Artyku³ przegl¹dowy Review
Proteoglikany s¹ bia³kami zawieraj¹cymi jeden lub wiêcej kowalencyjnie po³¹czonych ³añcuchów gliko-zoaminoglikanów (GAG). Wyj¹tek stanowi kwas hia-luronowy, który nie tworzy kowalencyjnego wi¹zania z rdzeniem bia³kowym. Wystêpuj¹ na powierzchni komórek i w zewn¹trzkomórkowej substancji podsta-wowej organizmów zwierzêcych. Dotychczas rozpoz-nano 7 podstawowych rodzajów glikozoaminoglika-nów: kwas hialuronowy, heparynê oraz siarczany: chondroityny, keratanu I i II, heparanu i dermatanu.
Glikozoaminoglikany charakteryzuj¹ siê struktur¹ liniow¹ utworzon¹ w wyniku polimeryzacji dwu-cukrów sk³adaj¹cych siê z aminocukru (D-glukozo-aminy lub D-galaktozo(D-glukozo-aminy) oraz kwasu uronowego (D-glukuronowego lub L-iduronowego). W przypadku siarczanu keratanu miejsce kwasu uronowego zajmuje galaktoza. Przynajmniej jeden z cukrów w powtarza-j¹cej siê jednostce disacharydu ma ujemnie na³adowan¹ grupê karboksylow¹ lub siarczanow¹. Utworzone ³añ-cuchy ³¹cz¹ siê z rdzeniem bia³kowym poprzez tri-sacharyd Galb1-3Galb1-4Xyl zwi¹zany z reszt¹ sery-ny bia³ka rdzeniowego wi¹zaniem O-glikozydowym, charakterystycznym dla wiêkszoci glikozoaminogli-kanów. Siarczan keratanu mo¿e ³¹czyæ siê z rdzeniem
bia³kowym za porednictwem wi¹zañ O-glikozydo-wych tworz¹cych siê pomiêdzy N-acetylogalaktozo-amin¹ a reszt¹ seryny b¹d treoniny lub N-glikozydo-wych pomiêdzy N-acetyloglukozoamin¹ a reszt¹ aspa-raginy. Po przy³¹czeniu trisacharydu do rdzenia bia³-kowego nastêpuje polimeryzacja GAG na koñcowej reszcie galaktozy. Biosynteza rdzeni bia³kowych zacho-dzi w siateczce ródplazmatycznej, natomiast glikozo-aminoglikany powstaj¹ i s¹ modyfikowane w aparacie Golgiego. Modyfikacja GAG w aparacie Golgiego polega g³ównie na epimeryzacji kwasu glukuronowe-go do iduronoweglukuronowe-go, któr¹ przeprowadzaj¹ w³aciwe epimerazy oraz przy³¹czeniu grupy siarczanowej w po-zycji 2, 3, 4 i/lub 6 wêgla aminocukru przez wysoko-specyficzne sulfotransferazy. ród³em reszty siarcza-nowej jest w tym przypadku 3-fosfoadenozyno-5--fosfosiarczan (PAPS) zwany aktywnym siarczanem (13).
Cz¹steczki proteoglikanów s¹ sk³adnikiem macie-rzy pozakomórkowej (ECM) wiêkszoci tkanek orga-nizmu, gdzie wi¹¿¹ siê, miêdzy innymi, z fibronekty-n¹ i laminifibronekty-n¹. Wystêpuj¹ na powierzchni ró¿nego typu komórek, gdzie mog¹ pe³niæ rolê receptorów, bior¹ udzia³ w adhezji komórkowej oraz oddzia³ywaniach
Budowa i zastosowanie wybranych
glikozoaminoglikanów
JOANNA ZEYLAND*/***, DANIEL LIPIÑSKI**, WOJCIECH JUZWA*,
ANDRZEJ P£AWSKI**, RYSZARD S£OMSKI*/**
*Katedra Biochemii i Biotechnologii Wydzia³u Rolniczego AR w Poznaniu, ul. Wo³yñska 32, 60-637 Poznañ **Instytut Genetyki Cz³owieka PAN w Poznaniu, ul. Strzeszyñska 32, 60-479 Poznañ
***Delta Pharma BV, ul. Lubicz 25, 31-503 Kraków
Zeyland J., Lipiñski D., Juzwa W., P³awski A., S³omski R.
Structure and application of select glycosaminoglycans
Summary
Proteoglycans can be found in the extracellular matrix of most tissues. They play the role of receptors, take part in cellular adhesion and also interactions between cells. Proteoglycans consist of proteins with one or more covalently bonded glycosaminoglycans. There are seven different types of glycosaminoglycans: hyaluronic acid, heparin and sulphates of chondroitin, keratan I and II, heparin and dermatan. Hyaluronic acid and chon-droitin sulphate appear in synovial fluid where they take part in binding water, preventing mechanical stress and increasing elasticity. Keratan sulphate and chondroitin sulphate are used as potential markers of osteo-arthritis. Osteoarthritis is a type of arthritis that is caused by the breakdown and eventual loss of the cartilage of one or more joints. Cartilage is a protein substance that serves as a cushion between the bones of the joints. Dermatan sulphate is responsible for the individual resistance to inflammation and pathogens. Understanding the mechanisms of interactions between glycosaminoglycans and pathogens will help to develop more effective vaccinations. The perfect functioning of glycosaminoglycans depends on the efficient activity of both synthesising and degrading enzymes. Even small dysfunctions cause major diseases and disorders.
miêdzykomórkowych. Oddzia³uj¹c z kolagenem i elas-tyn¹ utrzymuj¹ w³aciw¹ strukturê tkanki ³¹cznej. Jako polianiony mog¹ wp³ywaæ na selektywnoæ zale¿nej od ³adunku filtracji k³êbuszkowej. Proteoglikany za-anga¿owane s¹ równie¿ w szereg procesów zwi¹za-nych z onkogenez¹. Zmiany jakociowe i ilociowe tych makrocz¹steczek w macierzy mog¹ prowadziæ do aktywacji niektórych onkogenów.
