A C T A U N I V E R S I T Ä T I S L O D Z I E N S I S
F O L IA B IO C H IM IC A E T B IO P H Y S IC A 14, 1999
L eszek Szm igiero
ANALIZA USZKODZEŃ DNA W KOMÓRKACH SSAKÓW METODĄ ELUCJI ALKALICZNEJ
Je d n ą z ważniejszych m eto d stosow anych d o b a da n ia efek tów d ziałan ia czy nników ge noto ks yc zn yc h jes t eluc ja a lka lic zn a D N A . Jej p o ds ta w ow y m i za letam i są w y sok a czułość o ra z u niw ersaln oś ć p o zw a la ją ca n a o zna cza nie w ielu ró żn y ch us zk od ze ń D N A . W p ra cy p rze ds ta w ion o p od staw y m eto dy o ra z jej z as to s o w an ia badaw cze.
W S T Ę P
A naliza uszkodzeń D N A , czyli ich identyfikacja o raz po m iar częstości w ystępow ania w genomie, stosowana jest w badaniach m echanizm ów działania czynników genotoksycznych. Czynniki te m ają naturę fizyczną (prom ieniowanie u ltrafioletow e i jonizujące) lub są związkam i chem icznym i różniącym i się m iędzy sob ą zaró w no m echanizm am i reakcji ze sk ładn ikam i chro m aty ny , jak i biologicznym i konsekw encjam i działania. Zależnie od ro d zaju an a li-zow anego uszkodzenia D N A , sto so w ane są techniki o p ar te n a różnych po dstaw ach fizykochem icznych. Istnieje kilka rod zajów uszko dzeń D N A , k tó re zm ieniają w sposób rzeczywisty (pęknięcia nici) lub p ozorn y (między- niciow e w iązania sieciujące, w iązania D N A -b iałk o ) w ielkość cząsteczki p olinu kleo tyd u. Jed n ą z m etod, k tó r a odgry w a szczególnie w ażną rolę w b ada niu takich uszkodzeń, jest elucja alkaliczna D N A o p ra co w an a przez K o h n a [1-4]. W ciągu 25 lat od m om entu pojaw ienia się pierwszej publikacji donoszącej o nowej m etodzie w ykry w ania pęknięć D N A [1], po w stały liczne jej m odyfikacje zwiększające liczbę rodzajów uszkodzeń D N A , k tó re m o żn a w ykryw ać tą techniką. Obecnie jest o na stoso w ana do w ykry w ania o raz ilościowego o zn aczan ia następu jących uszkodzeń D N A . pojedynczych pęknięć nici (SSB, ang. single stran d break), po dw ójny ch pęknięć nici (DSB, ang. double stra nd break), m iędzyniciow ych w iązań sieciujących (ISC, ang. interstrand cross-link), m iejsc w rażliw ych n a hydrolizę alkaliczną (A LS, ang. alkali-labile siies), m iejsc potencjaln ie sieciowalnych
w D N A o raz w iązań sieciujących D N A -b iałko (D P C , ang. D N A-p rotein
crosslink). Liczne m odyfikacje m etod y po w odują, żc czasem używ any jest
w literatu rze term in „elucja m em b ra n o w a” , obejm ujący wszystkie wersje tej techniki, opartej na eluow aniu D N A , k tóry zo stał wcześniej zaad sorb o w an y n a specjalnych filtrach. Celem niniejszego przeglądu jest przedstaw ienie m ożliwości badawczych m etody bez om aw iania przepisów w ykonaw czych. N ajbardziej szczegółowy opis w ykonyw ania analizy uszkodzeń D N A techn ik ą alkalicznej elucji D N A m o żna znaleźć w [3],
W Y K R Y W A N IE P O J E D Y N C Z Y C H I P O D W Ó J N Y C H P Ę K N IĘ Ć N IC I DN A
T erm in „pojedyncze pęknięcia” nici nie oznacza, że uszkod zenia z lo k a-lizow ane są wyłącznie n a jednej z k om p lem entarny ch nici D N A . Przeciw nie, pęknięcia znajd ują się n a o bu niciach, z tym , że są od siebie o dd alon e o co najm niej 50 nuk leo ty dów [2], Jeżeli pęknięcia w ystępują rów nolegle lub odległość między nimi jest m niejsza od 50 nukleotydów , wówczas uszkodzenie to nazyw ane jest podw ójnym pęknięciem nici.
