owiec (zaka¿anych dowiadczal-nie materia³em od chorych krów). Nale¿y nadmieniæ, ¿e w Polsce nie wykryto dotychczas trzêsawki ma³ych prze¿uwaczy, co mo¿e wi¹zaæ siê z ma³¹ skal¹ badañ.
Ró¿nicowanie BSE i trzêsawki w pog³owiu owiec i kóz
MIROS£AW P. POLAK, MAGDALENA LARSKA, WOJCIECH RO¯EK, JAN F. ¯MUDZIÑSKI
Zak³ad Wirusologii Pañstwowego Instytutu Weterynaryjnego Pañstwowego Instytutu Badawczego, Al. Partyzantów 57, 24-100 Pu³awy
Polak M. P., Larska M., Ro¿ek W., ¯mudziñski J. F.
Discriminatory testing for BSE and scrapie in sheep and goat populations Summary
The use of BSE-contaminated meat and bone meal for feeding sheep and goats may be the cause of trans-mitting the BSE agent into small ruminant populations. Experimental studies have shown that sheep which are fed cattle brain homogenates from BSE cases can succumb to a BSE-like disease. The distribution of BSE agents in these sheep is similar to scrapie and a wider range of organs is affected when compared with BSE in cattle. Thus, the possibility of crossing the species barrier between sheep and man cannot be excluded (as has been shown with BSE and its variant Creutzfeldt-Jakob disease in man). The paper describes implementing one of the approved immuno-blot methods used for discriminating between BSE and scrapie in a small ruminant population. The use of two monoclonal antibodies of which only one reacts with scrapie and atypical scrapie samples facilitates differentiation between BSE and scrapie positive samples from sheep and goats.
Medycyna Wet. 2006, 62 (11) 1299 Pierwsze próby ró¿nicowania BSE i trzêsawki
u owiec na poziomie molekularnym podjêto pod ko-niec lat dziewiêædziesi¹tych XX w. (8, 9). Uzyskanie w kolejnych latach przeciwcia³ monoklonalnych dla ró¿nych epitopów bia³ka prionowego doprowadzi³o do wykrycia ró¿nic w materiale patologicznym z przy-padków naturalnych trzêsawki owiec oraz z przypad-ków zaka¿eñ dowiadczalnych owiec materia³em BSE (10, 11, 14, 15). Wyniki uzyskane w tych badaniach zaowocowa³y zmianami w prawodawstwie unijnym. Od 13 stycznia 2005 r. obowi¹zuje rozporz¹dzenie komisji nr 36/2005 modyfikuj¹ce podstawowy akt prawny dotycz¹cy pasa¿owalnych g¹bczastych ence-falopatii u prze¿uwaczy, jakim jest rozporz¹dzenie nr 999/2001. Aktualnie ka¿dy potwierdzony przypa-dek TSE u ma³ych prze¿uwaczy wymaga dalszych badañ wyjaniaj¹cych. Najpierw wykonuje siê bada-nie ró¿nicuj¹ce jedn¹ z 3 dopuszczonych metod typu immuno-blot. Je¿eli w badanej próbce nie mo¿na wy-kluczyæ obecnoci czynnika BSE, podejmuje siê do-datkowe badania ró¿nicuj¹ce (immuno-blot inny ni¿ ten, który stosowano w pierwszym etapie, ró¿nicuj¹ce badanie immunohistochemiczne, ewentualnie ró¿nicu-j¹ce badanie metod¹ ELISA). W badaniach tych ele-mentem ró¿nicuj¹cym bia³ko prionowe jest zestaw dwóch przeciwcia³ monoklonalnych, z których jedno reaguje wy³¹cznie z czynnikiem wywo³uj¹cym trzê-sawkê ma³ych prze¿uwaczy. W przypadku podtrzyma-nia podejrzepodtrzyma-nia BSE, rozstrzygaj¹ce jest badanie na myszkach w próbie biologicznej (badanie to trwa do dwóch lat). Zak³ada siê, ¿e mo¿liwoæ identyfikacji czynnika BSE w pog³owiu ma³ych prze¿uwaczy poz-woli na dok³adniejsz¹ analizê tego zjawiska, ocenê zagro¿enia dla cz³owieka oraz na podjêcie ewentual-nych dzia³añ zapobiegaj¹cych.
