Zastosowanie woltametrii w badaniach neurofizjologicznych

Zastosowanie woltametrii w badaniach neurofizjologicznych

M arek Wieczorek', Vitaly S. Palam archouk2

‘Pracow nia N eurofizjologii Katedry N eurobiologii, U niwersytet Łódzki, d e p a r tm e n t o f Pharmacology, Toxicology and Neurosciences, Louisiana State

University, Health and Sciences Center, Shreveport, USA

Streszczenie

Stosowana w badaniach neurofizjologicznych woltam etria wywodzi się bezpośrednio z analitycznych metod elektrochem icznych i jest zbliżona do polarografii. M etoda ta, w odróżnieniu od chrom atografii czy mikrodializy nie wym aga pobierania i przygotowywania próbek do późniejszych badań. Cała analiza odbywa się w miejscu, gdzie dany proces zachodzi (w określonej strukturze ośrodkowego układu nerwowego, gdzie ma m iejsce uwalnianie neurotransm iterów), a co najważniejsze, pom iar odbywa się w czasie rzeczywistym [20].

W spółcześnie stosow ane urządzenia pozw alają dokonywać analizy pracy system ów neurotransm isyjnych mózgu w sposób telem etryczny — nie ograniczając tym samym możliwości poruszania się zw ierzęcia w kamerze

dośw iadczalnej. Taką procedurę można stosować do, połączonych

z behawiorem , obserwacji zm ian neurochem icznych i bioelektrycznych mózgu [1].

Historia rozwoju woltametrii

Stosowane na gruncie badań neurofizjologicznych metody

woltam etryczne, w yw odzą się bezpośrednio z polarografii - jednej z metod analitycznych elektrochem ii [21]. Pierwsze inform acje o zastosow aniu tej metody w neurofizjologii zostały opublikowane w 1973 roku [10]. Stosowana aparatura wym agała stałego połączenia elektrod zaim plantowanych do mózgu zw ierzęcia z potencjostatem polarografu i urządzeniem rejestrującym (Schem at 1). Istotny posęp w rozwoju tej metody dokonał się w roku 1978 [7], kiedy Gonon wprow adzi! elektrodę roboczą z włókna w ęglow ego (Schem at 2). Elektroda ta, w odróżnieniu od uprzednio stosowanej przez K issingera elektrody z pasty węglow ej [10], dawała zdecydowanie lepszą powtarzalność i tym samym wiarygodność uzyskiwanych rezultatów.

■

■

S c h e m a t 1. Z e staw do w oltam etrii.

Kolejny, milowy krok w rozwoju woltametrii to zastosow anie w 1979 roku przez A rm strong-Jam es’a oraz M illar’a elektrody z w łókna węglow ego[2], znacznie krótszej niż ta, którą wprowadził Gonona [7]. Roboczy koniec tej elektrody m iał długość od 10 do 50 |j,m. W przypadku elektrody zastosow anej przez Gonona roboczy koniec miał długość 500 pm , a tym samym sygnał woltam etryczny był uzyskiwany ze stosunkowo dużej objętości tkanki, a nie z pojedynczych kom órek nerwowych.

Późniejsze badania zespołu Arm strong-Jam es’a [2, 3] wykazały, że można rejestrować wydzielane katecholam in oraz serotoniny zarówno w m etodach

in vivo ja k i in vitro. N astępnie, zarejestrow ane zostało uwalnianie dopam iny

w obrębie prążkow ia w odpowiedzi na stym ulacje elektryczną dróg

dopam inergicznych biegnących w obrębie pęczka przyśrodkowego

przodom ózgowia [13].

Pierwsze system y stosowane w badaniach w oltam etrycznych pozwalały

na jednoczesny pom iar aktywności jed ynie pojedynczych systemów

neurotransm isyjnych, zwykle w obrębie jednej struktury mózgu [14]. Rozwój elektroniki i tym samym ciągłe udoskonalanie poszczególnych elem entów aparatury do woltam etrii (potencjostaty, czy urządzenia odbierające i filtrujące sygnał z zaim plantowanych elektrod), dały m ożliwość pom iaru, w tym samym

czasie, aktywności dwóch system ów neurotransm isyjnych, choćby

dopam inergicznego i serotoninergicznego [5].