Z asadę w ykryw ania SSB p rzedstaw iono n a rys. 1. K o m ó rk i z D N A , w yzn akow anym najczęściej za p om ocą radioakty w nej tym idyny, nano szo ne są n a filtry m em b rano w e w yk onane z m ateriału charaktery zująceg o się niskim pow inow actw em d o białek i p od d ane lizie bu fo rem zawierającym siarczan dodecylu sodu (SDS). Najczęściej stosow ane są filtry poliw ęglanow e firm y N uc leop ore lub M illipore o średnicy porów 0,8 -2 /im . P o przesączeniu lizatu, n a filtrze zatrzym any zostaje D N A w raz z niew ielką ilością białek [1-4]. P oniew aż obecność białek zab u fza przepływ D N A przez filtry, należy przed rozpoczęciem elucji d o k on a ć odbiałczenia D N A . W ykon uje się to w p ro sty sp osó b p op rzez in ku b ację filtrów w roz tw o rze zaw ierający m p ro teinazę K . P o straw ieniu białek, na filtry nan oszon y jest alkaliczny (pH 12,1-12,2) bufor denaturujący i jednocześnie wym ywający D N A . D e natu rac ja D N A jest konieczna, aby długie nici p olinukleotydow e m ogły przejść przez pory filtrów w trakcie pow olnego przepływ u buforu. W natyw ny m heliksie D N A nici ko m p lem en tarn e stabilizują się naw zajem , dzięki czemu po siad a on właściwości m echaniczne helikalnej sprężyny i staw ia o p ó r siłom dzia-łającym poprzecznie do osi cząsteczki. U tru d n ia to w yginanie cząsteczek D N A , k tó re są zbyt długie aby przejść przez m ałe pory filtrów . Pojedyncze nici zd enaturo w an ego D N A są wiotkie, łatw o ulegają przem iano m k o nfo r- m acyjnym i m o gą przepływ ać przez filtr z szybkością zależn ą jedyn ie od ich długości [1-4]. P oró w nu jąc szybkości elucji D N A z k om ó rek k on troln y ch i z ko m ó rek , k tó re p o d d a n o działaniu czynników pow o dujących pęknięcia nici (rys. 2), łatw o zauważyć zależny od stężenia czynnika genotoksycznego
L iz a (d e te rg e n t + p ro te in a z a K ) E lu c ja ( p H 1 2 ,1 -1 2 ,2 + S D S )
r
P ro m ie n io w a n ie X iu b 7 d a w k a 3 G y ( 3 0 0 0 ra d ó w ) L iz a (d e te rg e n t + p ro te in a z a K ) w ią z a n ie m ię d zy n ic io w e E lu c ja ( p H 1 2 ,1 -1 2 .2\
r * R y s. 1. S c h e m a t w y k ry w a n ia p ę k n ię ć p o je d y n c z e j n ic i o ra z m ię d z y n ic io w y c h w ią z a ń si e c iu ją c y c h D N A m e to d ą a lk a li c z n e j e lu c jiw zrost szybkości elucji [5], K o rzystając z odpow iednich m etod obliczeniow ych m o żn a oznaczyć częstość w ystępow ania pęknięć i wyrazić ją w um ow nych jed n ostach (najczęściej jak o rów now ażnik daw ki prom ieniow ania jonizującego, tzw. rad-ekw iw alent) lub obliczyć częstość ab so lu tn ą (np. liczba p ę k n ięć /10 6 nu kleotyd ów ). Czułość m etody wynosi 1 pękn ięcie/10 7 n uk leo tyd ó w [2] i o d p o w iad a czułości inn ych p o p u larn y c h ob ecnie m eto d w y k ry w an ia pęknięć nici D N A , takich ja k m eto d a k om etk ow a [6] czy test alkalicznego rozwinięcia D N A [7]. <u N (0 c >% c CO E N k_ eS N < z Q Objętość eluatu (ml)
R ys. 2. K rzyw e elucji D N A k o m órek linii H e L a p o d d a n y ch d zia łaniu czy n nikó w g eneru jący ch w oln e ro d n ik i. H o d o w an e in vitro k o m ó rk i H e L a in k u b o w a n o 60 m in w te m p e ra tu rz e 0°C z H 20 2 lub p o d d a n o p ro m ie niow a niu y (da w k a 3 G y). A - D N A k o n tro ln y ; A - 50 /iM H 20 2; • - 100 n M H 20 2; O - 200 H 20 2; □ - p ro m ie niow a nie y (d a w ka 3 G y).
