Bronis aw K. G ÓD1, Pawe PISZCZ1, Iwona KIERSZTYN1, Anna LAMERT1, Pawe ZARZYCKI2
1)
Zak ad Chemii Analitycznej, Instytut Chemii, Akademia Podlaska ul. 3 Maja 54, 08-110 Siedlce
e-mail: bkg@onet.eu; URL: http://dach.ich.ap.siedlce.pl 2)
Zak ad Toksykologii i Bioanalityki, Wydzia Budownictwa i In ynierii rodowiska, Politechnika Koszali ska, ul. niadeckich 2, 75-453 Koszalin
ZASTOSOWANIE HPLC DO OZNACZANIA
WOLNYCH RODNIKÓW, ANTYOKSYDANTÓW
ORAZ CA KOWITEGO POTENCJA U
ANTYOKSYDACYJNEGO
W pracy przedstawiono podstawowe informacje o wolnych rodnikach, ich wytwarza-nie, oddzia ywanie z podstawowymi sk adnikami organizmów ywych, udzia w wielu stanach chorobowych, a tak e starzeniu organizmu. Ponadto omówiono metody oznaczania wolnych rodników, antyoksydantów oraz ca kowitego potencja u antyok-sydacyjnego za pomoc HPLC.
INFORMACJE PODSTAWOWE
Tlen jest pierwiastkiem bardzo rozpowszechnionym na Ziemi. Odpo-wiada za mniej wi cej jedn czwart jej masy. W dolnych warstwach atmos-fery obj to ciowa zawarto tlenu wynosi 21%. Pierwotna atmosfera ziem-ska by a mieszanin gazów o w a ciwo ciach redukuj cych. Wolny tlen w postaci cz steczkowej pojawi si w niej wraz z rozwojem pierwszych or-ganizmów fotosyntezuj cych, ok. 2 miliardów lat temu. Rozpuszczaj c si w wodzie by on niezb dnym czynnikiem powstania i rozwoju organizmów wy szych. Znacznie wy sza ni w wodzie jest jego rozpuszczalno w roz-puszczalnikach organicznych, co wp ywa na lokalizacj rodników tlenowych w hydrofobowych cz ciach b on biologicznych. W organizmach aerobo-wych znaczna cz pobieranego tlenu wykorzystywana jest jako akceptor elektronów. Takie enzymy jak dioksygenaza tryptofanowa i oksydaza ksan-tynowa katalizuj reakcje utleniania polegaj ce na przenoszeniu pojedyn-czych elektronów z substratów na cz steczk tlenu. W trakcie redukcji tlenu wytwarzane s tzw. reaktywne formy tlenu (ang. ROS - reactive oxygen spe-cies). Jest to pojecie szersze, gdy oprócz wolnych rodników zalicza si do nich m.in. wzbudzony tlen singletowy i nadtlenek wodoru. Wolne rodniki za s to atomy, cz steczki (lub ich fragmenty) b d te jony posiadaj ce nie-sparowane elektrony, nadaj ce im w asno ci paramagnetyczne.
Tlen, chocia jest konieczny do ycia, paradoksalnie ma on jednocze-nie dzia ajednocze-nie toksyczne dla organizmów ywych [1, 2]. Przyk adowo, oddy-chanie czystym tlenem przez d u ej ni 48 godzin prowadzi do mierci. Olbrzymia jego wi kszo wykorzystywana jest jako akceptor elektronów w komórkowych procesach energetycznych. Tym niemniej, w trakcie reduk-cji, niewielka cz tlenu przekszta cana jest w reaktywne formy tlenu, do których zalicza si równie rodniki tlenowe. Ocenia si , e do ROS prze-kszta cane jest 1÷4% tlenu zu ywanego przez organizm cz owieka [3]. Przy dziennym jego zu yciu wynosz cym ok. 10 l oznacza to wytworzenie ok. 4,5÷18 mmoli rodników. Jest to ilo znaczna, zw aszcza, je li uwzgl dni si fakt, e wiele uszkodze wolnorodnikowych ma tendencj do gromadzenia si w organizmach ywych. W ywym organizmie wolne rodniki s wytwa-rzane w warunkach zarówno fizjologicznych jak i patologicznych. W warun-kach fizjologicznych nie gromadz si w tkanwarun-kach gdy s stale unie- czynniane, zmiatane przez miejscowe mechanizmy antyoksydacyjne. W patologicznych mog prowadzi do degeneracji i obumierania komórek [1].
Kolejnym paradoksem tlenowym jest fakt, e chocia obecnie po-wszechnie wiadomo, e tlen w nadmiarze jest szkodliwy to jednak e nie ma spójnej teorii t umacz cej, który z rodników jest za t toksyczno odpowie-dzialny [2]. Wspomniany, paradoks tlenowy na tym si nie ko czy. Okaza o si , e niektóre wolne rodniki pe ni istotne funkcje fizjologiczne, np. inhibito-rów niektórych enzymów [4]. Do tego mo na doda dalsze paradoksy. Nie-jasny jest wp yw rodników na przebieg niektórych zmian patologicznych, jak mia d ycy [5] czy choroby Alzheimera [6]. Cz sto wyst puj nawet k opoty z odpowiedzi na pytanie czy rodniki s przyczyn czy skutkiem owych zmian. Jeszcze wi ksze problemy sprawia odpowied na pytanie czy poda-wanie antyoksydantów zapobiega tym zmianom [7, 8]. Wynika z tego, e cho jest to tematyka bardzo szeroko ostatnio dyskutowana to jej podsta-wowe problemy s wci nierozwi zane.
WYTWARZANIE RODNIKÓW
Wyst powanie reaktywnych form tlenu jest charakterystyczne nie tylko dla organizmów ywych. W warstwach przypowierzchniowych naturalnych zbiorników wodnych ich st enie jest znacznie wi ksze ni we wn trzu or-ganizmów ywych, gdzie mog si przedostawa . Najprostszym za rodni-kiem (dok adnie birodnirodni-kiem w stanie trypletowym) jest tlen atmosferyczny którym oddychamy.
Wolne rodniki mog by indukowane in vitro i in vivo przez ró ne czynniki: promieniowanie jonizuj ce, ultrafioletowe, widzialne i podczerwone oraz wszelkie reakcje utleniania i redukcji. Do reakcji tych zaliczy mo na autooksydacj tioli, katecholamin, flawin i hydrochinonów oraz niektóre re-akcje enzymatyczne, np. oksydazy ksantynowej, dysmutazy ponadtlenkowej stymuluj cej mitochondrialny system transportu elektronów, oksydazy cyto-chromowej P-450 i b-5 systemu mikrosomalnego.
Rys. 1. Schemat transportu elektronów, tworzenia ATP oraz utlenianie zredukowanego koenzymu Q wraz z towarzysz c mu redukcj cytochromu b
Rodniki mog równie generowa pobudzone komórki fagocytuj ce (makrofagi, monocyty i granulocyty) podczas tzw. wybuchu oddechowego. W tym przypadku odgrywaj one pozytywn rol . Jednak e d ugotrwa e ich wytwarzanie (np. w przewlek ych stanach zapalnych) ma dzia anie kancero-genne. W b onach komórkowych tworz si one g ównie w wyniku metaboli-zmu kwasu arachidonowego przy udziale cyklooksygenazy i lipooksygenazy. Z czynników zewn trznych wymieni mo na przyk adowo fenacytyn czy te parakwat oraz ca y szereg leków (haloperidol, salsolinol, cytostatyki itp.). Najwa niejszym generatorem wolnych rodników wydaje si by mitochon-drialny a cuch oddechowy (rys. 1). Nale y sobie równie zda spraw z te-go, e w komórkach ywych zwierz t i ro lin wolne rodniki s stale obecne jako konieczny etap przej ciowy przebiegu szeregu reakcji.
TLEN I PRODUKTY JEGO REDUKCJI
Cz steczki o spinach po ówkowych opisuje statystyka Fermiego-Diraca. Zgodnie z funkcj rozk adu prawdopodobie stwo wyst powania elektronu (fermionu) wzrasta ze spadkiem energii nie przekraczaj c 1. To znaczy, e w danym stanie energetycznym okre lonym energi , p dem oraz spinem
mo-e znajdowa si tylko jmo-edmo-en mo-elmo-ektron. Rozk ad mo-elmo-ektronów w cz stmo-eczcmo-e tlmo-enu i produktach jego redukcji przedstawiono na rys. 2. W stanie podstawowym tlen wyst puje jako dwurodnik trypletowy, co t umaczy jego wzgl dnie du reaktywno ale jednocze nie stosunkowo ma , jak na rodnik.
Rys. 2. Rozk ad elektronów na orbitalach tlenu i produktach jego redukcji. - orbital molekularny, * - orbitale antywi ce, - spiny elektronowe
W stanie wzbudzonym tlen wyst puje w postaci singletu. Jego st e-nie w cytoplazmie jest na poziomie 10-15M, podczas gdy tlenu trypletowego 10-5M. Wyró niamy dwa stany singletowe - delta i sigma. Czas ycia tlenu w stanie 1 g+O2 (antyrównoleg e spiny na ró nych orbitalach) w roztworach
wodnych wynosi 10-11 s, za tlenu delta 1 gO2 10 -6
s. W gazach czasy te wynosz odpowiednio 12 s i 45 min.