Celem badañ by³o wdro¿enie metody VLA hybry-dowy western-blot (jednej z trzech dopuszczonych metod ró¿nicowania czynnika BSE i trzêsawki) w Kra-jowym Laboratorium Referencyjnym ds. TSEs Zwie-rz¹t w Pañstwowym Instytucie Weterynaryjnym Pañ-stwowym Instytucie Badawczym (PIWet-PIB) w Pu-³awach. Metoda ta pozwala na analizê immunoreak-tywnoci oraz profilu glikozylacji patologicznej for-my bia³ka prionowego, opornej na proteolizê. Ka¿da próbka badana jest w duplikacie na dwóch ¿elach, aby oceniæ jej reaktywnoæ z dwoma przeciwcia³ami mo-noklonalnymi skierowanymi przeciwko ró¿nym epi-topom bia³ka prionowego opornego na proteolizê (PrPres).
Materia³ i metody
Materia³ do badañ stanowi³ pieñ mózgu z okolicy za-suwki. Do badañ wykorzystano homogenaty z dwóch po-twierdzonych przypadków BSE u byd³a oraz dwie referen-cyjne próbki z potwierdzonych przypadków trzêsawki owiec (uzyskane dziêki uprzejmoci Wspólnotowego La-boratorium Referencyjnego ds. TSEs, VLA Weybridge, Wielka Brytania). Jako kontrolê ujemn¹ zastosowano ho-mogenaty tkanki nerwowej od zdrowych krów.
Do ró¿nicowania formy patologicznej bia³ka pionowe-go specyficznej dla BSE od formy specyficznej dla trzê-sawki zastosowano metodê VLA hybrydowy western-blot. Próbki pnia mózgu homogenizowano do uzyskania 10% zawiesiny w buforze do homogenizacji (Prionics), a na-stêpnie wirowano przez 5 min. przy obrotach 12 000 × g w temp. 10°C. Próbki trawiono w obecnoci proteinazy K, nanosz¹c, odpowiednio, po 100 µl badanej próbki i 10 µl proteinazy K (Prionics) o stê¿eniu 1 mg/ml w duplikacie na 96-do³kow¹ p³ytkê o pojemnoci 0,2 ml (Eppendorf). Po inkubacji przeprowadzanej w temperaturze 50°C przez 45 min. dodawano roztwór inhibitorów proteaz (Prionics) oraz bufor próbkowy (Prionics) i prowadzono denaturacjê w temperaturze 99°C przez 10 min. Elektroforeza w wa-runkach redukuj¹cych prowadzona by³a w 12,5% ¿elu po-liakrylamidowym w systemie NuPAGE (Invitrogen) przy sta³ym napiêciu 200 V przez 45 min. Próbki nanoszono podwójnie na 2 oddzielne ¿ele w iloci 10 µl na ka¿dy do-³ek. Kontrolê testu stanowi³y: kontrola dodatnia (homoge-nat pnia mózgu zdrowej krowy, nie poddany trawieniu pro-teinaz¹ K) oraz kontrola ujemna (homogenat pnia mózgu zdrowej krowy, poddany trawieniu proteinaz¹ K). Rozdzie-lone bia³ka transferowano na dwie membrany PVDF, 0,45 µm (Immobilon, Millipore). Przed transferem mem-brany umieszczano w 96% metanolu, a nastêpnie przeno-szono do aparatu do transferu (BioRad) wype³nionego bu-forem do transferu (25 mM Tris, 190 mM glicyna, 10% metanol). Transfer bia³ek prowadzono przez 60 min., przy sta³ym napiêciu 150 V i w temperaturze 4°C. Po transferze membrany inkubowano w buforze do blokowania (Prio-nics) przez 