W edłu g S z m i g i e r o i S t u d z i a n a [5]
P rzyjm uje się zazwyczaj, że w śro dow isku alkalicznym o znaczane są pojedyncze pęknięcia nici D N A , ale trzeb a pam iętać, że m eto d a nie o dró żn ia w tych w a ru nk ach SSB od D SB, czyli w rzeczywistości o zn aczan a jest sum a o bu tych uszkodzeń. Jeżeli istnieje konieczność p om iaru częstości D SB, elucję pro w adzi się za po m o cą b uforu o p i l 10 [2-4]. P ozo stałe w aru nk i są identyczne ja k w przyp ad ku o zn aczan ia SSB. Ze względu n a w sp o m n ian ą wcześniej tru d n o ść przechod zenia dw uniciow ego D N A przez filtry należy sto sow ać filtry o p o rach po siadających większą średnicę (2-5 /an). C zułość m e to dy w tych w aru n kach jest w przybliżeniu 10-krotnie niższa [2-4].
O Z N A C Z A N IE M I E J S C O NA W R A Ż L IW Y C H N A H Y D R O L IZ Ę A L K A L IC Z N Ą
Istnieje wiele czynników genotoksycznych, k tó re uszk adzają D N A bez przery w ania ciągłości jego nici, ale zm ieniają stabilność p olin uk leoty du w środow isku zasadow ym . T akim i uszkodzeniam i są np. p ro d u k ty alkilacji g ru p fosforan ow ych lub m iejsca bez zasad (abasic site) [8, 9], Te o statn ie po w stają w w yniku d ziałan ia enzymów reperacyjny ch usuw ających zm o d yfikow ane czynnik am i genotoksycznym i zasady azotow e lub po przez sam o -rzu tny ro zpad w iązań N-glikozydow ych. W środo w isk u silnie alkalicznym m iejsca tak ie (ALS) ulegają przekształceniu w pęknięcia nici. Ich oznaczanie przeprow ad zane jest w sposób praw ie identyczny ja k w p rz y p ad k u SSB, z tym , że płyn elucyjny po siad a wyższe pH (12,7 zam iast 12,1), a przed rozpoczęciem elucji inku buje się zaadsorbo w any n a filtrach D N A , przez kilka godzin w płynie den atu ru jącym (rys. 3). O becno ść A LS w D N A
Objętość eluatu (ml)
R y s 3 K rzyw e elucji wskakujące n a obe cn ość w D N A m iejsc w rażliw ych n a hy drolizę a lka licz ną K o m ó rk i H eL a e k sp o n ow an o n a d zia łanie ipe ry tów izo fo s fo roa m id ow y ch 60 m m w 37°C n as tęp n ie p o d d a n o lizie n a filtrach po liw ęg lanow ych. D N A , o d białcz o no i prz ed ro zpo częciem elucji D N A in ku b o w a no 3 godz. w te m p e ra tu rz e p ok ojow e j w b uforze p H 12,7. D u ż a szybkość elucii D N A z ko m ó rek po dda ny ch działaniu iperytu dibrom o-izofosforo am idow e go w s k " z ^ e n a o be cn ość w D N A m iejsc w rażliw ych n a h yd ro lizę a lk a lic zn ą □ - D N A k o n tr o ln y O - ip ery t dichloro -izofos foram id ow y ; 3 - ip ery t c h lo ro bro m o -iz o fos fo roa m id ow y;
m o żn a zauw ażyć także w p rzy pad ku ozn aczan ia SSB, poniew aż krzywe elucji p osiad ają wów czas ch arakterysty czne wykrzywienia w skazujące na jej przyspieszanie w trakcie przem yw an ia filtrów alkalicznym ro ztw orem [2-4].