Pierwszym produktem redukcji tlenu jest anionorodnik ponadtlenkowy (O2
-) i jego zprotonowana forma rodnik nadhydroksylowy (HO2
). W roku 1954 Gershman, Gilbert i Fridovich wysun li hipotez , e za toksyczno tlenu odpowiedzialny jest w a nie anionorodnik ponadtlenkowy. Niestety, okaza o si , e jest on wprawdzie bardzo reaktywny ale jednocze nie krót-ko- yj cy oraz ma o reaktywny w rodowisku aprotycznym i w stosunku do aminokwasów i kwasów t uszczowych. Rodnik nadhydroksylowy jest znacz-nie silznacz-niejszym utleniaczem ni anionorodnik ponadtlenkowy. Sugeruje si nawet [9], e za szkodliwe dzia anie tlenu i uszkadzanie b on komórkowych odpowiedzialny jest uk ad rodników O2
·-/HO2 ·
, a nie rodnik hydroksylowy. HO2
·
charakteryzuje si d ugim czasem ycia przez co mo e dyfundowa on do s siednich struktur komórkowych. Przy pH fizjologicznym 7,4 ok. 1% anionorodnika wyst puje w postaci zhydratowanej (pKa = 4,88). W wyniku
przebiegu reakcji dysmutacji oba te rodniki wytwarzaj nadtlenek wodoru. W obecno ci jonów metali grup przej ciowych ( elaza i miedzi) nad-tlenek wodoru ulega rozpadowi z wytworzeniem reaktywnego rodnika hy-droksylowego, zgodnie z reakcj opisan po raz pierwszy w roku 1884 przez Fentona:
(1)
Fe
2(M
n)
H
2O
2
Fe
3(M
(n1))
OH
-
O
H
.Utleniony metal mo e zosta nast pnie zredukowany, co oznacza, e pe ni on rol katalizatora: anionorodnik ponadtlenkowy O 2 .-jon nadtlenkowy O2 2-singletowy O g O 2 2 1 + singletowy O g O 2 2 1 stan podstawowy O gO (tryplet)2 2 3 tlen atomowy p * 2p p p s s s s g g g e_ e_ e_ e_ 92 kJ 155 kJ H+
(2)
Fe
O
Fe
O
.W sumie obie reakcje przedstawia si jako reakcj Habera-Weissa (1934 r.): (3)
O
H
2O
2
O
2
OH
-
OH
-2 .
Bez katalizatora (jonów metali) reakcja (3) przebiega bardzo wolno. Znacz-nie przy piesza j Znacz-niewielka nawet obecno elaza na plus drugim stopniu utlenienia. elazo trójwarto ciowe równie mo e j katalizowa gdy jest ono atwo redukowalne w organizmie, np. w obecno ci kwasu askorbinowe-go, cysteiny lub glutationu. Przy pieszaj j równie niektóre kompleksy (EDTA, cytrynian). Kompleksy te mog przy piesza jego utlenianie gdy eliminuj konieczno zmiany jego pow oki hydratacyjnej. W wietle powy -szego problematyczne jest podawanie elaza w postaci kompleksu z askor-binianem i EDTA, stosowane przez niektóre firmy farmaceutyczne.
Powsta y w reakcjach (1 - 3) rodnik hydroksylowy jest wyj tkowo reak-tywny. Wchodzi on w reakcje z wieloma zwi zkami organicznymi (addycja, substytucja wolnorodnikowa, przenoszenie elektronów). Rodnik ten jest bar-dzo s abym kwasem, uwalniaj c alkaliczny jon nadtlenkowy O-. Jego sta a dysocjacji porównywalna jest ze sta nadtlenku wodoru i wynosi 11,85. Nie penetruje on jednak komórki. Reaguje tylko z cz steczkami obecnymi w bezpo rednim ich s siedztwie, np. z jonem w glanowym tworz c rodnik w glanowy b d cy silnym reduktorem.
Bardzo intensywnie badanym ostatnio rodnikiem jest tlenek azotu. Jest to zwi zek wyj tkowo ciekawy gdy , z jednej strony, jest on poszukiwa-nym od dawna ródb onkowym czynnikiem rozlu niaj cym (ang. EDRF - en-dothelial derived relaxing factor), neurotransmiterem i zmiataczem wolnych rodników (przez to zwi zkiem antykancerogennym). Z drugiej strony, b d c sam wolnym rodnikiem, jest on równie neurotoksyczny, kancerogenny i mo e wytwarza inne wolne rodniki.
Tlenek azotu jest zmiataczem anionorodnika ponadtlenkowego, a w szczególno ci skutecznym (silniejszym ni witamina E) przeciw utlenia-czem lipidów. Co ciekawe, po przej ciu do nadtlenoazotynu z przeciwutle-niacza staje si on silnym utleniaczem. Nadtlenoazotyn utlenia grupy tiolowe reszt tryptofanowych i metionylowych w bia kach (powoduje to ich fragmen-tacje), indukuje powstawanie grup karbonylowych, nitruje reszty tyrozylowe, utlenia kwasy nukleinowe i lipidy. Te oddzia ywania z biologicznie czynnymi zwi zkami maj aspekt pozytywny, mianowicie antykancerogenny, chocia mechanizm jego dzia ania jest nieznany. Zwi zany jest on m.in. z blokad reduktazy rybonukleinowej, co uniemo liwia wytwarzanie DNA i podzia ko-mórek nowotworowych. Z drugiej strony nitrozuje on aminy drugorz dowe do toksycznych, rakotwórczych N-nitrozoamin. Tlenek azotu oddzia ywuje równie z centrami Fe-S ró nych bia ek tworz c klastery nitrozylowe. Jest on inhibitorem enzymów mitochondrialnych, akonitazy i kompleksu I (NADPH - oksydorektuza ubichinowa).
Rozpuszczalno tlenku azotu w wodzie wynosi 1,8 10-3 M, a st enie w komórce jest rz du 3 10-6 M, okres pó trwania w wodzie od 4 min do 3 godzin, we krwi 0,1 sek., a w tkankach 3 - 30 sek. W komórce wytwarzany jest podczas utleniania (w obecno ci NADPH jako donora elektronów) przez syntaz tlenku azotu (NOS), zale n od cytochromu P-450, argininy do cy-truliny i NO. Jest on nast pnie szybko degradowany z powodu reakcji z tle-nem, dwutlenkiem azotu i anionorodnikiem ponadtlenkowym. Zmiataj c anionorodnik wytwarza anion peroksyazotawy, b d cy silnym utleniaczem i rozpadaj cym si na dwa rodniki, hydroksylowy i dwutlenek azotu. Wytwa-rzaj one z ma szybko ci azotany i azotyny.
Cytotoksyczno tlenku azotu wywo uj anion peroksyazotawy i po-wstaj cy z jego rozpadu rodnik hydroksylowy. Oddzia ywaj one m.in. z lipi-dami, DNA i wp ywaj na mitochondrialne kana y wapniowe (oddzia ywanie na kompleksy elaza w b onie mitochondrialnej). Uszkodzenia DNA aktywuj poli(ADP-rybozo)polimeraz , PARP. Enzym ten odpowiedzialny jest za energetyczn mier komórki poprzez zu ywanie ATP podczas naprawy uszkodzonego DNA. Jego nadprodukcja jest przyczyn mierci neuronów podczas zawa ów naczyniowych, w chorobie Huntingtona i Alzheimera.
NO jest te neurotransmiterem w obwodowym uk adzie nerwowym (sercowo-naczyniowym, p ciowo-moczowym, oddechowym i trawiennym). Przyk adowo, kontroluje on rozkurcz mi ni jelit podczas ruchów perystal-tycznych i rozkurcz mi ni cia jamistych u atwiaj cych nap yw krwi do pr cia podczas erekcji oraz rozkurcz mi ni naczy krwiono nych. To ostatnie po-woduje spadek ci nienia krwi. Dlatego chorym na serce podawana jest nitro-gliceryna, metabolizowana w organizmie do NO. eNOS z komórek ródb onka aktywowany jest przez kompleks Ca2+kalmodulina, tworz cy si po wnikni -ciu jonów wapnia do wn trza komórki. Otwarcie kana ów jonowych nast puje po zwi zaniu przez receptory powierzchniowe np. acetylocholiny. NO dyfun-duje do wn trza naczynia krwiono nego i jako czynnik EDRF do komórek mi ni g adkich. Uaktywnia cyklaz guanylow , cGMP, fosforylacj protein transportuj cych jony wapnia (spadek ich st enia) przez kinaz bia kow , co prowadzi do rozkurczu. Podobny efekt daj S-nitrozole, [Fe(CN)5(NO)]
2-, [Fe4S4(NO)7]
-, organiczne azotyny i azotany-, np. nitrogliceryna.
WP YW WOLNYCH RODNIKÓW NA PODSTAWOWE SK ADNIKI KOMÓREK
Wolne rodniki reaguj w zasadzie ze wszystkimi sk adnikami komórek. Najwi ksze uszkodzenia powoduj w lipidach, bia kach i DNA. Z organelli komórkowych najbardziej nara one na atak wolnych rodników s mitochon-dria. Ich uszkodzenie prowadzi mo e nawet do mierci komórek.
Nale y w tym miejscu zaznaczy , e mimo ich negatywnego wp ywu na organizmy ywe, wolne rodniki s koniecznymi etapami przej ciowymi przebiegu szeregu reakcji biochemicznych, jak te maj szereg dzia a po-zytywnych. Przyk adowo wspomnie tu mo na o tym, e szereg enzymów
reperuj cych DNA (polimerazy) aktywowanych jest wolnymi rodnikami, cz -sto indukowanych wiat em. Rodniki umo liwiaj równie spe nianie funkcji biologicznych cyklazie guanylynowej (receptor NO aktywuj cy cGMP, PKG i fosforyluj cy NOS), oksydazie glukozy, S-transferazie glutationu. Wolne rodniki s równie stosowane w terapii nowotworów tlenek azotu oraz wy-twarzane przez promieniowanie rodniki hydroksylowe. Du e ilo ci wolnych rodników wytwarzaj równie pobudzone komórki fagocytuj ce (granulocyty, monocyty i makrofagi) w trakcie tzw. wybuchu oddechowego.
