A C T A U N I V E R S I T A T I S L O D Z I E N S I S
F O L IA B IO C H IM IC A E T B IO P H Y S IC A 14, 1999
Emilia Krajewska, M aria B ryszew ska
TERAPIA FOTODYNAMICZNA
A rty k u ł stanow i przegląd p o d staw fizycznych terapii lbtodynam icznej n o w o tw o ró w o ra z p o d staw o w y ch fotouczulaczy stosow anych w tej terap ii.
R E A K C J E F O T O S E N S Y B IL IZ A C J I
P ojęcie „ te ra p ia fo to d y n am icz n a” (PD T - ang. photodynam ic therapy) w prow adził von T app ein er, któ ry zastosow ał zjaw isko fotosensybilizacji do leczenia n o w otw oró w skóry. U żyw ał on 5% barw n ik a eozynow ego, k tó ry m k ilk ak ro tn ie w ciągu dw óch miesięcy sm arow ał zaatak o w a n e m iejsca i w y staw iał na działanie prom ieniow ania słonecznego lub naśw ietlał lam pam i. R ezultatem była regresja n ow otw o ru [1]. Później o k az ało się, że zarów no b arw nik eozynow y, ja k i o ra n ż akrydynow y są zw iązkam i toksycznym i i rak otw órczym i i nie używ ano ju ż ich więcej w P D T .
Fotosensybilizacją (światłouwrażliwieniem) nazywam y zdolność pochłaniania energii p ro m ieniow ania świetlnego i przekazyw ania jej innym su bstan cjo m biorącym udział w reakcji świetlnej. F o touczulacz, znajdujący się w stanie podstaw o w ym , służy ja k o chrom ofor. W w yniku absorpcji św iatła sen- sybilizator ulega w zbudzeniu do wyższego poziom u energetycznego. W zb u d zo n a cząsteczka fotosensybilizatora m oże reagować bezpośrednio z substratem lub z innym i cząsteczkam i (najczęściej z tlenem ), znajdującym i się w m ie szaninie reakcyjnej, dając produk ty m ogące ponow nie reagow ać z substratam i. T a k więc proces fotosensybilizacji inicjow any jest przez św iatło, lecz dalsze e tap y reakcji zachodzą ju ż w ciem ności.
N ieak ty w n a cząsteczka fotouczulaćza znajduje się w stanie singletow ym , °S, w k tó ry m nie p o siad a niesparow anych spinów elektronow ych. A b so rp c ja fo to n ó w (hv) pow oduje przejście elek tro n u na wyższy o rb ital m o lek u larn y bez zm iany jego spinu. Pierwszy stan w zbudzony jest rów nież stanem singletow ym , 1S. Je d n a k niewiele reakcji fotosensybilizacji przebiega za
pośrednictw em tego stan u z p o w o d u jego krótkiego czasu życia (1-100 ns). W zb udzon y stan singletowy m oże przechodzić do sta n u podstaw o w ego em itując ciepło lub kw ant św iatła (fluorescencja). W p rzy p ad k u efektyw nego fotosen sy b ilizato ra zachodzi szybka inw ersja spinu w ysokoenergetycznego elek tro n u , czego efektem jest m etastały stan trypletow y, 3S, k tó ry p o sia d a d w a niesparow ane elektrony i dłuższy czas życia (1-1000 /is). Podczas swojego życia w zbudzony sensybilizator w stanie trypletow ym m oże d oznaw ać wielu zderzeń z innym i cząsteczkam i i w rezultacie pośredniczyć w reakcjach fotosensybilizacji. Procesy te m o żn a przedstaw ić następująco:
(hv)
°S —» *S —*■ 3S —> reakcje fotosensybilizacji.
Reakcje fotodynamiczne
W większości reakcji fotosensybilizacji fotouczulacz w stanie trypletow ym w raca ostatecznie do stanu podstaw ow ego i m oże ab so rb o w ać kolejny fo to n . W k ilku p rzy p ad k ach sensybilizator jest zużyw any stechiom etrycznie w reakcji. W iele reak cji fotosensyb ilizacji p rzeb ieg a z udziałem tlen u , nazyw ane są wtedy fotodynam icznym i. R eakcje z tlenem m o g ą przebiegać d w o m a drogam i; m ów im y wtedy o reakcjach typu I i ty p u II.
R eakcje typu I
W reak cjach tego typu w zbudzony sensybilizator zn ajdujący się w stanie trypletow ym reaguje n a p o cz ątk u z cząsteczkam i ze swojego bezpośredniego sąsiedztw a poprzez tran sfer elektronów lub pro to n ó w . W rezultacie pow staje sem izredukow any sensybilizator, S - lub SH ' i sem iutleniony su b stra t. T e wolne rodniki są reaktyw ne chemicznie. W większości przypadków pow stający w olnorodnikow y su b strat reaguje z tlenem , d ając utlenione p ro d u k ty różnego typu (np. nadtlenki), k tó re później m o g ą reagow ać inicjując w o ln oro dnik ow y proces autooksydacji. Sem izredukowany sensybilizator m oże reagow ać z tlenem w stanie podstaw ow ym , 30 2. W raca wtedy do stanu podstaw ow ego i generuje an io n o ro d n ik ponadtlenkow y:
S " + 3O 2 ^ 0S + O 2 ",
k tó ry w tórnie m oże reagow ać z biom olekułam i lub ulegać d ysm utacji, d ając H 20 2. Dalsze reakcje katalizow ane są przez enzym, dysm utazę ponad tlen ko w ą (SO D ). A n io n o ro d n ik po n ad tlen k o w y m o że rów nież pow staw ać, cho ć jest to reakcja m ało w ydajna, w w yniku tran sferu elek tro n u ze w zbudzonego sensybilizatora, znajdującego się w stanie trypletow ym , n a tlen:
Pow stający sem iutleniony sensybilizator m oże reagow ać ze zredukow anym su b stratem , dając sensybilizator w stanie podstaw ow ym i sem iutleniony su b stra t, m ogący uczestniczyć w dalszych reakcjach.
R eakcje typu I przew ażają przy w ysokim stężeniu su b stra tu i niskim stężeniu tlenu, poniew aż tlen w spółzaw odniczy z su bstratem o sensybilizator. R ów nież p o w stan ie połączo n y ch niekow alencyjnic k o m p lek só w s u b s tra t - sensybilizator przed naświetleniem podnosi praw dopodobieństw o zachodzenia reakcji ty pu I.
R eakcje typu II
W reakcjach tych uczestniczy sensybilizator znajdujący się w stanie trypletow ym , k tó ry w chodzi, poprzez tran sfer energii, w in terakcję z tlenem znajdującym się w stanic podstaw ow ym . Sensybilizator p o w ra ca wtedy d o stan u podstaw ow ego, zaś tlen przechodzi do w zbudzonego stan u sin- gletow ego, 'O j :
3s + 2o2 — °s + 1o2.
Poniew aż o b a składniki, sensybilizator i tlen w stanie p o d staw ow y m , są try p letam i, ich interak cja nie w ym aga zm iany spinu elek tro n u i przez to jest skuteczna. Tlen m oże istnieć w dwóch wzbudzonych stanach singletowych; fo rm a dłużej żyjąca, 1Afl z n ad w y żk ą energii 23 k ca l/m o l je st fo rm ą po d staw o w ą, bio rącą udział w reakcjach fotodynam icznych. Jego czas życia w w odzie wynosi 4 //s. Jednakże w obecności cząsteczek biologicznych, z którym i m oże reagow ać, czas ten znacznie się skraca. R eak cja tlenu singletow ego z k o m ponentam i organicznym i nie jest już spinow o zab ro n io n a, ja k m a to m iejsce w p rzy p ad k u tlenu w stanie po dstaw ow ym . C o więcej, tlen singletow y jest bardziej elektrofilow y niż 30 2 i m oże reagow ać szybciej z bogatym i w elektrony w ielom a biom olekułam i, dając u tlenion e p o ch odn e. M ożliw e są następujące reakcje:
1) addy cja * 0 2 d o w ęglow odorów etylenow ych z allelicznym i ato m am i w o d o ru (tak ja k np. nienasycone kw asy tłuszczow e i cholesterol), czego efektem są h y droksynadtlenki;
2) ad dycja * 0 2 d o system u dienów w zw iązkach heterocyklicznych (jak np. histydyna), co daje en d onadtlenki;
3) reakcja ł 0 2 z organicznym i siarczanam i (np. m etio nina) i po w staw anie sulfotlenków .