Obecny kierunek rozwoju tej metody badawczej to m iniaturyzacja potencjostatów i tym samym m ożliwość w prow adzenia m etod woltametrii bezprzewodow ej (Ryc. 1), które pracują bądź to w oparciu o sygnał radiow y [15], bądź to wykorzystujące transm isję sygnałów w podczerw ieni [4]. Tym

. Drut miedziany Pasta grafitowa epoxy

Rurka polietylenowa

Rurka ze stali nierdzewnej

Włókno w ęglow e

Kapilara silikonowa V Żywica epoxy

Końcówka aktywna

В

neurotransraiterów:

A m ikro ele ktroibi 7. w łókna w ęglow eąo В - elektroda odniesienia Ag/AgCI

S c h e m a t 2. Sch em a t kon struk cji elektro dy roboczej z w łókna w ę glow eg o (A ) oraz fotografia elek trody z w łók na w ęg lo w e go (B).

samym, możliwe się stało obserwowanie aktywności określonego systemu neurotransm isyjnego mózgu u nieuśpionych i niczym nie skrępowanych, sw obodnie poruszających się zwierząt. Daje to możliwość korelow ania zmian neurochem icznych mózgu, zachodzących w czasie rzeczywistym , ze zmianam i zachow ania się zwierzęcia w trakcie eksperym entu lub pomieszczeniu hodowlanym , jeśli tego w ym agają założenia doświadczenia.

R y c. 1. W spó łcze sny zesta w do woltam etrii bezprzew o dow ej (1. Szc zu r z zam on tow anym na głow ie p oten cjo statem ; 2, 3, 4. E lem enty potencjostatu).

Podstawowe zasady woltametrii

Podobnie jak w przypadku polarografii w elektrochem ii, tak również w przypadku woltam etrii w neurofizjologii, kluczowym warunkiem powodzenia pomiaru je st zdolność analizowanych związków do utleniania/redukcji i m ożliwości przem ieszczania się w polu elektrycznym (Rys. 2), to znaczy odłączania elektronów z utlenianego związku, po tym ja k zostanie on zaabsorbowany na powierzchni elektrody roboczej, a następnie przenoszenia ich poprzez powierzchnię rozdziału faz. W przypadku pojaw ienia się różnicy

potencjałów cząsteczki neurotransm iterów nabyw ają zdolność do

przem ieszczania się w kierunku elektrody roboczej, a podczas dalszego zwiększania różnicy potencjałów cząsteczki, które znajd ują się w warstwie

granicznej elektrody, m ogą być rów nież utleniane/redukowane [11].

W ykorzystując te właściw ości i stosując odpowiedni układ elektrod

pom iarowych (elektroda robocza - utleniająca, elektroda odniesienia i elektroda pom ocnicza - w ykorzystuje się j ą jedyn ie w przypadku szybkiego skanowania dla „odprowadzenia” silnego prądu, który nie jest związany z utlenianiem ) dokonuje się w układzie in vivo lub in vitro utleniania analizowanego związku i równocześnie rejestruje liczbę uwolnionych z cząsteczek elektronów (generowanych zm ian prądu) w czasie tego procesu. Prąd oksydacyjny, generowany w czasie utleniania związku jest proporcjonalny do stężenia

związku w przestrzeni graniczącej znajdującej się przy powierzchni elektrody, na której przebiega reakcja [ I I , 21]. Związki neurotransm isyjne (aminy biogenne czy am inokwasy) m ają charakterystyczne dla siebie potencjały, przy

których następuje ich maksym alne utlenianie w polu elektrycznym .

W ykorzystując tę ich właściw ość, metody woltam etryczne pozw alają na takie dostosow anie urządzeń pomiarowych, aby m ożna było obserw ować aktywność określonego/określonych system ów neurotransm isyjnych mózgu [4].