Wyj tkowo aktywnym organem, zu ywaj cym ponad 20% dostarcza-nego organizmowi tlenu, jest mózg. Jest on równie szczególnie nara ony na uszkodzenia wolnorodnikowe gdy w du ym st eniu wyst puj w nim wielonienasycone kwasy (PUFA) i elazo, a w ma ym - antyutleniacze. Ma on ponadto ma e mo liwo ci wi zania metali i nie posiada mo liwo ci rege-neracji neuronów. Ich nadmierne st enie wp ywa na starzenie si mózgu, jest przejawem choroby Alzheimera i syndromu Downa.
Wolne rodniki odgrywaj te wa n rol w wielu teoriach procesu sta-rzenia. Sam proces starzenia nie jest obecnie dok adnie poznany. Prawdo-podobnie starzenie si zwi zane jest w jaki sposób ze zmianami genetycz-nymi. Nawet nie miertelne organizmy musia y umiera z przyczyn losowych. Dlatego nie przekazywa y one swojemu potomstwu cech umo liwiaj cych zwalczanie chorób starczych. 2 000 lat temu przewidywana d ugo ycia cz owieka wynosi a 19 lat. Oznacza to, e geny które by yby korzystne w wieku 50 lat nie by y wówczas przekazywane. Chocia wi c starzenie nie jest korzystne z punktu widzenia poszczególnej jednostki to nie by o ewolu-cyjnego nacisku je eli tylko nieliczne jednostki do ywa y wieku s dziwego. Jak wiadomo wolne rodniki rodniki oddzia ywaj z DNA. Trudno jest
jednak-e jjednak-ednoznacznijednak-e stwijednak-erdzi ich wp yw na rozwój jednak-ewolucjny. Wraz z rozwo-jem, program genetyczny coraz to bardziej komplikowa si , a przez to by bardziej nara ony na uszkodzenia. Tym mo na wyt umaczy dlaczego zna-ne s nie miertelzna-ne organizmy jednokomórkowe, a nie np. ludzie. W latach pi dziesi tych L. Hayflick i P. Moorhead wysun li koncepcj o ograniczonej liczbie podzia ów komórki diploidalnej i wyst powaniu tzw. limitu Hayflicka. Zauwa ono w tym przypadku cis korelacj mi dzy oczekiwan d ugo ci ycia ró nych organizmów, a ich limitem Hayflicka. T teori jest wyj tkowo trudno po czy z wolno-rodnikow teori starzenia. Ostatnio sugeruje si jednak e, e limit Hayflicka zale y równie od rodowiska w którym przeby-wa komórka. Mog oby to oznacza udzia wolnych rodników w starzeniu, tym bardziej, e zaobserwowano, e komórki pochodz ce od organizmów d
ugo-yj cych s bardziej odporne na ich ataki. Faktycznie uda o si wyd u y d ugo ycia nicieni poprzez zamian jednego z genów zwi kszaj c jego funkcje anty-oksydacyjne.
ZMIATACZE WOLNYCH RODNIKÓW I ANTYUTLENIACZE
Organizmy ywe w trakcie ewolucji wytworzy y szereg mechanizmów zapobiegaj cych lub naprawiaj cych uszkodzenia powsta e wskutek dzia
a-nia wolnych rodników. Dlatego nie gromadz si one w tkankach gdy s stale unieczynniane, zmiatane przez miejscowe mechanizmy antyoksyda-cyjne. Bardzo cz sto stanowi one niedostateczn ochron i co wi cej, ich efektywno maleje z wiekiem. Generalnie mo na je podzieli na systemy naprawcze bia ek, lipidów i DNA oraz antyutleniacze enzymatyczne lub nie-enzymatyczne, jak to zosta o zestawione poni ej.
Rys. 3. Równowaga oksydacyjna 1. Systemy naprawcze
1.1. Naprawa bia ek - proteinazy (odcinaj utlenione bia ka), proteazy (tn produkty aktywno ci proteinaz), peptazy (tn produkty
aktywno-ci proteaz na aminokwasy).
1.2. Naprawa lipidów - fosfolipazy (usuwaj utleniane fragmenty lipidów z b on), acetylotransferazy (wymieniaj kwasy t uszczowe oddzielo-ne od lipidów), peroksydaza glutationowa i transferaza (wspomagaj napraw utlenionych kwasów t uszczowych).
1.3. Naprawa DNA - egzo- i endonukleazy (usuwaj zniszczone frag-menty DNA), glikozylazy i polimerazy (wype niaj ubytki powsta e po dzia aniu nukleaz), ligazy ( cz naprawione fragmenty).
2. Antyutleniacze (zmiatacze wolnych rodników) 2.1. Enzymatyczne
2.1.1. Dysmutaza ponadtlenkowa (SOD) sk ada si ona z dwóch dimerów o M = 32000, ka dy zawiera Cu(II) i Zn(II), przy czym mied znajduje si w centrum katalicznym, a cynk pe ni rol strukturaln . Wyst puje w cytozolu i mitochongriach (magne-zo-zale na). Katalizuje dysmutacj anionorodnika ponadtlenkowego w nadtlenek wodoru, powoduj c obni enie jego st -enia do poziomu poni ej 10-11M. Wstrzykni ta do chorej tkanki z przewlek ym stanem zapalnym powoduje szybkie jej wyleczenie. Daje to lepsze wyniki leczenia reumatyzmu ni dotychczasowa terapia polegaj ca na na wietlaniu, powodu-j ca wzrost st enia rodników i tylko przej ciow ulg . 2.1.2. Katalaza (M = 240 000) - sk ada si z 4 podjednostek, ka da
zawiera grup hemow z wysokospinowym elazem Fe(III). Jest reaktywna w peroksyzomach, obni a st enie nadtlenku wodoru. Os abienie funkcji SOD i katalazy jest przyczyn szybkiego starzenia si . Przy ich prawid owym rozwoju cz o-wiek móg by, prawdopodobnie, y znacznie d u ej.
2.1.3. Peroksydaza glutationowa (M = 90 000) zawiera atom selenu, st d niektórzy mylnie zaliczaj selen do antyutleniaczy. Wyst -puje w mitochondriach i cytozolu, redukuje hydronadtenki orga-niczne i nadtlenek wodoru do wody i tlenu cz steczkowego. 2.1.4. Ceruloplazmina - niebieska miedzioproteina wyst puj ca
w surowicy krwi (M = 132000; 7,8 jonów Cu(II)). Katalizuje ona utlenianie jonów elaza, przez co zapobiega tworzeniu si rodników hydroksylowych, likwiduje anionorodnik ponadtlen-kowy. Mniej reaktywna od SOD, nie wytwarza nadtlenku wo-doru. W przeciwie stwie do SOD jest zewn trzkomórkowa w uk adzie kr enia.
2.2. Nieenzymatyczne
2.2.1. Witamina E i beta-karoten reaguj c z wolnymi rodnikami wy-twarzaj trwa e rodniki oddzia ywuj ce nast pnie z witamin C. Jako rozpuszczalne w t uszczach chroni g ownie b ony plazmatyczne. Usuwaj NO2
.
chroni c p uca przed dymem ty-toniowym.
2.2.2. Witamina C reduktor zaanga owany w reakcje hydroksylacji (tworzenie hydroksyproliny w kolagenie). Chelatuje metale, w tym elazo. Chroni witaminy A i E przed utlenianiem. Re-aguje z wolnymi rodnikami w cytopla mie. Dzia a antyutlenia-j co wspólnie z witamin E.
2.2.3. Kwas moczowy likwiduje rodniki w cytopla mie. Jest on ko cowym produktem metabolizmu puryny u cz owieka i na-czelnych. Jego du e st enie (> 0,5 mM) u naczelnych t uma-czy ich du ywotno .
2.2.4. Chelatory metali (transferyna, laktoferyna, w tym bia kowe: hemoglobina, mioglobina, ferrodyksyna) zapobiegaj katalizowaniu reakcji utleniania przez elazo i mied Zaliczy mo
-na do nich równie poliaminy biogenne (spermi-na) produkty metabolizmu (podobnie do NO) argininy.
2.2.5. Zwi zki zawieraj ce grupy sulfhydrylowe -SH (cysteina, cy-steamina, glutation).
2.2.6. Kwas liponowy (tiooktanowy) lek podawany diabetykom (normalizuje poziom cukru we krwi). Usuwa z organizmu me-tale ci kie (Fe, Cu) i toksyczne (Cd, Pb, Hg). Ostatnio okaza-o si , e regeneruje okaza-on system nerwokaza-owy i w trokaza-ob okaza-oraz spokaza-o- spo-walnia rozwój wirusa HIV, choroby Parkinsona i Alzheimera. Wi e si to z jego silnym dzia aniem antyutleniaj cym (za-równo w wodzie jak i w t uszczach) oraz z ochron przed roz-k adem witamin C i E.
