Widok Bielmo - tkanka odżywiająca zarodek II. Autonomiczny rozwój bielma u roślin okrytonasiennych (Angiospermae)

E

K

i J

R

1

Zak³ad Cytologii i Embriologii Roœlin Uniwersytet Jagielloñski

Grodzka 52, 31-044 Kraków

e-mail: kutael@grodzki.phils.uj.edu.pl

2

Zak³ad Genetyki i Cytologii Uniwersytet Gdañski

K³adki 24, 80-822 Gdañsk

e-mail: rojek@biotech.univ.gda.pl

BIELMO — TKANKA OD¯YWIAJ¥CA ZARODEK

II. AUTONOMICZNY ROZWÓJ BIELMA U ROŒLIN OKRYTONASIENNYCH (ANGIOSPERMAE)

WSTÊP Bielmo (endosperma, endosperm) jest bar-dzo wa¿n¹ tkank¹ roœlinn¹, która dostarcza substancji od¿ywczych dla rozwijaj¹cego siê zarodka i dojrzewaj¹cego nasienia. U wiêkszo-œci rozmna¿aj¹cych siê p³ciowo Angiospermae bielmo powstaje w wyniku podwójnego zap³odnienia z komórki centralnej i pra-wid³owy rozwój jest uzale¿niony od w³aœciwej proporcji (2:1) matczynego i ojcowskiego ge-nomu, bior¹cych udzia³ w jego powstaniu. Ja-kiekolwiek, nawet nieznaczne, zak³ócenie w tym stosunku ma wp³yw na ¿ywotnoœæ zarod-ka. Przypuszcza siê, ¿e ten sam gen mo¿e dawaæ ró¿ny efekt w zale¿noœci od tego czy jest dzie-dziczony drog¹ mêsk¹ czy ¿eñsk¹ (patrz art. ROJEK i KUTA w tym numerze KOSMOSU).

Wystêpowanie autonomicznego bielma (rozwijaj¹cego siê bez zap³odnienia komórki centralnej) in vivo u ró¿nych taksonów (auto-nomiczne apomikty, nieliczne gatunki rozmna-¿aj¹ce siê p³ciowo), u których genom ojcowski w ogóle nie uczestniczy w jego rozwoju, jak równie¿ mo¿liwoœæ prawid³owego rozwoju bielma przy innym ni¿ 2:1 stosunku genomów rodzicielskich (np. u roœlin z rozwojem mega-gametofitu wg typu Oenothera, Penea,

Fritilla-ria, Peperomia; u wiêkszoœci pseudogamicz-nych apomiktów) wskazuj¹, ¿e w toku ewolu-cji roœliny wykszta³ci³y adaptacjê do normalne-go rozwoju bielma i nasion bez zachowania wymaganego stosunku genomów rodziciel-skich (patrz GRIMANELLI i wspó³aut. 2001, ROJEK i KUTA w tym numerze KOSMOSU).

Autonomiczny rozwój bielma mo¿na zaini-cjowaæ w warunkach eksperymentalnych w wyniku zapyleñ napromieniowanym py³kiem, jak równie¿ w wyniku kultur in vitro nie-zap³odnionych zal¹¿ków.

W ostatnich kilku latach ukaza³o siê wiele prac na temat mutacji fie, mea i fis u

Arabi-dopsis (np.: OHAD i wspó³aut. 1996, 1999; GROSSNIKLAUS i wspó³aut. 1998, 2001; GOLDBERGi FISCHER1999; KIYOSUEi wspó³aut. 1999; LUOi wspó³aut. 1999, 2000; VINKENOOG

i wspó³aut. 2000; VINKENOOG i SCOTT 2001). Zmutowane geny s¹ odpowiedzialne za nieza-le¿ny od zap³odnienia rozwój endospermy i na-sienia. Badania te wskazuj¹, ¿e zap³odnienie nie jest konieczne do stymulacji formowania siê endospermy nawet we wczesnych etapach rozwoju, jak równie¿, ¿e drogi rozwoju komór-ki jajowej i komórkomór-ki centralnej s¹ niezale¿ne,

Numer 1

(254)

gdy¿ mutacja fie nie inicjuje embriogenezy. Nadal jednak niewiele wiadomo na temat gene-tycznych podstaw autonomicznego rozwoju

bielma i partenogenetycznego ró¿nicowania siê komórki jajowej.

AUTONOMICZNY ROZWÓJ BIELMA U ROZMNA¯AJ¥CYCH SIÊ P£CIOWO ROŒLIN

AUTONOMICZNY ROZWÓJ BIELMA IN SITU

U rozmna¿aj¹cych siê p³ciowo Angiosper-mae bielmo powstaje w wyniku zap³odnienia komórki centralnej i z regu³y jest triploidalne (3n). Nieliczne gatunki charakteryzuje autono-miczny rozwój bielma w warunkach in situ (Tabela 1). Do takich gatunków nale¿¹ np.

Ane-mone ranunculoides i A. nemorosa. W

pol-skich populacjach osobniki rozmna¿aj¹ siê g³ównie na drodze wegetatywnej przez k³¹cza. Wykszta³cane nasiona nie s¹ zdolne do kie³wania, bowiem nie nastêpuje zap³odnienie ko-mórki centralnej; bielmo rozwija siê autono-micznie, co potwierdzi³a analiza kariologiczna (TRELA1963a, b; TRELA-SAWICKA1974). Mo¿li-woœæ autonomicznego rozwoju bielma u A.

ne-morosa ), we francuskich populacjach tego

ga-tunku, zosta³a opisana równie¿ przez BROULANDA(1968). Tylko w nielicznych mega-gametofitach autonomiczny rozwój bielma na-stêpowa³ na drodze normalnych podzia³ów mi-totycznych. Z wiêksz¹ frekwencj¹ wystêpo-wa³y zaburzone mitozy (TRELA 1963b), obja-wiaj¹ce siê g³ównie zahamowaniem cytokine-zy i tworzeniem j¹der restytucyjnych. Efektem powy¿ej opisanych zaburzeñ, obserwowanych g³ównie w centralnej czêœci endospermy, by³o powstawanie j¹der na ró¿nym stopniu ploidal-noœci (od 4n do 32n).

Uzyskane wyniki zosta³y potwierdzone przez ekperymenty z kastrowanymi i izolowa-nymi kwiatami, jak równie¿ poprzez zapylenia w warunkach kontrolowanych. Obserwowano pocz¹tkowy rozwój zygotycznego zarodka i au-tonomicznej endospermy; w póŸniejszych eta-pach nastêpowa³o zahamowanie rozwoju, co prowadzi³o do wytworzenia nasion niezdol-nych do kie³kowania.

Defet w rozwoju nasion osobników pol-skich populacji A. nemorosa i A.

ranunculo-ides wydaje siê byæ efektem samoniezgodoœci;

³agiewki py³kowe nie dorastaj¹ do komórki centralnej (TRELA-SAWICKA 1974). Osobniki powsta³e drog¹ powielania przez k³¹cza stano-wi¹ klon sk³adaj¹cy siê z roœlin identycznych genetycznie. Zapylenia w obrêbie klonu pro-wadzi³y do zaburzeñ w rozwoju nasion.

Nato-miast w wyniku krzy¿owañ miêdzy klonami powstawa³y ¿ywotne nasiona i siewki.

Autonomiczny rozwój bielma uda³o siê równie¿ uzyskaæ w warunkach in situ u orze-cha w³oskiego (Juglans regia) (TADEO i wspó³aut. 1994). G³ównym celem badañ by³o œledzenie rozwoju woreczka zal¹¿kowego i wp³ywu endogennych giberelin na zapylone i niezapylone zal¹¿nie tej roœliny. Uzyskane wy-niki wskazuj¹ na to, ¿e kolejnoœæ zapyle-nie/zap³odnienie moduluje poziom fitohor-monów. Pocz¹tkowo, tu¿ po zapyleniu, nastê-puje obni¿enie poziomu hormonów, a nastêp-nie, krótko po rozpoczêciu embriogenezy, po-ziom hormonów podnosi siê i utrzymuje na mniej wiêcej sta³ym poziomie. W niezapylo-nych zal¹¿niach najni¿szy notowany poziom giberelin pokrywa³ siê z momentem zahamo-wania wzrostu zal¹¿ni, „odpadania” niezapylo-nych zal¹¿ków (100%) oraz przyspieszeniem celularyzacji rozwijaj¹cej siê autonomicznie endospermy. Zastosowanie egzogennych gi-berelin nie niwelowa³o efektu hamowania wzrostu i „odpadania” zal¹¿ków.

Ostatnio, badania embriologiczne niezapy-lonych zal¹¿ków pomidora (Lycopersicon

escu-lentum) wykaza³y mo¿liwoœæ indukcji

autono-micznego bielma u tego gatunku in situ (ADAMOWICZ i wspó³aut. 2000). W jednym, na piêæ badanych genotypów, w pojedynczych zal¹¿kach obserwowano rozwój wieloj¹drowej struktury przypominaj¹cej endospermê, która wype³nia³a wnêtrze woreczka zal¹¿kowego.