Kwas hialuronowy
Kwas hialuronowy (HA) nale¿y do nierozga³êzio-nych glikozoaminoglikanów nie tworz¹cych wi¹zañ kowalencyjnych z rdzeniem bia³kowym. Wchodzi w sk³ad substancji miêdzykomórkowej tkanki ³¹cznej, mazi torebek stawowych, wystêpuje w skórze oraz cia³-ku szklistym oka. HA w du¿ych ilociach znajdujemy w tkankach embrionalnych, gdzie bierze udzia³ w pro-cesach naprawczych oraz migracji komórek w morfo-genezie. Zbudowany jest z powtarzaj¹cego siê dwu-cukru, w którego sk³ad wchodzi kwas glukuronowy oraz N-acetyloglukozoamina. HA poprzez wi¹zanie i zatrzymywanie wody w przestrzeniach miêdzykomór-kowych zwiêksza tak¿e odpornoæ tkanek na stres me-chaniczny. Wraz z siarczanem chondroityny zapew-nia tkance sprê¿ystoæ i wytrzyma³oæ. Pochodne kwa-su hialuronowego s¹ kwa-substancjami immunoneutralny-mi oraz apirogennyimmunoneutralny-mi. Powsta³e na drodze estryfika-cji grup karboksylowych kwasu D-glukuronowego polimery stosowane s¹ do powlekania powierzchni implantów, protez i biomateria³ów, a tak¿e w syste-mach dystrybucji leków w organizmie. W dermatolo-gii plastycznej stosuje siê pochodne kwasu hialurono-wego do zwiêkszania objêtoci tkanek miêkkich na drodze podskórnych iniekcji (18).
£atwo tolerowane przez organizm, nie wywo³uj¹ce odpowiedzi ze strony uk³adu immunologicznego pre-paraty zawieraj¹ce pochodne kwasu hialuronowego, pozyskiwanego z grzebieni kogutów wykorzystywa-ne s¹ równie¿ w plastyce korekcyjwykorzystywa-nej nosa, przeszcze-pach skóry, usuwaniu zmarszczek i blizn czy leczeniu skórnej atrofii. ród³em kwasu hialuronowego mog¹ byæ równie¿ bakterie z rodziny Streptococcus. Jednak-¿e preparaty otrzymywane z tych bakterii charaktery-zuj¹ siê silniejszymi w³aciwociami uczulaj¹cymi (18). Od kilku lat kwas hialuronowy znajduje równie¿ zastosowanie w leczeniu perforacji b³ony bêbenkowej (5). W przypadku du¿ych i ca³kowitych ubytków sto-suje siê zwykle przeszczepy autologiczne fragmentów chrz¹stki elastycznej ma³¿owiny usznej. W terapii za-mykania ma³ych perforacji najbardziej skuteczne oka-zuj¹ siê techniki anga¿uj¹ce czynniki wzrostu: EGF (epidermal growth factor), FGF-2 (fibroblast growth factor) oraz kwas hialuronowy. Substancje te bior¹ udzia³ w naturalnych procesach naprawczych b³ony bêbenkowej. Odpowiedzialne s¹ za pobudzanie hiper-keratynizacji, proliferacjê komórek nab³onka oraz ich migracjê, co prowadzi do zamkniêcia krawêdzi uszkodzenia (5).
Niedobór HA mo¿e prowadziæ do podatnoci na infekcje typu bakteryjnego, stany zapalne stawów oraz mechaniczne uszkodzenia tkanek. Pewne patogenne szczepy bakterii posiadaj¹ zbudowan¹ z glikozoami-noglikanów zewnêtrzn¹ otoczkê polisacharydow¹ nie-zbêdn¹ w procesie inwazyjnym (10). Obecnoæ GAG, na powierzchni ciany komórkowej bakterii, podob-nych do glikozoaminoglikanów gospodarza powodu-je, i¿ patogen nie jest rozpoznawany przez przeciw-cia³a. Taki system ochrony przed fagocytoz¹ oraz ak-tywacj¹ systemu dope³niacza stosuj¹, miêdzy innymi, ujemne Pasteurella multocida typ A oraz Gram--dodatnie Streptococcus grupy A i C (6, 10). Wysoka lepkoæ substancji zawieraj¹cych kwas hialuronowy utrudnia przenikanie przez nie czynników patogen-nych, zw³aszcza bakterii, chroni¹c w ten sposób tkan-ki przed infekcj¹ (29).
Heparyna
Heparyna (HEP) nale¿y do siarczanowanych poli-sacharydów o masie cz¹steczkowej 5-20 kDa o jed-nostkach cukrowych po³¹czonych 1,4-glikozydowymi wi¹zaniami. Wystêpuje g³ównie w ziarnistociach ko-mórek tucznych, w¹trobie, miêniach, p³ucach, sercu, nerkach oraz ledzionie, a tak¿e w skórze i krwi. He-paryna zbudowana jest z powtarzaj¹cej siê sekwencji disacharydu: glukozoaminy oraz kwasu glukuronowe-go. Po syntezie polisacharydu 90% reszt kwasu glu-kuronowego ulega epimeryzacji do kwasu iduronowe-go. Rdzeñ bia³kowy zbudowany jest wy³¹cznie z reszt seryny oraz glicyny, z czego oko³o 67% reszt seryny ³¹czy siê z heparyn¹ (28).