Reakcja utleniania dopaminy

' X T ' ' ♦ 211* ♦ 2«

♦ 211* + 2e’

Reakcja utleniania noradrenaliny

NH2 \\ X ^ м н 2 + 1Г + tr

Reakcja utleniania serotoniny

R y c. 2. R eakcje u tle nian ia do pam iny, no radre nalin y i serotoniny.

System bioczujników (biosensorów) w woltametrii

W m etodach woltam etrycznych, stosowanych w badaniach

neurofizjologicznych, polarograf połączony jest z systemem trzech elektrod (Schem at 1): elektro dą roboczą, elektrodą odniesienia i elektrodą pom ocniczą. Elektroda pom ocnicza wykonana jest z drutu platynow ego. Elektroda odniesienia z drutu srebrnego, pokryta została chlorkiem srebra [21]. Natom iast elektroda robocza, utleniająca, w początkowym okresie stosow ania woltam etrii w neurofizjologii, była budowana z metalu szlachetnego: złota lub platyny [21]. Elektrody robocze wykonane z metalu nie dawały m ożliwości pom iaru stężeń neurotransm iterów zbliżonych do ich wartości fizjologicznych w mózgu.

N astęp ną generacją były elektrody wykonane z pasty węglowej. Pow ierzchnia adsorpcyjna tych elektrod jest znacznie większa niż m etalowych i tym samym, znacznie w zrasta liczba cząsteczek, które w jed no stce czasu m ogą się utleniać. Duża pow ierzchnia tych elektrod znacznie zw iększyła ich czułość w kierunku niezbędnej dla możliwości pomiarów fizjologicznych stężeń neurotransm iterów w mózgu. Nowoczesne elektrody robocze wykonywane są z włókna węglow ego, którego cech ą jest wysoka pow ierzchnia właściwa, a łącznie z tym wysoka liczba porów transportujących (przepływ owych) oraz mikroporów. Obecnie najczęściej stosuje się elektrodę roboczą (Schem at 2) zbudow aną z w łókna węglow ego [22]. Elektrody odniesienia i pom ocnicza m ają zwykle średnicę 150 ц т [4], natom iast elektroda robocza z włókna węglow ego ma średnicę 30 ц т , a jej końcówka aktywna, długość od 200 do 500 ц т [22], (Ryc. 3).

Hme{s)

R y c. 3. Przy kład c hron oam pero m e trcz neg o zapisu, w cza sie rz ec zy w istym , uw alnian ia no radren alin y. R ejes tracja od jed n e go szc zura za p om o cą e lek trod y z w łók n a w ęglow ego znajdującej się w ob ręb ie form acji hipokam pa lnej. M ikroinie kcje C R F i glutam inian u w yk onano do m iejsc a sin aw eg o (1 00 nL, 1 /tg /l/iL ).

Zastosow anie woltametrii we współczesnych badaniach

neurofizjologicznych

Od czasu opublikow ania przez Kissingera i jeg o zespól [10] pracy przedstawiającej wykorzystanie metod woltam etrycznych w neurofizjologii do

chwili obecnej ukazało się blisko 1800 publikacji naukowych,

przedstawiających dane dośw iadczalne uzyskane przy w ykorzystaniu tej metody (wg. Science Direct).

W oltam etrię, jak o m etodę oceny aktyw ności system ów

neurotransm isyjnych mózgu, można stosować w szeregu różnych

eksperym entach, zarówno m etodach in vitro jak i in vivo. M etoda ta często jest wykorzystywana do oceny aktywności układów m onoam inergicznych mózgu w badaniach nad neurochem icznym podłożem zaburzeń em ocjonalnych [18, 19], uzależnieniami od leków [12] - amfetaminy czy kokainy, a także w badaniach nad depresją [9].