Podobnie, w badaniach nad komercyjnym kultywarem Viola x wittrockiana (bratek szwajcarski), w niezap³odnionych megagame-tofitach p¹ków o d³ugoœci 20 mm i p¹ków pó³otwartych, obserwowano wieloj¹drowe struktury, przypominaj¹ce endospermê j¹dro-w¹, towarzysz¹ce niekiedy aparatowi jajowe-mu, które wystêpowa³y odpowiednio z fre-kwencj¹ 2,3% i 4,8% (OPOKA2001). Interpreta-cja takich woreczków zal¹¿kowych jest bardzo trudna bowiem nie mo¿na ustaliæ czy jest to efekt podzia³u j¹dra wtórnego b¹dŸ j¹der bie-gunowych, czy te¿ wynik nadliczbowych mitoz prowadz¹cych do powstania wieloj¹drowych, nienormalnych, dojrza³ych gametofitów.

Autonomiczny rozwój bielma in situ u ro-œlin rozmna¿aj¹cych siê p³ciowo jest zjawi-skiem rzadkim i wymaga bardziej wnikliwych badañ porównawczych rozwoju endospermy

in situ i in vitro u danego genotypu czy

gatun-ku. Nie mo¿na wykluczyæ, ¿e indukcja autono-micznego rozwoju bielma ma zwi¹zek z

pre-dyspozycjami wielu roœlin okrytonasienncyh do apomiksji, która w œwietle obecnych da-nych wydaje siê byæ uwarunkowana ekspresj¹ pojedynczego (-czych) genu (-ów), zale¿n¹ od czasu i stadium rozwojowego (KOLTUNOW i wspó³aut. 1995, SAVIDAN2001).

Tabela 1. Autonomiczne bielmo u rozmna¿aj¹cych siê p³ciowo przedstawicieli Angiospermae.

Takson Literatura

In situ

Anemone nemorosa TRELA (1963a, b); BROULAND(1968)

Anemone ranunculoides TRELA-SAWICKA(1974)

Juglans regia TADEO i wspó³aut. (1994)

Lycopersicon esculentum ADAMOWICZi wspó³aut. (2000)

Viola x wittrockiana OPOKA(2001)

Zea mays LAIKOVA(1976)

In situ po zapyleniu napromieniowanym py³kiem Actinidia deliciosa MUSIA£ i PRZYWARA (1998, 1999b)

Cucumis sativus LEDEUFFi SAUTON(1994); FARISi NIEMIROWICZ-SZCZYTT

(1999)

Malus spp. JAMESi wspó³aut. (1985); NICOLLi wspó³aut. (1987); ZHANG i LESPINASSE (1991)

Nicotiana sp. MUSIA£ i PRZYWARA (1999a)

Prunus domestica PEIXEi wspó³aut. (2000)

Theobroma cacao FALQUEi wspó³aut. (1994)

In vitro

Allium cepa MUSIA£ i wspó³aut. (2001)

Brassica napus CHMIELOWIEC i wspó³aut. (1997); ROJEK 2000; ROJEKi wspó³aut. (2000)

Gossypium hirsutum JENSEN i wspó³aut. (1977)

Helianthus annuus YANG i wspó³aut. (1986)

Helleborus niger MÓL i wspó³aut. (1995)

Hordeum vulgare HUANGi wspó³aut. (1982)

Lupinus luteus MÓL i wspó³aut. (1995)

Melandrium album MÓL 1992; MÓL i wspó³aut. (1995)

Oryza sativa ZHOU i YANG(1981)

Viola odorata WIJOWSKAi wspó³aut. (1999a, b)

Viola riviniana WIJOWSKAi KUTA (2000)

Viola silvestris WIJOWSKAi KUTA (2000)

INDUKCJA AUTONOMICZNEGO ROZOWJU BIELMA W WARUNKACH EKSPERYMENTALNYCH

Autonomiczny rozwój endospermy mo¿na zaindukowaæ w warunkach eksperymental-nych przez zapylenia z u¿yciem napromienio-wanego py³ku oraz w kulturach in vitro nieza-pylonych zal¹¿ków i zal¹¿ni (Tabela 1).

Autonomiczne rozwój bielma po zapyleniach in

situ napromieniowanym py³kiem

Zapylenia napromieniowanym py³kiem (stosuje siê g³ównie promieniowanie gamma) s¹ szeroko stosowan¹ technik¹ w indukcji in

situ haploidalnych roœlin. Ta metoda zosta³a

miêdzy innymi zastosowana u niektórych ro-œlin u¿ytkowych (np. u jab³oni, ogórka, kiwi, gruszy, ró¿y, melona), aczkolwiek procent uzy-skiwanych haploidów by³ bardzo niski. Dopie-ro zastosowanie kultury in vitDopie-ro zapylonych napromieniowanym py³kiem zal¹¿ków, nasion lub zarodków znacznie polepszy³o uzyskiwane wyniki.

Pomimo, ¿e napromieniowanego py³ku u¿ywano od wielu lat (po raz pierwszy u¿yty w 1922 r. przez Blakeslee i wspó³pracowników), niewiele jest badañ nad zap³odnieniem i wcze-snymi etapami embriogenezy po zapyleniu na-promieniowanym py³kiem. Takie badania em-briologiczne zosta³y przeprowadzone nad

Li-lium, Melandrium, Tradescantia, Theobroma cacao, Actinidia deliciosa, Pyrus, Prunus, Cu-cumis (patrz MUSIA£i PRZYWARA1998, FARISi NIEMIROWICZ-SZCZYTT1999, PEIXEi wspó³aut. 2000).

Autonomiczny rozwój bielma uda³o siê za-indukowaæ, w wyniku zapyleñ napromienio-wanym py³kiem, u kilku taksonów wa¿nych ekonomicznie: ogórka, tytoniu, kiwi, jab³oni, œliwy, i kakaowca (Tabela 1).

Badania prowadzone nad zapyleniami na-promieniowanym py³kiem wskazuj¹ na kilka efektów tego procesu: (i) napromieniowanie zaburza podwójne zap³odnienie, co jest zwi¹zane g³ównie z wp³ywem promieniowa-nia na wzrost ³agiewki py³kowej i na ¿ywot-noœæ py³ku; (ii) rozwój zarodka i endospermy jest zale¿ny od dawki napromieniowania; (iii) z regu³y, przy stosowaniu wy¿szych dawek na-promieniowania (200 i > Gy) rozwój zarodka i bielma jest opóŸniony w stosunku do mate-ria³u kontrolnego i do matemate-ria³u uzyskanego po u¿yciu ni¿szych dawek napromieniowania (<100 Gy), chocia¿ efekt zastosowanej dawki jest zale¿ny od gatunku. Najczêœciej, przy

wy¿-szych dawkach promieniowania nastêpuje znaczne przyspieszenie degeneracji bielma i zarodków, jak równie¿ ich rozwój odbiega od normalnego. Mog¹ oczywiœcie byæ wyj¹tki i tak np. u Actinidia deliciosa, chocia¿ wy¿sze daw-ki napromieniowania (700 i 900 Gy) drastycz-nie obni¿a³y liczbê nasion w zal¹¿niach, to przy wiêkszej dawce napromieniowania (900Gy) procent nasion zawieraj¹cych zarówno zaro-dek, jak i endospermê by³ wy¿szy ni¿ przy daw-ce 700 Gy (Ryc. 1). To zjawisko mo¿e byæ

wyja-œnione przez tzw. efekt Hertwiga opisywany przez kilku badaczy (patrz MUSIA£i PRZYWARA

1998). Natomiast u Nicotiana nie obserwowa-no wyraŸnego wp³ywu dawki napromieniowa-nia; efekt zapylenia napromieniowanym py³kiem by³ podobny we wszystkich u¿ytych Fig. 1. Autonomiczne komórkowe bielmo (ab) i partogenetyczny zarodek (z) u Actinidia, 72 dni po zapyleniu napromieniowanym py³kiem o dawce promieniowania 9 kG; pow. 90× (zdjêcie udostêpnione przez dr. K. Musia³ i prof. L. Przy-warê).

krzy¿ówkach, a ró¿nice w indukcji autono-micznego rozwoju endospermy i partenogene-zy pod wp³ywem zastosowanych dawek by³y znikome (MUSIA£ i PRZYWARA 1999a); (iv) opóŸniony rozwój bielma przejawia siê, w przypadku bielma j¹drowego, brakiem zak³ad-ania siê œcian komórkowych; bielmo kontrolne po okreœlonym, dla danego gatunku, czasie po zapyleniu osi¹ga stadium komórkowe, bielmo powsta³e po zastosowaniu py³ku napromienio-wanego pozostaje j¹drowe (PEIXEi wspó³aut. 2000); (v) w zale¿noœci od wysokoœci dawki na-promieniowania, uzyskuje siê nasiona: normal-ne, puste, z obecnoœci¹ wy³¹cznie endosper-my, wy³¹cznie zarodka, b¹dŸ z zarodkiem i biel-mem; (vi) z regu³y autonomiczne bielmo za-wiera mniej substancji zapasowych w porów-naniu z bielmem kontrolnym; iloœæ skrobi i lipi-dów w diploidalnej endospermie komórkowej jest porównywalna z iloœci¹ tych substancji w komórce centralnej; (vii) status bielma (plo-idalnoœæ) ustala siê na podstawie analizy kario-logicznej, cytometrii przep³ywowej b¹dŸ me-tod analizy morfometrycznej; (viii) j¹dra auto-nomicznej endospermy mog¹ wykazywaæ zró¿-nicowanie kariologiczne (powstaj¹ j¹dra poli-ploidalne na skutek zaburzeñ podzia³ów mito-tycznych, b¹dŸ procesów endoreplikacyj-nych), co obserwowano u jab³oni (NICOLL i wspó³aut. 1987) lub nie wykazuj¹ takiej zmien-noœci np. u kiwi (MUSIA£i PRZYWARA1999b); synchronizacja podzia³ów j¹der endospermy mo¿e byæ wyraŸnie zak³ócona.