Heparyna reguluje proces angiogenezy, moduluje lipazy lipoproteinowe, a tak¿e odpowiada za zahamo-wanie proliferacji miêni g³adkich po przebytych ura-zach (28). Heparyna produkowana jest g³ównie przez mastocyty, czyli komórki tuczne, a w mniejszym stop-niu przez bazocyty (granulocyty zasadoch³onne) (24). Heparyna posiada w³aciwoci antykoagulacyjne. £¹cz¹c siê z wystêpuj¹c¹ w osoczu antytrombin¹ III przyspiesza proces inaktywacji proteaz serynowych, do których nale¿y trombina. Oddzia³ywanie heparyny z antytrombin¹ nastêpuje bezporednio poprzez przy-³¹czanie glikozoaminoglikanu do reszt lizyny enzymu i zmianê jego konformacji, a porednio przez specy-ficzne wi¹zanie siê z lipaz¹ lipoproteinow¹ obecn¹ w naczyniach w³osowatych pobudzaj¹c¹ sekrecjê an-tytrombiny. Utworzony kompleks zbudowany z hepa-ryny, antytrombiny III oraz proteazy serynowej roz-pada siê na nieaktywny kompleks ATIIIproteaza oraz cz¹steczkê heparyny, która ³¹czy siê z kolejn¹ cz¹s-teczk¹ antytrombiny III. Tworzenie siê po³¹czeñ heparyny z antytrombin¹ III ma hamuj¹ce dzia³anie na IX, X, XI i XII czynnik koagulacyjny oraz na kali-kreinê (20).
Kliniczne zastosowanie heparyny zwi¹zane jest z wykorzystaniem jej w³aciwoci antykoagulacyjnych. Na pojawienie siê i rozwój zakrzepicy ¿ylnej ma wp³yw
niew³aciwa pierwotna i wtórna budowa oraz kszta³t naczyñ krwiononych obserwowane u pacjentów po przebytych operacjach neurochirurgicznych, ortope-dycznych, urazach czaszki, oparzeniach termicznych czy rozleg³ych zawa³ach serca. Prawdopodobieñstwo rozwiniêcia siê zakrzepicy ¿ylnej u osób po zabiegach operacyjnych mo¿e dochodziæ do 28%, a w przypad-ku z³amañ koci biodrowej nawet do 50%. W konsek-wencji u oko³o 2% wy¿ej wymienionej populacji pa-cjentów dochodzi do miertelnego zejcia na skutek powstania zatoru p³ucnego. Kolejnymi czynnikami ryzyka s¹ zaburzenia przep³ywu krwi w naczyniach krwiononych spowodowane, miêdzy innymi, ci¹¿¹ i po³ogiem, oty³oci¹, zawa³em miênia sercowego, przed³u¿aj¹cym siê unieruchomieniem, a tak¿e zmia-ny sk³adu i w³aciwoci krwi bêd¹ce skutkiem, na przy-k³ad, terapii estrogenowej.
Niskocz¹steczkowa heparyna jest skutecznym i po-wszechnym lekiem wykorzystywanym w zapobiega-niu i leczezapobiega-niu zakrzepic, mia¿d¿ycy, usprawniazapobiega-niu przep³ywu krwi w naczyniach wieñcowych i obwodo-wych czy indukowaniu angiogenezy. Heparynê wyso-kocz¹steczkow¹ nale¿y stosowaæ ostro¿nie, gdy¿ mo¿e wywo³ywaæ krwotoki i krwawienia (1-10%), stany zapalne ¿y³, odczyny skórne oraz indukowaæ trombo-cytopenie, hipertransaminazemiê, a przy d³ugotrwa³ym leczeniu prowadziæ do osteopeni i osteoporozy (3). Niskocz¹steczkowa heparyna mo¿e byæ aplikowana w d³u¿szym czasie, a okres jej pó³trwania jest od dwóch do trzech razy d³u¿szy od czasu pó³trwania natywnej, niefrakcjonowanej heparyny.
W czasie przeprowadzania zabiegów hemodializy oraz wszczepiania bajpasów krew kontaktuj¹ca siê z materia³ami syntetycznymi podlega procesowi ko-agulacji, co wymusza stosowanie antykoagulanta. Pro-wadzi siê badania nad fizyczn¹ oraz chemiczn¹ immobilizacj¹ heparyny do membran, które pokrywa-³yby zarówno sprzêt, narzêdzia, jak i materia³y opera-cyjne, gdy¿ infuzje heparynowe mog¹ prowadziæ do wyst¹pienia skaz krwotocznych (19).
Myszy z uszkodzonym jednym z czterech genów koduj¹cych N-deacetylazy/N-sulfotransferazy nie s¹ zdolne do produkcji heparyny. Zwierzêta te charakte-ryzuj¹ siê normaln¹ ¿ywotnoci¹ oraz p³odnoci¹, po-siadaj¹ jednak mniejsz¹ liczbê mastocytów, a niedo-bór heparyny powoduje zaburzenie ich funkcji wydziel-niczej (11).
Siarczany heparanu, dermatanu, keratanu i chondroityny
Siarczan heparanu (HS) nale¿y do grupy glikozo-aminoglikanów zbudowanych z monomerów kwasu D-glukuronowego oraz N-acetyloglukozoaminy. Resz-ty N-aceResz-tyloglukozoaminy mog¹ byæ podstawiane kil-koma grupami siarczanowymi. HS wbudowany w b³o-nê plazmatyczn¹ odpowiada za jej sprê¿ystoæ. Bierze udzia³ w przenoszeniu informacji poprzez przejmo-wanie funkcji receptorowej oraz uczestniczy w
oddzia-³ywaniach miêdzy komórkami. Siarczan heparanu mo¿e oddzia³ywaæ z czynnikami wzrostu, czynnika-mi adhezyjnyczynnika-mi oraz enzymaczynnika-mi.