Anaerobowe reakcje fotosensybilizacji
Istn ieją zw iązki, k tó re in d u k u ją przekształcanie biom olekuł n a skutek reakcji fotosensybilizacji pod nieobecność tlenu. N ajw ażniejszą g ru p ą takich
sensybilizatorów są psoraleny, atakujące kwasy nukleinowe. Innym i zw iązkam i są ketony, ja k np. aceton, któ reg o w zbudzenie d o stan u trypletow ego m o żn a generow ać światłem w zakresie 300-360 nm . W ciem ności keton y m o g ą być przekształcane d o stanu trypletow ego za pośrednictw em pewnych enzym ów na drodze reakcji oksydacji lub w w yniku dekom pozycji n adtlenków lipidow ych. E nergia stanów trypletow ych wielu k eton ów jest wyższa niż energia w iązań pom iędzy zasadam i D N A ; w rezultacie m oże następow ać jego uszkodzenie (np. n a skutek form ow ania pirym idynowych dim erów o strukturze cyklobutanu) [2],
Fotosensybili zatory
W 1913 ro k u za o b serw o w an o selektyw ne g ro m ad zen ie w tk a n k a c h now o tw orow ych porfiry n, w tym po chodnych h em ato p o rfiry n o w y ch (H P D - haem atoporphyrin derivative) i zaczęto ich używać ja k o sensybilizatorów [3]. H P D je st m iesza n in ą zaw ierającą h e m a to p o rfiry n y i p ro d u k ty ich d eh y d ratacji o raz dim ery i wyższe oligom ery po rfiry n połączone w iązaniam i estrow ym i. O prócz H P D wym ienić należy F o to frin II, fo to san o ra z p ro to - porfirynę IX . F o to frin II i fo to san są oczyszczonym i p re p a ra ta m i aktyw nej frakcji H P D ; p re p ara ty kom ercyjne (85% czystości) zaw ierają p ro to p o rfiry n ę IX (PP), hydroksyetylo-w inylo-deutero-porfirynę IX (IIV D ) i zanieczyszczenia w postaci wysoce zagregow anych ko m p o n en tó w [4, 5]. B ad an ia w skazują, że fotosensybilizacja za pośrednictw em porfiryn zachodzi w edług reakcji ty p u II (generow any jest tlen singletow y) [6, 7], N iestety, głów ne pasm o absorpcji H P D przy p ad a na długość fali ok. 400 nm (rys. 1). Św iatło czerw one (630 nm), używ ane w fototerap ii z p ow o d u w zrastającej p rzenikal- ności tkan ek w raz ze w zrostem długości fali, jest przez nie słabo pochłaniane. P o n a d to sk ó ra p acjen ta staje się bard zo w rażliw a n a św iatło (na skutek pow olnego u w alniania H P D ) [2],
R ozpoczęto poszukiw ania alternatyw nych sensybilizatorów w fo to tera p ii now otw orów . Zw rócono wtedy uwagę n a ftalocyjaniny (Pc), wcześniej stosow a ne jak o katalizatory, barwniki i pigm enty [9]. M etaloftalocyjaniny są związkami porfirynopodobnym i, trwałymi i łatwymi do zsyntetyzowania. Silnie pochłaniają światło czerwone z zakresu 600-700 nm; d la X = 680 nm e ~ 2 x 105 m 2 m ol - 1 (H P D : £ = 1200, 1 = 624 nm). U żyw ając ftalocyjanin u zy sk an o d o d a tk o w e przesunięcie ku czerwieni, um ożliw iające lepszą penetrację tk an ek : o 20% głębiej dla skóry i 50% dla tk an k i m ózgowej d orosłego człow ieka. N a p rzykład: po naśw ietleniu tk an ek prom ieniow aniem o długości fali 630 nm św iatło dociera n a głębokość od 1 d o 3 m m . Jeżeli jed n ak użyjem y św iatła z zak resu 700-850 nm , to w niknie o no n a głębokość 6 m m [10] (rys. 2).
Długość fali (nm)
R ys. 1. P rzykładow e w idm o a b so rp cy jn e p o rfiry n [8]
Długość fali (nm)
Dtugość fali (nm)
R ys. 2. T ran sm isja o p ty czn a sk ó ry n a głębokości (a) 0,05 m m i (b) 2,0 m m [11]
F o to se n sy b iliza cja przy udziale Pc je st procesem fo to d y n am icz n y m , w k tó ry m niezbędna jest obecność tlenu m oleku larnego , lecz w zależności od p o larno ści środow iska reakcje typu I i II m o g ą zachodzić rów nocześnie, zaś w p rzypadku pochodnych alum iniow ych i cynkow ych m am y d o czynienia tylko z reakcjam i typu I [12].
S tw ierdzono, że ato m centralny jest krytyczny d la w łaściw ości fo to - d y n am iczn y ch ftalo cy jan in . Pc zaw ierające m etale c h a ra k te ry z u ją c e się właściw ościam i diam agnetycznym i, tak ie ja k alum inium lub cynk, są aktyw ne fotobiologicznie. B rak takiej aktyw ności obserw uje się w p rz y p ad k u m etali p aram agnetycznych, ja k żelazo, k o b alt, nikiel. P od staw n ik i lokujące się przy peryferycznych pierścieniach benzenow ych w pływ ają n a ro zpuszczalność ftalocyjanin [13]. Zm ienia się przez to pow inow actw o barw nika d o biom olekuł w ystępujących w kom órce. L o kalizacja barw n ik a w ko m órce będzie decy d o w a ła o jeg o fototoksyczności.
B arw niki ftalocyjaninow e zaliczane są do fo to sen syb ilizato ró w drugiej generacji. O p ró cz nich należy wymienić: chlorofile i ich p o ch o d n e, takie jak : te tra (m -hydroksyfenylo) chlorofil i jego an alo g - bak terio ch lo ro fil, m o n o -L -a sp arty lo chlorofil e6 (N Pe6) [14-16]; zm odyfikow ane po rfiryn y, ta k ie jak: sulfonow ane tetrafenyloporfiryn y (T P P S J [17, 18], te tra (m - -hydroksyfenylo) porfiryny (m -T H P P ), uropo rfiryn y [19], p so ralen i jego p o chodne, błękit m etylenow y [16] i wiele innych.
O statn io w ykazano, że p o d aw an ie kw asu 5-am inolew ulinow ego (5-A LA ), p re k u rso ra w szlaku biosyntezy hem u, po w oduje zw iększoną syntezę i g ro m adzenie p orfiryn (w szczególności p ro to p o rfiry n y IX ) w n iek tó ry ch k o m ó r k a c h /tk a n k a c h n o rm alnych i no w otw orow ych, co pozw ala, po naśw ietleniu, n a zainicjowanie reakcji fotosensybilizacji [20-22]. Biosynteza hem u rozpoczyna się pow staniem kw asu 5-aminolewulinowego z glicyny i bursztynylo koenzym u A. O statnim jej etapem jest in k o rp o ra cja żelaza d o p ro to p o rfiry n y IX , co m a m iejsce w m ito ch o n d riach .
K w as 5-am inolew ulinow y zastosow ali p o raz pierw szy w 1990 r. K e n n e d y i wsp. A L A m oże być stosow any m iejscow o lub u stro jo w o do leczenia n o w otw orów skóry i innych, ja k np. rak p o d staw n o k o m ó rk o w y sk ó ry i ra k gruczołow y żołądkow o-jelitow y [23-25], Jest rów nież skuteczny w diagnostyce n ow otw orów skóry, pęcherza, przew odu po k arm o w eg o i płuc [26], A L A je st związkiem hydrofitow ym i niełatw o pen etruje sk órę i błony biologiczne. Jeżeli A L A jest stosow any m iejscow o w leczeniu no w o tw o ró w skó ry, swoje działanie zaw dzięcza zwiększonej przepuszczalności zm ienionej tk a n k i. T rw ają b a d a n ia nad lipofilnym i p ochodnym i estrów k w asu 5-A L A , łatw iej i głębiej w nikający ch w tk an k i. P o ch o d n e ta k ie są co p ra w d a nieaktyw ne fotodynam icznie, lecz esterazy znajdujące się w k o m ó rk a c h m o g ą odcin ać cząsteczkę kw asu od części estrow ej [27],
Psoralen AIPcSn Trimer porfirynowy m-THPC m-THPP 5-ALA PPIX
R ys. 3. W zory chem iczne n iek tó ry ch fo to sen sy b ilizato ró w
CH c h3 C H 2 - C H 3
T rim er porfirynow y jest głównym aktyw nym składnikiem F o to frin u . R , i R 2 to a lb o g ru p a h y d ro k sy e ty lo w a [C H (O H )C H 3], a lb o w in y lo w a (C H = C H 2); M e - to g ru p a m etylow a (C H 3); P H - g ru p a kw asu p ro p io - now ego [(C H 2) 2CO O H ];
A1PcS„ - ftalocyjanin a alum iniow a z n grupam i sulfonow ym i; R jest po d staw ian e przez grupę sulfonow ą ( S 0 3) lub w od ór (II);
m -T H P P , to 5,10,15,2 0 -te tra (m -h y d ro k s y fe n y lo )p o rfin a , m -T H P C - 5,10,15,20-tetra(m -hydroksyfenylo) chlorofil;
M B D - p o c h o d n a błękitu m etylenow ego (m ethylene blue derivative); 5-A L A , to kw as 5-am inolew ulinow y; P P IX , to p ro to p o rfiry n a IX , Vi - g ru p a w in y lo w a (C H = C H 2), P H - g ru p a k w a su p ro p io n o w e g o [(C H 2) 2C O O H ],
Czynniki wpływające na fotoaktywność sensybilizatorów
N ależy podkreślić, że stopień uszkodzenia zależy od lokalizacji b arw n ik a w kom órce i przedziałach m iędzykom órkow ych. M aksym alne działanie uzyski w ane jest wtedy, gdy barw nik znajduje się możliwie blisko swojego celu. Jest to spow odow ane niewielkimi odległościami, jakie m ogą przebyć aktyw ne produkty fo tow zbud zenia podczas swojego czasu życia (mniej niż 0,1 fim w m ateriale biologicznym ) [6, 28]. L okalizacja b arw nika w kom óce jest uzależn io n a od wielu czynników, włączając w to jego właściwości fizykochemiczne, ch arak tery stykę otaczającego go środow iska, nośnika, czasu inkubacji [29], B ardzo w ażną w łaściw ością sensybilizatorów jest ich rozpuszczalność.