Wyniki te maj¹ du¿e znaczenie, bowiem uzyskana na tej drodze endosperma mo¿e da-waæ potencjalne mo¿liwoœci regeneracji ho-mozygotycznych, diploidalnych roœlin, jak równie¿ dla badañ genetycznych i programów rozrodczych.

Eksperymenty z napromieniowanym py³kiem mog¹ rzuciæ pewne œwiat³o na zjawi-sko imprintingu genomowego charaktery-stycznego dla rozwoju bielma u rozmna-¿aj¹cych siê p³ciowo Angiospermae. W wyniku zapyleñ napromieniowanym py³kiem mo¿na uzyskaæ potomstwo, które jest dok³adn¹ re-plik¹ roœliny matczynej. Podobnie jak w przypadku autonomicznie rozwijaj¹cej siê en-dospermy u apomiktów i niektórych taksonów rozmna¿aj¹cych siê p³ciowo, prawid³owy sto-sunek genomów rodzicielskich 2 (mateczne):1 (ojcowski), bior¹cych udzia³ w powstawaniu bielma po zapyleniu napromieniowanym py³kiem, jest zak³ócony; nie uczestniczy w ogó-le genom ojcowski.

Autonomiczny rozwój bielma w kulturach niezapy-lonych zal¹¿ków i zal¹¿ni

Kultury in vitro niezapylonych zal¹¿ków i zal¹¿ni s¹ obecnie, obok androgenezy, jedn¹ z najwa¿niejszych metod uzyskiwania haplo-idów, organizmów modelowych do wielu ba-dañ embriologicznych i genetycznych. W wyni-ku indukcji gynogenezy in vitro dochodzi do partenogenetycznego rozwoju komórki jajowej i/lub rozwoju bez zap³odnienia innej komórki woreczka zal¹¿kowego b¹dŸ bezpoœredniej em-briogenezy z megaspor (MÓL1999). Sporadycz-nie mo¿e rówSporadycz-nie¿ dochodziæ do stymulacji po-dzia³ów j¹dra wtórnego komórki centralnej lub j¹der biegunowych, co prowadzi do rozwoju autonomicznej endospermy (MÓL 1999). In-dukcjê autonomicznego bielma uzyskano w kul-turze niezap³odnionych zal¹¿ków b¹dŸ zal¹¿ni kilkunastu taksonów (Tabela 1).

Czynniki wp³ywaj¹ce na indukcjê rozwo-ju autonomicznego bielma w kulturach in vitro. Podobnie jak w przypadku gynogenezy,

wiele czynników mo¿e wp³ywaæ na indukcjê podzia³ów komórki centralnej. Wystêpowanie autonomicznego rozwoju bielma w zal¹¿kach hodowanych na po¿ywkach indukuj¹cych gy-nonegezê sugeruje podobieñstwo dzia³aj¹cych czynników na obydwa procesy.

Do najwa¿niejszych czynników wp³ywa-j¹cych na efektywnoœæ kultur niezapylonych zal¹¿ków i zal¹¿ni nale¿¹: genotyp roœliny do-norowej, sk³ad po¿ywki, stadium rozwojowe woreczka zal¹¿kowego, warunki kultury, ro-dzaj eksplantatu, wiek oraz warunki wzrostu roœliny matecznej (patrz MUSIA£ i PRZYWARA

2001). Wp³yw poszczególnych czynników na indukcjê gynogenezy zosta³ szeroko omówio-ny w kilku pracach przegl¹dowych (YANG i ZHOU 1982, BOHANEC 1994, M

UKHAMBE-TZHANOV1997, MÓL1999, MUSIA£i PRZYWARA

2001). W niniejszej pracy przedstawiony jest wp³yw wy¿ej wymienionych czynników na in-dukcjê rozwoju autonomicznego bielma.

Istnieje wyraŸna zale¿noœæ pomiêdzy geno-typem roœliny donorowej a zdolnoœci¹ do roz-woju in vitro. U Viola odorata, w kulturze nie-zapylonych zal¹¿ków, zarówno frekwencja po-wiêkszonych zal¹¿ków, jak i indukcja autono-micznej endospermy zale¿a³a w g³ównej mie-rze od genotypu roœliny matecznej (WIJOWSKA

i wspó³aut. 1999a, b). W genotypach G6 i G10 ponad 95% zal¹¿ków powiêksza³o siê, podczas gdy w genotypie G9 tylko 47%. Najwy¿sz¹ fre-kwencjê indukcji endospermy uzyskano w

notypie G9 (12,3%), natomiast najni¿sz¹ w ge-notypie G6 (5,5%). U rzepaku dwa, spoœród trzech testowanych genotypów, okaza³y siê po-datne na indukcjê autonomicznego rozwoju bielma w warunkach kultur in vitro niezap³od-nionych s³upków (CHMIELOWIEC i wspó³aut. 1997, ROJEK 2000, ROJEK i wspó³aut. 2000).

Podobna zale¿noœæ wystêpuje w przypadku rodzaju eksplantatu. Dla jednych roœlin najlep-sze rezultaty osi¹gano stosuj¹c kulturê niezapy-lonych zal¹¿ków, dla innych wydajniejsza by³a kultura zal¹¿ni czy nawet ca³ych p¹ków kwiato-wych. U rzepaku najlepsza okaza³a siê kultura s³upków z zachowanymi dzia³kami kielicha i fragmentem szypu³ki kwiatowej (CHMIELOWIEC

i wspó³aut. 1997, ROJEK2000, ROJEKi wspó³aut. 2000), ca³ych zal¹¿ni u ry¿u (ZHOU i YANG

1982), Lupinus luteus, Helleborus niger i

Me-landrium album (MÓL i wspó³aut. 1995) i u przedstawicieli rodzaju Viola (WIJOWSKA i KUTA2000). Aczkolwiek dla Viola odorata do-bre rezultaty uzyskano równie¿ stosuj¹c kulturê niezap³odnionych zal¹¿ków. Natomiast w przy-padku V. silvestris, V. riviniana i Viola x

wit-trockiana indukcja autonomicznego rozwoju

endospermy wyst¹pi³a jedynie przy wykorzysta-niu jako eksplantatu niezapylonych zal¹¿ni; nie uda³o siê utrzymaæ w kulturze izolowanych, nie-zap³odnionych zal¹¿ków (WIJOWSKA i wspó³aut. 1999a, b; WIJOWSKAi KUTA2000; S TÊ-PIEÑ-WIJOWSKA2002), a u H. niger obok zal¹¿ni zadowalaj¹ce wyniki uzyskano w kulturze zal¹¿ków przymocowanych do placenty (MÓLi wspó³aut. 1995).