HS uczestniczy w procesach rozwojowych, regulu-j¹c aktywnoæ morfogenów wingless oraz hedgehog bêd¹cych segmentowymi genami polarnoci Drosophi-la meDrosophi-lanogaster. Mutacje w genie dehydrogenazy UDP-glukozy, której produktem jest kwas UDP-glu-kuronowy prowadz¹ do zablokowania tworzenia siê ³añcuchów GAG, a w rezultacie do zaburzenia funkcji genów wingless oraz hedgehog. Gen hedgehog wyda-je siê bardziej wra¿liwy na niedobór ³añcuchów siar-czanu heparanu. Hamuj¹ce dzia³anie mutacji w genie dehydrogenazy dotyczy równie¿ dzia³ania na czynnik wzrostu fibroblastów (FGF). Podobny wp³yw na za-burzenia aktywnoci wy¿ej wymienionych genów maj¹ mutacje w genach N-deacetylazy/N-sulfotrans-ferazy odpowiedzialnych za pocz¹tkowe modyfikacje ³añcucha heparanu. B³êdne modyfikacje lub ich brak prowadz¹ do utraty funkcji GAG (9).
Mutacje w genie 2-O-sulfotransferazy siarczanu heparanu powoduj¹ niew³aciw¹ polaryzacjê brzusz-n¹ oraz grzbietow¹ u Drosophila, a tak¿e niew³aciwe formowanie nerek u myszy. Siarczan heparanu wbu-dowywany jest w b³ony podstawne komórek k³êbusz-ków nerkowych, gdzie wraz z innymi zwi¹zkami od-powiada za selektywnoæ filtracji zale¿nej od ³adun-ku. Zmiany w jego strukturze wp³ywaj¹ na nieprawid-³owe funkcjonowanie nerek, a tak¿e towarzysz¹ nefro-patiom o ró¿nej etiologii (27).
Niektóre organizmy patogenne, takie jak: wirus Den-guea, wirusy herpes (HSV 1), sporozoity malarii czy dwoinki rze¿¹czki wykorzystuj¹ siarczan heparanu obecny na powierzchni komórek jako receptor pod-czas wi¹zania siê do komórek gospodarza (16). Bli¿-sze poznanie mechanizmów chorobotwórczych zale¿-nych od siarczanu heparanu pozwoli na opracowanie strategii oraz zaprojektowanie leków chroni¹cych cz³o-wieka przed tymi gronymi patogenami.
Siarczan dermatanu (DS), nazywany równie¿ siar-czanem chondroityny B, zamiast kwasu D-glukurono-wego wystêpuj¹cego w siarczanie chondroityny, zwi¹-zanego z N-acetylogalaktozoamin¹ wi¹zaniem b1,3, posiada kwas L-iduronowy po³¹czony wi¹zaniem a1,3. Podczas syntezy tego GAG dochodzi do epimeryzacji kwasu D-glukuronowego do L-iduronowego przy udziale 5-epimerazy. Proces epimeryzacji jest proce-sem regulowanym poprzez stopieñ siarczanowania ³añ-cuchów GAG. Przy niedostatecznej iloci reszt siar-czanowych w pozycji C4 oraz C6 heksoaminy, a tak¿e C2 kwasu iduronowego, siarczan dermatanu staje siê mieszanin¹ disacharydów, zbudowanych z N-acetylo-galaktozoaminy po³¹czonej z kwasem D-glukurono-wym lub L-iduronoD-glukurono-wym. Siarczan dermatanu wcho-dzi w sk³ad proteoglikanów bogatych w leucynê, ta-kich jak dekoryna czy biglikan, jest równie¿ sk³adow¹ wersykanu oraz agrekanu bêd¹cych du¿ymi cz¹stecz-kami polisacharydowymi.
DS wchodzi w sk³ad ródb³onka naczyñ krwiono-nych. Produkowany jest g³ównie przez miocyty naczy-niowe, które w procesie mia¿d¿ycowym silnie proli-feruj¹. Ma zdolnoæ ³¹czenia siê z osoczowymi lipo-proteinami o niskiej gêstoci. Badania wskazuj¹, ¿e to w³anie siarczan dermatanu jest odpowiedzialny w du-¿ej mierze za rozwój blaszki mia¿d¿ycowej (14). Siar-czan dermatanu obecny jest w rogówce oka, zapew-niaj¹c jej przezroczystoæ, a tak¿e w twardówce, gdzie odpowiedzialny jest za utrzymanie w³aciwego kszta³tu ga³ek ocznych.
Siarczan dermatanu zwiêksza aktywnoæ antykoagu-lacyjn¹ kofaktora heparyny II (HC II) oko³o 1000-krot-nie. Kompleks, jaki tworzy siê miêdzy siarczanem dermatanu, fibryn¹ oraz trombin¹ znacznie ró¿ni siê od tego, jaki tworzy z nimi heparyna. Heparyna przy-³¹cza zarówno trombinê, jak i fibrynê, tworz¹c w ten sposób kompleks zdolny do blokowania centrum ak-tywnego kofaktora heparyny II. Natomiast siarczan dermatanu przy³¹cza siê bezporednio tylko do trom-biny, zapobiegaj¹c jej ³¹czeniu z fibryn¹. Siarczan der-matanu okaza³ siê skuteczny w walce z objawami za-krzepicy u pacjentów, którzy przeszli operacyjne usu-niêcie nowotworu, a uzupe³niaj¹ce siê w³aciwoci heparyny i siarczanu dermatanu mog¹ przyczyniæ siê do opracowania efektywnego leku o w³aciwociach antykoagulacyjnych.