W p rz y p ad k u p orfiryn kluczow e znaczenie m ają boczne łańcuchy ja k o p o dstaw n ik i przy pierścieniu tetrapiro low ym pow odujące, że zw iązki te m o g ą być cząsteczkam i albo b ard zo lipofilow ym i, ja k np. PP i fo to ak ty w n e w obec m olekuł o właściw ościach hydrofobow ych lub zasocjow anych z błon ą, alb o b ard zo hydrofilow ym i, ja k uro p o rfiry n y , k tó ry ch d ziałanie jest bardziej skuteczne w obec k o m p o n en tó w rozpuszczalnych w w odzie z enzym am i cytoplazm atycznym i w łącznie [7, 29]. Poniew aż czas życia 0 2 CAg) w ro z p uszczalnikach organicznych i m icelach (20-25 fis) jest znacznie dłuższy niż w w odzie (3-4 fis) [6, 30], fo touszkodzenia zachodzące za pośrednictw em tlen u singletow ego będą większe, jeśli p orfiry ny i cząsteczki - tarcze są zlokalizow ane w regionach h y dro fobow ych [7]. W p rz y p ad k u b arw n ik ó w ftalocyjaninow ych zwiększenie ich hydrofilow ości będzie się w iązało z przy łączeniem d o pierścieni benzenow ych reszt kw asu siarkow ego.
R o zm iar uszkodzeń jest też silnie determ ino w any przez stopień agregacji sensybilizatora; tylko form y m ono m eryczne są aktyw ne fotodynam icznie. A g reg aty w ykazują niską w ydajność form o w an ia tlenu singletow ego.
Dystrybucja fotoscnsybilizatorów w komórce
l O z, pow stały na skutek w zbudzenia fo tosen syb ilizato ra przez św iatło,
natychm iast wchodzi w reakcję z przypadkow ym i biom olekułam i znajdującym i się w jego bezpośrednim sąsiedztw ie (są to najczęściej k o m p o n en ty błonow e [31]), chociaż istnieją doniesienia o jego zdolności penetracji m em b ra n biologicznych [6], Stw ierdzono jed n ak , że jeżeli J0 2 g enerow any jest na zew nątrz kom ó rk i (jak m a to m iejsce w p rzy p ad k u u ro p o rfiry n lub p rzy łączonych d o białek h em atoporfiryn), to proces fo tod estruk cji nie jest tak skuteczny ja k w p rzypadku * 0 2 generow anego w ew nątrz k o m ó rk i. C o więcej, w ydajność kw antow a d la procesu inaktyw acji k om ó rek przez F o to frin i inne lipofilne barw niki była 10-krotnie wyższa niż przez n iek tó re b arw niki hydrofilow e [32]. Poniew aż wszystkie te sensybilizatory ch a rak tery zu ją się p o d o b n ą w ydajnością tw orzenia l0 2 [33], d an e te w skazują n a isto tne znaczenie dystrybucji barw n ik a w kom órce.
H e m a to p o rfiry n y i F o to frin zą zw iązkam i lipofilnym i i g ro m ad zą się głów nie w m ito c h o n d riach , retikulum endoplazm atycznym , b ło n ach plaz- m atyczn ych oraz, in vitro, w obszarze perijądrow ym cytoplazm y. W niższych stężeniach m ogą również wnikać do lizosomów i ją d ra [34, 35]. Po naświetleniu stw ierdzo no, że głównym m iejscem atak u jest układ błonow y k o m ó rk i [35]. F ta lo c y ja n in y AlPcS„, b a d a n e za p o m o cą m ik ro sk o p ii fluorescen cyjn ej, lokują się w kom ó rce w zależności od swojej polarności: bardziej p o larn e A IP cS j i A1PcS4 d ają tylko p u n k to w ą fluorescencję w cytoplazm ie. R o zkład tych barw ników p o d o b n y jest do rozm ieszczenia o ra n żu ak rydynow ego (A O ) w tych sam ych k o m ó rk ach , co w skazuje, że lo kalizu ją się on e głów nie w lizosom ach. G d y b ad an o m niej p o larn e A lP cS j i A1PcS2, o trzy m a n o bardziej zróżnicow any w zór subkom órkow ej lokalizacji b arw n ik a [36], co może być spow odow ane ich amfipatycznymi właściwościami [37], Ftalocyjaniny te okazały się je d n a k bardziej skuteczne, niż A1PcS3 i A1PcS4, jeśli chodzi 0 fo to d estru k cję kom órek. W skazuje to, że in aktyw acja k o m ó rek przez P D T jest o wiele skuteczniejsza, jeżeli po w o d o w an a jest przez barw niki lokujące się w błon ach, a nie w lizosom ach. S tw ierdzono też, że A1PcS 2 są bardziej skuteczne w fotodestrukcji k om ó rki niż A lP cS 1; m im o że barw niki m o n o su lfo n o w an e są bardziej hyd rofobow e niż dw usulfonow ane. T łum aczy się to większą m ożliw ością agregacji A lP cS ^
W łaściw a tarc za atak u indukow anej przez ftalocyjaniny P D T nie jest jeszcze d o końca znana, choć często obserwuje się uszkodzenia m itoch on driów [37], Użycie transm isyjnego m ik ro sk o p u elektronow ego pozw oliło stw ierdzić, że A1PcS2 i A lP cS i pow o d u ją uszkodzenia układu błonow ego k o m ó rk i, ja k np. częściową u tra tę błony cytoplazm atycznej, pęcznienie m ito c h o n d rió w 1 zniszczenie retiku lum endoplazm atycznego. Dzięki użyciu elektronow ego
m ik ro sk o p u skaningow ego stw ierdzono w błonach plazm atycznych k o m órek inkubo w anych z A1PcS2 i A lP c S ^ oprócz zniknięcia m ikrorzęsek, pojaw ienie się licznych dziur, przez które następow ał wyciek cytozolu i innych składników ko m ó rk o w y ch d o środow iska zew nętrznego. M oże to być spow o do w an e sieciow aniem białek błonow ych [38]. A1PcS4 i A1PcS 3 p o w o d u ją zaś p o w staw anie dużych „b ą b li” n a pow ierzchni błony kom órkow ej, k tó ra w końcu pęka. T ak więc A lPcSn w różny sposób działają n a b ło n ę k o m ó rk o w ą k o m ó rk i, lecz żad n a z nich nie pow oduje uszkodzeń ją d ra .