Wa¿nym czynnikiem dla wydajnej kultury ¿eñskich gametofitów jest stadium rozwojowe woreczka zal¹¿kowego. Z regu³y im woreczek jest lepiej wykszta³cony tym wiêksze prawdo-podobieñstwo wyst¹pienia haploidalnej parte-nogenezy. Wydaje siê, ¿e taka sama zale¿noœæ istnieje dla indukcji rozwoju autonomicznej endospermy. W momencie inokulacji u Viola

odorata (WIJOWSKA i wspó³aut. 1999a, b; WIJOWSKA i KUTA 2000; STÊPIEÑ-WIJOWSKA

2002), Brassica napus (CHMIELOWIEC i wspó³aut. 1997, ROJEK2000, ROJEKi wspó³aut. 2000), Lupinus luteus i Helleborus niger (MÓL

i wspó³aut. 1995), Helianthus annuus (YANGi wspó³aut. 1986), woreczek zal¹¿kowy by³ w stadium 8-j¹drowym. U Melandrium album, w momencie rozpoczêcia kultury, eksplantaty za-wiera³y megagametofity w m³odszych stadiach rozwojowych (1- do 4- j¹drowe woreczki zal¹¿kowe), które osi¹ga³y dojrza³oœæ w toku trwania kultury. Aczkolwiek w kulturze

zal¹¿ków przymocowanych do placenty, 1- do 4-j¹drowe woreczki zal¹¿kowe tego gatunku rozwija³y siê w nietypowe gametofity z nadlicz-bowymi j¹drami (MÓL 1992, MÓL i wspó³aut. 1995), które po dalszych podzia³ach tworzy³y strukturê przypominaj¹c¹ wieloj¹drowe biel-mo. W przypadku Hordeum vulgare hodowa-ne in vitro zal¹¿nie zawiera³y wprawdzie ga-metofity w ró¿nych stadiach rozwojowych (od 1-j¹drowego woreczka zal¹¿kowego do sta-dium dojrza³ego megagametofitu), to jednak najwy¿sz¹ frekwencjê indukcji haploidalnych zarodków i autonomicznej endospermy odno-towano, kiedy zal¹¿ki w momencie inokulacji zawiera³y dojrza³e, 8-j¹drowe megagametofity (HUANG i wspó³aut. 1982, CASTILLO i CISTUE

1993). U Oryza sativa obserwowano rozwój haploidalnych roœlin nawet bezpoœrednio z megaspory, jednak kultura starszych zal¹¿ni da³a w efekcie zarówno rozwój haploidów jak i autonomicznej endospermy (patrz MUSIA£ i PRZYWARA 2001).

Na wyniki kultury in vitro niew¹tpliwy wp³yw ma równie¿ rodzaj po¿ywki oraz stê¿e-nie substancji wzrostowych i cukrów. Pocz¹tkowo (lata 50.) wiêkszoœæ eksperymen-tów prowadzono na po¿ywkach Nitscha; obec-nie najczêœciej u¿ywa siê po¿ywek: MS, Millera, i N6 (patrz MUSIA£ i PRZYWARA 2001). Wiele doœwiadczeñ wskazuje na to, ¿e sk³ad po¿ywki mo¿e mieæ decyduj¹ce znaczenie dla drogi, jak¹ bêdzie przebiegaæ rozwój niezap³odnione-go gametofitu ¿eñskieniezap³odnione-go. U rzepaku, z kilkuna-stu zastosowanych po¿ywek, na piêciu nast¹pi³a indukcja autonomicznego rozwoju endospermy: MS (bez dodatku regulatorów wzrostu), MS + 2 mg/l BAP + 0,1 mg/l NAA, MS + 2 mg/l BAP + 2 mg/l 2,4-D oraz po tzw. szo-kach auksynowych, gdzie na po¿ywce MS z wy-sokimi dawkami 2,4-D (20 lub 40 mg/l) hodo-wano materia³ przez 1 godz., a natêpnie prze-noszono na czyst¹ po¿ywkê MS (CHMIELOWIEC

i wspó³aut. 1997, ROJEK 2000, ROJEK i wspó³aut. 2000). W przypadku gatunków z ro-dzaju Viola, autonomiczny rozwój endosper-my wyst¹pi³ u V. riviniana, V. silvestris i Viola x wittrockiana (WIJOWSKAi KUTA 2002, S TÊ-PIEÑ-WIJOWSKA 2002) na po¿ywce MS zawie-raj¹cej nisk¹ koncentracjê 2,4-D (0,01, 0,1 i 1 mg/l); z kolei dla Viola odorata rodzaj po¿ywki nie by³ istotnym czynnikiem dla indukcji roz-woju endospermy; rozwój nast¹pi³ na wszyst-kich zastosowanych w kulturze po¿ywkach (WIJOWSKA i wspó³aut. 1999b, WIJOWSKA i KUTA 2000).

W wiêkszoœci przypadków obecnoœæ egzo-gennych hormonów jest niezbêdna do induk-cji rozwoju autonomicznego bielma, aczkol-wiek ich wysokie stê¿enie mo¿e stymulowaæ nadmierny rozrost tkanek somatycznych, przy jednoczesnym zahamowaniu rozwoju struktur wewn¹trz woreczka zal¹¿kowego (YANG i ZHOU 1982, MUKHAMBETZHANOV1997). Bada-nia nad Brassica napus wykaza³y, ¿e rozwój au-tonomicznej endospermy jest tak¿e mo¿liwy bez u¿ycia egzogennych fitohormonów. Na po¿ywce podstawowej MS wbogaconej tylko wy¿szym stê¿eniem sacharozy (6%), frekwen-cja indukcji autonomicznego rozwoju endo-spermy by³a stosunkowo wysoka (ROJEK i wspó³aut. 2000). U Helleborus niger obecnoœæ wody bez dodatku fitohormonów i sk³adników od¿ywczych oraz podwy¿szenie temperatury, indukowa³o autonomiczny rozwój bielma (MÓLi wspó³aut. 1995). Warto zaznaczyæ, ¿e w przypadku gynogenezy in vitro, rozwój gyno-genicznych zarodków na po¿ywce bez dodat-ku egzogennych fitohormonów notowano jak dot¹d tylko w kulturach niezapylonych zal¹¿ni kukurydzy (Alatorceva i Tyrnov 1994, za BHOJWANI i THOMAS 2001) i u Allium cepa (CAMPION i wspó³aut. 1995).

Warunki w jakich prowadzi siê kultury nie-zapylonych zal¹¿ni i zal¹¿ków maj¹ równie¿ du¿e znaczenie. Mo¿na stosowaæ po¿ywki p³ynne lub sta³e, hodowaæ eksplantaty na œwietle lub w ciemnoœci i przy ró¿nej tempe-raturze. Izolowane zal¹¿nie i zal¹¿ki z regu³y hoduje siê w temperaturze 22–26oC, ale czasa-mi ni¿sze lub wy¿sze temperatury s¹ optymal-ne dla kultury (MUKHAMBETZHANOV 1997). MÓL i wspó³autorzy (1995) podaj¹, ¿e obok hormonów temperatura jest istotnym czynni-kiem indukuj¹cym podzia³y w niezap³odnio-nych komórkach centralniezap³odnio-nych. U Helleborus

niger temperatura by³a prawdopodobnie

naj-wa¿niejszym czynnikiem spontanicznego for-mowania siê endospermy w pó³naturalnych warunkach, gdzie kwiaty by³y inkubowane w wodzie bez dodatku fitohormonów, ale przy znacznie podwy¿szonej temperaturze (27oC) w porównaniu z warunkami in planta (poni¿-ej 10oC).

Dotychczas nieliczne badania dotyczy³y okreœlenia wp³ywu wieku roœliny donorowej na procesy zachodz¹ce w kulturach in vitro. W przypadku gynogenezy u Gerbera jamesonii wykazano, ¿e wiek jest bardzo wa¿nym czynni-kiem wp³ywaj¹cym zarówno na wydajnoœæ for-mowania kalusa jak i na jego zdolnoœci

morfo-genetyczne (patrz MUSIA£i PRZYWARA2001). W przypadku Viola odorata zal¹¿ki z p¹ków kwiatowych i kwiatów serii jesiennej by³y bar-dziej podatne na indukcjê autonomicznego rozwoju bielma (12,5% i 13,7%, odpowiednio) ni¿ ze stadium otwartego kwiatu i kwiatów po-chodz¹cych z serii wiosennej (odpowiednio 8,3% i 4,9%).

Embriologia autonomicznego bielma uzy-skanego in vitro. Autonomiczny rozwój bielma

rozpoczyna siê zwykle od podzia³ów j¹dra wtórnego (MÓL i wspó³aut. 1995), ale mo¿e byæ równie¿ rezultatem podzia³ów j¹der biegu-nowych, które nie uleg³y fuzji. Kolejn¹ mo-¿liw¹ drog¹ jest powstanie nietypowego ceno-cytowego woreczka zal¹¿kowego z du¿¹ liczb¹ j¹der, z którego po cytokinezie mo¿e powstaæ tkanka przypominaj¹ca bielmo (MÓL 1999).

Z regu³y moment pierwszych podzia³ów j¹der endospermy jest trudny do zaobserwo-wania, nie mo¿na wiêc bezpoœrednio ustaliæ czy autonomiczna endosperma powsta³a z dwóch osobno dziel¹cych siê j¹der bieguno-wych (lub jednego) czy te¿ w wyniku po-dzia³u wtórnego j¹dra komórki centralnej. Dotychczas bardzo nieliczne s¹ dane na te-mat statusu kariologicznego autonomiczne-go bielma zaindukowaneautonomiczne-go w warunkach in

vitro. Aby ustaliæ pochodzenie

autonomicz-nej endospermy wykorzystuje siê wiec drogê poœredni¹, polegaj¹c¹ na porównaniu struk-tury i wielkoœci j¹der endospermy powsta³ej w wyniku kultury, z endosperm¹ kontroln¹ oraz z j¹drami biegunowymi i pierwotnym j¹drem endospermy.