W oltam etrię bezprzew odow ą stosuje się do ilościowych obserwacji zmian neurochem icznych w połączeniu z równoległą rejestracją zmian behaw ioralnych u szczura (Ryc. 4). Na Ryc. 4A i 4B pokazano m ożliw ość rejestracji odpowiedzi dopam inergicznej w układzie efekt - dawka. Ryc. 4D przedstawia następujące dopam iny czasie obniżenie stężenia uwalnianej dopam iny w obrębie prążkowia. Zm iany te następują po wcześniejszym uwolnieniu dopam iny wywołanym dootrzewnow ym wstrzyknięciem D-amfetaminy (2 mg/kg) przy uprzednio zablokow anym wychw ycie zwrotnym tego neurotransm itera (w strzyknięcie dootrzew onow e 15 mg/kg kokainy). Obserwowane zm iany stężenia dopam iny pokazują, że proces uw alniania tego neurotransm itera przebiega znacznie wolniej, niż wtedy, gdy wychwyt zw rotny nie jest blokowany (Ryc. 4B). Jedynie wysoka czasow a rozdzielczość metody woltam etrycznej dała m ożliwość obserwowania kinetyki tego typu procesów synaptycznych [15].

Perspektywy rozwoju woltametrii

W oltam etria, mimo jej niewątpliwego rozwoju od czasu, kiedy została po raz pierwszy wprow adzone do neurofizjologii, podobnie jak każda metoda analityczna nie w yjaśnia wszystkich problemów zw iązanych z aktyw nością system ów neurotransm isyjnych. Mimo jej niewątpliwej zalety, że pozwala obserw ować niezw ykle szybko zachodzące zjawiska, jakim i jest wydzielanie neurotransm iterów do przestrzeni synaptycznej [6], to jed nak nie wszystkie stosowane obecnie techniki woltametryczne odpow iadają na te same pytania. Na przykład chronoam perom etria daje m ożliwości najlepszego rozdziału czasowego

Z m i a n a s t ę ż e n i a D A , m M Z m i a n a s t ę ż e n i a D A , m M Ю R y c . 4 . T e le w o lt a m e tr y c z n e z a p is y z m ia n s tę ż e n ia d o p a m in y w o b rę b ie p rą ż k o w ia . Z m ia n y w s tę ż e n iu d o p a m in y p o p o d a n iu 1 m g /k g D -a m fe ta m in y ( A ), 2 m g /k g D -a m fe ta m in y ( B ), 2 0 m g /k g k o k a in y ( C ), 1 5 m g /k g k o k a in y , a n a st ę p n ie 2 m g /k g D -a m fe ta m in y ( D ).

zachodzących zjaw isk synaptycznych, jednak niestety słabą stroną tej techniki

je st je j średnia m ożliwość rozróżnienia poszczególnych zw iązków

neurotransm isyjnych. Z drugiej strony, woltam etria cykliczna oferuje zarówno dobry rozdział czasow y jak i chemiczny badanych zjaw isk synaptycznych. Natom iast szybka chronoam perom etria daje dobry rozdział czasowy i średniej jakości rozdział chemiczny obserwowanych zjaw isk [6].

Obecnie p ojaw iają się szerokie perspektywy zastosow ania (i tym samym połączenia) w oltam etrii z innymi metodami eksperym entalnym i, na przykład metodami rejestracji czynności bioelektrycznej mózgu. Przykładem może być zastosow anie woltam etrii do obserwacji zmian uwalniania noradrenaliny w obszarze pól projekcyjnych z miejsca sinaw ego (LC), w odpowiedzi na pojedyncze wstrzyknięcia (dokom orowe czy dożylne) m orfiny u szczurów. Badania elektrofizjologiczne wykazały, że pojedyncze dawki m orfiny powodują

nie tylko proste obniżenie aktywności bioelektrycznej neuronów

noradrenergicznych m iejsca sinawego, ale rów nież indukują synchroniczne wyładow ania oscylacyjne w obrębie LC. W ykorzystując chronoam perom etrię, stw ierdzono zwiększenie uwalniania noradrenaliny w obrębie zakrętu zębatego formacji hipokam palnej zsynchronizowane z aktyw nością neuronów LC [8].