2.2.7. Melatonina hormon wytwarzany w szyszynce. Poniewa za-nika ona z wiekiem st d wysuni to koncepcj , e podawanie melatoniny mo e zapobiec, a nawet odwróci procesy starze-nia. Faktycznie, w roku 1994r. Pierpaoli i Regalson przed u yli maksymaln d ugo ycia myszy (z 23 do 28 miesi cy) po-przez podawanie im melatoniny w po ywieniu lub przeszczep szyszynki. Dzia anie melatoniny nie jest dok adnie poznane. Wiadomo, e jest ona 15 razy silniejszym antyutleniaczem ni witamina E. Jest st enie (10-9 M) jest jednak e za ma e, aby mog a ona skutecznie usuwa wolne rodniki. Problematyczna wydaje si równie mo liwo bezkarnej kuracji hormonal-nej. Wi e si to z wysuni t jeszcze w latach dwudziestych, przez Steinacha, koncepcj , wed ug której g ówn przyczyn starzenia jest niedobór hormonów. Spektakularne wyniki oka-za y si bardzo niekorzystne w d u szym okresie coka-zasu. 2.2.8. Koenzym Q10 (ubichinon) wyst puje w komórkowym uk
a-dzie oddychania, na wewn trznej membranie mitochondriów oraz w cytopla mie w po czeniu z lipoproteinami. Chroni przed utlenianiem lipidów.
2.2.9. Fito-zwi zki zmiatacze rodników pochodzenia ro linnego (polifenole, flawonoidy, antocyjany, proantocyjanidy, pyto-estrogeny).
CA KOWITY POTENCJA ANTYOKSYDACYJNY
W literaturze mo na znale opisy wielu metod oznaczania zarówno poszczególnych wolnych rodników [32-54] jak te antyoksydantów [32, 54-57]. Wolne rodniki wytwarzane s w trakcie przebiegu ca ego a cucha przemian. W rezultacie dochodzi do wytworzenia wielu rodników o ró nej trwa o ci i reaktywno ci. Istnieje, wi c potrzeba oznaczania sumarycznej
ilo-ci wolnych rodników lub stresu oksydacyjnego spowodowanego przez nie [41, 42, 51-53]. Z drugiej strony w trakcie przebiegu zmian patologicznych zmieniaj si st enia ró nych antyoksydantów. Spowodowane jest to
z jednej strony ich zu ywaniem si w czasie reakcji z wolnymi rodnikami, z drugiej za akcj obronn organizmu. Okaza o si , e oznaczanie suma-rycznego st enia wszystkich antyoksydantów cz sto lepiej pozwala oceni poziom mocy antyoksydacyjnej badanego uk adu biologicznego ni ozna-czanie st enia poszczególnych antyoksydantów osobno [58-67]. Obie te wielko ci, tzn. stres oksydacyjny i ca kowity potencja antyoksydacyjny, s ze sob ci le powi zane, a nawet czasami, uto samiane [67]. M.in. zmiana st enia antyoksydantów w surowicy krwi pozwala bada wp yw wolnych rodników na przebieg szeregu stanów patologicznych [68-70]. Okaza o si , e wspó dzia anie mi dzy ró nymi antyoksydantami daje wi ksz protekcj ni zwi zki te osobno. Przyk adowo, wymieni tu mo na synergizm glutatio-nu regeneruj cego askorbinian [71], czy askorbiniaglutatio-nu regenerujacego
-tokoferol [27, 72]. Te zdolno ci zmiatania rodników w literaturze definio-wane i nazydefinio-wane s bardzo ró norodnie (ang. TAC total antioxidant
capa-city, FRAP ferric reducing ability of plasma, TRAP total peroxyl radical trapping antioxidant parameter, TRAP total redox antioxidant potential,
ORAC oxygen radical absorbance capacity, TEAC Trolox-equivalent
an-tioxidant capacity czy TAR total anan-tioxidant reactivity) [59, 64, 73]. W
opra-cowaniu stosujemy skrót CPA pochodz cy od terminu - ca kowity potencja
antyoksydacyjny.
Za przybli on miar stresu oksydacyjnego jest st enie najbardziej reaktywnych rodników - hydroksylowych. Poniewa s one wyj tkowo nie-trwa e dlatego do ich oznaczania stosuje si metod pu apki spinowej. Me-toda ta polega na wprowadzeniu do materia u biologicznego wzgl dnie nie-toksycznych zwi zków aromatycznych i oznaczaniu produktów ich reakcji (substytucja wolnorodnikowa lub nukleofilowa) z rodnikiem hydroksylowym. Jako pu apk spinow wykorzystuje si naturalnie wyst puj c fenyloalani-n , kwas tereftalowy [74] lub egzogefenyloalani-nfenyloalani-ne pochodfenyloalani-ne aspiryfenyloalani-ny. Produkty ich reakcji z rodnikiem hydroksylowym oznaczane s chromatograficznie.
Chromatografia mo e by równie zastosowana do pomiaru CPA. Wówczas uk ad pomiarowy zawiera badany zwi zek lub próbk biologiczn oraz b d cy pu apk spinow detektor (np. kwas p-hydroksybenzoesowy) [75]. Rodniki hydroksylowe wygenerowane zostaj w reakcji analogicznej do Fentona, w uk adzie elazo (II), nadtlenek wodoru i ADP [76, 77]. Rodniki te s zmiatane zarówno przez detektor jak i badan próbk . Je li próbka cha-rakteryzuje si wi ksz reaktywno ci z rodnikami wówczas spowoduje to zmniejszenie wysoko ci piku chromatograficznego produktu reakcji detekto-ra z rodnikiem. Umo liwia to porównanie mocy zmiatania rodników hydrok-sylowych przez ró ne próbki.
Rodniki s wytwarzane m.in. pod wp ywem dzia ania promieniowania elektromagnetycznego na niektóre zwi zki. Podczas reakcji odwrotnej, np. rekombinacji rodników lipidowych dochodzi do wydzielenia kwantu promie-niowania elektromagnetycznego (chemiluminescencji). Dzi ki temu metod chemiluminescencji mo na bada niestabilne rodniki lipidowe, niemo liwe do bezpo redniej ich analizy, nawet w ywym materiale biologicznym [78]. Inna metoda polega na dodaniu do badanego uk adu zwi zku tworz cego
trwa y rodnik, mo liwy do oznaczenia fotometrycznego [62, 64] lub za pomo-c elektronowego rezonansu paramagnetypomo-cznego [79, 80]. Olbrzymia wi k-szo rodników maj cych istotne znaczenie biologiczne jest utleniaczami. Dlatego te sumaryczne st enie rodników niskocz steczkowych mo na oznacza metodami elektrochemicznymi [81, 82].
Oddzieln grup technik oznaczania stresu oksydacyjnego jest anali-za niektórych zwi zków naturalnie wyst puj cych w uk adach biologicznych. Zaliczy do tego mo na oznaczanie sumarycznego st enia tioli [99, 100], stosunku st e glutationu do jego utlenionej postaci [101, 102] czy kwasu askorbinowego do dehydroaskorbinowego [103]. Wolne rodniki reaguj praktycznie z wszystkimi zwi zkami biologicznie aktywnymi. Najbardziej istotne s ich oddzia ywania z DNA, bia kami i lipidami. Produkty tych reakcji s u do wyznaczenia stopnia uszkodzenia tych zwi zków [104]. Uszkodze-nie wolnorodnikowe bia ek mierzone jest stopUszkodze-niem przereagowania tyrozyny w bityrozyn lub st eniem grup karbonylowych [105]. Znanych jest ponad 20 wolnorodnikowych uszkodze zasad purynowych i pirymidynowych. W ród istotnych wska ników uszkodzenia kwasów nukleinowych wyró ni nale y 8-okyguanin i 8-oksyadenin i 8-hydroksy-2-deoksyguanozyn [106]. Inne podej cie polega na okre leniu aktywno ci enzymu reperuj cego nici DNA, Poli-ADP-rybozy [107]. Najwi cej prac po wi conych jest jednak okre leniu stopnia peroksydacji lipidów [60, 108]. W tym przypadku oznacza si dialdehyd malonowy (MDA) [108, 109], 4-hydroksy-2-nonenal [110], oksysterole [111], hydroksynadtlenki [112] czy te sprz one dieny [113]. Ostatnio stwierdzono, e izomery prostaglandyny F2 s równie wska
nika-mi generacji wolnych rodników i peroksydacji lipidów. F2-izoprostany
(w szczególno ci 8-epiPGF2 ) powstaj przede wszystkim w procesie
perok-sydacji kwasu arachidonowego i eikozanoidów (prostoglandyny, leukotrieny i tromboksany) [114-117].
Jednym z pierwszych oznacze aktywno ci antyoksydacyjnej by a wprowadzona w Instytucie Fizyki Chemicznej by ego ZSRR w Moskwie me-toda polegaj ca na ocenie wp ywu ekstraktów tkanek otrzymanych w wyniku dzia ania rozpuszczalników organicznych na utlenianie nienasyconego kwa-su t uszczowego w standardowych warunkach (przedmuchiwanie tlenem, sta a temperatura 37C). Je li w ekstrakcie znajdowa y si antyoksydanty, utlenianie kwasu t uszczowego (monitorowane przez jodometryczny pomiar zawarto ci nadtlenków) rozpoczyna o si z opó nieniem, po czasie indukcji, który by zale ny od sumarycznego st enia antyoksydantów. Metoda ta po-zwala a na oznaczenie zawarto ci antyoksydantów hydrofobowych i zdol-nych do oddzia ywania z hydrofobowym kwasem t uszczowym. Wraz z roz-wojem nauki powsta y coraz to nowocze niejsze i bardziej czu e metody oznaczania CPA. Wi kszo tych metod opiera si na tej samej zasadzie. Utleniacz inicjuje reakcj której przebieg mo na atwo ledzi , np. fotome-trycznie. Obecno antyoksydantów w próbce spowalnia reakcj utleniania, a mierzony parametr (np. czas indukcji) charakteryzuj cy to spowolnienie jest miar zawarto ci antyoksydantów w próbce [118].