O Z N A C Z A N IE M IĘ D Z Y N IC IO W Y C H W IĄ Z A Ń S IE C IU J Ą C Y C H
N iek tó re związki chem iczne p osiadają wiecej niż jed n o cen trum zdo ln e d o tw o rz enia kow alencyjn ych po łączeń z D N A . M o g ą więc reag ow ać dw ufu nkcyjnie i przyłączać się jednocześnie do ob u k om p lem en tarn ych nici D N A , tw orz ąc uszkodzenie D N A zwane m iędzyniciow ym wiązaniem sieciu-jącym (ISC). Przykładam i takich związków są liczne leki przeciwnowotworowe, tak ie ja k cz.ę-diam minodichloroplatyna, m itom ycy na C, nitrozom oczn iki, p och od n e iperytu azotow ego [11] lub izofosforam idow ego [10]. Z a sad a oznaczania ISC przedstaw io na jest n a rys. 1. Przebieg oznaczenia p rzypo m ina procedurę stoso w aną do w ykryw ania SSB i także w tym przypadku konieczne
0) N aj c 0 O) <D c co E
1
m N O 'o to Objętość eluatu (ml)R ys. 4. K rzy w e elucji c ha ra k te ry styc zn e d la D N A zaw ierają ce go m iędzyn ic iow e w iąz an ia sieciujące. K o m ó rk i H e L a e k sp o n ow a n o n a dz iałanie ip erytów izo fo s fo roa m id ow y ch 60 m in w 37°C , n a s tęp n ie p o d d a n o je p ro m ie n iow an iu y d a w k ą 3 G y i z lizo w a no n a filtrac h p oliw ęgla now ych . D N A e luo w an o z filtró w bu forem o p H 12,1. □ - D N A k o n tro ln y ; O - ip ery t d ich lo ro -izofos foram id ow y ; 9 - ip ery t c h lo ro b ro m o -iz o fo s fo ro a m id o w y ; • - ip e ry t
jest zd enatu ro w anie D N A alkalicznym buforem elucyjnym [2-4], O becność IS C pow oduje, że pojedyncze nici zdenatu ro w a nego D N A nie o d d alają się od siebie, m im o zerw ania w iązań w odorow ych pom iędzy k om plem entarnym i p aram i zasad. D zięki tem u d o ch od zi do sp o w o ln ienia w ypływ u D N A z filtrów , gdyż dwie nici p rzechod zą przez po ry filtrów razem , im itując ed n ą dłuższą cząsteczkę. Efekt ten widoczny jest tylko w tedy, gdy nici D N A nie są zbyt długie. D lateg o k om ó rk i ko n tro ln e i b ad an e na obecno ść ISC p od d aw an e są przed lizą pro m ien iow an iu y (d aw ka 3 G y) celem pocięcia nici D N A n a krótsze odcinki. O obecności IS C św iadczy zm niejszenie w p oró w n an iu z k o n tr o lą szybkości elucji D N A (rys. 4).
K on ieczność fragm entacji D N A za p om o cą p ro m ieniow an ia jonizująceg o jest isto tny m u tru dn ieniem technicznym , w ym ag a bow iem d o stęp u do ap a ra tu ry radiacyjnej, wysoko w ydajnych bom b kob altow ych lub ap a rató w R oen tg ena o dużej m ocy. P roblem ten m ożn a je d n ak om in ąć stosując alternaty w ne m etod y fragm entacji D N A w ykorzystujące związki chem iczne zdolne do gen erow an ia wolnych rod nikó w . Najczęściej stoso w an ym i d o tego celu zw iązkam i są: nadtlenek w od o ru [5] i bleom ycyna [12].
O Z N A C Z A N IE W DN A M IE J S C P O T E N C J A L N IE S IE C IO W A L N Y C II
Związki po w odujące IS C reagują z D N A d w u etapo w o [11]. W p ierw -szym e ta p ie p o w staje m o n o a d d u k t z cz ąsteczk ą c z y n n ik a sieciującego p rz y łąc zo n ą d o jed n e j ty lk o nici D N A . M o n o a d d u k t, k tó ry p o sia d a w swojej cząsteczce drugie centrum zd olne do kow alencyjnego po łączen ia z D N A , m oże p o pewnym czasie (1- 6 godz.) w ytw orzyć drugie w iązanie z k o m p lem en tarn ą nicią. P ew na część m o n o a d du k tó w zostaje w tym cza-sie u sun ięta n a d ro dze sp ontaniczn ego o drzucen ia zm odyfikow anej zasady lub w w yniku działan ia ko m ó rko w y ch system ów napraw czych. A by m o żliwa była o cena sprawności system ów n ap raw y ISC, ko nieczna jest zn ajo -m o ść p otencjalnie -m aksy-m alnej częstości tych uszkod zeń, k tó re -m ogłyby za istn ie ć p rzy b r a k u m ech an izm ó w usu w ający ch m o n o a d d u k ty . Je d n a z m od yfikacji alkalicznej elucji pozw ala n a oznaczenie częstości m iejsc p otencjalnie sieciowalnych [13]. W m etodzie tej k o m ó rk i p o d d aw an e są działan iu czy nnik a sieciującego, w czasie k tóreg o do ch odzi d o p o w stan ia m o n o ad d u k tó w . N astępn ie przep ro w adza się fragm entację D N A i lizuje k o m ó rk i n a filtrach m em branow y ch. P o odbiałczeniu D N A nie zo staje on od razu zdenatu ro w an y, lecz filtry są ink ubo w ane w buforze o pH 10 w 37°C przez wiele godzin (do 12). W tym czasie m oże zachodzić drugi
e ta p sieciow ania, w którym m o n o a d d u k ty reagują z D N A nici ko m p lem an- tarnej. W reakcji tej uczestniczy znacznie większa liczba m o n o ad d u k tó w , niż m a to m iejsce w przyp adk u, gdy reakcja biegnie w ew nątrz ko m ó rk i [13].