30 min. w temperaturze pokojowej. Nastêpnie ka¿d¹ z membran inkubowano z jednym z przeciwcia³ mo-noklonalnych (mAb): 6H4 w rozcieñczeniu 1 : 5000 (Prio-nics) przez 60 min. lub mAb P4 w rozcieñczeniu 1 : 2500 (R-Biopharm) przez 120 min. w temperaturze pokojowej. Obydwa przeciwcia³a rozcieñczano w buforze TBST (1,37 mM NaCl, 0,027 mM KCl, 0,25 mM Tris, 0,05% Tween-20). Po trzykrotnym p³ukaniu w TBST membrany inkubowano z koniugatem anty-mysie IgG z fosfataz¹ al-kaliczn¹ (Prionics) w rozcieñczeniu 1 : 5000 przez okres 30 min. Po trzech p³ukaniach membrany inkubowano 5 min. w buforze luminescencyjnym (Prionics), a nastêpnie na-warstwiano substrat CDP-Star (Sigma) tak¿e na okres 5 min. Sygna³ chemiluminescencyjny uzyskany na kliszy rentge-nowskiej poddawano obróbce i analizie komputerowej za pomoc¹ programu ONE-Dscan, wersja 1.31 (Scanalytics). W interpretacji wyników brano pod uwagê immunoreak-tywnoæ oraz ró¿nice mas cz¹steczkowych badanych bia-³ek. W przypadku BSE u byd³a nale¿a³o oczekiwaæ sygna-³u reakcji z mAb 6H4 i braku sygnasygna-³u reakcji z mAb P4. Dla typowego przypadku trzêsawki owiec nale¿a³o oczeki-waæ zarówno sygna³u reakcji z mAb 6H4, jak i z mAb P4. Forma nieglikozylowana (0G) patologicznego bia³ka prio-nowego trzêsawki powinna charakteryzowaæ siê wiêksz¹ mas¹ cz¹steczkow¹ w stosunku do analogicznej formy z przypadków BSE byd³a. W przypadku dowiadczalnego BSE u owiec lub nietypowego przypadku trzêsawki owiec nale¿a³oby siê spodziewaæ sygna³u z obydwoma przeciw-cia³ami (s³abszy w reakcji z mAb P4 w porównaniu do 6H4) oraz ni¿szej masy cz¹steczkowej formy nieglikozylowanej w stosunku do próbek dodatnich BSE byd³a (14).
Medycyna Wet. 2006, 62 (11) 1300
Wyniki i omówienie
W przypadku próbek BSE uzyskano dodatni sygna³ reakcji wy³¹cznie z przeciwcia³em 6H4 w postaci trzech pr¹¿ków odpowiadaj¹cych formom glikozyla-cji bia³ka PrPres (tzw. profil glikozylacji: forma
dwu-glikozylowana 2G, jedno- 1G i niedwu-glikozylowana 0G) (ryc. 1). Próbki dodatnie z przypadków trzêsawki owiec zareagowa³y dodatnio zarówno z przeciwcia-³em 6H4, jak i z przeciwciaprzeciwcia-³em P4. W przypadku jed-nej z próbek zauwa¿ono znacznie s³abszy sygna³ re-akcji z przeciwcia³em 6H4, choæ sygna³ rere-akcji z mAb P4 dla obydwu próbek z przypadków trzêsawki by³ porównywalny. Nie stwierdzono reakcji w przypadku kontrolnych próbek ujemnych ani z mAb 6H4, ani z mAb P4. Poza uzyskaniem dodatniego sygna³u reakcji dla próbek pochodz¹cych z przypadków BSE byd³a (z przeciwcia³em 6H4) i trzêsawki owiec (za-równo przeciwcia³o 6H4, jak i P4) stwierdzono tak¿e