Jednym z najpowszechniejszych oznacze jest TAS (Total Antioxidant
Status), zaproponowane przez RiceEvans [118]. Opiera si ono na nast
-puj cej zasadzie. W rodowisku reakcji znajduje si 2,2-azynobis- -(3-etylobenzotiazolino-6-sulfonian) (ABTS), nadtlenek wodoru i peroksyda-za lub mioglobina dzia aj ca jako pseudoenzym. Peroksydaperoksyda-za katalizuje reakcje jednoelektronowego utleniania ABST przez nadtlenek wodoru. W wyniku reakcji powstaje kationorodnik ABTS.+ charakteryzuj cy si zielo-noniebiesk barw . Im wi cej antyoksydantów znajduje si w rodowisku reakcji tym wolniej powstaje zielone zabarwienie i tym jest ono s absze. Za-hamowanie zielenienia próbki mierzonego spektrofotometrycznie po okre-lonym czasie inkubacjijest miar zawarto ci przeciwutleniaczy w próbce. Metoda ta ma wiele wad, jednak jej ogromn zalet jest wykonanie ozna-cze w ci le okre lonych warunkach, gdy zestaw odczynników do prze-prowadzenia testu jest powszechnie dost pny [118].
Rys. 4. Schemat pomiaru ca kowitego potencja u antyoksydacyjnego metod fotometryczn . 1 hipotetyczna zmiana sygna u przy braku próbki w mieszaninie reakcyjnej, 2 przebieg rzeczywistej zmiany sygna u w obecno ci próbki charakteryzuj cej si du o wi ksz sta szybko ci reakcji z rodnikiem ni detektor i 3 sta szybko ci reakcji porównywaln z nim
Pomiar CPA jest szczególnie cz sto stosowany do bada skompliko-wanych próbek biologicznych, g ównie surowicy lub osocza krwi [59-67]. Oparty on jest na fotometrycznym pomiarze wytworzonych trwa ych rodni-ków [62, 99] lub redukcji elaza przez sk adniki surowicy [60]. Najcz ciej jednak wykorzystuje si metod opart o generacj rodników wskutek ter-micznego rozpadu zwi zków dwuazowych, najcz ciej AAPH (2,2-diazobis-(2-amidinopropano)-dihydrochlorek). Pocz tkowo AAPH rozpada si samo-rzutnie na dwa rodniki alkilowe, które nast pnie reaguj c z tlenem wytwarza-j rodniki ponadtlenkowe. Powsta e rodniki monitoruwytwarza-je si za pomoc tzw. detektora, tzn. zwi zku, który po przereagowaniu z rodnikami zmienia sygna luminescencyjny [63], fluorometryczny [59, 119] lub fotometryczny [61, 65]. Miar potencja u antyoksydacyjnego jest czas opó nienia krzywej obrazuj
-cej zmiany st enia detektora lub produktu jego reakcji w czasie (rys. 4). To przesuni cie spowodowane jest tym, e antyoksydanty zawarte w próbce nie dopuszczaj do reakcji rodnika z detektorem. St d podstawowym wy-mogiem tej metody jest, aby reakcja próbki z rodnikiem by a znacznie szyb-sza od analogicznej reakcji detektora.
Du a ilo metod pomiaru CPA powoduje, e ten sam materia mie-rzony za pomoc ró nych metod mo e dawa odmienne wyniki. W celu ujednolicenia wyników w wi kszo ci przypadków stosuje si przeliczanie ich na jeden ze standardów, przewa nie st enie Troloksu, syntetycznego, roz-puszczalnego w wodzie analogu witaminy E.
CHROMATOGRAFICZNY POMIAR STRESU OKSYDACYJNEGO
CPA jest odwrotnie skorelowany z inn sumaryczn wielko ci , mia-nowicie ze stresem oksydacyjnym. Po redni grup technik oznaczania stresu oksydacyjnego jest analiza niektórych zwi zków naturalnie wyst pu-j cych w uk adach biologicznych. Zaliczy do tego mo na oznaczanie suma-rycznego st enia tioli, stosunku st e glutationu do jego utlenionej postaci czy kwasu askorbinowego do dehydroaskorbinowego. Wolne rodniki reaguj z praktycznie wszystkimi zwi zkami biologicznie aktywnymi (najbardziej istotne s ich oddzia ywania z DNA, bia kami i lipidami). Produkty tych reak-cji s u do wyznaczenia stopnia uszkodzenia tych zwi zków. Poniewa s one nietrwa e ich bezpo rednie oznaczanie w próbkach materia u biologicz-nego (np. w osoczu, czy w homogenatach tkankowych) nie jest zazwyczaj mo liwe, dlatego te po redni metod oznaczania stresu oksydacyjnego jest analiza produktów tych reakcji. Uszkodzenie wolnorodnikowe bia ek mierzone jest stopniem przereagowania tyrozyny w bityrozyn lub st eniem grup karbonylowych. Znanych jest ponad 20 wolnorodnikowych uszkodze zasad purynowych i pirymidynowych. W ród istotnych wska ników uszko-dzenia kwasów nukleinowych wyró ni nale y 8-okyguanin i 8-oksyadenin i 8-hydroksy-2-deoksyguanozyn . Inne podej cie polega na okre leniu ak-tywno ci enzymu reperuj cego nici DNA, poli-ADP-rybozy. Wydaje si , e w chwili obecnej najwi ksze zainteresowanie wzbudza okre lenie stopnia peroksydacji lipidów. Oznaczanymi produktami ich peroksydacji jest dialde-hyd malonowy (MDA) [7], 4-dialde-hydroksy-2-nonenal (HNO), oksysterole (7 -, 7 -, 24, 25- i 27-hydroksycholesterol oraz epoksycholesterol [8a]), hydrok-synadtlenki, sprz one dieny czy te ostatnio intensywnie badane izomery prostaglandyny F2. F2-izoprostany (w szczególno ci 8-epiPGF2 ) powstaj
przede wszystkim w procesie peroksydacji kwasu arachidonowego i eikoza-noidów (prostoglandyny, leukotrieny i tromboksany).
Produktami peroksydacji, g ównie wielonienasyconych kwasów t usz-czowych (PUFA), s aldehydy, hydroksynadtlenki i ketony, a ich produktem ko cowym jest dialdehyd malonowy (MDA). Pomiar jego st enia jest po-wszechnie uznawany za miar wolnorodnikowego uszkodzenia lipidów [7]. Najcz ciej stosuje si do tego, ze wzgl du na prostot obs ugi i wysok
czu o , test kwasu tiobarbiturowego, TBA [7]. Niestety test TBA jest wysoce niespecyficzny i trudny do zastosowania w próbkach biologicznych. Dodatni wynik otrzymuje si tak e z cukrami, niektórymi aminokwasami, kwasami ó ciowymi, alkenami, alkadienami, itp. Pewne udoskonalenie uzyskano sto-suj c chromatografi w uk adzie faz odwróconych z detekcj fluorometrycz-n [10, 11] lub fotometryczfluorometrycz-n przy d ugo ci fali 535 fluorometrycz-nm [13-16]. W tym przy-padku derywatyzacja (kwasem tiobarbiturowym) wp ywa zarówno na rozdzia , jak i na detekcj . Ci gle jednak etap derywatyzacji zwi zany z opi-san niejednoznaczno ci , jest wymagany. Metod t próbowano zmodyfi-kowa stosuj c derywatyzacj 2,4-dinitrofenylohydrazyn [17-19] lub diami-nonaftalenem [20] z detekcj fotometryczn przy 310 nm. Etap derywatyzacji usuni to stosuj c tzw. chromatografi par jonowych [21, 22] (dialdehyd jest kwasem i dlatego jest on s abo zatrzymywany na fazie RP-18). Detekcja fotometryczna przy 267 nm pozwala na jednoczesn ana-liz MDA z dwoma powszechnie wyst puj cymi w surowicy krwi antyoksy-dantami, tzn. kwasem askorbinowym i moczowym. Na rysunku 5 przedsta-wiono analogiczny chromatogram uzyskany metod chromatografii wykluczania jonowego (jest to technika predysponowana do rozdzia u s a-bych kwasów), takich jak MDA (pKa ~4.5) [23]. Porównany on zosta
z chromatogramem uzyskanym po derywatyzacji MDA.
Rys. 5. Chromatogram jonowo-wykluczaj cy 100 M kwasu (AA) askorbinowego, (UA) moczowego, (MDA) dialdehydumalonylowego i - 25 M MDA.TBA (dolny wykres).
Warunki: kolumna 300x7.8 mm I.D. TSK-GEL SCH(H+) (TosoHaas); faza ruchoma: (A) - 3 mM H2SO4, 3 mM TBABr, 5% ACN, temp. 40C; (B) 1 mM H2SO4, 15% ACN,
temp. 20C; detektor UV-267/535 nm
267nm 535nm AA UA MDA A B 20 min
Rodniki hydroksylowe s wyj tkowo reaktywne. Dlatego te s sto-sunkowo cz sto oznaczane i po rednio wiadcz o ca kowitym stresie oksy-dacyjnym. Poniewa s one wyj tkowo nietrwa e, do ich oznaczania stosuje si metod pu apki spinowej. Polega ona na wprowadzeniu do materia u bio-logicznego wzgl dnie nietoksycznych zwi zków aromatycznych i oznaczaniu produktów ich reakcji (substytucja wolnorodnikowa lub nukleofilowa) z rodni-kiem hydroksylowym. Jako pu apk spinow wykorzystuje si naturalnie wy-st puj c fenyloalanin , kwas tereftalowy lub egzogenne pochodne aspiry-ny. W przypadku fenyloalaniny (D-izomer) jej produktami reakcji z rodnikami hydroksylowymi s tyrozyny [24]. Produkty ich reakcji z rodnikiem hydroksy-lowym oznaczane s chromatograficznie.