Z aró w n o błony biologiczne, ja k i biocząsteczki m o g ą być m od y fik o w an e przez ftalocyjaniny. Fotosensybilizacja przez ftalocyjaniny cynkow e prow adzi d o utlenienia niektórych am inokw asów , tak ich jak : cysteina, histyd yn a, m etionina, tryptofan i tyrozyna, ja k i również uszkodzeń niektórych enzymów, ja k np. lizozym u [39]. Innym efektem jest pojaw ienie się w iązań krzyżow ych pom iędzy białkam i błonow ym i. P o n ad to w roztw orach w odnych sulfonow ane p o ch o d n e ftalocyjanin pow odują utlenianie cholesterolu d o p o ch o d n y ch 5a- -h y d ro k sy n a d tle n k o w y ch (5a-O O H ), będących specyficznym p ro d u k te m reakcji z 10 2 [40]. A1PcS4 p o w o d u ją rów nież peroksydację lipidów błon ery tro cy tarn y ch [41]. W szystkie chem iczne m odyfikacje m og ą p ro w adzić do zm iany przepuszczalności błony, zm niejszenia jej płynności, inhibicji b ąd ź inaktyw acji enzym ów błonow ych lub receptorów , a w konsekw encji - do lizy k om ó rk i. Pc m o g ą rów nież p ow odow ać niszczenie ją d ra k om ó rk o w eg o , lecz nie w wyniku przyłączania się do chrom atyny, lecz d o błony jądrow ej [42],
Lokalizacja sensybilizatorów w tkankach nowotworowych
Pom im o wielu lat intensyw nych badań , m echanizm tra n sp o rtu i lokalizacji sensybilizatorów w k o m ó rk ac h tk a n e k n ow otw orow ych nie zo stał d o k o ń ca p o zn a n y . G uzy now o tw o ro w e zaw ierają, o p ró c z k o m ó re k zm ien io ny ch no w o tw o ro w o , w łasny układ naczyniow y (stanow iący ok. 10% tk an k i) i tk a n k ę śródm iąższow ą (zdrow e tk an k i rów nież zaw ierają śródm iąższ, lecz w guzach jest go zw ykle znacznie więcej). D o k o m ó re k n ow otw orow ych m o g ą się d o stać jedynie te cząsteczki, k tó re są niesione przez krew . U kład naczyniow y pow staje n a bazie u k ład u g o sp od arza, lecz jeg o org an izacja i tem po w zrostu, w zależności od rodzaju guza, m oże być zupełnie odm ienna. B ad an ia m orfologiczne naczyń now otw orow ych ludzi i zw ierząt ujaw niły w ystępow anie szerokich połączeń, okienek i kanałów pom iędzy śródbłonkiem , pow stałych n a skutek b ra k u ciągłości lub niew ystępow ania błony pod staw n ej śró d b ło n k a. P o n a d to u kład naczyniow y ch arak teryzu je się n ierów nom iernym rozgałęzieniem i k o m ó rk i znajdujące się w głębszych w arstw ach guza nie m a ją z nim k o n ta k tu (kom órki rakow e z obszarów p o zbaw io ny ch k rą żen ia
m o g ą na pierwszy rzut o k a okazać się m artw e, ale często ożyw ają z chw ilą, gdy d o trą d o nich substancje odżywcze) [43, 44]. T a k a budow a m orfologiczna m oże oznaczać, że przepuszczalność k o m ó rek now otw orow ych jest in n a niż tk a n e k praw idłow ych; substancje d o starc zan e z zew n ątrz (w tym rów nież leki) m a ją więc u tru d n io n y d o stęp do k o m ó rek guza. T k a n k a śródm iąższow a sk ład a się z różnych kom ponentów : m akrocząsteczek (gliko zoam in og lik any , glikoproteiny, w ęglow odany, lipidy i w oda), w łókien (kolagen) i n o rm alnych ko m ó rek g o sp o d arza (fibroblasty, m ak ro fag i, m asto cyty itp .) [45],
S tw ierdzono, że p i l wielu ko m ó rek no w otw orow ych je st niższe niż k o m ó rek n o rm aln ych [46, 47], G łó w n ą różnicą pom iędzy guzam i litym i a otaczającym i je n orm alnym i k o m órkam i jest ich zap o trzeb o w an ie n a składniki odżywcze. R ów nież ilość tlenu jest raczej niedostateczna. Spalanie glukozy zachodzi więc częściowo na dro d ze anaerobow ej, w w yniku czego pow staje kw as m lekow y. N a d m ia r kw asu pow stającego w ew nątrz k o m ó rk i jest tra n sp o rto w a n y do środow iska zew nętrznego. p H cytozo lu k o m ó rek now otw o ro w ych m oże się różnić naw et o połow ę jed n o stk i. Jest to istotn y czynnik przyczyniający się d o obserw ow anej preferencyjnej ak u m u lac ji fotouczulaczy w now o tw o rach . Z n ajdu jąc się ju ż w ew nątrz k o m ó rk i, w p i l ok. 6,9, obojętny d o tej po ry sensybilizator zyskuje jed en bąd ź dw a ład un ki; z tak im „b ag ażem ” nie m oże ju ż przejść przez błonę.
C o raz w iększa liczba d anych w skazuje n a to, że n a zd olno ść p rzen ik an ia d o kom ó rek now otw orow ych m a ją wpływ chem iczne właściwości cząsteczki tran sp o rto w an ej, a w szczególności zdolność przy łączania się d o białek osocza [48,49]. Sugeruje się, że barw niki hydrofilow e tra n sp o rto w a n e są głównie przez album iny i globuliny i lokują się w zrębie naczyń krw ionośnych guza. Bardziej h ydrofobow e barw niki przyłączają się d o lip o p ro tein i w ten sposób w nik ają d o k o m ó rek now otw orow ych [50]. S tw ierdzono, że ilość b arw n ik a w k o m ó rk ac h zw iększa się, jeżeli był on wcześniej in k u b o w an y z L D L lu b lip osom am i. S p o śró d b arw n ik ó w w nikający ch d o w n ę trza k o m ó rk i należy wym ienić A lP cS 1; A1PcS2, F o to frin , m - I H P C i m -T H P P . N ajw iększe stężenia obserw ow ano po 24 godz. od iniekcji. Sposób rozm iesz czenia w kom ó rce jest uzależniony od ilości p o d an eg o b arw n ik a i od rodzaju guza [51]. Tabela 1 przedstawia lokalizację fotouczulaczy w kom órkach i tk a n k a c h now otw orow ych.
B iorąc pod uwagę d an e dotyczące lokalizacji fotosensybilizatorów w guzie n o w o tw o ro w y m i m iejsca akcji fo to d y n am iczn ej, z a p ro p o n o w a n o d w a m echanizm y destrukcji now otw orów przez P D I : 1) pośredni, gdzie w ynikiem
zniszczenia uk ładu naczyniow ego n o w o tw o ru (śró d b ło n k a lub innych k o m p o n en tó w ściany naczynia) jest h ip o k sja 1 (i/lub an o k sja 2), co w efekcie p ro w a d zi d o śm ierci k o m ó re k now o tw o ro w y ch ; 2) b ez p o śred n i, kiedy k o m ó rk i now otw orow e są niszczone n a skutek bezpośredniej akcji foto- dynam icznej (uszkodzenia m ito ch o n d rió w lub k o m órko w ego system u b ło nowego). M echanizm destrukcji kom órki jest uzależniony od takich czynników, jak : właściwości chem iczne barw n ik a (hydrofilow ość, k tó ra determ in uje sp osób tra n sp o rtu i rozm ieszczenie w kom órce), stężenie tlenu w tk an ce o ra z czas od zaaplik o w an ia do w zbudzenia b arw n ik a przez św iatło [52, 53],
Pośredni mechanizm fotodestrukcji
P oczątkow o uw ażano, że terap ia fotodynam iczna n ow otw orów zawdzięcza sw oją efektyw ność selektywnej lokalizacji b arw n ika w k o m ó rk ac h n o w o tw orow ych i bezpośredniem u ich niszczeniu przez 10 2 pow stający n a sku tek fotoaktyw acji sensybilizatora. Jed n ak ostatnie prace sugerują, że w większości p rz y p ad k ó w uszkodzenie k o m ó rek n ow otw orow ych jest p o w o d o w a n e nisz czeniem u k ład u naczyniow ego guza, co indu ku je h ip ok sję/ano ksję k o m ó rek , a w ko ńcu - nekrozę [54]. R eakcja ta zachodzi w tedy, gdy naśw ietlanie tk a n e k p ro w a d zi się k ró tk o po p o d a n iu b a rw n ik a i p o w o d u je zw ęże nie/rozszerzenie naczyń krw ionośnych, agregację ery tro cy tó w i płytek krwi, w reszcie za trzy m an ie k rą ż e n ia [55], D o d a tk o w o P D T m oże in d u k o w a ć odpow iedź im m unologiczną, co objaw ia się pow staw aniem endogennych w azoaktyw nych m ediatorów . N a skutek uszkodzenia k om órek endotelialnych uw alniane są czynniki krzepnięcia krwi [56, 57], ja k n a przyk ład czynnik von W illeb ra n d a (vW F ), k tó ry p o średniczy w adhezji p łytek d o ścian naczyń [58], zakrzepicy [59] i uszkodzeniach naczyń k rw io no śny ch [60]. U szkodzenia błon lipidow ych pro w ad zą d o aktyw acji fosfolipazy A 2 k a ta lizującej uw alnianie kw asu arach idonow ego z fosfolipidów błonow ych [61]. N a skutek działania cyklooksygenazy n a kwas arachidonow y m ogą pow staw ać p ro stag lan d y n y , zaś z en d o p ero k sy n ad tlen k ó w p ro stag lan d y n - rozszerzające naczynia tro m b o k san y A 2 [62], P D T pow oduje d egranu lację m asto cy tó w 1 uw alnianie m ed iato ró w tak ich ja k h istam ina, p ro stag lan d y n a D 2 i czynnik aktyw ujący płytki krw i [63], co zachodzi w dw óch fazach: wczesnej (do 2 godz.) i późnej (od 2 d o 24 godz.). O pisane zm iany obserw uje się zaró w n o d la fotouczulaczy o w łaściw ościach hydrofilow ych (A1PcS4) ja k i hy drofobow ych (F o to frin , m -T H P C i m -T H P P ).