Innym z kolei zastosow aniem tej metody je st jej wykorzystanie do pomiaru aktywności układu glutaminergicznego w mózgu. Pomim o tego, że ten

pobudzeniowy system neurotransm isyjny je st w mózgu szeroko

rozpow szechniony, to obserwacja jego aktywności w czasie rzeczywistym jest niezwykle trudna. Rozwiązaniem tego problemu jest wykorzystanie woltametrii w połączeniu ze specjalnie skonstruowaną elektrodą enzym atyczną [16, 17].

W ymienione wyżej zastosowania i perspektyw y rozwoju woltam etrii są jedyn ie wybranym i przez autorów niniejszego opracow ania przykładam i

wykorzystywania tej metody we w spółczesnych badaniach

neurofizjologicznych. Pełna analiza wszystkich zastosowań tej metody

eksperym entalnej w znacznym stopniu przekracza cel niniejszego opracowania.

Piśmiennictwo:

1. A illon, D., Jo hn son , D .A., John son , D., Palam arch ouk, V .S., Sm agin, G .N . (2 005 ) In vitro study o f a new c arb on fib er m icro electro de for real tim e m eas ure m en t o f d op am in e with digital w irele ss transm issio n: ap plication to stud ies in b eh aving anim als. S oc iety f o r N eur os cienc e M eeting, W ashington, DC.

2. A rm strong -Jam es ,M ., an d M illar, J. (1979) C arbon Fibre M icro clectrod es. J. N eu ro sci M eth. 1: 27 9-28 7.

3. A rm strong-Jam es, M ,. M illar, J., and K ruk, Z .L. (1 980) Q uan tifica tio n o f n orad re naline io ntop horesis. N ature. 288: 181-183.

4. C respi, F., D a lessan dro , D., A n novazz i-L odi, V., H eidbreder, C., N orgia, M. (20 04) In vivo voltam m etry: from wire to wireless m easurem ents. J. N eurosci. M eth. 140: 153-161.

5. C re spi, F., E ng land , T .G ., T rist, D.G. (1995) S im u ltan eous , selec tive d ete ctio n o f ca tec ho la m ine rgic and in dola m ine rgic signals using cyclic v oltam m etry w ith trea ted m icro-sensor. J. N eurosci. M eth. 61: 201-2 12.

6. D a n e n , M .J., W ig htm an, R.M . (1 999) E lectroc hem ical m o nitorin g o f b io ge nic am ine n eu ro tran sm ission in real tim e. J. F arm. B iomed. A nal. 19: 33-46.

7. G o non, F., C e sp ug lio , R ., Pon cho n, J-L , B uda, M ., Jouv et, M ., A dam s, R .N ., Pujol, J-F. (1 978) M e sure électroc him iq uec on tinu e d e la libération de d opa m in e réalis ée da ns le n éo stria tum du rat. C om p te R en du s 286: 1203-1206.

8. Z hu, H., Pa lam arch ouk , V .S., Z h ou , W. (2005) E ffects o f m orp hine on n orep in ep hrine release in rat h ipp ocam pu s: a n in vivo voltam m etry study. S o cie ty f o r N e ur osc ie nc e M eeting, W ashington, DC.

9. H u erta-C erdän , A., de la R osa, J.M ., G onzâlez, C .A., G enes ca, J. (2 003 ) C yclic voltam m e try and diele ctric studies on P b S -p ota ss iu m ethyl x a ntha te-d e x trin e system u nd e r flota tion and d epressio n co nd ition s. J. M a teria ls P rocess. Technol. 143-144: 23-2 7.

10. K issinge r, P.T ., Hart, J.B ., and Adam s, R.N. (19 73) V o ltam m etry in B rain T is sue - a new ne uro phy siolo gic al m easurem e nt. B rain Res. 55: 209-213.

