[2008/Nr 3] Wpływ inhibitora katepsyny D z łupin nasion wyki siewnej na aktywność enzymów proteolitycznych

(1)

Wiesława Roszkowska-Jakimiec, Agnieszka Krupkowska, Katarzyna Bielawska, Elżbieta Milewska

WPŁYW INHIBITORA KATEPSYNY D Z ŁUPIN NASION WYKI SIEWNEJ NA AKTYWNOŚĆ ENZYMÓW PROTEOLITYCZNYCH

Zakład Analizy Instrumentalnej Uniwersytetu Medycznego w Białymstoku Kierownik: dr hab. n. med. W. Roszkowska-Jakimiec

W pracy określono wrażliwość inhibitora katepsyny D na aktywność pepsyny, trypsyny, chymotrypsyny oraz plazminy. Stwierdzono, że inhibitor katepsuny D wyizolowany z łupin nasion wyki siewnej nieznacznie hamuje tylko aktywność plazminy.

Hasła kluczowe: łupiny nasion wyki, inhibitor katepsyny D, pepsyna, trypsyna, chy-motrypsyna.

Key words: common vetach seed peal, cathepsin D, pepsin, trypsin, chymotrypsin. Katepsyna D jest proteazą lizosomalną. Uczestniczy w degradacji białek komór-kowych i białek pozakomórkomór-kowych (1). Współuczestniczy w powstawaniu i rozwo-ju stanów zapalnych, niedokrwienia mięśnia sercowego, chorób wątroby, dystroﬁ i mięśniowej, stwardnienia rozsianego oraz w rozroście i przerzutach nowotworo-wych (2, 3, 4). Katepsyna D nie posiada inhibitorów endogennych, natomiast egzo-gennymi naturalnymi inhibitorami tej proteazy jest pepstatyna (wytwarzana przez bakterie rodzaju Streptomyces) (5) i inhibitor występujący w bulwach ziemniaka (6). Są to jednak inhibitory mało specyﬁ czne. Hamują także aktywność innych proteaz: pepsyny, trypsyny i chymotrypsyny (7, 8).

Z łupin nasion wyki siewnej (odmiana Szelejewska) wyizolowano inhibitor ka-tepsyny D. Inhibitor kaka-tepsyny D z łupin nasion wyki może być przydatny w le-czeniu stanów chorobowych, którym towarzyszy wzmożona proteoliza, np. trudno gojące się rany, wrzody żołądka.

Celem pracy było określenie wrażliwości inhibitora katepsyny D na aktywność proteaz aspartylowych (pepsyny) oraz proteaz serylowych (trypsyny, chymotrypsy-ny oraz plazmichymotrypsy-ny).

MATERIAŁ I METODY

Odczynniki: pepsyna, trypsyna, chymotrypsyna, plazmina, kwas trichlorooctowy, Sigma-Aldrich, USA; hemoglobina, Disco Laboratories, USA; odczynnik Folina

i Ciocalteau, Merck, Niemcy.

W celu ustalenia wpływu peptydowego inhibitora katepsyny D na aktywność pepsyny, trypsyny i chymotrypsyny, do 0,125 cm3_{enzymu dodawano 0,125 cm}3 BROMAT. CHEM. TOKSYKOL. – XLI, 2008, 3, str. 262–264

(2)

Nr 3 Wpływ inhibitora katepsyny D na aktywność enzymów proteolitycznych 263 inhibitora (w kontroli 0,125 cm3_{0,15 mol/dm}3_{NaCl) i preinkubowano 30 min.}

w temp. 37°C. Następnie dodawano 0,250 cm3_{6% denaturowanej hemoglobiny}

i dalej inkubowano 2 h w tej samej temperaturze. Reakcję przerywano przez doda-nie 0,5 cm3_{10% kwasu trichlorooctowego. Aktywność pepsyny oznaczano w pH}

2,0, a trypsyny i chymotrypsyny w pH 7,5. W otrzymanym przez wirowanie płynie nadosadowym określono ilość uwolnionej tyrozyny za pomocą odczynnika Folina

i Ciocalteau (9).

Wpływ inhibitora katepsyny D na aktywność plazminy oceniano metodą fi bry-nolityczną (pomiar czasu fi brynolizy utworzonego skrzepu fi brynowego), metodą kazeinolityczną (pomiar ilości uwolnionej tyrozyny z substratu białkowego, kazei-ny) oraz metodą amidolityczną (pomiar ilości uwolnionej p-nitroaniliny z substratu chromogennego).

WYNIKI I ICH OMÓWIENIE

Wpływ inhibitora katepsyny D z łupin nasion wyki siewnej na aktywność prote-az aspartylowych (pepsyna) orprote-az serylowych (trypsyna, chymotrypsyna, plprote-azmina) przedstawiono w tab. I. Inhibitor ten hamuje aktywność plazminy w 14%.