Aspiryna (kwas o-acetylosalicylowy) jest lekiem powszechnie stoso-wanym m.in. przy leczeniu stanów zapalnych i z ogów naczy krwiono nych. W organizmach jest ona bardzo szybko hydrolizowana do kwasu salicylo-wego (rys. 9). Kwas ten w warunkach fizjologicznego pH = 7,4 reaguje z rodnikami hydroksylowymi daj c trzy produkty reakcji: kwasy 2,3- (49%) i 2,5-dihydroksybenzoesowe (40%) (DHBA) oraz o-katechol (11%). Pu ap-kowanie rodników hydroksylowych kwasem salicylowym zosta o wielokrotnie opisane w literaturze [24]. Kwas ten (ok. 5 mM) wprowadzany jest dootrzew-nowo lub stereotaktycznie dokomorowo do komory mózgowej. St enie 2,5-DHBA mo e by powi zane ze st eniem cytochromu P-450. Zmiany st enia 2,3-DHBA s za bezpo rednio powi zane ze zmianami st enia rodników hydroksylowych. Kwasy te oznaczane s zwykle chromatograficz-nie w uk adzie faz odwróconych [25], jak przedstawiono to na rys. 6.
Rys. 6. HPLC chromatogram 1 mM standardów kwasów (1) - 2,5-,
(2) - 2,3-dihydroksybenzoesowych oraz (3) - kwasu salicylowego. Warunki chromatograficzne: kolumna - 250x4 mm r. wew. Zorbax ODS 5 m (Knauer); faza ruchoma - bufor
octanowo-cytrynianowy pH = 4,3, 1 mM KCl, 0,25 mM EDTA, 5% MeOH, 3 mM TBAP; temp. - 20ºC; szybko przep ywu - 0,9 ml/min; detektor - UV-205 nm
Pu apka salicylanowa posiada szereg wad [26]:
a) problematyczne jest oznaczanie kwasu 2,5-dihydroksybenzoesowe- go gdy mo e on wyst powa endogennie, np. wskutek dzia ania cytochromu P-450,
b) czu o uk adu jest zmniejszona na skutek tworzenia si dwóch pro-duktów reakcji,
c) pochodne aspiryny mog wyst powa w po ywieniu, a jej nieuza-sadnione podawanie wp ywa na stany zapalne.
Aby unikn tych trudno ci SteMarie i wsp. zaproponowali zast pienie sali-cylanów kwasem p-hydroksybenzoesowym [26]. Chocia kwasy te oznacza mo na fotometrycznie to zwykle stosuje si znacznie bardziej czu (1 pg dla DHBA, 100 pg dla kwasu salicylowego) detekcj elektrochemiczn (elektro-da pracuj ca: w giel szklisty; 0,8 V vs Ag/AgCl) [25].
Rys. 7. Chromatogram jonowo-wykluczaj cy kwasów 3,4-dihydroksybenzoesowego oraz kwasu p-hydroksybenzoesowego. Warunki chromatograficzne: kolumna - 300x7,8 mm r. wew. TSK-GEL SCX(H+) (TosoHaas); faza ruchoma - 1 mM H2SO4, 1 mM KCl, 0,25 mM EDTA,
13% ACN; detektor elektrochemiczny
Rys. 8. Hydrodynamiczne woltamogramy 1 mM kwasów 3,4-dihydroksybenzoesowego i p-hydrosybenzoesowego. Warunki chromatograficzne jak na rysunku powy ej
Rys. 9. Metabolity i produkty reakcji ataku rodnika hydroksylowego na kwas salicylowy
CHROMATOGRAFICZNY POMIAR CA KOWITEGO POTENCJA U ANTYOKSYDACYJNEGO OH COOH OH OH COOH OH
Rys. 10. Reakcja pu apkowania rodnika hydroksylowego kwasem p-hydroksybenzoesowym, w wyniku której powstaje kwas 3,4-dihydroksybenzoesowy
Poniewa rodnik hydroksylowy jest najbardziej reaktywny z ca ej ka-skady rodników jego oznaczanie pozwala uzyska informacje o ca kowitym stresie oksydacyjnym. Rodniki hydroksylowe s wyj tkowo nietrwa e dlatego do ich oznaczania stosuje si metod pu apki spinowej. Polega ona na wprowadzeniu do materia u biologicznego wzgl dnie nietoksycznych zwi
z-OH HO CO2 COOH OH 2,5-DHBA OH OH CO2 COOH OH kwas salicylowy OH OH COOH OH OH 2,3-DHBA 3 OCOCH COOH 3 OCOCH aspiryna hydroliza CONHCH CO H2 2 OH kwas salicylurowy COOH OC H O6 9 6 salicylofenyloglukoronid OH COC H O6 9 6 salicyloacyloglukoronid
ków aromatycznych i oznaczaniu produktów ich reakcji (substytucja wolno-rodnikowa lub nukleofilowa) z rodnikiem hydroksylowym. Jako pu apk spi-now wykorzystuje si m.in. naturalnie wyst puj c fenyloalanin , kwas te-reftalowy, egzogenne pochodne aspiryny oraz, przedstawiony na rys. 10, kwas p-hydroksybenzoesowy (p-HBA) [25]. Kwasy hydroksybenzoesowe mog by oznaczane metod wysokosprawnej chromatografii cieczowej w uk adzie faz odwróconych z detekcja elektrochemiczn (w giel szklisty; 0,8 V vs Ag/AgCl).
W tym miejscu warto zauwa y , e salicylany, czy szerzej hydroksy-benzoesany, (np.: aspiryna - kwas o-acetylosalicylowy) wyst puj w wielu ro linach. Wykorzystanie, z powodzeniem, tej grupy zwi zków jako pu apki rodnika hydroksylowego udowadnia, e oprócz w asno ci przeciwzapalnych zwi zki te w organizmie mog pe ni równie rol antyoksydantów.
Rys. 11. Porównanie potencja antyoksydacyjny metanolu, etanolu i dimetyosulfotlenku. Rodniki hydroksylowe zosta y wygenerowane w uk adzie (ADP/Fe(II)/H2O2,) i pu apkowane kwasem p-hydroksybenzoesowym w obecno ci badanych rozpuszczalników o st eniu 0.1%. Produkt reakcji (kwas 3,4-dihydroksybenzoesowy) by oznaczany z zastosowaniem chromatografii wykluczania jonowego. Próbka kontrolna nie zawiera a antyoksydantów, dlatego wysoko
jej piku chromatograficznego przyj to za 100%
Rys. 12. Prównanie potencja u antyoksydacyjny poliamin biogennych (AGM agmatyny, PUT putrescyny, SPD spermidyny i SPE sperminy). Warunki jak na rys. 11
W statycznej, chromatograficznej metodzie pomiaru ca kowitego po-tencja u antyoksydacyjnego uk ad pomiarowy zawiera badany zwi zek lub próbk biologiczn oraz b d cy pu apk spinow detektor (np. kwas
p-hydroksybenzoesowy) [28]. Rodniki hydroksylowe wygenerowane zostaj
w reakcji analogicznej do Fentona, w uk adzie elazo (II), nadtlenek wodoru i ADP [29]. Rodniki te s zmiatane zarówno przez detektor jak i badan próbk . Je li próbka charakteryzuje si wi ksz reaktywno ci z rodnikami wówczas spowoduje to zmniejszenie wysoko ci piku chromatograficznego produktu reakcji detektora z rodnikiem. Umo liwia to porównanie mocy zmia-tania rodników hydroksylowych przez ró ne próbki. Okaza o si , e tak wy-znaczony potencja antyoksydacyjny skorelowany jest ze sta ymi szybko ci reakcji rodnika hydroksylowego z badanymi zwi zkami.
Na rys. 11 pokazano wysoko ci pików chromatograficznych uzyska-nych w obecno ci niektórych rozpuszczalników organiczuzyska-nych (metanolu, etanolu i dimetylosulfotlenku DMSO) w odniesieniu do próbki kontrolnej (wytworzony rodnik+detektor) [28]. Zmniejszenie wysoko ci pików wskazuje na to, e rozpuszczalniki te zmiataj rodniki hydroksylowe. Mo e to t uma-czy protekcyjne w asno ci DMSO obserwowane w czasie stresu oksyda-cyjnego mózgu [30, 31]. Obserwowane zmniejszenie wysoko ci pików chromatograficznych dihydroksybenzoesanów jest proporcjonalne do st enia próbki, ale tak e i jej w asno ci. Ta ostatenia jest prawdopodobnie zale -na od warto ci sta ej szybko ci reakcji próbki z rodnikiem hydroksylowym. Sta e szybko ci wynosz 8.3 x 108, 2.2 x 109 i 7.0 x 109 mol L-1s-1 odpowied-nio dla metanolu, etanolu i DMSO.