1 N ieznaczne niedotlen ien ie tk an ek .
M echanizm y prow adzące d o opisanych zm ian patofizjologicznych nie są d o k o ń ca znane. A utorzy w swych doniesieniach są je d n a k zgodni, że p o cz ątk o w e zm iany z a ch o d zą głów nie w ob ręb ie ś ró d b ło n k a [19, 55], S tw ie rd z o n o n a p rz y k ła d , że p o c h o d n e h e m a to p o rfiry n o ra z F o to f rin lo kalizują się głów nie w okół naczyń krw ionośnych [64], Jest to zgodne z doniesieniam i o dużym pow inow actw ie niektórych p orfiry n d o ko lagenu, elastyny i fibryny [65] o raz A1PcS4 i F o to frin u do m iejsc w ystępo w an ia białek kolagenow ych [22]; b iałka te i inne elem enty łączące tk a n k i są pierw szym obiektem atak u [66], D o regresji guza m o że przyczyniać się rów nież o dpow iedź im m unologiczna, a w szczególności uw alnianie przez m ak ro fag i czynnika m artw icy n o w otw orów (T N F ). U żyw ając ja k o uk ład u m odelow ego tk a n e k m yszy stw ierdzono, że jednoczesne p o d an ie zrekom - binow anego ludzkiego T N F i F o to frin u nasila skuteczność P D T [67], Co więcej, fo to te ra p ia no w otw orów m oże prow adzić do m iejscow ych reakcji im m unologicznych, m anifestujących się d u żą ilością k o m ó rek zapalnych: lim focytów , k o m ó rek plazm atycznych i m ak ro fag ó w [68],
Bezpośredni mechanizm fotodestrukcji
U szkodzenia u k ład u naczyniow ego (w łączając b ezpośrednie zniszczenie k o m ó rek śró d b ło n k a) nie zawsze jest bezpośrednią przyczyną zniszczenia n o w o tw o ru . W czesne dośw iadczenia w ykazały, że p o ch o d n e h e m a to p o r- firynow e preferencyjnie ak u m u lu ją się w tk a n k a c h no w otw o ro w ych zw ie rz ą t o raz człow ieka i pow o d u ją ich nekrozę [69], O dpow iedź b ezp o śred n ia zachodzi w tedy, gdy czas od iniekcji b arw n ik a d o naśw ietlenia jest d ostatecznie długi i jeżeli użyte zo stan ą specjalne no śniki, np. L D L lub liposom y, ułatw iające w niknięcie b arw n ik a do k o m ó rk i [70], W yk azan o inaktyw ację wielu istotnych dla życia kom ó rk i enzym ów , tak ich ja k np. enzym y m ito c h o n d rialn e i tran sb ło n o w e (A 1 P aza i o k sy daza cy to ch ro m u c) [71, 72, 73]. N a stę p u je rów nież zauw ażalny sp ad e k p o zio m u A T P , ja k o b ezpośrednia odpow iedź tk an k i now otw orow ej n a P D T , k tó ry jest n a jp ra w d o p o d o b n ie j spow o d o w an y zachw ianiem funkcji m ito c h o n d rió w [74]. D ziałanie fotosensybilizatorów jest uzależnione od lokalizacji b a rw n ik a w kom ó rce i od typu kom o rek now otw orow ych. C o więcej, o b a m ech an izm y d estru k c ji n o w o tw o ró w , po śred n i i b ez p o śred n i, z a c h o d z ą gdy b arw nik jest um iejscow iony w ew nątrz- i zew n ątrzk o m ó rk o w o . W nie k tó ry ch p rzy p ad k ach , gdy naśw ietlanie prow adzi się 4 godz. p o p o d an iu b arw n ik a, zachodzi w łaśnie ten typ fo todestrukcji [60], bow iem w tych w a ru n k ach barw nik lokalizuje się jednocześnie n a zew nątrz i w ew nątrz kom ó rk i.
W o statn ich doniesieniach dow iedziono, że we wczesnych etap a ch P D T in d u k o w a n a jest a p o p to z a kom ó rek oraz stw ierdzono udział jo n ó w w apnia w aktyw acji tego pro cesu [75, 76], P o zo stało je d n a k jeszcze w iele nie w yjaśnionych kwestii, tak ich ja k relacja pom iędzy a p o p to z ą a ob serw o w an ą przy P D T cytotoksycznością, spo sób w yzw alania ap o p to zy o ra z p ośred nie i bezpośrednie działanie P D T na kom ó rk i no w otw orow e in vivo.
T a b e l a 1
L o k alizacja fo to sen sy b iliz ato ró w w k o m ó rce i tk an ce n o w o tw o ro w ej [77]
F o to se n sy b iliz a to r Cel k o m ó rk o w y L o k alizacja w no w o tw o rze O ra n ż a k ry d y n o w y 5-ALA AIPcS AIPcSj AIPcSj AIPcS* H e m in a B ak terio ch lo ro fil a H p H p + lip o so m y lub L D L H p D B łękit m etylenow y F o to frin F o to s a n T H PC T H P P Z n P c + liposom y System błon k o m ó rk o w y ch Mitochondria/jądro komórkowe System błon k o m ó rk o w y ch (a p o p to z a) System błon k o m ó rk o w y ch L izosom y Lizosom y B ło n a k o m ó rk o w a M ito c h o n d ria K o m ó rk i n o w o tw o ro w e K o m ó rk i n o w o tw o ro w e, śró d b ło n ek U k ła d naczyniow y K o m ó rk i n o w o tw o ro w e U k ła d naczyniow y K o m ó rk i n o w o tw o ro w e u k ła d n aczyniow y U k ła d naczyniow y K o m ó rk i n o w o tw o ro w e
Mitochondria, błona komórkowa, K o m ó rk i n o w o tw o ro w e a p a ra t G olgiego, ją d ro
k o m ó rk o w e B łony, m ito c h o n d ria M ito c h o n d ria (a p o p to z a) M ito c h o n d ria u k ład naczyniow y U k ła d naczyniow y K o m ó rk i n o w o tw o ro w e, u k ła d n aczyniow y K o m ó rk i n o w o tw o ro w e K o m ó rk i n o w o tw o ro w e D Z IA Ł A N IE P D T N A K R W IN K Ę C Z E R W O N Ą
W 1987 r. C h o p p i wsp. [78] stwierdzili, że P D T p ow od uje d estru kcję u k ład u naczyniow ego. P o p o d an iu F o to frin u II i 30 m in ekspozycji n a św iatło erytrocyty zbijały się w zw arte agregaty. Z aob serw ow ali oni, że uszkodzenie k o m ó rek endo telialnych p ow o do w ało u w alnian ie czynników krzepnięcia. F o rm ow anie skrzepu w naśw ietlanym m iejscu nasilało ekspozycję erytro cy tó w na św iatło, co prow adziło d o uszkodzeń błony i w yzw olenia
procesu hem olizy. W efekcie osm olycznie napęczniałe erytrocyty zupełnie zatykały naczynia krw ionośne.
E rytro cy ty są b ardzo wrażliwe n a działanie fotosensybilizatorów . S tw ier d z o n o , że ftalocyjaniny i hem ato p o rfiry n y łączą się z b ło n ą k o m ó rk o w ą ery tro cy tu p ow od ując lizę, je d n a k m echanizm d ziałania tych dw óch sen- sybilizatorów jest inny.
O b a barw niki łączą się silnie z białkam i osocza, je d n a k h em ato p o rfiry n y w ydają się być w tedy bardziej efektyw ne niż ftalocyjaniny. W p rz y p ad k u tych drugich następuje ham ow anie reakcji hem olizy [79],
Stw ierdzono również, że w przypadku ftalocyjanin d u żą rolę g ra stru k tu ra chem iczna b arw nika, choć nic znaleziono żadnej korelacji pom iędzy rodzajem m e ta lu w c e n tru m pierścienia, liczbą reszt kw asu siark o w eg o i liczbą pierścieni benzenow ych a zdolnością in d u k o w an ia reakcji hem olizy. W ydaje się, że kom b in acja tych w szystkich p aram etró w p ozw ala n a przyłączenie się b arw n ik a do swoistej tarczy (białka) n a błonie erytrocy tarn ej i fo to hem olizę [80]. N ajskuteczniejszym i okazały się sulfonow ane p o c h o d n e alum iniow e (A1PcS 2). P oniew aż m a ją c h a ra k te r am fifilow y, łatw iej p e n e tru ją b ło n ę k o m ó rk o w ą i przem ieszczają się pom iędzy różnym i k o m p o n en tam i k o m ó r kow ym i.