ró¿nice w mi-gracji formy nieglikozylowa-nej (0G) bia³ka PrPres (ryc. 2). Forma 0G z przypadków trzêsawki posia-da³a wiêksz¹ masê cz¹stecz-kow¹ w odnie-sieniu do analo-gicznej formy z przypadków BSE byd³a, co widoczne by³o w postaci wy¿-szej lokalizacji
na membranie w odniesieniu do analogicznej formy z przypadków BSE byd³a. Podobn¹ prawid³owoæ zauwa¿ono tak¿e dla formy jednoglikozylowanej (1G) (ryc. 2). Jednoczenie porównanie za-wartoci procentowej formy dwu-i jednoglikozylowanej bia³ka PrPres
dla BSE i trzêsawki pozwoli³o tak¿e zró¿nicowaæ obydwa czynniki. Za-wartoæ formy dwuglikozylowanej by³a wy¿sza w przypadku BSE w przeciwieñstwie do formy jednogli-kozylowanej, która wykazywa³a wy¿-sz¹ zawartoæ dla trzêsawki (ryc. 3). Ró¿nica ta jest wyranie widoczna na wykresie punktowym, na którym o X odpowiada procentowej zawarto-ci formy dwuglikozylowanej, a o Y odpowiada formie jednoglikozylowa-nej (ryc. 4).
Skala badañ w kierunku trzêsawki owiec w ostatnich latach uleg³a znacz-nemu nasileniu w krajach cz³onkow-skich Unii Europejskiej (UE). Wi¹¿e siê to z mo¿liwoci¹ transmisji g¹b-czastej encefalopatii byd³a do ma³ych prze¿uwaczy w zwi¹zku ze stosowa-niem w ich ¿ywieniu m¹czek miêsno--kostnych. Ze wzglêdu na odmienn¹ patogenezê choroby u owiec w sto-sunku do byd³a, o czym wspomniano we wstêpie, ryzyko transmisji cho-roby do cz³owieka by³oby znaczne. Dlatego te¿ pojawi³a siê potrzeba ró¿-nicowania dodatnich przypadków trzêsawki ma³ych prze¿uwaczy, aby odró¿niæ zachorowania owiec na ty-pow¹ trzêsawkê od procesu chorobo-wego wywo³anego przez czynnik BSE, który móg³ byæ obecny w m¹cz-K 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 35 kDa 30 kDa B. K 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 35 kDa 30 kDa 2G 1G 0G A.
Ryc. 1. Wynik badania dwóch próbek BSE od byd³a oraz dwóch próbek trzêsaw-ki owiec metod¹ VLA hybrydowy western-blot (ka¿da próbka zbadana w dup-likacie)
Objanienia: A. reakcja z przeciwcia³em 6H4; B. reakcja z przeciwcia³em P4; K kontrola testu próbka bia³ka PrPC nie poddana proteolizie; 1-2, 5-6 dwie próbki BSE od byd³a; 3-4, 9-10 dwie próbki trzêsawki owiec; 7- 8, 11-12 dwie próbki ujemne; 2G, 1G, 0G forma dwu-, jedno- i nieglikozylowana bia³ka PrPres
Ryc. 2. Ró¿nice w migracji formy jedno-(1G) i nieglikozylowanej (0G) bia³ka PrPres z przypadku BSE (linia 1, 2) oraz trzêsawki (linia 3, 4). Znakowanie prze-ciwcia³em 6H4. Po³o¿enie form 1G oraz 0G zaznaczono kreskami
1 2 3 4
2G
1G
Medycyna Wet. 2006, 62 (11) 1301
kach miêsno-kostnych stosowanych w ¿ywieniu tych zwierz¹t. Opracowuj¹c metody ró¿nicowania trzêsawki i BSE u owiec wykorzystano materia³ od owiec zaka-¿onych eksperymentalnie czynnikiem BSE. Analiza metod¹ immuno-blot formy PrPres bia³ka prionowego