DS zawdziêcza swoj¹ nazwê skórze w³aciwej, w której stanowi 0,3% suchej masy. Uczestniczy w pro-cesie koagulacji, wzrocie komórek, ochronie przed czynnikami patogennymi, a tak¿e bierze udzia³ w na-prawie uszkodzeñ skóry. Miejscowe stê¿enie siarcza-nu dermatasiarcza-nu w uszkodzonej skórze mo¿e wzrastaæ nawet do 23 µg/ml (26). W przypadku zranieñ obser-wuje siê lokalne wzmo¿enie syntezy i akumulacji na powierzchni komórek ródb³onka oraz hiperproliferu-j¹cych keratynocytów: syndekanu 1, a tak¿e wzrost stê¿enia syndekanu 4 i dekoryny. Myszy niezdolne do syntezy syndekanu 4 charakteryzuj¹ siê d³u¿szym okre-sem gojenia ran ni¿ myszy zdolne do jego produkcji (7). Zaobserwowano równie¿, ¿e wzrost stê¿enia syn-dekanu 1 i synsyn-dekanu 4 wp³ywa na bliznowacenie ran. Uszkodzenia skóry p³odowej nie podlegaj¹ temu pro-cesowi ze wzglêdu na nisk¹ zawartoæ wczeniej wy-mienionych syndekanów.
Siarczan dermatanu aktywuje mechanizmy przyle-gania tocz¹cych siê po warstwie p³ytek krwi leukocy-tów poprzez stymulacjê cz¹steczek adhezyjnych ICAM-1, a proteoglikany zawieraj¹ce siarczan derma-tanu promuj¹ aktywnoæ czynnika wzrostu fibroblas-tów FGF-2, wzmagaj¹c podzia³y komórkowe (25). Siarczan dermatanu bierze tak¿e udzia³ w tworzeniu immunologicznej bariery dla patogenów.
DS oraz proteoglikany zawieraj¹ce siarczan derma-tanu s¹ czynnikami mog¹cymi modyfikowaæ osobni-cz¹ odpornoæ na infekcje. Myszy, które nie syntety-zuj¹ dekoryny, s¹ bardziej odporne na infekcje Borre-lia burgdorferi, bakterii odpowiedzialnej za
wywo³y-wanie boreliozy z Lyme. G³ównym mechanizmem patogenezy jest krzy¿owe wi¹zanie bakteryjnego bia³ka OspA z integryn¹ CD11a/CD18 (LFA-1), czego kon-sekwencj¹ jest adhezja limfocytów T do komórek pre-zentuj¹cych antygen oraz wzmo¿enie ich aktywacji. Prowadzi to do rozwiniêcia siê stanu zapalnego w ob-szarze stawów, charakterystycznego dla infekcji t¹ bakteri¹ (4).
Prawdopodobnie DS odpowiedzialny jest równie¿ za oddzia³ywanie z Pseudomonas aeruginosa, Ente-rococcus faecalis czy Streptococcus pyogenes. Orga-nizmy te wytwarzaj¹ proteinazy, które uwalniaj¹ ³añ-cuchy siarczanu dermatanu z proteoglikanu. Wolne ³añcuchy siarczanu dermatanu ³¹cz¹ siê z a-defensy-nami, blokuj¹c ich aktywnoæ. Defensyny nale¿¹ do grupy antybiotyków peptydowych. Mechanizm ich dzia³ania opiera siê na uszkadzaniu i wytwarzaniu ka-na³ów w b³onie komórkowej patogenów (23). Zrozu-mienie mechanizmów oddzia³ywania GAG z organiz-mami chorobotwórczymi mo¿e w przysz³oci wp³y-n¹æ na mo¿liwoæ manipulowania ich patogennoci¹ oraz przyczyniæ siê do opracowania nowych, skutecz-niejszych szczepionek.
Siarczan keratanu (KS) nale¿y do grupy GAG zbu-dowanych z powtarzaj¹cych siê jednostek galaktozy po³¹czonej z N-acetyloglukozoamin¹. Wyró¿nia siê dwa typy siarczanu keratanu. Siarczan keratanu typu I wraz z siarczanem dermatanu wystêpuj¹ w rogówce oka. Umiejscowione pomiêdzy w³óknami kolageno-wymi nadaj¹ rogówce przezroczystoæ. Siarczan ke-ratanu typu II wystêpuje g³ównie w lunej tkance ³¹cz-nej. Zarówno typ I, jak i II keratanu mo¿e ulegaæ siar-czanowaniu w pozycji C6 N-acetyloglukozoaminy, a w pewnych sytuacjach siarczanowanie dotyczy ga-laktozy.
Keratany ró¿ni¹ siê od siebie sposobem wi¹zania do rdzenia bia³kowego. W siarczanie keratanu typu I N-acetyloglukozoamina ³¹czy siê wi¹zaniem N-gliko-zydowym z reszt¹ asparaginy, a w typu II N-acetylo-glukozoamina tworzy wi¹zanie O-glikozydowe z reszt¹ seryny b¹d treoniny. Keratany wchodz¹ w sk³ad ko-mórek nab³onka, gdzie bior¹ udzia³ w naprawie uszko-dzeñ powierzchni, a tak¿e w sk³ad komórek nerwo-wych, gdzie odpowiedzialne s¹ za prawid³owe prze-wodzenie sygna³ów. Uczestnicz¹ równie¿ w procesie zagnie¿d¿ania siê zarodka (8).