N a podstaw ie b ad a ń u ltrastru k tu ra ln y c h stw ierdzono, że fo to h em o liza jest p o p rz ed zo n a pęcznieniem ko m órki. Po działaniu barw n ik am i ftalocyja- ninowym i erytrocyt zachowuje swój dwuwklęsły kształt naw et przy raptow nym zw iększeniu swoich rozm iarów [81]. H e m a to p o rfiry n y p o w o d u ją n ato m iast transform ację dyskocytu do echinocytu z jednoczesnym zwiększeniem objętości k o m ó rk i [80]. P otw ierdzają to badania: hem ina (F e-p ro to p o rfiry n a) pow oduje dysocjację zw iązanych z b ło n ą e ry tro cy tarn ą białek cytoszkieletu [82], K a żd e osłabienie cytoszkieletu błonow ego w w yniku jego chem icznej m odyfikacji będzie prow adzić do zm ian dw uw klęsłego k ształtu i zw iększać w rażliw ość kw inek n a hem olizę [83], W ydaje się więc p ra w d o p o d o b n e, że zm iany m orfologiczne fotosensybilizow anych przez h em ato p o rfiry n y k o m ó re k są spow od ow ane zm ianam i w cytoszkielecie błonow ym , zarów n o w ciem ności ja k i po ekspozycji na św iatło [84]. Z m iany zachodzące n a sku tek fo tosen - sybilizacji przez ftalocyjaniny m ogą być spow od ow ane raczej w nikaniem w ody niż działaniem na cytoszkielet. Stw ierdzono, że fotohem olizie nie tow arzyszy p eroksydacja lipidów ; analiza rozdziału białek b łonow ych n a żelu poliakryloam idow ym u k azała zniknięcie kilku pasm , w tym białka o m asie 14 k D a , m o n o m eró w spektryny (220-260 k D a ) i białek p asm a 3 (110-120 k D a ) z jednoczesnym pojaw ieniem się b iałk a o m asie 28 k D a w miejsce tropom iozyny, k tó re m ogło pow stać n a skutek w iązań krzyżow ych pom iędzy różnym i białkam i błonow ym i [85].
F o to h e m o liza jest zazwyczaj uw ażana za proces o p o d ło żu k o lo id aln o - -o sm o ty c z n y m , p rz ejaw iają cy się u tr a tą selektyw nej p rz e p u sz c z a ln o śc i,
uszkodzonej n a skutek P D T , błony. R ozpuszczone w wodzie jony, d o tej pory ro zp oznaw ane i skutecznie zatrzym yw ane przez błonę, zaczynają w nikać do w nętrza, a w raz z nimi - woda. W wyniku tego następuje pęcznienie kom órki, a w końcu jej zniszczenie, czyli liza. T ak i proces jest najwyraźniej k o n tro lo w a ny praw am i dyfuzji i osm ozy i pow inien mieć jed n ą w artość energii aktyw acji (E a), a w ykres A rrh en iu sa - c h a ra k te r liniowy. F o to h e m o liza in d u k o w a n a przez ftalocyjaniny (AIPcS) nie jest jedynie p ro stą u tratą selektywnej przepusz czalności błony plazmatycznej; jest procesem bardziej skom plikow anym . D o w o dem n a to są: b ra k linearności w ykresu A rrhen iusa i silne działanie k ation ów zew nątrzkom órkow ych na poprzedzającą hem olizę szybkość zm ian rozm iarów kom órki. W ykreślony n a podstaw ie danych doświadczalnych wykres A rrh en iu sa jest krzyw ą, co znaczy, że proces fotohem olizy m usi być w tym p rzypadku w ieloetapow y [86],
K a tio n y obecne w m edium m a ją duży wpływ na szybkość hem olizy. Szybkość ta w zrasta w porządku: Li + , N a + , K + , C s + , R b + , jeżeli zaś chodzi o halogenki, to: F “ , C l“ , B r“ , C l" i B r- zachow ują się w sposób, ja k tego oczekiw ano ze względu n a ich rozm iar i B r“ jest n ajbardziej aktyw ny w indukcji reakcji hem olizy. Z a p ro p o n o w a n o dw a w yjaśnienia tego zjaw iska: m ożliw ość pow staw an ia porów w błonie o średnicy ok. 0,5 -0 ,7 nm i otw ieranie kanałów jonow ych. Ł ad u n ek jo n ó w m oże być p rzeszk o d ą w tran sp o rcie przez kanały. W raz ze w zrostem ro zm iaru jo n u zm niejsza się gęstość ła d u n k u na jego pow ierzchni, a tym sam ym nasila się jego tra n sp o rt. D ru gi m echanizm w ydaje się bardziej pasow ać d o m o delu reakcji w ielo etapow ej, w ynikający z nieliniow ego w ykresu A rrheniusa.
Najm niejszy halogenek F~ wykazuje zadziwiające działanie. W roztw orach izotonicznych ham uje reakcję hem olizy przeszło d w u k ro tn ie w sto su n k u do jo n ó w C l“ , i to ju ż przy b ard zo m ałych stężeniach ( < 1 m M ). Z m niejsza rów nież p ra w d o p o d o b ień stw o p ow staw an ia w iązań krzyżow ych pom iędzy stru k tu raln y m i białkam i błonow ym i. E fek t ten był częściowo znoszony, jeśli fluorki były d o d aw an e po naśw ietleniu.
R ów nież d o d an ie przed naśw ietlaniem deoksyglukozy, in h ib ito ra glikolizy, procesu, k tó ry jest głów nym źródłem A T P dla erytrocytów , nasila hem olizę i redukuje kom órkow y poziom A T P o ok. 50% w porów naniu z erytrocytam i k o n tro ln y m i zaw ierającym i glukozę. Sugeruje to , że glikoliza i A T P są istotny m i czynnikam i zapobiegającym i hem olizie [87].
Szybkość fotohem olizy erytrocytów ludzkich zw iększa się po d o d a n iu askorbinianu. C hociaż askorbinian jest biologicznym antyoksydantem , w obec ności m etali inicjujących reakcje redoks, tak ich ja k żelazo, działa ja k o p ro o k sy d a n t. Po d o d an iu d o zawiesiny erytrocy tó w F e C l3 i ask o rb in ian u reak cja hem olizy przebiega 4 -k ro tn ie szybciej niż z sam ym sen sy b ilizato rem . R ów nież w obecności sam ego ask o rb in ian u , bez udziału żelaza, reak cja hem olizy zachodzi d w u k ro tn ie szybciej. Szybkość hem olizy i stężenie asko
r-binianu w zakresie 0-1 m M były bezpośrednio skorelow ane, co sugeruje, źe ask o rb in ian jest reagentem , nie katalizato rem . W yższe stężenia (1 -2 m M ) m iały tylko m arginalny wpływ n a szybkość reakcji. W zm ocnienie efektu obserw ow ano jedynie wtedy, gdy askorbinian był obecny podczas naświetlania; jego d o d an ie do zawiesiny k om órek bezpośrednio p o naśw ietleniu było nieefektyw ne. Proces ten rów nież w ym aga obecności tlen u - test z azydkiem i D 20 w ykazał udział tlenu singlctow ego, chociaż w m niejszym sto p n iu niż przy b ra k u ask o rb in ian u . Z kinetyki reakcji w yw nioskow ano zachodzenie jednocześnie dw óch typów reakcji: pom iędzy w zbudzonym sensybilizatorem
a askorbinianem i za pośrednictw em tlenu singlctow ego [88],
W zrastająca w ostatnich latach groźba zarażenia cho ro b am i bakteryjnym i i w irusow ym i, ja k wirusem żółtaczki zakaźnej typu B i C o raz H IV podczas p rzetaczan ia krw i, skłoniła do poszukiw ania now ych efektyw nych m etod sterylizacji p re p ara tó w krw iopochodnych. Przez o statn ie 7 lat w p row ad zon o wiele m etod inaktyw acji lub usuw ania wirusów z erytrocytów i k o m p o n en tó w krw i. N ajbardziej obiecujące w ydaje się użycie ftalocy jan in alum iniow ych i ich sulfonow anych pochodnych. Niestety ftalocyjaniny uszkadzają erytrocyty. D latego prow adzone są intensywne b adania nad specyficznymi wygaszaczam i, nie zm ieniającym i fotodynam icznych właściwości barw n ik a, lecz chroniącym i erytrocy ty przed zniszczeniem. Jednym z takich zw iązków jest kw ercety na (rys. 4).
