M
A£GORZATA£
OBOCKA, O
LGAB
UGAJSKAi A
NETAD
OBRUK Zak³ad Biochemii DrobnoustrojówInstytut Biochemii i Biofizyki PAN Pawiñskiego 5A, 02-106 Warszawa e-mail: lobocka@ibb.waw.pl
PARTYCJA NISKOKOPIOWYCH PLAZMIDÓW WPROWADZENIE
Segregacyjna stabilnoœæ plazmidów zale¿y od czêstoœci z jak¹ ka¿da komórka potomna otrzymuje przynajmniej jedn¹ kopiê plazmidu od komórki matczynej w czasie podzia³u. Przy losowym rozmieszczeniu plazmidów w ko-mórce czêstoœæ ta jest wprost proporcjonalna do iloœci kopii plazmidu i mo¿e byæ obliczona ze wzoru: P= 1–0,52n, w którym n oznacza licz-bê kopii. Losowa segregacja wystarcza do sta-bilnego utrzymania w populacjach bakteryj-nych plazmidów wielokopiowych (Ryc. 1). Przyk³adowo w 500-tysiêcznej populacji bakte-rii zawieraj¹cych dziesiêciokopiowy plazmid a¿ 99,9999% z miliona komórek powsta³ych po jednym podziale bêdzie nadal zawiera³o ten plazmid. Natomiast plazmid jednokopiowy by³by obecny tylko w 75% komórek po podzia-le, co prowadzi³oby do jego szybkiej utraty. Chocia¿ czêstoœæ losowej utraty niskokopio-wych plazmidów powinna byæ du¿a, plazmidy te s¹ stabilnie utrzymywane w populacjach bakteryjnych. Okazuje siê, ¿e lokalizacja nisko-kopiowych plazmidów w komórkach nie jest przypadkowa, a dystrybucja ich zreplikowa-nych kopii zale¿y od procesu aktywnej segre-gacji (partycji). Partycja przypomina mitozê w tym, ¿e przed podzia³em komórkowym zrepli-kowane cz¹steczki plazmidu s¹ przemieszcza-ne z centrum komórki macierzystej do pozycji odpowiadaj¹cych przysz³ym centrom komó-rek potomnych (Ryc. 2). Tylko dwa bia³ka ko-dowane przez ka¿dy niskokopiowy plazmid s¹ niezbêdne dla procesu partycji. Dlatego
przy-puszcza siê, ¿e ich rola mo¿e polegaæ na pod-czepianiu cz¹steczek plazmidu do maszynerii
partycyjnej komórki. Partycja zale¿y od obec-noœci w cz¹steczkach plazmidowego DNA spe-cyficznych sekwencji, uwa¿anych za analogi centromerów eukariotycznych. S¹ one rozpo-znawane przez plazmidowe bia³ka partycyjne.
Numer 3
(256)
Strony 305–318
Ryc. 1. Schemat losowej segregacji plazmidu wie-lokopiowego (A) i jednokopiowego (B).
Bia³ka bakteryjne, które mog³yby uczestniczyæ w procesie przemieszczania plazmidów wewn¹trz komórki nie zosta³y dot¹d poznane, a badania nad rol¹ samych bia³ek plazmido-wych w ruchu plazmidów s¹ w toku.
Niespodziank¹ ostatnich lat by³o odkrycie homologów plazmidowych bia³ek partycyj-nych kodowapartycyj-nych przez chromosomy bakte-ryjne (GERDESi wspó³aut. 2000). Badania nad ich funkcj¹ u Bacillus subtilis, Caulobacter
cre-scentus i Pseudomonas putida wykaza³y, ¿e
uczestnicz¹ one w partycji chromosomów tych bakterii (LINi GROSSMAN1998, MOHLi GOBER
1997, GODFRIN-ESTEVENONi wspó³aut. 2002). Homologie bia³ek partycyjnych wskazuj¹, ¿e mimo ró¿nic w partycji chromosomów i pla-zmidów oba procesy maj¹ elementy wspólne.