11. K issinger, P.T ., H e inem an, W .R. (1984) L abora tory te ch niqu es in e lectroan alytical chem istry. M arc el Dekker, INC. N e w York a n d B asel, s. 51-127.

12. Kiyatkin, E .A ., Ste in, E .A . (1 995) Fluctu atio ns in nuc leus a ccum ben s d op am in e du ring co caine se lf-a dm in is tration behavior: an in vivo electroch em ica l study. N e uroscienc e. 64: 599-617.

13. M illa r, J, Sta m ford , J.A ., Kruk, Z .L ., W ightm an, R.M . (19 85) E lectroc hem ica l, ph arm aco log ica l, an d ele ctrop hys iolo gica l evide nce o f rap id d op am in e rele ase an d rem o val in the rat cau date nuc leus follow ing electrical stim ulation o f the m edia n forebra in bundle. E u rop ean J. P harm . 109: 341-348.

14. N akaza to, T ., A kiym a, A. (1999) H ig h-spe ed voltam m etry: dual m easurem e nt o f dop am in e and se roto nin. J. N eurosci. M eth. 89: 105-110.

15. Pala m arch ouk , V .S., G o ed ers , N., Song, D., A illon, D., Jo hn son , D .A ., Jo hn so n , D., Sm agin, G.N. (20 05 ) In vivo real tim e m easurem e nt o f do pam in e with digital w ire less data tra nsm iss ion: a pp lic atio n to studies in beh aving anim als. S oc iety f o r N eu ros cien ce M eeting, W ashington, DC .

16. Pa lam a rch ouk , V .S., Song, D., A. M edd, A illon, D., Jo hn son , D .A ., M rzljak, L., Sm a gin, G.N.. (2 004 ) In vivo real tim e m easurem ent o f glutam ate in ba solateral am ygd ala (B L A) o f beh aving a nim als s ubjected to co nd itio ne d fear stress parad igm . S oc iety f o r N e uro scie nc e M eeting. Sa n D ie go ,C A

17. Pa lam arch ouk, V .S., So ng, D., M edd, A., A illon, D., Jo hn son , D .A ., M rzljak, L., Sm agin, G .N., (2 003) In vivo real tim e m ea surem e nt o f glutam ate using en zym e ele ctro des . S oc iety f o r N eur os cienc e M eeting. Sa n D ieg o , С A

18. Pezz e, M .A ., Fe ld on , J. (2 004 ) M esolim bic do pam inerg ic patw ays in fea r con d itio nin g . Prog. N eurob iol. 74: 301-320.

19. Salam one , J.D . (1 996 ) T he behavioral neu rochem istry o f m otivatio n: m etho dologic al and c once ptu al issues in studies o f the dynam ic activity o f n ucle us a ccu m be ns dopa m ine. J. N eurosci. M eth. 64: 137-149

20. Stam fo rd,J.A . (19 90) Fast C yclic V oltam m etry - M e asu rin g T ran sm itte r R eleas e in Real- T im e. J. N euro sc i. M eth. 34: 67-72

21. Sta nford , J., C resp i, F., M arsden, C.A. (1992) In vivo volta m m etric m ethod s for m onitoring m ono -am in e releas e and m ethabolism . W: P ra ctica l ap pr o ac h se rie s m o n ito ring ne ur ona l activity. Oxford, UK: Ir l P ress a t O x ford U niversity P ress, s. 113-145

22. Sw iergie l, A.H ., Palam arch ouk , V .S., D unn, A.J. (1 997) A new de sig n o f ca rbo n fiber m icro electrod e for in vivo voltam m etry using fused s i lic a ../. N eurosci. M eth. 73: 29-33

A d res do k o re sp on de nc ji: M a r e k W ie cz o re k Pracow nia N eu rofiz jolog ii K atedry N e urobiolog ii U n iw e rsy tet Łódzki ul. R ew o lucji 1905 r nr 66 90 -22 2 Ł ó dź tel. (48 42 ) 66 55 668 e-m ail: m are k@ b iol.u ni.lo dz.p l