Siarczan chondroityny (CS) zbudowany jest z 25-40 powtarzaj¹cych siê jednostek dwucukru (kwas glu-kuronowy oraz N-acetylogalaktozoamina) o masie cz¹steczkowej 12-20 kDa. Reszta N-acetylogalakto-zoaminy mo¿e ulegaæ podstawieniu siarczanem w po-zycji 4 lub 6. CS stanowi oko³o 80% GAG obecnych w chrz¹stce stawowej. Proteoglikany zawieraj¹ce CS wystêpuj¹ równie¿ w aorcie, miêniach szkieletowych, oku, p³ucach oraz mózgu.
W przypadku zapalenia stawów obserwuje siê zró¿-nicowanie w poziomie siarczanowania N-acetyloga-lakotozoaminy w chrz¹stce i mazi stawowej (15). CS
wytwarzany jest w aparacie Golgiego, a nastêpnie transportowany do macierzy miêdzykomórkowej, gdzie tworzy makrocz¹steczki b¹d te¿ lokalizowany jest na powierzchni komórek (22). Po³¹czony z kwa-sem hialuronowym za pomoc¹ bia³ek wi¹¿¹cych utrzy-muje w³aciw¹ strukturê, sprê¿ystoæ i wytrzyma³oæ tkanki chrzêstnej. Z wiekiem zmniejsza siê zawartoæ tego GAG w chrz¹stce, co mo¿e prowadziæ do rozwo-ju zmian zwyrodnieniowych u starszych osobników. Jego obecnoæ obserwuje siê równie¿ w miejscach wapnienia koci d³ugich.
Przyczyn¹ wyst¹pienia zmian zwyrodnieniowo-znie-kszta³caj¹cych (osteoarthritis) jest na³o¿enie siê dzia-³ania negatywnych czynników pochodzenia bioche-micznego i biomechanicznego. Zmiany patologiczne dotycz¹ g³ównie tkanek i mog¹ byæ wynikiem z³amañ, pêkniêæ czy zwichniêcia stawu, towarzysz¹ tak¿e dys-plazjom i osteochondrozom. Do g³ównych objawów nale¿y degradacja chrz¹stki stawowej, subchondralne twardnienie koci oraz pojawienie siê w p³ynie ma-ziowym cech charakterystycznych dla procesu zapal-nego (21). Proces powstawania choroby jest z³o¿ony i dotyczy zaburzenia naturalnej równowagi pomiêdzy syntez¹ i degradacj¹ sk³adników pozakomórkowej macierzy chrz¹stki, za utrzymanie której odpowiedzial-ne s¹ chondrocyty. Stany chorobowe wynikaj¹ zwykle z niezrównowa¿onej aktywnoci metaloproteinaz i zwi¹zanych z nimi inhibitorów, na skutek dzia³ania których dochodzi do niszczenia struktury macierzy i degradacji proteoglikanów.
Diagnostyka osteoarthritis opiera siê g³ównie na wykorzystaniu technik radiografii, które pozwalaj¹ na wykrywanie zaawansowanego stadium choroby. Nie znajduj¹ natomiast zastosowania w przypadku detek-cji zmian o niewielkim nasileniu. Artroskopia, rezo-nans magnetyczny czy ultrasonografia poprawi³y czu-³oæ badañ diagnostycznych, nie pozwoli³y jednak na wykrywanie minimalnych zmian patologicznych oraz monitorowanie postêpu choroby.
Najnowsze badania z zakresu osteoarthritis dono-sz¹ o mo¿liwoci wykorzystania markerów moleku-larnych do diagnozowania pacjentów podejrzanych o osteoarthritis. Wyró¿nia siê trzy grupy zwi¹zków jako potencjalnych markerów osteoarthritis. Strome-lizyna (MMP-3), kolagenaza (MMP-1), tkankowe in-hibitory metaloproteinaz oraz interleukina 4 i 6 (IL-4, IL-6) nale¿¹ do moleku³ bior¹cych udzia³ w procesie degradacji chrz¹stki, natomiast siarczan keratanu, siar-czan chondroityny, fragmenty agrekanu, glikoproteiny oraz niektóre oligomery bia³kowe s¹ produktami jej rozk³adu. Trzeci¹ grupê potencjalnych markerów two-rz¹ siarczan chondroityny, bia³ka ³¹cznikowe oraz ko-lagen X substancje wytworzone na skutek odpowie-dzi na zaistnia³y proces chorobowy (30).
Materia³em do badañ diagnostycznych osteoarthri-tis mo¿e byæ osocze, p³yn maziowy oraz mocz. Wyko-rzystanie osocza i moczu jako ród³a informacji o to-cz¹cym siê procesie chorobowym zosta³o
zakwestio-nowane. Stê¿enie markerów w tych p³ynach jest wy-padkow¹ przemian tocz¹cych siê we wszystkich sta-wach, co mo¿e prowadziæ do zafa³szowania wyników. Pomiary dokonywane z wykorzystaniem p³ynu mazio-wego wydaj¹ siê najbardziej obiektywne i miarodajne. Pomiar stê¿enia siarczanu keratanu oraz siarczanu chondroityny, jako pochodnych rozk³adu chrz¹stki sta-wowej, mo¿e byæ wykorzystany w diagnostyce osteo-arthritis. Zastosowanie w wykrywaniu tych GAG znaj-duj¹ techniki radioimmunologiczne z u¿yciem prze-ciwcia³ monoklonalnych skierowanych przeciwko epi-topowi 3B3 siarczanu chondroityny, epiepi-topowi 5D4 siarczanu keratanu oraz technika ELISA. Dowiadcze-nia nie zawsze jednak potwierdzaj¹ korelacjê pomiê-dzy wyst¹pieniem osteoarthritis a wysokim stê¿eniem siarczanu keratanu zarówno u zwierz¹t, jak i u ludzi (2). Zmiany w metabolizmie tkanki objawiaj¹ce siê produkcj¹ niew³aciwie ukszta³towanych glikozoami-noglikanów, a zw³aszcza siarczanu keratanu, mog¹ staæ siê przyczyn¹ wra¿liwoci stawów na czynniki ze-wnêtrzne i wyst¹pienia choroby. W takim uk³adzie stê-¿enie siarczanu keratanu w p³ynie mo¿e nie ulec zmia-nie, a nawet siê obni¿yæ. Lepszym markerem wydaje siê siarczan chondroityny, którego stê¿enie wzrasta w wiêkszoci przypadków naturalnie pojawiaj¹cego siê i indukowanego osteoarthritis (12).