W kulturach niezapylonych zal¹¿ków Viola

odorata nie obserwowano wczesnych etapów

rozwoju bielma, nie uda³o siê równie¿ ustaliæ liczby chromosomów. Istnieje jednak kilka fak-tów wskazuj¹cych na powstanie bielma w wy-niku podzia³ów j¹der biegunowych (W IJOW-SKA i wspó³aut. 1999b). W kontrolnych kwia-tach, po wolnym zapyleniu, znajdowano doj-rza³e, 8-j¹drowe megagametofity z obecnoœci¹ 2 j¹der biegunowych w komórce centralnej. Nawet w zap³odnionych woreczkach zal¹¿ko-wych, gdzie komórka plemnikowa widoczna by³a w komórce jajowej, j¹dra biegunowe nadal nie ulega³y fuzji. W niezapylonych kwia-tach, pozostawionych w izolacji przez trzy ty-godnie, znajdowano wy³¹cznie komórkê cen-tralna z 2 j¹drami biegunowymi. Podobnie w materiale hodowanym in vitro, po czterech dniach kultury, w niezap³odnionych

worecz-kach zal¹¿kowych nadal stwierdzano obec-noœæ w komórce centralnej j¹der biegunowych obok aparatu jajowego. Powy¿sze obserwacje wskazuj¹ raczej na pochodzenie autonomicz-nej endospermy u tego taksonu z j¹der biegu-nowych (lub jednego j¹dra biegunowego) ani¿eli j¹dra wtórnego. To oznacza³oby, ¿e au-tonomicznie rozwijaj¹ca siê endosperma jest haploidalna. Autorzy (WIJOWSKA i wspó³aut. 1999b) nie wykluczaj¹ jednak mo¿liwoœci fuzji j¹der biegunowych w toku trwania kultury.

U Lupinus luteus, Helleborus niger i

Melan-drium album w wiêkszoœci pierwotnych

eks-plantatów wystêpowa³y j¹dra biegunowe, ale w trakcie kultury, w licznych zal¹¿kach, obser-wowano równie¿ j¹dro wtórne (MÓL i wspó³aut. 1995), co sugeruje rozwój autono-micznego bielma w wyniku podzia³ów j¹der biegunowych lub j¹dra wtórnego.

Rozwój autonomicznej endospermy z wtórnego j¹dra komórki centralnej notowano tak¿e w kulturach niezapylonych zal¹¿ków

Gossypium hirsutum (JENSEN i wspó³aut. 1977), zaœ z j¹der biegunowych u ry¿u i bawe³ny (ZHOU i YANG 1981, HUANG i wspó³aut. 1982).

Endosperma indukowana in vitro z regu³y sk³ada siê z kilku do kilkdziesiêciu j¹der. U

Vio-la odorata, w zal¹¿kach po 4–7 dniach kultury

liczba j¹der autonomicznej endospermy waha³a siê od 10 do 50 (Ryc. 2), zaœ u rzepaku miedzy 3 a 14 dniem kultury od 2–20, a u

Al-lium cepa do trzeciego tygodnia kultury od 4

do 30. Wieloj¹drowe autonomiczne bielmo ob-serwowano u Helleborus niger; niektóre

zal¹¿ki zawiera³y 260–420 j¹der. Jednak w ¿ad-nym z zal¹¿ków nie zauwa¿ono celularyzacji endospermy. Czêœciow¹ celularyzacjê bielma u tego gatunku obserwowano jedynie w pó³na-turalnych warunkach hodowlanych, a tak¿e sporadycznie (w jednym zal¹¿ku) w warun-kach in vitro u Melandrium album (MÓL

1992). Przedwczesn¹ celularyzacjê autono-micznej endospermy uzyska³ JENSENi wspó³au-torzy (1977) po zastosowaniu egzogennych hormonów (IAA i GA3).

Do niedawna twierdzono, ze w kulturze nie-zapylonych zal¹¿ków i zal¹¿ni, w jednym wo-reczku zal¹¿kowym, rozwija³a siê tylko autono-miczna endosperma lub wy³¹cznie haploidalny zarodek (MÓL 1999). Ostatnie badania nad

Al-lium cepa udowodni³y, ¿e zarówno zarodek, jak

i endosperma mog¹ rozwijaæ siê w jednym zal¹¿ku w warunkach kultury in vitro nie-zap³odnionych zal¹¿ków (MUSIA£ i wspó³aut.

2001). Rozwój haploidalnego zarodka i autono-micznej endospermy w obrêbie tego samego zal¹¿ka opisywano tak¿e w przypadku ekspery-mentów z zapylaniem in situ napromieniowa-nym py³kiem u Actinidia deliciosa (MUSIA£ i PRZYWARA 1998, 1999a), u przedstawicieli ro-dzaju Nicotiana (MUSIA£i PRZYWARA1999b) i u

Prunus domestica (PEIXE i wspó³aut. 2000).

Zak³ócenia w pocz¹tkowej fazie rozwoju cenotycznego bielma w kulturach in vitro po-legaj¹ce na nietypowym rozmieszczeniu j¹der w cytoplazmie wype³niaj¹cej ca³e wnêtrze wo-reczka zal¹¿kowego, zahamowaniu procesu ce-lularyzacji oraz wyraŸnym opóŸnieniu w roz-woju autonomicznego bielma w porównaniu z bielmem kontrolnym, mog¹ wynikaæ ze zmia-ny ekspresji genów odpowiedzialzmia-nych za cykl Ryc. 2. Autonomiczne bielmo j¹drowe (ab) zain-dukowane w niezapylonych, izolowanych zal¹¿kach Viola odorata po 6 dniach kultury na po¿ywce MS+0,1mg/l 2,4-D; pow. 400× (zdjêcie udostêpnione przez dr M. Stêpieñ-Wijowsk¹).

komórkowy, tworzenie siê radialnego systemu mikrotubul i cytokinezê. Wiadomo bowiem, ¿e w kulturach in vitro tkanek roœlinnych zmiany poziomu metylacji cytozyny wp³ywaj¹ na eks-presj¹ genów; geny, które ulegaj¹ ekspresji maj¹ obni¿on¹ metylacjê (patrz OLSZEWSKA i wspó³aut. 1999). Nie mo¿na wiêc wykluczyæ, ¿e w warunkach kultury in vitro niezap³odnio-nych zal¹¿ków i zal¹¿ni nastêpuje zmiana eks-presji genów (zahamowanie ekseks-presji genów) blokuj¹cych podzia³y j¹dra wtórnego b¹dŸ

j¹der biegunowych przed zap³odnieniem, ale byæ mo¿e jest to jedynie wp³yw regulatorów wzrostu na indukcjê podzia³ów mitotycznych w komórce centralnej. Hipotezy te wymagaj¹ dalszych badañ na poziomie molekularnym.

Autonomiczna endosperma zaindukowana w œciœle zdefiniowanych warunkach ekspery-mentalnych mo¿e okazaæ siê uk³adem modelo-wym do badania mechanizmów ró¿nicowania siê tej tkanki; mo¿e równie¿ rzuciæ œwiat³o na rolê udzia³u genomu ojcowskiego na rozwój bielma.

AUTONOMICZNY ROZWÓJ BIELMA U ROŒLIN APOMIKTYCZNYCH Termin apomiksja oznacza bezp³ciowy

roz-wój roœlin, w którym ominiête s¹ dwa etapy charakterystyczne dla rozmna¿ania p³ciowego: mejoza (czêœciowo lub ca³kowicie) oraz zap³odnienie komórki jajowej. Zarodek rozwi-ja siê na drodze partonogenezy zaœ bielmo au-tonomicznie (u apomiktów autonomicznych) lub po zap³odnieniu komórki centralnej (apo-mikty pseudogamiczne). Pocz¹tkowo termin ten mia³ bardzo szeroki zakres i obejmowa³ wszystkie typy rozmna¿ania bezp³ciowego, ³¹cznie z rozmna¿aniem wegetatywnym, w któ-rych nowy organizm powstawa³ bez po³¹cze-nia siê gamet (syngamii). Obecnie apomiksja zawê¿ona jest do agamospermii, czyli rozmna-¿ania przez nasiona; zarodek powstaje bez pro-cesu zap³odnienia (patrz NOGLER1984; CZAPIK

1991, 1997, 1999, 2000a, b).

Apomiksja mo¿e byæ uwa¿ana za rozwojow¹ odmianê p³ciowej drogi rozmna¿ania, w której okreœlone etapy zosta³y skrócone (KOLTUNOW

1993). Przy takim za³o¿eniu, oba typy rozmna-¿ania powinny mieæ wiele wspólnych sk³adni-ków regulatorowych. Jest wysoce prawdopo-dobne, ¿e geny kontroluj¹ce apomiksjê, odgry-waj¹ równie¿ kluczow¹ rolê w rozmna¿aniu p³ciowym. Zatem genetyczna in¿ynieria apo-miksji bêdzie wymaga³a zrozumienia genetycz-nych podstaw i molekulargenetycz-nych mechanizmów kontroluj¹cych rozmna¿anie p³ciowe. Niestety, jak dot¹d, problemy te s¹ bardzo s³abo poznane (patrz GROSSNIKLAUS 2001).