O Z N A C Z A N IE W IĄ Z A Ń S IE C IU J Ą C Y C H D N A -B IA Ł K O
T en rodzaj uszkodzeń ch ro m atyn y jest stosun kow o najm niej p o znan y, m im o że po w odo w any jest przez bardzo wiele czynników. A lkaliczna elucja D N A jest jed n ą z ważniejszych technik, k tó re są używane do jeg o ozn aczania [2-4], S p osó b o zn acza n ia D P C p rz yp o m in a p roc edu rę o p ra c o w a n ą d la w ykryw ania IS C z kilk o m a zm ianam i. F ragm en ta cja D N A prz epro w ad zan a jest zwykle 10 razy wyższą d aw k ą pro m ieniow ania, ko m ó rki p od d aw an e są lizie na filtrach m em bran ow ych o dużym pow inow actw ie do białek i p om ija się odbiałczanie. M ocno pocięty przez prom ieniow anie y lub inny czynnik generujący w olne rodniki i n astępnie zden atu ro w an y D N A w ypływ a z filtrów
Objętość eluatu (ml)
R ys. 5. W ykryw anie w ią zań D N A -b ia łk o m e tod ą alkalicz nej elucji. K o m ó rk i H ela in k u b o w a n o z ip ery tam i iz ofos foroa m ido w y m i ja k p o d a n o w opisie rys. 4 i p o d d a n o p rom ie nio w a niu
y (da w k a 30 G y ). K o m ó rk i zlizow an o n a filtrach po lic hloro w in ylo w yc h i e lu o w a n o D N A
b u fo re m o p H 12,1 nie za w ie ra ją cy m d e te rg e n tó w . □ - D N A k o n tro ln y ; O - ip ery t d ich lo ro -izo fo sfo ra m id o w y ; 9 - ip ery t c hlo ro b ro m o -izo fos fo roa m id o w y ; • - ip e ryt d ib ro m o -
bard zo szybko [24]. N ato m iast frak cja D N A , k tó ra po łączo na jest ko w alen -cyjnym i w iązaniam i z białkam i, zostaje w raz z nim i z aad so rb o w an a n a filtrze (rys. 5). Ilość D N A zatrzym anego na filtrze jest m iarą częstości D P C [2-4, 14]. Czułość w ykryw ania D P C nie różni się od czułości p o m iaru SSB o raz IS C i wynosi 1 u szko dzen ie/107 nuk leoty dów [2-4],
M O Ż L IW O Ś C I A R T E FA K T Ó W
Ż a d n a, naw et najbardziej now oczesna m etod a sto so w ana w b adan iach biochem icznych nie jest p ozbaw ion a ograniczeń czy m ożliw ości d o starcza n ia błędnych w yników . N ie jest inaczej w p rzypadk u alkalicznej elucji D N A i należy pam iętać o przestrzeganiu pewnych zasad w trakcie w yko ny w ania oznaczeń, k tó re zabezpieczają przed artefaktam i.