z u¿yciem przeciwcia³a P4 z przypadków BSE byd³a, trzêsawki owiec oraz eksperymentalnego BSE u owiec wykaza³a, ¿e reaktywnoæ wystêpuje w przypadku trzê-sawki owiec oraz eksperymentalnego BSE u owiec. Oznacza³o to, ¿e epitop dla mAb P4 na bia³ku PrPres
z przypadków BSE byd³a w przeciwieñstwie do trzê-sawki i eksperymentalnego BSE owiec ulega znisz-czeniu w wyniku trawienia z u¿yciem proteinazy K. W badaniach w³asnych zastosowano jedn¹ z dopusz-czonych aktualnie w krajach cz³onkowskich UE tech-nik ró¿nicowania BSE i trzêsawki tzw. VLA hybry-dowy western-blot (14). Uzyskane wyniki pozwoli³y na jednoznaczne zakwalifikowanie próbek badanych jako zawieraj¹cych czynnik wywo³uj¹cy BSE lub trzê-sawkê w oparciu o immunoreaktywnoæ z przeciwcia-³em 6H4 lub P4 oraz na podstawie wielkoci fragmen-tów nieglikozylowanych bia³ka PrPres. Dodatkowo,
ocena procentowej zawartoci form 2G oraz 1G poz-woli³a na zró¿nicowanie czynników BSE i trzêsawki. Krajowe Laboratorium Referencyjne ds. TSEs Zwie-rz¹t w PIWet-PIB w Pu³awach, wraz z czterema labo-ratoriami z krajów cz³onkowskich UE, uczestniczy³o w lipcu 2005 r. w tecie kompetencji zorganizowanym przez Wspólnotowe Laboratorium Referencyjne VLA Weybridge, Wielka Brytania. Obejmowa³ on oce-nê zdolnoci poszczególnych laboratoriów
wykrywa-15 20 25 30 35 40 45 55 60 65 70 75 forma dwuglikozylowana – 2G forma jednoglikozylowana – 1G BSE trzêsawka 0 10 20 30 40 50 60 70 80 2G 1G BSE trzêsawka
Ryc. 4. Ró¿nice w zawartoci procentowej formy dwu- (2G) i jednoglikozylowanej (1G) bia³ka PrPres z przypadku BSE oraz trzêsawki w postaci wykresu punktowego (zale¿noæ zawartoci formy 2G na osi X do zawartoci formy 1G na osi Y). Znakowanie przeciwcia³em 6H4
Ryc. 3. Ró¿nice w zawartoci procentowej formy dwu- (2G) i jednoglikozylowanej (1G) bia³ka PrPres z przypadku BSE oraz trzêsawki. Znakowanie przeciwcia³em 6H4
nia i ró¿nicowania BSE od trzêsawki na podstawie badañ ró¿nicuj¹cych metod¹ immuno-blot. Po przed-stawieniu uzyskanych wyników, Krajowe Laborato-rium Referencyjne ds. TSEs Zwierz¹t w PIWet-PIB w Pu³awach uzyska³o akceptacjê i zgodê Wspólnoto-wego Laboratorium Referencyjnego na prowadzenie badañ ró¿nicuj¹cych dodatnich przypadków trzêsaw-ki owiec i kóz w Polsce.
Pimiennictwo
1.Benestad S. L., Sarradin P., Thu B., Schonheit J., Tranulis M. A., Bratberg B.: Cases of scrapie with unusual features in Norway and designation of a new type, Nor98. Vet. Rec. 2003, 153, 202-208.
2.Buschmann A., Biacabe A. G., Ziegler U., Bencsik A., Madec J. Y., Erhardt G., Luhken G., Baron T., Groschup M. H.: Atypical scrapie cases in Germany and France are identified by discrepant reaction patterns in BSE rapid tests. J. Virol. Methods 2004, 117, 27-36.
3.Butler D.: Doubts over ability to monitor risks of BSE spread to sheep. Natu-re 1998, 395, 6-7.