Pozo-stałe proteazy nie są hamowane przez ten inhibitor.

Inhibitor katepsyny D z łupin nasion wyki siewnej nieznacz-nie hamuje równieznacz-nież aktywność ﬁ brynolityczną, kazeinolitycz-ną i amidolityczkazeinolitycz-ną plazminy (tab. II).

Inhibitor katepsyny D z łupin nasion wyki siewnej nie hamu-je proteaz o hydroﬁ lowym miejscu wiążącym substrat (trypsyna). Jedynie plazmina jest nieznacznie hamowana. Aktywność katepsyny D, enzy-mu o hydrofobowym miejscu wiążącym jest hamowana przez ten inhibitor. Natomiast aktyw-ność chymotrypsyny i pepsyny mimo, że enzymy te zawierają również hydrofobowe miejsce wiążące, nie zmienia się pod działaniem tego inhibitora. Powyższe fakty wskazują, że w interakcji enzymu z inhibitorem, obok struktury miejsca wiążącego i katalitycznego enzymu, istotnym czynnikiem jest struktura przestrzenna sąsiadujących z nimi cząsteczek białka enzymatycznego, decydująca o dostępności inhibitora.

Tabela I. Wpływ inhibitora katepsyny D na aktywność proteaz Table I. The effect of cathepsin D inhibitor on protease activities

Proteaza Aktywność, Tyr., nmol/cm 3 bez inhibitora z inhibitorem Pepsyna 296,0 ± 23,6 292,0 ± 26,3 Trypsyna 388,0 ± 34,9 376,7 ± 26,3 Chymotrypsyna 350,3 ± 28,0 338,5 ± 27,0 Plazmina 385,7 ± 26,9 331,7 ± 29,9

Tabela II. Wpływ inhibitora katepsyny D na aktywność plazminy Table II. The effect of cathepsin D on plasmine activity

Metoda Aktywność

bez inhibitora z inhibitorem Fibrynolityczna,

czas fibrynolizy, sek 435,0 ± 47,9 475,0 ± 41,3 Kazeinolityczna,

Tyr, nmol/cm3 384,0 ± 37,9 356,7 ± 31,3 Amidolityczna,

(3)

Nr 3

264 W. Roszkowska-Jakimiec i inni

WNIOSKI

1. Inhibitor katepsyny D z łupin nasion wyki siewnej nie hamuje aktywności pep-syny, trypsyny i chymotrypsyny.

2. Inhibitor ten nieznacznie hamuje aktywność plazminy.

W. R o s z k o w s k a-J a k i m i e c, A. K r u p k o w s k a, K. B i e l a w s k a, E. M i l e w s k a THE EFFECT OF CATHEPSIN D INHIBITOR ISOLATED FROM COMMON VETACH SEED

PEALS ON PROTEOLYTIC ENZYME ACTIVITY S u m m a r y

Cathepsin D inhibitor, isolated from common vetach seed peal, Szelejewska variety, does not inhibit the activities of pepsin, trypsin, and chymotrypsin but slightly inhibits plasmine activity.

PIŚMIENNICTWO

1. Barrett A.J.: Cathepsin D. Puriﬁ cation of isoenzymes from human and chicken liver. Biochem. J., 1970; 117: 601-607. – 2. Garcia M., Derocq D., Pujol P., Rochefort H.: Overexpression of transfected cathepsin D in transformed cells increases their malignant phenotype and metastatic potency. Oncogene, 1990; 5: 1809-1814. – 3. Lodice A.A.: The inhibition by pepstatin of cathepsin D and autolysis of dystropic muscle. Life Sci., 1976; 19: 1351-1358. – 4. Warwas M., Turowska E.: Znaczenie katepsyny D w diag-nostyce choroby nowotworowej. Post. Hig. Med. Dośw., 1993; 47: 277- 288. – 5. Morishima H., Takita

T., Aoyagi T., Takeuchi T., Umezawa H.: The structure of pepstatin. J. Antibiot., 1970; 23: 263-265. – 6.

Keilova H., Tomasek V.: Isolation and some properties of cathepsin D inhibitor from potatoes. Collection Czechoslov. Chem. Commun., 1976; 248: 489-497. – 7. Berezin V.A., Reva A.D., Schmatchenko N.A.,

Korobov V.I.: Wydielenije I oczistka katepsyna D iz kory gołownowo mozga byka i swini. Biochimija,

1979; 44: 1030-1035. – 8. Valueva T.A., Revina T.A., Kladnitskaya G.V., Mosolov V.V., Mentele P.: Pri-mary structure of a 21-kD protein from potato tubers. Biochemistry (Moscow), 1999; 64: 1258-1265. – 9.

Folin O., Ciocalteau V.: On tyrosine and tryptophane determinations in proteins. J. Biol. Chem., 1927;

73: 627-650.