Jedn ym z czynników wpływających n a d ok ład no ść oznaczeń są w arunk i ośw ietlenia pracow ni. W szystkie czynności od m o m en tu rozpo częcia lizy k om ó rek m u szą być pro w adzon e w pom ieszczeniu zaciem nionym z tylko jedny m , słabym źródłem św iatła um ieszczonym kilka m etró w od m iejsca pracy. Zaciem nienie zabezpiecza D N A przed pojawieniem się d od atko w y ch pęk nięć nici. Szczególnie d u ż ą w rażliw ość n a św iatło w ykazuje D N A jednoniciow y. D w um inutow e naświetlenie zdenaturow an eg o D N A za p om o cą zw ykłych św ietlów ek znajdu jący ch się w odległości 10 cm od filtrów pow o duje pojaw ienie się pęknięć nici z częstością rów n ow ażn ą działan iu prom ieniow ania y o dawce 3 Gy (Szmigiero i K o hn, wyniki nie publikow ane). P oniew aż elucja zdenatu ro w aneg o D N A trw a zwykle od 5 d o 15 godz., więc zaciem nienie pracow ni w tym okresie po w inn o o dp o w iad ać ciemni fo tograficznej. D w uniciow y D N A nie jest tak m ocno w rażliw y n a działanie św iatła, ale trzeba p am iętać, że wiele zw iązków oddziaływ ających z D N A m o że mieć właściwości światłouczulające. T ak jest w p rzy p adk u barw nych ligandów interkalujących, takich ja k brom ek etydyny lub związki akrydynowe. N aśw ietlanie dwuniciowego D N A w obecności b rom ku etydyny w stężeniach rzędu 1 0 ~ 7 m o l/d cm 3 pow o duje b ard zo w ysoką częstość pęknięć nici D N A , ró w n o w ażn ą p rom ien iow aniu y o daw ce 4 - 5 Gy (Szm igiero i K o h n , wyniki nie pu bliko w ane). D rug im czynnikiem zw iększającym częstość pękn ięć w badanym D N A m oże być nadm ierna szybkość przepływ u buforu elucyjnego przez filtry. Szybkość ta k o n tro lo w an a jest za p o m o cą w ielo kanałow ych p o m p p ery staltyc zn y ch i p o w in n a być u tr z y m a n a w p rzed ziale
0 ,0 3 -0 ,1 0 m l/m in. M ożliwe jest rów nież uzyskanie fałszyw ie zaniżonych
oznaczeń częstości SSB spow odow ane niedostatecznym odbiałczaniem . Z asad -niczo stan d ard o w a m e to d a odb iałczania D N A w y korzy stująca traw ienie lizatów k o m ó rk o w y ch p ro te in a z ą K jest zabiegiem w ystarczającym d o usunięcia białek z filtrów [l^ t]. Jednakże zdarzają się czynniki genotoksyczne,
k tó r e w ytw arzają D P C w ykazujące, z niewyjaśnionych przyczyn, znaczną o p o rno ść n a traw ienie p rotein azą [15]. W takich p rzy p adk ach należy ustalić n ie stan d a rd o w e w a ru n k i o db iałcz an ia: po dw yższon e stężenie p ro tein azy i przedłużony czas traw ienia lizatów.
P od ob ne zasady p ro w ad zenia eksperym entów d oty czą o zn aczania ISC. Z tym , że czynniki w p ro w ad zające a rtefa k ty po dczas o z n ac za n ia SSB działają od w ro tnie w przyp ad k u w ykryw ania sieciow ania D N A . Światło o bn iża ilość w ykryw anych ISC, a niedostateczne odb iałczanie po zornie ją podw yższa. O ddzielnym prob lem e m , k tó ry nie w ydaje się m ożliw y do całkow itego rozw iązania, jest badan ie związków indu kujący ch w D N A jednocześnie SSB o raz ISC. Pęknięcia D N A zw iększają szybkość elucji, a w iązania sieciujące ją obniżają. D ocho dzi więc d o wzajem nego m asko w ania uszkodzeń. N a ogół o b a te uszkodzen ia różn ią się kin ety k ą p ow staw an ia i reperacji, dzięki czemu m aksim a ich efektów rozdzielone są w czasie [16]. F a k t ten daje m ożliw ość oznaczenia pęknięć nici i w iązań sieciujących D N A w innym czasie po zakoń czeniu ekspozycji ko m ó rek n a działanie czyn nika genotoksycznego. Jeżeli taki sposób prow adzenia eksperym entu nie jest m ożliw y, należy zastosow ać m atem atyczn ą m eto dę korekcji w yników [3, 4], T rz e b a je d n a k w tym p rz y p ad k u p am iętać, że m eto d a o p a r ta je st na p om iarach w ykonanych d la szczególnego uk ła du uszkodzeń w yw ołanych jedn oczesn ym działaniem ip ery tu azoto w ego ja k o czy n n ik a sieciującego i prom ieniow aniem jon izującym po w odującym pęknięcia D N A [3]. Inne czynniki genotoksyczne m o g ą po siadać o dm ienną cha rak tery sty k ę krzywych elucji i założenia m atem atyczne wspom nianej m etody obliczeniowej korygującej wyniki oznaczeń m og ą nie być dla tych czynników właściwe.