Podobne zale no ci uzyskane dla poliamin biogennych, putrescyny, spermidyny, sperminy i agmatyny przedstawiono na rys. 12 [11]. Zwi zki te pe ni istotn rol we wszystkich ywych organizmach, m.in. we wzro cie i replikacji komórek. Poza tym pe ni rol antagonistów niektórych kationów (takich jak K+, Mg2+ czy Ca2+) i antyoksydantów [12]. Jako substancje sma-kowe i zapachowe wyst puj m.in. w winie, herbacie, grzybach, jab kach itd. Pe ni one rol te antygenów w komórkach niektórych bakterii, nowotwo-rów, paso ytów i grzybów chorobotwórczych. Dlatego sugeruje si , e picie herbaty ma dzia anie antykancerogenne gdy pobudza to aktywno komó-rek uk adu odporno ciowego i wzrost produkcji np. interferonu gamma. Zmiany ich st enia obserwowano w czasie ischemii i reperfuzji. Kontrower-sje wzbudza w dalszym ci gu czy ich wytwarzanie ma w tym przypadku dzia anie neurotoksyczne czy neuroprotekcyjne [13]. Z przedstawionego ry-sunku wynika, e poliaminy s zmiataczami wolnych rodników. Podobnie do opisanych wcze niej rozpuszczalników organicznych ich potencja antyok-sydacyjny proporcjonalny jest do sta ych szybko ci ich reakcji z rodnikiem hydroksylowym (wynosz one odpowiednio 1.1 x 108, 1.2 x 108 i 1.3 x 108 mol L-1s-1). Mechanizm zmiatania rodników w tym przypadku oparty jest g ównie na kompleksowaniu jonów elaza, co zapobiega przebiegowi reakcji Fentona, a nie na konkurencyjnej reakcji z jonami hydroksylowymi.
Ostatnio du ym zainteresowaniem ciesz si naturalne antyoksydanty do których zalicza si wyst puj ce w ro linach barwniki flawonoidy w tym
antocyjany. Do tych ostatnich nale y m.in. barwnik C3G (3-O- -D glukozyd cyjnidyny) oraz jego aglikol cyjanidyna. S to zwi zki powszechnie wyst -puj ce w warzywach i owocach. Du e ilo ci antocyjanów zawieraj owoce o niebieskim b d fioletowym zabarwieniu. Wyizolowano je m.in. z czerwo-nej i czarczerwo-nej fasoli. Uwa ane s one za potencjalne wymiatacze wolnych rodników tlenowych in vivo [14]. W szczególno ci du o antocyjanów zawar-tych jest w aronii czarnej (Aronia melanocarpa) [14-16]. W literaturze mo na znale liczne opisy ich neuro- i cytoprotekcyjnego dzia ania, m.in. w choro-bie Alzheimera, udarze mózgu, zawale serca itp. [14]. Ekstrakt z owoców aronii jak i zawarte w niej antocyjany charakteryzuj si silnymi w asno cia-mi antyoksydacyjnycia-mi. Okaza o si jednak e, e nie zcia-mienia on potencja u antyoksydacyjnego osocza krwi, co oznacza, e zwi zki te nie s wch ania-ne z przewodu pokarmowego. Wyja nieniem tego paradoksu mo e okaza si sugestia Tsudy i wsp., e cyjanidyna zawarta w aronii ulega w organi-zmach ywych alglikolizacji, a nast pnie jest metabolizowana do kwasu 3,4-dihydroksybenzoesowego (3,4-DHBA) (rys. 13), jak wynika z bada sil-nego zmiatacza rodników peroksylowych.
Rys. 13. Przypuszczalny schemat metabolizmu cyjanidyny
Wed ug tradycji w roku 2737 p.n.e. cesarzowi Chen Nung wpad do wody listek herbaty. Odt d datuj si pocz tki znajomo ci zdrowotnego dzia ania ró nych herbat, które oko o XVI wieku przyby y do Europy.
Spo-ród przebadanych i przedstawionych na rys. 14 [120] fotometrycznych war-to ci CPA wynika, e najsilniej wolne rodniki s zmiatane przez ekstrakt z herbaty zielonej. Na uwag zas uguje te fakt zupe nego braku zmiatania wolnych rodników przez napój herbaciany Green Tea & Lychee. Sugeruje si , e tymi aktywnymi antyoksydantami wyst puj cymi w herbacie s zwi zki z grupy flawonoidów. Podobne wyniki uzyskane zosta y z zastoso-waniem metody analogicznej do opisanej powy ej chromatograficznej (rys. 15). Ró nica polega a na detekcji z zastosowaniem spektroskopii
ma-OH HO H OH O+ O O HO HO OH
sowej. Warto zwróci w tym przypadku uwag na silne w asno ci zmiataj ce melatoniny, zupe nie nieaktywnej w stosunku do rodników peroksylowych.
Rys. 14. Ca kowity potencja antyoksydacyjny, odniesiony do rodników peroksylowych, niektórych ekstraktów zio owych o st eniu pocz tkowym 1 mg/ml: ekstraktu z herbaty zielonej,
aronii, pycnogenol, ekstraktu z herbaty czerwonej, imbiru oraz napoju herbacianego Green Tea & Lychee
Rys. 15. Ca kowity potencja antyoksydacyjny ekstraktów zio owych, melatoniny oraz -amyloidu. Rodnik generowany hydroksylowy, metoda pomiaru MS
LITERATURA
1. B.K. G ód, G.A. Czapski, P.R. Haddad, TRAC, Trends Anal. Chem., 19(2000)492.
2. R.A. Floyd, FASEB J., 4(1990)2587.
3. A. Boveris, N. Oshinao, B. Chance, Biochem. J., 128(1972)617. 4. W. Droge, Physiol. Rev., 82(2002)47.
5. T. Kulawik, R. Gil, P. Grieb, B.K. G ód, Probl. Lekar., 41(2002)393. 6. G. Benzi, A. Noretti, Neurobiol. Aging, 16(1995)661.
7. B.K. G ód, J.C. Kowalski, J. Liquid Chromatogr. & Rel. Technol., 27(2004)2733-2742.
8. B. Halliwell, Free Radic. Res, 25(1996)439.
8a. S. Dzeletovic, O. Breuer, E. Lund, U. Diczfalusy, Anal. Biochem., 225(1995)73-80.
9. I. Fridovich, Arch. Biochem. Biophys., 247(1986)1.
10. R.M.J. Palmer, D.S. Ashton, S. Moncada, Nature, 333(1988)664. 11. B.K. G ód, P. Grieb, Chem. Anal. (Warsaw), 47(2002)399.
12. H.C. Ha, J.D. Yager, P.A. Woster, R.A Casero, Biochem. Biophys. Res.
Commun., 244(1998)298.
13. E. Lövaas, Medical Hyphoteses, 45(1995)59.
14. T. Tsuda, F. Horio, T. Osawa, BioFactors, 13(2000)133.
15. R. Salvayre, P. Braquet, T.H. Perruchot, L. Douste-Blazy, Proc.
Inter-nat. Bioflavan. Symp., Munch 1981, str. 437-442.
16. Y.L. Hong, S.L. Yeh, C.Y. Chang, M.L. Hu, Clin. Biochem., 33(2000)619-625.
17. J. Pilz, I. Meineke, C.H. Gleiter, J. Chromatogr. B, 742(200)315-325. 18. R. Bakalova, M. Mileva, C. Kotsev, V. Bardarov, S. Ribarov, Method
Find. Exp. Clin., 22(2001)267-269.
19. F. Fenaille, P. Mottier, R.J. Turesky, S. Ali, P.A. Guy, J. Chromatogr. A, 921(2001)237-245.
20. P.J. Steghens, A.L. van Kappel, I. Denis, C. Collombel, Free Radic.
Biol. Med., 31(2001)242-249.
21. A.H. Waterfall, G. Singh, J.R. Fry, C.A. Marsden, Neurosci. Lett., 200(1995)69-72.
22. A.W. Bull, L.J. Marnet, Analyt. Biochem., 149(1985)284-290. 23. B.K. G ód, Neurochem. Res., 22(1997)1237-1248.
24. T. Obata, H. Hosokawa, Y. Yamanaka, Comp. Biochem. Physiol., 106(1997)629-634.
25. B.K. G ód, G.A. Czapski, Zastosowanie HPLC do Badania Reakcji
Wol-norodnikowych w Uk adach Biologicznych [w] Chromatographic Met-hods in the Analysis of Food and Ecotoxicology, Wyd. UMCS, Lublin
1999, 11-15.
26. Ste-Marie L., Boismenu D., Vachon L. and Montgomery J., Anal.
Bio-chem., 241(1996)67.
27. A.P. Diplock, Med. Biol., 62(1984)78-80.
28. B.K. G ód, R. Greib, Chem. Anal., 47(2002)399-407.
29. R.A. Floyd, J.J. Watson, P.K. Wong, J. Biochem. Biophys. Methods, 10(1984)221.
30. J.W. Phillis, A.Y. Estevez, M.H. O'Regan, Neurosci. Lett., 244(1998)109-111.
31. A. Bishayee, H.Z. Hill, D. Stein, D.V. Rao, R.W. Howell, Radiation Res., 155(2001)335-344.
32. B. Kami ska, M. Sta czyk, Post. Biol. Kom., 25 sup.11(1998)15. 33. A. Friedman, Acta. Neurol. Scand., 89(1994)258.
35. W. Pakszys, B.K. G ód, P.P. Liberski, A. Klimek, red., Post py w
rozpo-znawaniu i monitorowanym klinimetrycznie leczeniu choroby Parkinso-na i parkinsonizmu, Medical Communications, Warszawa 2004.
36. A. Szczudlik, Choroba Parkinsona, XVI Zimowa Szko a Instytutu Far-makologii PAN, Mogilany 1999.
37. H. Ehringer, O. Hornykiewicz, Klin. Wochenschr., 38(1960)1236. 38. E.S. Tolosa, Clin. Neuropharm., 21 sup.1(1998)S1-S4.