Potomstwo powsta³e w wyniku agamosper-mii jest matroklinalne, co oznacza, ¿e fenotypo-wo jest podobne do organizmu matecznego. Jest to zatem naturalna droga klonowania ro-œlin przez nasiona. Jednak nale¿y pamiêtaæ o mo¿liwoœci powstawania mieszañców typu

B3, gdy niezredukowana komórka jajowa mo¿e byæ zap³odniona przez zredukowany plemnik.

Nale¿y podkreœliæ, ¿e bielmo wykszta³ca siê u wszystkich badanych do tej pory apomiktów. Jest to zjawisko charakterystyczne zarówno dla apomiktów gametofitowych, jak i sporofito-wych. U tych ostatnich rozwój zarodka przyby-szowego jest zale¿ny od obecnoœci bielma po-wsta³ego na drodze p³ciowej (patrz G ROS-SNIKLAUS 2001).

Ogólnie, apomiksja jest szeroko rozprze-strzeniona wœród roœlin okrytonasiennych i uznaje siê, ¿e ewoluowa³a niezale¿nie w kilku taksonach z rozma¿aj¹cych siê p³ciowo przod-ków. Szacuje siê, ¿e apomiksja wystêpuje u 300–400 taksonów (podawany zakres liczby taksonów apomiktycznych jest dosyæ szeroki, co wynika z ró¿nego podejœcia autorów do ran-gi jak¹ nadaje siê mikrogatunkom rozmna-¿aj¹cym siê bezp³ciowo) nale¿¹cych do ok. 40 rodzin. Wiêkszoœæ taksonów apomiktycznych (75%) nale¿y do 3 rodzin: Asteraceae, Poaceae i Rosaceae. Wystêpowanie apomiksji i jej form nie jest przypadkowe. Diplosporia jest po-wszechna wœród Asteraceae, a mniej czêsta u pozosta³ych dwóch rodzin. Natomiast apospo-ria wystêpuje z najwiêksz¹ frekwencj¹ u Rosa-ceae i PoaRosa-ceae, zaœ rzadko u AsteraRosa-ceae. Auto-nomiczna apomiksja wydaje siê byæ ograniczo-na g³ównie do Asteraceae; u dwóch pozo-sta³ych rodzin wystêpuje sporadycznie (patrz NOGLER 1984, GROSSNIKLAUS 2001, G RIMA-NELLI i wspó³aut. 2001).

We florze Polski, spoœród 2620 opisanych taksonów (MIREK i wspó³aut. 1995), u 63 (ok. 2,5%) nale¿¹cych do 3 wy¿ej wymienionych ro-dzin wystêpuje rozwój na drodze agamosper-mii, b¹dŸ stwierdzono u nich wystêpowanie

okreœlonych procesów apomiktycznych (CZAPIK i KOŒCIÑSKA-PAJ¥K 2000).

Najnowsze osi¹gniêcia i trendy w bada-niach nad apomiksj¹ dotycz¹ce g³ównie gene-tycznych podstaw i molekularnych mechani-zmów, jak równie¿ perspektywy badañ przed-stawiaj¹ artyku³y przegl¹dowe zebrane w ksi¹¿ce pt. „The flowering apomixis: from me-chanisms to genetic engineering” wydanej w 2001 r. pod zbiorow¹ redakcj¹ Y. Savidana, J.G. Carmana, T. Dresselhausa.

U zdecydowanej mniejszoœci apomiktów, rozwój bielma jest autonomiczny, czyli nie jest konieczne zap³odnienie komórki centralnej i tym samym bielmo powstaje bez udzia³u geno-mu ojcowskiego. Tak wiêc przewidywany sto-sunek genomów rodzicielskich w bielmie u tych form powinien wynosiæ 4 (mateczne):0 (ojcowskie) przy za³o¿eniu, ¿e bielmo rozwija siê z j¹dra wtórnego powsta³ego po fuzji j¹der biegunowych, b¹dŸ 2:0 kiedy bielmo powstaje na skutek podzia³ów pojedynczych j¹der bie-gunowych.

Chocia¿ py³ek jest zbêdny u autonomicz-nych apomiktów, to jednak rzadko kwiaty s¹ mêskosterylne. S¹ natomiast przypadki form np. w rodzaju Alchemilla, u których py³ek w ogóle nie jest wykszta³cony (IZMAI£OW1986). Przyk³adem roœliny uniezale¿nionej od zapyle-nia jest rozdzielnop³ciowy gatunek

Antenna-ria alpina s.l., w obrêbie którego wyró¿niono

setki taksonów znanych tylko z ¿eñskich oka-zów (patrz NOGLER 1984).

Bielmo autonomicznych apomiktów sk³ada siê z j¹der o ró¿nym stopniu ploidalnoœci. Na podstawie badañ embriologicznych po³¹czo-nych ze szczegó³ow¹ analiz¹ kariologiczn¹ biel-ma autonomicznych apomiktów z rodzin Aste-raceae (Taraxacum — MA£ECKA 1967, 1973, 1982; Hieracium — SKAWIÑSKA 1962, SKALIÑSKAi KUBIEÑ1972, SKALIÑSKA1973, P O-GAN i WCIS£O 1995, Chondrilla — K OŒCIÑ-SKA-PAJ¥K 1996) i Rosaceae (Alchemilla —

IZMAI£OW1986, 1994) wynika, ¿e u badanych taksonów autonomiczne bielmo powstaje w wyniku podzia³ów: (i) wtórnego j¹dra bêd¹cego efektem fuzji 2 j¹der biegunowych o niezredukowanej liczbie chromosomów; (ii) pojedynczych, niezredukowanych j¹der nowych; (iii) wtórnego j¹dra b¹dŸ j¹der biegu-nowych.

W toku rozwoju autonomicznego bielma dochodzi do zró¿nicowania kariologicznego tej tkanki (powstaj¹ j¹dra o aneuploidalnej i po-liploidalnej liczbie chromosomów), u podstaw którego le¿¹ zak³ócenia w przebiegu mitozy (powstawanie mostów anafazowych, zlewanie siê p³ytek metafazowych, powstawanie j¹der restytucyjnych) oraz procesy endoreplikacyj-ne (endomitoza, endoreduplikacja), co œwiad-czy o tym, ze te same mechanizmy s¹ odpowie-dzialne za zró¿nicowanie bielma autonomicz-nego jak i powsta³ego w wyniku zap³odnienia komórki centralnej (patrz art. ROJEKi KUTAw tym numerze KOSMOSU).

Wystêpowanie autonomicznych apomik-tów nasuwa pytanie, czy w przypadku takich taksonow mo¿na mówiæ o imprintingu geno-mowym. Przypuszcza siê, ¿e u rozmna¿aj¹cych siê p³ciowo gatunków, jak równie¿ u pseudo-gamicznych apomiktów spoœród genów odpo-wiedzialnych za rozwój endospermy, ekspresji ulegaj¹ g³ównie geny pochodz¹ce od genomu ojcowskiego. Je¿eli uzna siê, ¿e te geny s¹ wy-starczj¹ce do rozwoju bielma, to w przypadku autonomicznego rozwoju endospermy, nale¿y za³o¿yæ, ¿e ekspresji ulegaj¹ geny pochodz¹ce od genomu matczynego, czyli nie wystêpuje imprinting matczyny.

Byæ mo¿e w toku ewolucji roœlin okrytona-siennych, imprinting genomowy ulega³ mody-fikacji b¹dŸ by³ „usuwany” (wymazany) kilka razy, co umo¿liwi³o powstanie autonomicz-nych apomiktów w takich taksonach (GRIMANELLI i wspó³aut. 1997).

AUTONOMICZNY ROZWÓJ BIELMA A IMPRINTING GENOMOWY W jaki sposób mo¿e dojœæ do rozwoju

auto-nomicznej endospermy in vivo, czyli w warun-kach kiedy nie wystêpuje zap³odnienie komórki centralnej i nie jest zachowany stosunek geno-mów rodzicielskich (2 matczyne : 1 ojcowski), wymagany do normalnego rozwoju bielma u rozmna¿aj¹cych siê p³ciowo roœlin okrytona-siennych? Przy za³o¿eniu, ¿e u podstaw

wyma-ganego stosunku genomów le¿¹ ró¿nice epige-netyczne genomów rodzicielskich, co oznacza, ¿e w ka¿dym z genomów, okreœlony zestaw ge-nów jest inaktywowany w specyficzny dla danej p³ci sposób, mo¿na s¹dziæ, ¿e kiedy nast¹pi³oby „usuniêcie” (wymazanie) imprintingu (ang. re-moval of imprints) z genomu endospermy po-chodz¹cego od matki, co doprowadzi³oby do

ekspresji genów matczynych (normalnie inak-tywowanych), to w efekcie mog³oby zast¹piæ brakuj¹cy genom ojcowski. Potwierdzeniem tej hipotezy jest uzyskany mutant fie Arabidopsis o

nisko zmetylowanym genomie, u którego roz-wój endospermy przebiega normalnie mimo braku zap³odnienia. (VINKENOOG i wspó³aut. 2000, VINKENOOG i SCOTT 2001).