Dotychczasowe, czêsto nieefektywne leczenie zmian zwyrodnieniowo-zniekszta³caj¹cych polega³o wy³¹cz-nie na stosowaniu leków przeciwbólowych oraz wy³¹cz- nie-steroidowych i nie-steroidowych leków przeciwzapalnych, które wykazuj¹ szkodliwe dzia³anie na metabolizm chrz¹stki stawowej. Dostawowe iniekcje kortykoste-roidów znosz¹ przede wszystkim ból, co grozi nad-miernym przeci¹¿aniem chorego stawu i dalszymi uszkodzeniami chrz¹stki stawowej. Obecnie stosuje siê bardziej skuteczne sole sodowe kwasu hialurono-wego posiadaj¹ce w³aciwoci przeciwbólowe i prze-ciwzapalne, zmniejszaj¹ce wysiêk stawowy oraz do-datnio wp³ywaj¹ce na lepkoæ i sprê¿ystoæ mazi sta-wowej. Sole sodowe HA wspomagaj¹ równie¿ odbu-dowê chrz¹stki stawowej, obni¿aj¹c jednoczenie stê-¿enie siarczanu keratanu, który jest markerem jej uszkodzeñ (1).
Proteoglikany zbudowane z ³añcuchów siarczanu chondroityny (agrekan, wersykan, neurokan, brewikan, fosfakan, neuroglikan C), siarczanu dermatanu, a tak-¿e siarczanu heparanu (syndekan-2, syndekanu-3) bior¹ udzia³ w formowaniu sieci neuronowej w rozwijaj¹-cych siê mózgach ssaków. W obrêbie neuronów CS tworzy ródkomórkowy szkielet, który umo¿liwia utrzymywanie sta³ego kszta³tu komórek nerwowych. Proteoglikany zawieraj¹ce CS wp³ywaj¹ na takie pro-cesy, jak: przyleganie komórkowe, proliferacja, ró¿ni-cowanie, migracja neuronalna czy synaptogeneza.
Prawid³owe funkcjonowanie glikozoaminoglikanów wymaga sprawnego dzia³ania enzymów zaanga¿owa-nych zarówno w ich syntezê, jak i degradacjê. Nawet niewielkie zaburzenia ich aktywnoci mog¹ prowadziæ
do ró¿nego typu zmian chorobowych o charakterze przewlek³ym, które mog¹ byæ przyczyn¹ trwa³ego ka-lectwa. Ponadto wczesne zmiany, przebiegaj¹ na ogó³ bezobjawowo i mog¹ byæ trudne do uchwycenia za pomoc¹ obecnie stosowanych metod. Badanie czyn-ników reguluj¹cych procesy syntezy i degradacji gli-kozoaminoglikanów maj¹ ogromne znaczenie dla po-znania mechanizmów odpowiedzialnych za powsta-wanie zmian patologicznych, co w dalszej perspekty-wie mo¿e przyczyniæ siê do rozwoju lepszych metod diagnostycznych i stworzyæ w przysz³oci podstawy do zastosowania nowych, bardziej skutecznych i swo-istych metod terapeutycznych.
Pimiennictwo
1.Amiel D., Toyoguchi T., Kobayashi K., Bowden K., Amiel M. E., Healey R. M.: Long-term effect of sodium hyaluronate (Hyalgan) on osteoarthritis progres-sion in a rabbit model. Osteoarthr. Cartilage 2003, 11, 636-643.
2.Belcher C., Yaqub R., Fawthrop F., Bayliss M., Doherty M.: Synovial fluid chondroitin and keratan sulphate epitopes, glycosaminoglycans, and hyalu-ronan in arthritic and normal knees. Ann. Rheum. Dis. 1997, 56, 299-307. 3.Borawski J., Naumnik B., Mysliwiec M.: Hepatocyte growth factor: a
possi-ble mediator of heparin-induced osteoporosis? Clin. Appl. Thromb. Hemost. 2003, 9, 171-172.
4.Brown E. L., Wooten R. M., Johnson B. J., Iozzo R. V., Smith A., Dolan M. C., Guo B. P., Weis J. J., Hook M.: Resistance to Lyme disease in decorin-defi-cient mice. J. Clin. Invest. 2001, 107, 845-852.
5.Chauvin K., Bratton C., Parkins C.: Healing large tympanic membrane per-forations using hyaluronic acid, basic fibroblast growth factor, and epider-mal growth factor. Otolaryngol. Head Neck Surg. 1999, 121, 43-47. 6.Cywes C., Wessels M. R.: Group A Streptococcus tissue invasion by
CD44--mediated cell signalling. Nature 2001, 414, 648-652.