Mechanizm aktywnej partycji jest ewolu-cyjnie stary i charakteryzuje siê szerok¹
uni-wersalnoœci¹ dzia³ania (GERDES i wspó³aut. 2000, YAMAICHI i NIKI 2000). Sekwencje cen-tromerowe plazmidów w po³¹czeniu z genami koduj¹cymi plazmidowe bia³ka partycyjne mog¹ byæ wykorzystane w formie kaset geno-wych w stabilizacji innych plazmidów. Funkcja tych kaset nie zale¿y od replikacji (TREPTOWi wspó³aut. 1994) ani od typu replikonu (AUSTIN
i wspó³aut. 1986, LINi GROSSMAN, 1998), ani nawet od ca³kowitej topologii DNA (G RIGO-RIEVi £OBOCKA2001). Kasety partycyjne funk-cjonuj¹ nawet po przeniesieniu z bakterii Gram-dodatnich do Gram-ujemnych. Plazmid zawieraj¹cy miejsce centromerowe chromoso-mu Bacillus subtilis podlega³ aktywnej segre-gacji w komórkach Escherichia coli syntety-zuj¹cych bia³ka partycyjne B. subtilis
(YAMAICHI i NIKI 2000).
ORGANIZACJA PLAZMIDOWYCH KASET PARTYCYJNYCH
Funkcje plazmidowych bia³ek partycyj-nych s¹ konserwatywne (HIRAGA2000). Jedno z nich ma zdolnoœæ specyficznego wi¹zania siê do centromeru. Drugie ma aktywnoœæ ATPazy, która jest niezbêdna dla partycji. Przypuszcza siê, ¿e hydroliza ATP zale¿na od ATPaz partycyj-nych mo¿e dostarczaæ energii dla ruchu pla-zmidów podczas partycji.
Organizacja genów koduj¹cych oba bia³ka partycyjne u wiêkszoœci plazmidów jest po-dobna. Tworz¹ one operon, w którym gen ko-duj¹cy ATPazê partycyjn¹ (parA/sopA) jest pierwszym, zaœ gen koduj¹cy bia³ko wi¹¿¹ce
centromer (parB/sopB) drugim genem opero-nu. Transkrypcja operonów partycyjnych jest reprymowana przez jeden lub oba produkty bia³kowe tych operonów. Zapewnia to utrzy-manie wewn¹trzkomórkowego stê¿enia bia³ek partycyjnych w okreœlonych granicach. Auto-regulacja jest niezbêdna dla efektywnej party-cji. Nie tylko nadprodukcja lub niedobór jedne-go z bia³ek partycyjnych, lecz tak¿e zaburzenia w proporcjach stê¿eñ obu bia³ek interferuj¹ z procesem partycji.
W zale¿noœci od rodzaju kodowanej ATPa-zy operony partycyjne podzielono na dwa typy
1
3
2
4
komórka kompleks ParB-Gfp z DNA plazmidu P1Ryc. 2. Lokalizacja w komór-kach Escherichia coli cz¹ste-czek jednokopiowego plazmi-du P1 podczas kolejnych eta-pów cyklu komórkowego oznaczonych jako 1, 2, 3 i 4. Pomiêdzy przejœciem z etapu 1 do 2 nast¹pi³a replikacja plazmidu P1 i zapocz¹tkowanie procesu segre-gacji jego kopii. Ogniska fluore-scencji reprezentuj¹ kompleksy DNA plazmidu P1 z fluoryzuj¹cym bia³kiem fuzyjnym ParB-Gfp wi¹¿¹cym siê do DNA tego plazmi-du (patrz tekst; Bugajska i £oboc-ka, dane niepublikowane).
(GERDES i wspó³aut. 2000, Ryc. 3). Operony typu pierwszego (I) koduj¹ ATPazy zawie-raj¹ce w swojej sekwencji aminokwasowej tzw. motyw Walkera wystêpuj¹cy w szeregu enzymach o aktywnoœci ATPazowej (KOONIN
1993). W ATPazach partycyjnych motyw ten jest w charakterystyczny sposób zmieniony. Podobne zmiany motywu Walkera zaobserwo-wano w niektórych ATPazach pe³ni¹cych funk-cjê pomp jonowych oraz w ATPazach rodziny MinD, bêd¹cych czêœci¹ systemu, który kontro-luje tworzenie przegród podzia³owych w ko-mórkach bakteryjnych. Operony typu drugie-go (II) koduj¹ ATPazy aktynopodobne (BORKi wspó³aut. 1992).