P odczas oznaczan ia D P C trzeb a z kolei zw racać uwagę n a d o k ład n ość oczyszczenia filtrów z detergentu użytego do lizy ko m órek. N aw et jego niewielkie ilości po zostające na filtrze zakłó cają elucję i o b niżają w yniki oznaczeń D P C. Błąd tego rodzaju jest łatwy do zauważenia, poniew aż zmienia k ąt nachylenia krzywych elucji i zm niejsza pow tarzalność uzyskiw anych w yni-ków . N a po w tarzalno ść w yniyni-ków otrzym yw any ch wszystkim i m o dy fikacjam i alkalicznej elucji D N A wpływa też d o kład no ść d ziałan ia p o m p perystaltycz- nych. Nawet urządzenia najbardziej renom owanych producentów nie gw aran tu-j ą tetu-j sametu-j szybkości p o m po w ania we wszystkich k an ałach. D lateg o przed rozpoczęciem eksperym en tó w każde nowe urządzenie m usi być d ok ładn ie przetestowane i wyregulowane. D odatkow ym sposobem popraw iającym p o w ta-rzalność i porów nyw alność wyników jest zastosow anie norm alizacji opartej na w prow adzeniu d od atk ow eg o stan d ard u D N A , obecnego we w szystkich b a d a -nych prób kach [2-4], Źródłem tego D N A są kom órki naprom ieniow ane daw ką 3 Gy. D N A standard ow y w yznakow any jest innym izotopem p ro m ien iotw ór-czym niż D N A kom órek badanych. Badany i standard ow y D N A eluow ane są jednocześnie z tego sam ego filtru. K rzyw ą elucji przedstaw ia się wówczas ja k o
zm iany retencji bad anego D N A w odniesieniu d o retencji stan dard ow ego D N A , a nie ja k o funkcję czasu trw an ia elucji lub objętości eluatu.
W większości od m ian elucji D N A z filtrów m em bran ow y ch sto sow ane są w arunki alkaliczne. pH buforów elucyjnych nie pow inn o być niższe niż 12,0. Ze względu na szybkie pochłanianie C O z przez alk aliczne roztw ory ich pH nie jest stabilne i dlateg o przed każdym dośw iadczeniem m usi być spraw dzane. Przy w artości p il od 11,7 do 11,9 rozdzielenie nici D N A nie jest pełne, co m oże się stać przyczyną błędnych w yników i p row adzić do ob niżenia częstości w ykryw anych SSB, a także po zo rneg o podw yższenia częstości IS C lub D P C . In terp retu jąc wyniki oznaczeń ISC należy b rać pod uwagę, że alkaliczność bu forów elucyjnych, jakk olw iek ko nieczna, m oże p ow odo w ać hydrolizę w iązań sieciujących p ow odo w an ych przez niek tóre związki reagujące z D N A [17, 18]. D latego w p racac h n ad m ech an izm am i działania związków sieciujących, m etodyka badań nie pow inna być ograniczona tylk o do alkalicznej elucji D N A . T a o statn ia uw aga m a ch a ra k te r ogólny i dotyczy rów nież innych techn ik używ anych w b ada niach czynników genotoksycznych.
P O D S U M O W A N IE
K ażd e z uszkodzeń D N A , k tó re w ykryw ane jest alkaliczną elucją, m o że być o znaczane innym i m etod am i. W p rzy p ad ku w ykryw an ia SSB istnieją naw et m etod y ok. 10 razy czulsze, takie jak ultraw irow anie n ukleo idów [19] lub w isko elastym etria D N A [20]. W iększość m etod analizy uszkodzeń D N A w k o m órk ach ssaków , alternatyw nych w sto sun k u do alkalicznej elucji, jest przystosow ana do w ykryw ania tylko jednego rodzaju uszkodzenia chrom atyny, a nieliczne z nich, ja k np. m eto d a „k o m etk o w a” , po zw alają b ad ać zaró w n o pęknięcia D N A , ja k i IS C [21]. P o dstaw o w ą zaletą alkalicznej elucji D N A jest jej uniw ersalność. P ozw ala o na bowiem n a szybkie wykrycie wielu ro d zajó w uszko dzeń D N A , obecnych w jednej badanej po pulacji ko m ó rek. T a cecha pow oduje, że w ru ty now ych badan iach aktyw n ości genotoksycznej leków i substancji zanieczyszczających środo w isko n atu raln e, alkaliczna elucja D N A jest techn iką często stosow aną.