ENDOSPERM — NUTRITIVE TISSUE FOR EMBRYO

II. AUTONOMOUS DEVELOPMENT OF ENDOSPERM IN ANGIOSPERMS (ANGIOSPERMEAE)

S u m m a r y In sexually reproducing flowering plants both

embryo and endosperm development is initated by fertilization (double fertilization) and in the vast ma-jority of these plants a ratio of 2 maternally derived genomes to 1 paternally derived genom (2m:1p) is es-sential for endosperm formation and therefore for seed development. However, there is a group of taxa in which reproductive development is fertiliza-tion-independent. The occurrence of autonomous endosperm is well-known phenomenom in autono-mous apomicts and a very rare one in amphimictic

taxa. The development of fertilization-independent endosperm can be induced experimentally with the use of irradiated pollen and also through in vitro cul-ture of unfertilized ovules or ovaries.

In this review the problem of genomic imprinting is discussed in the light of autonomous endosperm de-velopment without paternal genome involvement. How genomic imprinting can be overcome in the case of autonomous endosperm development in flowering plants?

LITERATURA

ADAMOWICZE., KUTAE., PRZYWARAL., 2000. Embryologi-cal analysis of unfertilized ovules of tomato (Ly-copersicon esculentum Mill.) cultured in vitro.

Acta Biol. Cracov. Ser. Bot. 42 (Suppl.1), 34. BHOJWANIS. S., THOMAST. D., 2001. In vitro

gynogene-sis. [W:] Current Trends in the Embryology of An-giosperms. BHOJWANIS. S., SOHW. Y., (red.). Kluwer Academic Publishers, Netherlands, 489–507. BOHANECB., 1994. Induction of gynogenesis in

agricul-tural crops: review. Proceedings of IBPA, 5–7

De-cember 1994, Rogla, 43–55.

BROULANDM., 1968. A propos de la formation de l’albu-men á partir du noyau secondaire non fécondé chez l’Anemone nemorosa. Ann. Univ. Ares 5,

165–169.

CAMPIONB., BOHANECB., JAVORNIKB., 1995. Gynogenic lines of onion (Allium cepa L.): evidence of their homozygosity. Theoret. Appl. Genet. 91, 598–602.

CASTILLOA. M., CISTUEL., 1993. Production of

gynoge-nic haploids of Hordeum vulgare L. Plant Cell Rep.

12, 139–143.

CHMIELOWIECM., KUTAE., PRZYWARAL., 1997. An attemt

to induce gynogenesis in Brassica napus L. Acta

Biol. Cracov. Ser. Bot. Zool. 38 (Suppl. 1), 49. CZAPIKR., 1991. Some research problems of the

endo-sperm in Angioendo-spermae. Polish Bot. Stud. 2,

109–120.

CZAPIKR., 1997. Theoretical aspects of apogamety in

Angiosperms. Bull. Polish Acad. Sci. Biol. Sci. 45,

2–4.

CZAPIKR., 1999. Enigma of apogamety. Protoplazma

208, 206–210.

CZAPIKR., 2000a. Controversy around apomixis. Acta Biol. Cracov. Ser. Bot. 42/2, 55–59.

CZAPIKR., 2000b. Apomixis in Monocotyledons. [W:] Grases: Systematic and Evolution. JACOBS S. W., EVERETT J. (red.). CSIRO, Melbourne, 316–321.

CZAPIKR., KOŒCIÑSKA-PAJ¥KM., 2000. Apomictic studies and agamospermy in Polish flora. Bot.

Guidebo-oks 24, 129–149.

FALQUEM., KODIAA. A., SOUNIGO, ESKESA.B., CHARRIERA., 1994. Gamma irradiation of cacao (Theobroma

cacao L.) pollen: efect on pollen grain viability, germination and mitosis and on fruit set.

Euphyti-ca 64, 167–172.

FARISN. M., NIEMIROWICZ-SZCZYTTK., 1999. Cucumber (Cucumis sativus L.) embryo development in situ after pollination with irradiated pollen. Acta Biol.

Cracov. Ser. Bot. 41, 411– 418.

GOLDBERGR. B., FISCHERR. L., 1999. Control of

fertiliza-tion-indepedendent endosperm by the MEDEA polycomb gene in Arabidopsis. Plant Biol. 96,

4186–4191.

GRIMANELLID., HERNANDEZM., PERROTIE., SAVIDAN Y., 1997. Dosage effects in the endosperm of

diplospo-rous apomictic Tripsacum (Poaceae). Sex. Plant

Reprod. 10, 279–182.

GRIMANELLI D., TOHMEJ., GONZÁLEZ-DE-LEÓN D., 2001.

Application of molecular genetics in apomixis re-search.[W:] The Flowering of Apomixis: From Me-chanisms to Genetic Engineering. SAVIDAN Y.,

CARMANJ. G., DRESSELHAUST. (red.). CIMMYT, IRD & EU’s RTD FAIR program, 83–94.

GROSSNIKLAUS U., 2001. From sexuality to apomixis:

molecular and genetic approaches. [W:] The Flo-wering of Apomixis: From Mechanisms to Genetic Engineering. SAVIDANY., CARMANJ. G., DRESSELHAUS

T. (red.). CIMMYT, IRD & EU’s RTD FAIR program, 168–211.

GROSSNIKLAUS U., VIELLE-CALZADA J. P., HOEPNERM. A., GAGLIANOW. B., 1998. Maternal control of

embry-ogenesis by MEDEA a polycomb group gene in Arabidopsis. Science l280, 446–450.

GROSSNIKLAUS U., SPILLANE C., PAGE D. R., KOHLER C., 2001. Genomic imprinting and seed

develop-ment: Endosperm formation with and without sex. Curr. Opin. Plant Biol. 4, 21–27.

HUANGQ. F., YANGH.Y., ZHOUC., 1982. Embryological

observation on ovary culture of unpollinated yo-ung flowers of Hordeum vulgare L. Acta Bot. Sin.

24, 295–300.

IZMAI£OWR., 1986. Cyto-embryological studies on Al-chemilla L. (series Calycinae Buser). II. Apomictic processes in ovules. Acta Biol. Cracov. Ser. Bot. 28,

39–63.

IZMAI£OWR., 1994. Embryo and endosperm relations at early stages of their development in Alchemilla subsect. Heliodrosium (Rosaceae). Polish Bot.

Stu-dies 8, 61–67.

JAMESD. J., PASSEYA. J., MACKENZIEK. A. D., MENHINICKE.

C., 1985. The effect of pollen irradiation on the

development of the postfertilization ovule of ap-ple (Malus pumila Mill.). [W:] Experimental Manipulation of Oule Tissues. CHAPMANG. P. C., MANTELL S., DANIELSR. (red.). Longman, London, 210–224.

JENSENW. A., SCHULTZP., ASHTONM. E., 1977. An

ultra-structural study of early endosperm development and synergid changes in unfertilized cotton ovu-les. Planta 133, 179–189.

KIYOSUET., OHADN., YADEGARIR., HANNONM., DINNEY

M., WELLSD., KATZA., MAGROSSIANL., HARADAJ. J., GOLDBERGR. B., FISCHERR. L., 1999. Control of

ferti-lization-indepedendent endosperm by the MEDEA polycomb gene in Arabidopsis. Plant Biol. 96,

4186–4191.

KOLTUNOWA. M., 1993. Apomixis: Embryo sac and

em-bryos formed without meiosis or fertilization in ovules. Plant Cell 5, 1425–1437.

KOLTUNOW A. M., BICKNELL R. A., CHAUDHRURY A. M., 1995. Apomixis: Molecular strategies for the

gene-ration of genetically identical seeds without ferti-lization. Sex. Plant Reprod. 12, 253–266.

KOŒCIÑSKA-PAJ¥KM.., 1996. Embryological problems in

the apomictic species Chondrilla juncea L. (Com-positae). Folia Geobot. Phytotax. 31, 397–403.

LAIKOVAL. I., 1976. Cytoembryological findings about

autonomous formation of endosperm in maize.

[W:] Apomixis and Breeding. KHOKHLOV S. S. (red.). Amerind, New Delhi, 109–112.

LEDEUNFFE., SAUTONA., 1994. Effect of parthenocarpy

on ovule development in cucumber (Cucumis sa-tivus L.) after pollination with normal and irra-diated pollen. Sex. Plant Reprod. 7, 221–228.

LUOM., BILODEAUP., KOLTUNOWA., DENNISE. S., PEACOC

W. J., CHAUDHURYA. M., 1999. Genes controling

fer-tilization-independent seed development in Ara-bidopsist thaliana. Proc. Nat. Acad. Sci. USA 96,

296–300.