4.Collinge J., Sidle K. C. L., Meads J., Ironside J., Hill A. F.: Molecular analy-sis of prion strain variation and the aetiology of new variant CJD. Nature 1996, 383, 685-690.
5.Eloit M., Adjou K., Coulpier M., Fontaine J. J., Hamel R., Lilin T., Mes-siaen S., Andreoletti O., Baron T., Bencsik A., Biacabe A.-G., Beringue V., Laude H., Le Dur A., Vilotte J. L., Comoy E., Deslys J. P., Grassi J., Simon S., Lantier F., Sarradin P.: BSE agent signatures in a goat. Vet. Rec. 2005, 156, 523-524.
6.Foster J. D., Hope J., Fraser H.: Transmission of bovine spongiform ence-phalopathy to sheep and goats. Vet. Rec. 1993, 133, 339-341.
7.Gretzschel A., Buschmann A., Eiden M., Zeigler U., Luhken G., Erhardt G., Groschup M. H.: Strain typing of German transmissible spongiform ence-phalopathies field cases in small ruminants by biochemical methods. J. Vet. Med. B, 2005, 52, 55-63.
8.Hill A. F., Sidle K. C. L., Joiner S., Keyes P., Martin T. C., Dawson M., Collinge J.: Molecular screening of sheep for bovine spongiform encephalo-pathy. Neurosci. Lett. 1998, 255, 159-162.
9.Kuczius T., Haist I., Groschup M. H.: Molecular analysis of bovine spongi-form encephalopathy and scrapie strain variation. J. Infect. Dis. 1998, 178, 693-699.
10.Lezmi S., Martin S., Simon S., Comoy E., Bencsik A., Deslys J.-P., Grassi J., Jeffrey M., Baron T.: Comparative molecular analysis of the abnormal prion protein in field scrapie cases and experimental bovine spongiform encepha-lopathy in sheep by use of western blotting and immunohistochemical methods. J. Virol. 2004, 78, 3654-3662.
11.Nonno R. M., Eseposito E., Vaccari G., Conte M., Marcon S., Di Bari M., Ligios C., Di Guardo G., Agrimi U.: Molecular analysis of cases of Italian sheep scrapie and comparison with cases of bovine spongiform encephalo-pathy (BSE) and experimental BSE in sheep. J. Clin. Microbiol. 2003, 41, 4127-4133.
12.Orge L., Galo A., Machado C., Lima C., Ochoa C., Silva J., Ramos M., Simas J. P.: Identification of putative atypical scrapie in sheep in Portugal. J. Gen. Virol. 2004, 85, 3487-3491.
13.Parchi P., Capellari S., Chen S. G., Petersen R. B., Gambetti P., Kopp N., Brown P., Kitamoto T., Tateishi J., Giese A., Kretzschmar H.: Typing prion isoforms. Nature 1997, 386, 232-233.
14.Stack M. J., Chaplin M. J., Clark J.: Differentiation of prion protein glyco-forms from naturally occurring sheep scrapie, sheep-passaged scrapie strains (CH1641 and SSBP1), bovine spongiform encephalopathy (BSE) cases and Romney and Cheviot breed sheep experimentally inoculated with BSE using two monoclonal antibodies. Acta Neuropathol. 2002, 104, 279-286. 15.Thuring C. M. A., Erkens H. F., Jacobs J. G., Bossers A., Van Keulen L. J. M.,
Garssen G. J., Van Zijderveld F. G., Ryder S. J., Groschup M. H., Sweeney T., Langeveld J. P. M.: Discrimination between scrapie and bovine spongiform encephalopathy in sheep by molecular size, immunoreactivity and glycopro-file of prion protein. J. Clin. Microbiol. 2004, 42, 972-980.
Adres autora: dr Miros³aw P. Polak, Al. Partyzantów 57, 24-100 Pu³awy; e-mail: ppolak@piwet.pulawy.pl