7.Echtermeyer F., Streit M., Wilcox-Adelman S., Saoncella S., Denhez F., Detmar M., Goetinck P.: Delayed wound repair and impaired angiogenesis in mice lacking syndecan-4. J. Clin. Invest. 2001, 107, R9-R14.
8.Funderburgh J. L.: Keratan sulfate biosynthesis. IUBMB Life 2002, 54, 187--194.
9.Grobe K., Ledin J., Ringvall M., Holmborn K., Forsberg E., Esko J. D., Kjellen L.: Heparan sulfate and development: differential roles of the N-ace-tylglucosamine N-deacetylase/N-sulfotransferase isozymes. Biochim. Bio-phys. Acta 2002, 19, 209-215.
10.Harmon B. G., Glisson J. R., Latimer K. S., Steffens W. L., Nunnally J. C.: Resistance of Pasteurella multocida A:3,4 to phagocytosis by turkey macro-phages and heterophils. Am. J. Vet. Res. 1991, 52, 1507-1511.
11.Humphries D. E., Wong G. W., Friend D. S., Gurish M. F., Qiu W. T., Hung C., Sharpe A. H., Stevens R. L.: Heparin is essential for the storage of specific granule proteases in mast cells. Nature 1999, 400, 769-772.
12.Innes J. F., Sharif M., Barr A. R. S.: Changes in concentrations of biochemi-cal markers of osteoarthritis following surgibiochemi-cal repair of ruptured cranial cru-ciate ligaments in dogs. Am. J. Vet. Res. 1999, 60, 1164-1168.
13.Klaassen C. D., Boles J. W.: Sulfation and sulfotransferases 5: the importan-ce of 3-phosphoadenosine 5-phosphosulfate (PAPS) in the regulation of sulfation. FASEB J 1997, 11, 404-418.
14.Kovanen P. T., Pentikainen M. O.: Decorin links low-density lipoproteins (LDL) to collagen: a novel mechanism for retention of LDL in the athero-sclerotic plaque. Trends Cardiovasc. Med. 1999, 9, 86-91.
15.Lewis S., Crossman M., Flannelly J., Belcher C., Doherty M., Bayliss M. T., Mason R. M.: Chondroitin sulphation patterns in synovial fluid in osteoarth-ritis subsets. Ann. Rheum. Dis. 1999, 58, 441-445.
16.Liu J., Thorp S. C.: Cell surface heparan sulfate and its roles in assisting viral infections. Med. Res. Rev. 2002, 22, 1-25.
17.Lohmander L. S.: Markers of cartilage metabolism in arthrosis. Acta Orthop. Scand. 1991, 62, 623-632.
18.Manna F., Dentini M., Desideri P., De Pita O., Mortilla E., Maras B.: Com-parative chemical evaluation of two commercially available derivatives of hyaluronic acid (hylaform from rooster combs and restylane from strepto-coccus) used for soft tissue augmentation. J. Eur. Acad. Dermatol. Venerol. 1999, 13, 183-192.
19.Michanetzis G., Katsala N., Missirlis Y.: Comparison of haemocompatibility improvement of four polymeric biomaterials by two heparinization techni-ques. Biomaterials 2003, 24, 677-688.
20.Mousa S. A., Fareed J.: Overview: from heparin to low molecular weight heparin: beyond anticoagulation. Curr Opin Investig Drugs 2001, 2, 1077--1080.
21.Myers S. L.: Synovial fluid markers in osteoarthritis. Rheum. Dis. Clin. North Am. 1999, 25, 433-449.
22.Ninomiya T., Sugiura N., Tawada A., Sugimoto K., Watanabe H.: Molecular cloning and characterization of chondroitin polymerase from Escherichia coli strain K4. J. Biol. Chem. 2002, 277, 21567-21575.
23.Nizet V., Ohtake T., Lauth X., Trowbridge J., Rudisill J., Dorschner R. A., Pestonjama V., Piraino J., Huttner K., Gallo R. L.: Innate antimicrobial pep-tide protects the skin from invasive bacterial infection. Nature 2001, 414, 454-457.
24.Orloff L. A., Glenn M. G., Domb A. J., Esclamado R. A.: Prevention of ve-nous thrombosis in microvascular surgery by transmural release of heparin from a polyanhydride polymer. Surgery 1995, 117, 554-559.
25.Penc S. F., Pomahac B., Eriksson E., Detmar M., Gallo R. L.: Dermatan sulfate activates nuclear factor-kappab and induces endothelial and circula-ting intercellular adhesion molecule-1. J. Clin. Invest. 1999, 103, 1329-1335. 26.Penc S. F., Pomahac B., Winkler T., Dorschner R. A., Eriksson E., Gallo R. L.: Dermatan sulfate released after injury is a potent promoter of fibroblast growth factor-2 function. J. Biol. Chem. 1998, 263, 28116-28121.
27.Raats C. J., Van Den Born J., Berden J. H.: Glomerular heparan sulfate alte-rations: mechanisms and relevance for proteinuria. Kidney Int. 2000, 57, 385-400.
28.Rabenstein D. L.: Heparin and heparan sulfate: structure and function. Nat. Prod. Rep. 2002, 19, 312-331.
29.Roberts J. A.: Tropism in bacterial infections: urinary tract infections. J. Urol. 1996, 156, 1552-1559.
30.Rorvik A. M., Grondahl M.: Markers of osteoarthritis: a review of the litera-ture. Vet. Surg. 1995, 24, 255-262.
Adres autora: mgr in¿. Joanna Zeyland, ul. Strzeszyñska 32, 60-479 Poznañ; e-mail: jzeyland@yahoo.com, jzeyland@gmail.com