LUOM., BILODEAUP., KOLTUNOWA., DENNISE. S., PEACOC

W. J., CHAUDHURYA. M., 2000. Expression and pa-rent-of-origin effects for FIS2, MEA, and FIE in the endosperm and embryo of developing Arabi-dopsis seeds. Proc. Nat. Acad. Sci. USA 97,

10637–10642.

MA£ECKA J., 1967. Cytoembryological studies in

Ta-raxacum scanicum. Acta Biol. Cracov. Ser. Bot. 10,

195–207.

MA£ECKAJ., 1973. Problems of the mode of

reproduc-tion in microspecies of Taraxacum secreproduc-tion Palu-stria Dahlstedt. Acta Biol. Cracov. Ser. Bot. 16,

127–135.

MA£ECKAJ., 1982. Further embryological studies in the

genus Taraxacum L. Acta Biol. Cracov. Ser. Bot.

24, 143–157.

MIREKZ., PIÊKOŒ-MIREKH., ZAJ¥CA., ZAJ¥CM., 1995.

Va-scular plants of Poland. Polish Bot. Studies,

Guide-book Series 15, 1–303..

MÓLR., 1992. In vitro gynogenesis in Melandrium

al-bum: from partenogenetic embryos to mixoploid plants. Plant Sci. 81, 261–296.

MÓLR., 1999. Embryological aspects of in vitro

gyno-genesis in plant organ cultures. Acta Biol. Cracov.

Ser. Bot. 41, 67–74.

MÓLR., BETKAA., WOJCIECHOWICZM., 1995. Induction

of autonomous endospem in Lupinus luteus, Hel-leborus niger and Melandrium album by in vitro culture of unpollinated ovaries. Sex. Plant

Re-prod. 8, 273–277.

MUKHAMBETZHANOV S. K., 1997. Culture of nonfertili-zed female gametophytes in vitro. Plant Cell

Tis-sue and Organ Culture 48, 111–119.

MUSIA£K., PRZYWARAL., 1998. Influence of irradiated

pollen on embryo and endosperm development in kiwifruit. Ann. Bot. 82, 747–756.

MUSIA£K., PRZYWARAL., 1999a. Pollination with

heavi-ly irradiated pollen in Nicotiana: induced parthe-nogenesis and embryological study. Acta Biol.

Cra-cov. Ser. Bot. 4, 127–137.

MUSIA£K., PRZYWARAL., 1999b. Endosperm response to

pollen irradiation in kiwifruit. Sex. Plant Repord.

12, 110–117.

MUSIA£ K., PRZYWARA L., 2001. Gynogeneza u roœlin. Kosmos, 1–2, 39–48.

MUSIA£K., BOHANECB., PRZYWARAL., 2001.

Embryologi-cal study on gynogenesis in onion (Allium cepa L.). Sex. Plant Reprod. 13, 335–341.

NICOLLM. F., CHAPMANG. P., JAMES D. J., 1987.

Endo-sperm responses to irradiated pollen in apples.

Theoret. Appl. Genet. 74, 508–515.

NOGLERG. A., 1984. Gametophytic apomixis. [W:]

Em-bryology of Angiosperms. JOHRIB. (red.). Springer, Berlin, 475–518.

OHADN., MAGROSSIANL., HSUY. C., WILLIAMSC., REPPETII

P., FISCHERR. L., 1996. A mutation that allow

endo-sperm development without fertilization. Plant

Biol. 93, 5319–5324.

OHAD N., YADEGARI R., MAGROSSIAN L., HANNON M., HARADAJ. J., GOLDBERGR. B., FISCHERR. L., 1999.

Mu-tation in FIE polycomb group gene, allow endo-sperm development without fertilization. Plant

Cell 11, 407–416.

OLSZEWSKA M., 1999. Podstawy Cytogenetyki Roœlin. PWN, Warszawa.

OPOKAJ., 2001. Badania embriologiczne i kultury in

vitro niezapylonych zal¹¿ni Viola x wittrockiana i V. cornuta. Praca magisterska, Uniwersytet

Ja-gielloñski, Kraków.

PEIXEA., CAMPOSM. D., CAVALEIROC., BARROSOJ., PAISM.

S., 2000. Gamma-irradiated pollen induces the

formation of 2n endosperm and abnormal em-bryo development in European plum (Prunus

do-mestica L., cv. ‘Rainha Cludia Verde’). Sc. Hort. 86,

267–278.

POGANE., WCIS£OH., 1995. Embryological analysis of

Hieracium pilosella L. Acta Biol. Cracov. Ser. Bot.

37, 53–61.

ROJEKJ., 2000. Indukcja autonomicznej endospermy

w kulturze niezapylonych zal¹¿ni Brassica na-pus cv. Topas. Praca magisterska. Uniwersytet

Ja-gielloñski, Kraków.

ROJEKJ., KUTAE., PRZYWARAL., 2000. Indukcja

autono-micznej endospermy w kulturze niezapylonych zal¹¿ni (Brassica napus L. cv. Topas). V

Ogólno-polska Konferencja, Zastosowanie Kultur in vitro w Fizjologii Roœlin. Kraków 14–15.XII. 2000, 52. SAVIDANY., 2001 Gametophytic apomixis. [W:]

Cur-rent Trends in the Embryology of Angiosperms.

BHOJWANIS. S., SOHW. Y. (red.). Cluwer Academic Publishers, Netherlands, 419– 433.

SKALIÑSKAM., 1973. Further studies in facultative apo-mixis of Hieracium aurantiacum L. Acta Biol.

Cra-cov. Ser. Bot. 16, 121–133.

SKALIÑSKAM., KUBIEÑE., 1972. Cytological and

embryo-logical studies in Hieracium pratense Tausch.

Acta Biol. Cracov. Ser. Bot. 15, 39–50.

SKAWIÑSKAR., 1962. Apomixis in Hieracium alpinum

L. Acta Biol. Cracov. Ser. Bot. 5, 89–96.

STÊPIEÑ-WIJOWSKA M., 2002. Kultury niezapylonych

zal¹¿ni i zal¹¿ników przedstawicieli rodzaju Viola L. Praca doktorska, Uniwersytet Jagielloñski,

Kraków.

TADEOF. R., TALONM., GERMAINE., DOSBAF., 1994.

Em-bryo sac development and endogenous giberellins in pollinated and unpollinated ovaries of valnut (Juglans regia). Physiol. Plant. 91, 37–44.

TRELA Z., 1963a. Embryological studies in Anemone

nemorosa L. Acta Biol. Cracov. Ser. Bot. 6, 1–14.

TRELAZ., 1963b. Cytological studies in the

differentia-tion of the endosperm in Anemone nemorosa L.

Acta Biol. Cracov. Ser. Bot. 6, 177–183.

TRELA-SAWICKAZ., 1974. Embryological studies in

Ane-mone ranunculoides L. from Poland. Acta Biol.

Cracov. Ser. Bot. 17, 1–11.

VINKENOOGR., SCOTT R. J., 2001. Autonomous

endo-sperm development in flowering plants: how to overcome the imprinting problem? Sex. Plant

Re-prod. 14, 189–194.

VINKENOOG R., SPIELMAN M., ADAMS S., FISCHER R.L.,

DICKINSONH. G., SCOTTR. J., 2000.

Hypomethyla-tion promotes autonomous endosperm deve-lopment and rescues postfertilization lethality in fie mutants. Plant Cell 12, 2271–2282.

WIJOWSKAM., KUTAE., 2000. Embryological analysys

of unpollinated ovaries of Viola L. cultured in vi-tro. Acta Biol. Cracov. Ser. Bot. 42 (Suppl. 1), 31.

WIJOWSKAM., KUTAE., PRZYWARAL., 1999a. In vitro

cul-ture of unpollinated ovules of Viola odorata L.

Acta Biol. Cracov. Ser. Bot. 41, 95–101.

WIJOWSKA M., KUTA E., PRZYWARA L., 1999b.

Autono-mous endosperm induction by in vitro culture of unfertilized ovules of Viola odorata L. Sex. Plant

Reporod. 12, 164–170.

YANGH.Y., ZHOUC., 1982. In vitro induction of haploid

plants from unpollinated ovaries and ovules.

The-oret. Appl. Genet. 63, 97–104.

YANGH.Y., ZHOUC., CEID., YANH., CHENX., 1986. In

vi-tro culture of unfertilized ovules in Hellianthus annuus L. [W:] Haploids of Higher Plants in vitro.

HUH., YANGH. (red.). Springer-Varlag, Berlin, He-idelberg, New York, 182–191.

ZHANGY. X., LESPINASSEY., 1991. Pollination with

gam-ma-irradiated pollen and development of fruits, seeds and parthenogenetic plants in apple.

Euphy-tica 54, 101–109.

ZHOUC., YANGH., 1981. Induction of haploid rice