39. J. Cederbaum, Clin. Pharmacokinet., 13(1987)141.
40. G.C. Cotzias, M.H. Van Woert, L.M. Schiffer, N. Engl. J. Med., 276(1967)374.
41. Y. Agid, T.Chasa, D.Marschen, Lancet, 351(1998)851. 42. C.W. Olanow, Eur. J. Neurol., 4 sup.3(1997)13. 43. P.G. Jenner, Eur. J. Neurol., 4 sup.3(1997)3.
44. H.S. Markus, M. Cox, A.M. Tomkins, Clinical Science, 83(1992)199. 45. W. Pakszys, Neurol. Neurochir. Pol., 6(1971)837.
46. M.D. Yahr, Autonomic Dysfuncion in Parkinson Dis. Rev., 1, 2(1989). 47. D.J. Lanska, Ch.G. Goetz, T.A. Chmura, Movement Disorders,
16(2001)736.
48. K. Kwiatos, Pomiar i analiza dr e ko czyn cz owieka, rozprawa dok-torska na Wydziale Elektroniki WAT 2000.
49. P. Jenner, C.W. Olanow, Neurology., 47(1996)161.
50. D.T. Dexter, C.J. Carter, F.R. Wells, F. Javoy-Agid, J. Neurochem., 52(1989)381.
51. J. Garthwaite, Tren. Neurosci., 14(1991)60.
52. U. Pinkernell, S. Effekemann, U. Karst, Anal. Chem., 69(1997)3623. 53. M. Gu, M.T. Gash, J.M. Cooper, G.K. Wenning, S.E. Daniel, N.P.
Qu-inn, C.D. Marsden, A.H.V. Schapira, Ann. Neurol., 44(1997)418. 54. T. Obata, Toxicol. Lett., 132(2002)83.
55. T. Singer, A.J. Trevor, N. Castagnoli, Trend Biochem. Sci., 12(1987)266.
56. J.W. Langston, Life Sci., 36(1985)201.
57. E. Sofic, P. Riederer, H. Heinsen, H. Beckmann, G.P. Reynolds, G. He-benstreit, J. Neural. Trans., 74(1988)199.
58. E. Sofic, W. Paulus, K. Jellinger, P. Riederer, J. Neurochem., 56(1991)978.
59. C. Buhmann, S. Arlt, A. Kontush, T. Moller-Bertram, S. Sperber, M. Oechsner, M. Stuerenburg, U. Beisiegel, Neurobiol. Disease, 15(2004)160.
60. A.N. Basma, E.J. Morris, W.J. Nicklas, H.M. Geller, J. Neurochem., 64(1995)825.
61. D.G. Graham, Mol. Pharmacol., 14(1978)633.
62. S.T. Spencer, T. Parker, W.D. Bennet, Neuroreport, 5(1994)1009. 63. E. Martignoni, F. Blandini, L. Godi, S. Desideri, C. Pacchetti, F. Mancini,
G. Nappi, Free Rad. Biol. Med., 27(1999)428.
65. M. Tanaka, A. Sotomatsu, H. Kanai, S. Hirai, J. Neurol. Sci., 101(1991)198.
66. Y. Agid, Neurology, 43(1998)145.
67. B.K. G ód, G.A. Czapski, P.RF. Haddad, TrAC, Trends Anal. Chem., 19(2000)492.
68. E. Mi tkiewski, Kurs wyk adów fizjologii cz owieka, wyd. 2, PZWL, War-szawa, 1969.
69. R.A. Floyd, FASEB J., 4(1990)2587.
70. A. Boveris, N. Oshinao, B. Chance, Biochem. J., 128(1972)617. 71. B. Halliwell, Lancet, 355(2000)1179.
72. B. Halliwell, Free Radic. Res, 25(1996)439. 73. I. Fridovich, Arch. Biochem. Biophys., 247(1986)1.
74. R.M.J. Palmer, D.S. Ashton, S. Moncada, Nature, 333(1988)1.
75. B.K. G ód, J. Strosznajder, Wolne rodniki w starzeniu si mózgu
i innych procesach biologicznych, w Mózg a starzenie (M.J. Mossa-
kowski, J. Strosznajder, red.), O wiata UN-O, Warszawa 2001. 76. P.G. Osborne, K. Yamamoto, J. Chromatogr. B, 707(1998)3.
77. B. Halliwell, H. Kaur, M. Ingelman-Sundeberg, Free Radical Biol. Med., 10(1991)439.
78. B.K. G ód, Neurochem. Res., 22(1997)1237.
79. B.K. G ód, G.A. Czapski, P.R. Haddad, TRAC, Trends Anal. Chem., 19(2000)492.
80. B.K. G ód, P. Grieb, Chem. Anal., (Warsaw), 47(2002)399.
81. A. Rehman, M. Whiteman, B. Halliwell, British J. Pharmacol., 122(1997)1702.
82. G. Ellis, I. Adatia, M. Yazdanpanah, S.K. Makela, Clin. Biochem., 31(1998)195.
83. T-K. Lin and C-C. Lai, J. Chromatogr., 227(1982)369.
84. B.K. G ód, W. Hilgier, J. Strosznajder, J. Albrecht, Chem. Anal., (Warsaw), 45(2000)27.
85. P.M. Abuja, R. Albertini, Clin. Chim. Acta, 306(2001)1.
86. A. Ghiselli, M. Serafini, G. Maiani, E. Azzini, A. Ferro-Luzzi, Free Rad.
Biol. Med., 18(1995)29.
87. M. Carlberg, J. Neurosci. Meth., 52(1994)165.
88. K. Kostner, S. Bayai, M. Jansen, G. Khoschsorur, W.H. Horl, G. Maurer, B. Winklhofer-Roob, K. Derfler, Clin. Chim. Acta, 288(1999)21.
89. A.H. Waterfall, G. Singh, J.R. Fry, C.A. Marsden, Neurosci. Lett., 200(1995)69.
90. I.N. Acworth, B. Bailey, The Handbook of Oxidative Metabolism, ESA Inc. 1995.
91. C.A. Rice-Evans, Free Rad. Res., 33(2000)59. 92. M. Valkonen, T. Kuusi, J. Lipid Res., 38(1997)823.
93. N. J. Miller, C. Rice-Evans, M.J. Davies, V. Gopinathan, A. Milner, Clin.
Scie., 84(1993)407.
94. E. Lissi, M. Salim-Hanna, C. Pascual, M.D. del Castillo, Free Rad. Biol.
95. A. Ghiselli, M. Serafini, F. Natella, C. Saccini, Free Rad. Biol. Med., 29(2000)1106.
96. F. Tubaro, A. Ghiselli, P. Rapuzzi, M. Maiorino, F. Ursini, Free Rad.
Biol. Med., 24(1998)1228.
97. A. Krasowska, D. Rosiak, K. Szkapiak, M. ukasiewicz, Curr. Topics
Biophys., 24(2000)89.
98. H. Wang. J.A. Joseph, Free Rad. Biol. Med., 27(1999)612.
99. D. Genser, M-H. Kang, H. Vogelsang, I. Elmadta, Europ. J. Clin. Nutrit., 53(1999)675.
100. E.C. Tsai, I.B. Hirsh, J.D. Brunzell, A. Chait, Diabetes, 43(1994)1010. 101. E. Ali, Zesz. Nauk. Uniw. Jag., Prace Biol. Molek., 11(1985)139. 102. C. O'Gara, K. Maddipati, L. Marnett, Chem. Res. Toxicol., 2(1989)295. 103. L. Ste-Marie, D. Boismenu, L. Vachon, J. Montgomery, Anal. Biochem.,
241(1996)67.
104. R.A. Floyd, J.J. Watson, P.K. Wong, J. Biochem. Biophys. Meth., 10(1984)221.
105. B.J. Tabner, S. Turnbull, O.M.A. El-Agnaf, D. Allsop, Free Rad. Biol.
Med., 32(2002)1076.
106. B.K. G ód, K.I. Sta czak, A. Wo niak, A. Walendzik, W. Pakszys, CPS: analchem/0306002.
107. M.M. Tarpey, I. Fridovich, Circ. Res., 89(2001)224.
108. S. Chevion, E.M. Berry, N. Kitrossky, R. Kohen, Free Rad. Biol. Med., 22(1997)411.
109. R. Kohen, E. Vellaichamy, J. Hrbac, I. Gati, O. Tirosh, R. Kohen, Free
Rad. Biol. Med., 28(2000)547.
110. G.L. Ellman, Arch. Biochem, Biophys., 82(1959)70.
111. E. Bald, w The XXVIth Sci. Symp. Chromatogr. Met. Invest. Org. Comp., Katowice-Szczyrk 5-6.06.2002.
112. C. O'Gara, K. Maddipati, L. Marnett, Chem. Res. Toxicol., 2(1989)295. 113. M. Asensi, J. Sastre, F.V. Pallardo, A. Lloret, M. Lehnor, J.G. Asuction,
Met. Enzymol., 295(1999)267.
114. K.P. Miltor, T. Dzialosynski, S.E. Sanford, J.R. Trevithicle, Curr. Eye
Res., 16(1997)564.
115. A.T. Diplock, Free Rad. Res., 33(2000)521.
116. W.A. Pryor, T. Strickland, D.F. Church, J. Am. Chem. Soc., 110(1988)2224.
117. T. Doba, G.W. Burton, K.U. Ingold, Biochim. Biophys. Acta, 835(1985)298.
118. G. Cao, H.M. Alessioo, R.G. Cutler, Free Radic. Biol. Med., 14(1993)303.
119. G. Cao, R.G. Cutler, Arch. Biochem. Biophys., 320(1995)106.
120. K. G ód, K. Sta czak, A. Wo niak, W. Pakszys, Farmac. Pol., 49(2003)S26-S30.