L IT E R A T U R A
fl] K o h n K. W , E w i g R. A. G . (1973), C a nce r R e s , 33, 1849-1853.
[2] K o h n K. W. (1979), [w:] M e tho ds in Cancer Research: D N A as a target f o r cancer
[3] K o h n K. W. , E w i g R. A. G. , E r i c k s o n L. C., Z w e l l i n g L. A. (1981), [w:] D N A
repair: A laboratory m anu al o f research techniques: M easu rem e nt o f s tr a n d bre aks a nd cross -links in D N A b y alkaline elution, ed. E. C. F r i e d b e r g , P. C. H a n a w a i t , M a rce l
D e k k e r, N ew Y o rk , 379-401. [4] K o h n K. W. (1991), Ph a rm a c . T h er., 49, 55-77. [5] S z m i g i e r o L., S t u d z i a n K. (1988), A nal. B iochem ., 168, 88 -93. [6] S i n g h N. P. , M c C o y M. T „ T i c e R. R „ S c h n e i d e r E. L. (1988), E xp . Cell R es ., 175, 184-189. [7] T a n i n g h e r M. , B o r d o n e R. , R u s s o P. , G r i l l i S., S a n t i L., P a r o d i S. (1987), A n tic a nc er R e s., 7, 669-680.
[8] F o r n a c e A. J., D o b s o n P. P., K i n s e l l a T . J. (1986), C arcino gen esis , 7, 9 27-932 . [9] S h o o t e r K. V., M e r r y f i e l d R K. (1978), B iochim . B iophys. A c ta, 521, 155-159. [10] S t u d z i a n K. , S z m i g i e r o L. (1992), B iochem . P ha rm ac o l., 937 -94 3. [11] K o h n K . (1996), C a nce r R es., 56, 5533-5546. [12] B r y n e s R. W „ P e t e r i n g D . H . (1994), R a d ia l. R es., 137, 162-170. [13] D ’ l n c a l c i M. , S z m i g i e r o L., E r i c k s o n L. C. , H a r t l e y J. A. , K o h n K . W. (1985), A n al. B iochem ., 150, 161-165. [14] W a l i c k a M. , S z m i g i e r o L., C i e s i e l s k a E. , G r ą d z k a L , (1993), B iochem . P h arm ac o l., 46, 615-620. [15] P a s t w a E. , C i e s i e l s k a E., P i e s t r z e n i e w i c z K. M. , D e n n y W. A. , G n i a z -d o w s k i M, S z m i g i e r o L. (1998), B iochem . Ph a rm ac ol., 56, 351-359. [16] S z m i g i e r o L., E r i c k s o n L. C. , E w i g R. A. , K o h n K . W . (1984), C an c er Res., 44, 4447-44 52.
[17] K o n o p a I. (1988), [w:] M olec ular A spe cts o f C hem otherapy, ed. E. B o r o w s k i , D. S h u g a r , P erga m on Press, N ew Y o rk , 83-94.
[18] G n i a z d o w s k i M. , S z m i g i e r o L. (1995), G e n eral Ph a rm a c ol., 26, 47 3-4 81. [19] C o o k P. R. , B r a z e l l 1. A. (1976), N a tu re , 263, 679-682.
[20] U h l e n h o p p E. L. (1975), B iophys. J., 15, 233-237.
[21] P f u h l e r S., W o l f H. U . (1996), E nv ir. M o lec. M u tag e n ., 27, 196-201.
W p łyn ęło d o R e da kc ji Z a k ła d C he m ii O gólnej
F o lia b ioc him ic a et b iop hy sica A ka d e m ia M ed y c zn a w Ł odzi 24.04.1998
L e s ze k Szm igiero
A N A L Y SIS O F D NA D A M A G E IN M A M M A L IA N C E L L S BY A L K A L IN E E L U T IO N
D N A a lk alin e e lutio n is one o f th e m o s t p ro m in e n t m eth o d s w hich a re c u rre n tly in u se fo r in v es tig a tio n o f the effects o f ge no to xic agents. T he m ain a d v a n ta g e o f th is te c hn iq u e is its high sensitivity as well a s ve rs atility th a t allow s one to m eas ure a va rie ty o f D N A lesions. B asic p rin ciples o f the m eth od a n d its re searc h a p p lic atio n s a re review ed.