O H
R ys. 4. K w ercety n a
Flaw onoidy, d o których należy kwercetyna, są nietoksycznym i naturalnym i p o life n o la m i sze ro k o w y stępującym i w tk a n k a c h ro ślin n ac zy n io w y ch . S tw ierdzono, że kw ercetyna ham uje reakcje w oln orod nik ow e, poniew aż jej stru k tu ra m o lekularna posiada cechy niezbędne d o funkcjonow ania w c h a ra k terze antyoksydanta, akceptora wolnych rodników i czynnika kom pleksującego m etale. Jest rów nież zm iataczem ro d n ik a p o n ad tlenkow ego i hydroksylow ego, inhib ito rem indukow anej przez żelazo peroksydacji lipidów w m ik ro so m ach w ą tro b y szczura w niskich m ikrom olarny ch stężeniach. Jed n ak że w wyższych
stężeniach d ziała ja k o p ro o k sy d a n t i przyśpiesza g en ero w an ie ro d n ik a hydroksylow ego z n ad tlen k u w o d o ru w obecności F e 3+ - E D T A (kw asu etylenodiam inoczterooctow ego). U e n - l l u r i wsp. [81] stw ierdzili, że kw er- cetyna inhibuje reakcje typu I i II i w ykazuje działanie o ch ro n n e w obec ery tro c y tó w człow ieka, co m o ż n a tłum aczyć zd o ln o ścią d o h a m o w a n ia reakcji sieciow ania białek błonow ych.
D ziałanie fenoli ja k o an ty o k sy d an tó w tłum aczy się zm iataniem ro d n ik ó w tlenow ych b iorących udział w procesie p ro p a g acji i jed n o cz esn y m fo r m ow aniem utlenionych fenoli. Jeśli odpow iedni zw iązek red uk ujący jest obecny w środow isku, m oże on reagow ać z utlenionym su b stratem i rege nerow ać fenole, dzięki czemu n ad a l m o g ą działać ja k o an ty o k sy d an ty . Rzeczywiście, flaw onoidy m o g ą w chodzić w interakcję z kw asem a s k o r binow ym , któ ry m oże redukow ać u tlenio ną kw ercetynę, k tó ra odzyskuje swoje właściwości antyoksydacyjne. R ów nież w p rz y p ad k u fotosensybilizacji indukow anej przez p ro to p o rfiry n y , anty oksydacyjne d ziałan ie kw ercetyny jest stym ulow ane przez kwas askorbinow y , naw et jeśli ask o rb in ian w ystępuje
w stężeniach, w jak ich działa ju ż ja k o p ro o k sy d an t.
K w ercetyna m oże rów nież ham ow ać reakcje, w k tó ry ch uczestniczy tlen singletow y, takie ja k fotoliza krocyny pod wpływem różu bengalskiego. K w e rc e ty n a je st rów nież u tle n ia n a n a sk u tek reakcji fo tosen sy bilizacji in d u k o w an y ch przez p ro to p o rfiry n y ; reakcja ta jest in h ib o w an a przez N a N 3 po d w arun kiem , że użyty jest w stężeniach, w k tó ry ch fu nk cjo n u je ja k o wygaszacz tlenu singletow ego, lecz nie stan u trypletow ego fotou czulacza. U w aża się, że p ro d u k ty reakcji kw ercetyny z tlenem singletow ym , pow stające w obecności różu bengalskiego, to efekt d o d a n ia tlenu d o 2,3 pod w ó jn ego w iązania pierścienia enolowego, co następuje p o ich przem ieszczeniu. O ch ro na erytro cy tó w przed fo tohem olizą m oże sprow adzać się d o ko m petycyjnego zm iatan ia tlenu singletow ego [85].
L IT E R A T U R A
[1] v o n T a p p e i n e r H. , J o d l b a u e r A . (1907), F C W Vogel, Leipzig.
[2] B e n - H u r E. , M o o r A. C. E., M a r g o l i s N u n n o H. , G o t t l i e b P. , Z u k M. M. , L u s t i g m a n S., H o r o w i t z B., B r a n d A. , V a n S t e v e n i n c k J., D u b b e l - m a n T . M . A . R. (1996), T ran sfu sio n M ed. R ev., 1, 15-22.
[3] K e s s e l D. , D o u g h e r t y T . J. (eds) (1982)., Advances in exp erim en ta l m edicine and
biology, 160, P len u m Press, N ew Y o rk .
[4] D o u g h e r t y T . J. (1987), P h o to c h em . P h o to b io l., 46, 569-574.
[5] K e s s e l D. , B y r n e C. J., W a r d A . D . (1992), J. P h o to ch em . P h o to b io l. B: B iol., 14, 275 -2 9 2 .
[6] V a l e n z e n o D . (1987), P h o to ch em . P h o to b io l., 46, 146-160. [7] S a n d b e r g S., R o m s i o I. (1981), C lin. C him . A cta, 109, 193-201.
[8] R a m p o n i R. , S a c c h i C. A. , C u b e d d u R. (1989), [w:] L aser A pplications in
M edicine and Biology, cd: M . L. W o l b a r s h t , 5, P lenum , N ew Y o rk , ro zd z. 2.
[9] M o s e r F. H. , T h o m a s A . C. (1963), R e in h o ld , N ew Y ork.
[10] B e n - H u r E., R o s e n t h a l I. (1986), L asers in Life Sei., 1(1), 79-86.
[11] D a n i e l s F . (1969), [w:] The Biologic E ffects o f U ltraviolet R adiation with E m phasis on
the S k in , ed. F . U r b a c h , P e rg am o n , O x fo rd , 151-157. [12] R o s e n t h a l 1., B e n - H u r E . (1995), In t. J. R a d ia t. Biol., 67(1), 85-91. [13] B e n - H u r F,., R o s e n t h a l 1., L e z o n o f f C. C. (1988), J. P h o to ch em . P h o to b io l. B: B iol., 2, 243-252. [14] S p i k e s J. D . (1990), J. P h o to ch em . P h o to b io l. B: Biol., 6, 259-274. [15] R i c h t e r A. M „ K e l l y B., C h o w J. (1987), J. N atl. C an cer In st., 79, 1327-1332. [16] G a r b o M. G . (1996), J. P h o to ch em . P h o to b io l. B: Biol., 34, 109-116. [17] W i n k e l m a n J. (1962), C ancer R es., 22, 589-596. [18] W i n k e l m a n J., S l a t e r G. , G r o s s m a n J. (1967), C an cer R es., 27, 2060-2064. [19] B e r e n b a u m M. C. , H a l l G. W. , H o y e s A. D . (1986), B r. J. C an cer, 53, 81-89. [20] D i e t e l W. , B o l s e n K. , D i c k s o n E., F r i t s h C. , P o t t i e r R. , W e n d e n b u r g R. (1996), J. P h o to ch em . P h o to b io l. B: B iol., 33, 225-231. [21] S r o k a R. , B e y e r W. , G r o s s n e r L., S a s s y T. , S t o c k e r S., B a u m g a r t n e r R. (1996), J. P h o to ch em . P h o to b io l. B: B iol., 34, 13-19. [22] P e n g Q. , N e s l a n d J. M. , M o a n J., E v e n s e n J. F. , K o n g s h a u g M. , R i m i n g - t o n C . (1990), In t. J. C ancer, 45, 972-979. [23] K e n n e d y J. C. , P o t t i e r R. H. (1992), J. P h o to ch em . P h o to b io l. B: Biol., 14, 143-148. [24] W o l f P., R i e g e r E. , K e r l H . (1993), J. A m . A cad . D e rm a to l., 28, 17-21. [25] C a i r n d u f f F. , S t r i n g e r M. R. , H u d s o n E. J., A s h D. V„ B r o w n S. B. (1994). Br. J. C an cer, 69, 605-608. [26] K r i e g m a i r M. , B a u m g a r t n e r R. , K n u e c h e l R. , S t e p p H. , H o f s t a d t e r F. , H o f s t e t t e r A. (1996), J. U ro l., 155, 105-110. [27] P e n g Q. , W a r l o e T. , B e r g K. , M o a n J., K o n g s h a u g M. , G i e r c k s k y K. , N e s h l a n d J. M . (1997), C an cer, 79, 2282-2308. [28] K i m e l S., T r o m b e r g B. J., R o b e r t s W. G. , B e r n s M. W. (1989), P h o to ch em . P h o to b io l., 50, 175-183.
[29] J o r i G. , S p i k e s J. D . (1984), w: K . C. Sm ith (ed.), Topisc in P hotom edicine, P lenum , N ew Y o rk , 183-318. [30] M e r k e l P. B., K e a r n s D . R. (1972), J. A m . C hem . Soc., 94, 7244-7253. [31] M o a n J., P e n g Q. , E v e n s e n J. F. , B e r g K. , W e s t e r n A. , R i m i n g t o n C. (1987), P h o to ch em . P h o to b io l., 46, 713-721. [32] M o a n J., B e r g K . (1992), P h o to ch em . P h o to b io l., 55, 931-948. [33] M o a n J., J o h a n n e s e n J. V., C h r i s t e n s e n T. , E s p e v i k T. , M c G h i e J. B. (1982), A m . J. P a th o l., 109, 184-192. [34] B e r n s M. W. , D a h l m a n A. , J o h n s o n F . (1982), C an cer R es., 42, 2325-2329. [35] P e n g Q. , F a r r a n t s G. W. , M a d s l i e n K. , B o m m e r J. C. , M o a n J., D a n i e l s e n H. E.’, N e s h l a n d J. M . (1991), In t. J. C an cer, 49, 290-295. [36] P a q u e t t e B., A l i H. , L a n g l i o i s R. , v a n L i e r J. (1988), P h o to c h em . P h o to b io l., 47, 215-220. [37] B e n - H u r E., G r e e n M. , P r a g e r A. , K o l R. , R o s e n t h a l I. (1987), P h o to ch em . P h o to b io l., 46, 651-656. [38] D u b b e l m a n T. M. A. R. , d e B r u i j n e A. W. , v a n S t e v e n i n c k J. (1977), B iochem . B iophys. Res. C o m m u n ., 77, 811-817.
[40] L a n g l o i s R. , A l i H. , B r a s s e u r N. , W a g n e r J. R ., v a n d e r L i e r J. E. (1986)., P h o to ch em . P h o to b io l., 44, 117-123.
[41] D e u t i c k e ß. , H e n s e l e i t U. , H a e s t C. W. M. , H e l l e r K. B., D u b b e l m a n T. M. A . R. (1989), B iochim . Biophys. A cta, 982, 53-61.
[42] K v a m E., S t o k k e T. , M o a n J. (1990), Biochim . Biophys. A cta, 1049, 33-37. [43] J a i n R. K. (1987), C an cer M e tasta sis R ev., 6, 559-594.
[44] D v o r a k H. F. , N a g y J. A. , D v o k a r J. T. , D v o r a k A. M. (1988), A m . J. P a th o l., 133, 95-109. [45] D v o r a k H . F. (1986), New E ngl. J. M ed ., 314, 165-1659. [46] B r a u l t D. , V e v e r - B i z e t C. , K u z e l o v a K. (1993), J. P h o to c h em . P h o to b io l. B: Bio!., 20, 191-195. [47] B a r r e t t A. J., K e n n e d y J. C. , J o n e s R. A. , N a d e a u P. (1990), J. P h o to ch em . P h o to b io l. B: Biol., 6, 309-321. [48] K o n g s h a u n g M. (1992), In t. J. B iochem ., 24, 1239-1265. [49] K e s s e l D. , W o o d b u r n K . (1993), In t. J. B iochem ., 25, 1377-1383. [50] K e s s e l D ., T h o m p s o n P., S a a t i o K ., N a n t w i K. D . (1987), P hotochem . Photobiol., 45, 787-790. [51] J a i n R . K . (1987), C an cer R es., 47, 3039-3051. [52] D o u g h e r t y T. J. (1987), P h o to ch em . P h o to b io l., 45, 879-890. [53] Z h o u C . (1989), J. P h o to ch em . P h o to b io l. B: B iol., 3, 299-318. [54] S e l m a n S. H. , K r e i m e r - B i r n a u m M. , K l a u n i g J. E., G o l d b l a t t P. J., K e c k R. W. , B r i t t o n S. L. (1984), C ancer. R es., 44, 1924-1927. [55] C h a n d h u r i K. , K e c k R. W. , S e l m a n S. (1987), P h o to ch em . P h o to b io l., 46, 823-827. [56] B e n - H u r E. (1990), S pectrum , 3, 3-4. [57] Y o n u s c h o t G . (1991), F re e R ad . Biol. M ed., 11, 307-317. [58] F o s t e r T. H. , P r i m a v e r a M. C. , M a r d e r V. J., H i l f R. , S p o r n L. (1991), C ancer R es., 51, 3261-3266. [59] R i s H . B., A l t e r m a t t H. J., I n d e b i t z i R. (1991), Br. J. C a n ce r, 64, 1116-1120. [60] P e n g Q. , M o a n J., N e s h l a n d J. M. , R i m i n g t o n C. (1990), In t. J. C an cer, 46, 719-726. [61] R e e d M. W. R. , W i e m a n T. J., D o a k K. W. , P i e t s c h K. , S c h u s c h k e D . A. (1989), P h o to c h em . P h o to b io l., 50, 419-423. [62] F i n g a r F. H. , W i e m a n T. J., W i e h l e S. A. , C e r r i t o P. B. (1992), C a n er. R es., 52, 4914-4921. [63] K e r d e l F. A. , S o t e r N . A ., L i m H . W . (1987), J. Invest. D e rm ato l., 88, 277-280. [64] C a r p e n t e r R. J., R y a n R. J., N e e l H. B., S a n d e r s o n D . R. (1977), A n n . O to l., 86, 661-666.
[65] M u s s e r D. A. , W a g n e r J. M, D a tta - G u p ta N . (1982), Res. C o m m u n . C hem . P a th o l. P h a rm a c o l, 2, 251-259. [66] N e l s o n J. S , L i a w L. H. , O r e n s t e i n A. , R o b e r t s W. G , B e r n s M. W. (1988), J. N atl. C an cer. In st., 80, 1599-1605. [67] E v a n s S , M a t t h e w s W , P e r r y R , F r a n k e l D , N o r t o n J. (1990), J. N atl. C an cer I n s t , 82, 34-39. [68] S c h u m a k e r B. P„ H e t z e l F. W. (1987), P h o to ch em . P h o to b io l, 46, 899-901. [69] W i n k l e m a n J. (1961), J. N atl. C an cer I n s t , 27, 1369-1377. [70] Z h o u C , M i l a n e s i C , J o r i G . (1988), P h o to ch em . P h o to b io l, 48, 487-492. [71] D u b b e l m a n T. M. A. R , v a n S t e v e n i n c k J. (1984), B iochim . B iophys. A cta,
771, 201-207.
[72] H i l f R , S m a i l D . B , M u r a n t R. S , L e a k e P. B , G i m s o n S. L. (1984), C an cer. R e s , 44, 1483-1488.
[73] G i b s o n S. L., H i l f R. (1983), C an cer R es., 43, 4191 4197. [74] C e c k l e r T. L., B r y a n t R. G. , P e n n y D. P., G i b s o n S. L., H i l f R. (1986), 140(1), 273-279. [75] Z a i d i S. 1. A. , 0 1 e i n i c k N . L., T a r i f - Z a i m M ., M u k h t a r H . (1993), P h o to ch em . P h o to b io l., 58, 771-776. [76] M c C o n c e y D . J., O r r e n i u s S. (1994), T re n d s Cell Biol., 4, 370-374. [77] P e n g Q. , M o a n J., N e s h l a n d J. M. (1996), U ltra str. P a th o l., 20, 109-129. [78] C h o p p M. , G l a s b e r g M. R. , R i d d l e J. M. , H e t z e ! F. W. , W e l c h K. M. A. (1987), P h o to ch em . P h o to b io l., 46, 103-108.
[79] B e n - H u r E., R o s e n t h a l 1. (1986), C ancer L etters, 30, 321-327. [80] S e n g e M. O. (1992), J. P h o to ch em . P h o to b io l. B: Biol., 16, 3-3 6 . [81] B e n - H u r E., M a l i k Z., D u b b e l m a n T. M. A. R. , M a r g a r o n P ., A l i H ., v a n L i e r J. E. (1993), P h o to c h em . P h o to b io l., 58(3), 351-355. [82] M a l i k Z., L e v B. (1991), B lood Cells, 17, 570-574. [83] S o l a r 1., M u 11 e r e b e r h a r d U. , S h i v r o Y. , S h a k l a i N. (1991), B iochim . B iophys. A cta, 1062, 51-58. [84] M i l l e r F. N. , T a n g e i d e r G. J., S l a a f D. W. , R e n e m a n R . S. (1991), B lood Cells, 17, 555-556.
[85] B e n - H u r E., R o s e n t h a l I., G r a n o t (G razian i) Y. (1993), P h o to c h em . P h o to b io l., 57(6), 984-988.
[86] B e n - H u r E., O r e s t e i n A . (1991), In t. J. R a d ia l. Biol., 60(1/2), 293-301.
[87] B e n - H u r E . , N a g e l k e r k e J . F. , D u b b e l m a n T. M. A. R. , V a n S t e v e n i n c k s J. (1992), In t. J. R a d ia t. Biol., 6, 767-772.
[88] R o s e n t h a l I., B e n - H u r E. (1992), In t. J. R a d ia t. B iol., 62(4), 4 8 1-486.
W płynęło d o R ed ak cji U n iw ersy tet Ł ó d zk i
F o lia b iochim ica et b iophysica K a te d ra Biofizyki O gólnej
24.04.1998
Em ilia K rajew ska, M aria B ryszew ska
P H O T O D Y N A M IC T H E R A P Y
T h is article d escribes the te rm o f p h o to d y n am ic th erap y , a relativ ely new w ay o f cancer tre a tm e n t and gives the rew iev o i the com m o n ly used p h o to sen sitizers, expecially th e p h th a - locyanines and th eir w ay o f actio n . T h e las t p a r t is dev o ted to the a ctio n o f P D T o n h u m a n ery th ro cy tes.