Ze wzglêdu na lokalizacjê miejsc centro-merowych operony typu I-go cechuje du¿a ró¿norodnoœæ. W przypadku wiêkszoœci z nich, wyodrêbnionych jako podtyp A, rejony centromerowe znajduj¹ siê na koñcu opero-nu, za genem dla bia³ka wi¹¿¹cego siê z centro-merem. W mniej licznej grupie, wyodrêbnio-nej jako podtyp B, rejony centromerowe, znaj-duj¹ siê na pocz¹tku operonu, przed genem dla ATPazy partycyjnej, gdzie pokrywaj¹ siê one z rejonami promotorowo-operatorowy-mi. U niektórych plazmidów (np. RK2 i N15) rejony centromerowe nie s¹ bezpoœrednio sprzê¿one z operonami partycyjnymi, a bia³ka wi¹¿¹ce centromer tych plazmidów oprócz uczestnictwa w partycji mog¹ funkcjonowaæ jako regulatory ekspresji genów nie zwi¹za-nych z partycj¹ (BIGNELL i THOMAS, 2001, GRIGORIEV i £OBOCKA 2001). Sekwencje bia³ek wi¹¿¹cych centromer ró¿nych
opero-nów typu IA wykazuj¹ znacz¹ce podobieñ-stwo.
W operonach partycyjnych typu II-go rejo-ny centromerowe pokrywaj¹ siê czêœciowo lub ca³kowicie z rejonami promotorowo-operato-rowymi.
Szczególnym przyk³adem odmiennej orga-nizacji s¹ geny partycyjne licznych plazmidów bakterii z rodzaju Agrobacterium, Rhizobium i
Paracoccus, nazwane repA i repB z powodu
sprzê¿enia ich funkcji z funkcjami replikacyj-nymi. Tworz¹ one wspólny operon z genem koduj¹cym bia³ko inicjuj¹ce replikacjê tych plazmidów, repC (BARTOSIK, 2001). Produkt genu repA, ATPaza typu Walkera, jest jednocze-œnie represorem transkrypcji operonu repABC. Rejon centromerowy w tego typu operonach znajduje siê bezpoœrednio za koñcem genu
repC (BARTOSIK i wspó³aut. 2002).
Odmienna organizacja genów partycyjnych, w po³¹czeniu ze sprzê¿eniem ich regulacji z re-gulacj¹ replikacji mo¿e byæ równie¿ cech¹ nie-których plazmidów bakterii Gram-dodatnich, jak np. pSM19035 (DE LA HOZ i wspó³aut. 2000). Gen koduj¹cy bia³kod tego plazmidu, po-dobne do ATPaz partycyjnych typu Walkera, tworzy jednogenowy operon. Jego transkrypcja jest negatywnie regulowana przez bia³ko, które jednoczeœnie pe³ni funkcje pozytywnego regu-latora liczby kopii pSM19035. Przeciwstawna regulacja ekspresji genu zwi¹zanego z partycj¹ i liczby kopii plazmidu mog³aby byæ czêœci¹ me-chanizmu indukcji funkcji partycyjnych plazmi-dów œredniokopiowych w odpowiedzi na spa-dek liczby kopii.
KASETY PARTYCYJNE KODUJ¥CE ATPAZY TYPU WALKERA
Operony partycyjne typu I-go, koduj¹ce ATPazy ze zmienionym motywem Walkera, s¹ szeroko rozpowszechnione. Wystêpuj¹ zarów-no w wiêkszoœci niskokopiowych plazmidów, jak i w szeregu chromosomach bakteryjnych. Ich funkcje poznano najlepiej w badaniach nad partycj¹ plazmidu P1. P1 jest bakteriofagiem ³agodnym, który w lizogenach nie wystêpuje w postaci wintegrowanej do chromosom lecz jako du¿y jednokopiowy plazmid o kolistym genomie d³ugoœci prawie 100 kb.
Operon partycyjny plazmidu P1 sk³ada siê z genu parA, koduj¹cego ATPazê i genu parB ko-duj¹cego bia³ko zdolne do wi¹zania centrome-ru (ABELESi wspó³aut. 1985; patrz Ryc. 3). Cen-tromer P1, parS, obejmuje oko³o 90-cio
nukle-otydowy rejon zlokalizowany bezpoœrednio za koñcem genu parB. Bia³ko ParB rozpoznaje dwa rodzaje krótkich sekwencji (typu A i B, patrz Ryc. 3) w obrêbie centromeru (FUNNELL, 1988b,
F
UNNELLi GAGNIER1993). Wi¹zanie siê ParB do centromeru zachodzi razem z wi¹za-niem bakteryjnego bia³ka IHF i jest uwa¿ane za pocz¹tkowy etap partycji (FUNNELL1991). IHF zagina DNA umo¿liwiaj¹c oddzia³ywanie ze sob¹ cz¹steczek ParB zwi¹zanych z DNA po przeciwnych stronach miejsca rozpoznawane-go przez IHF (HAYES i AUSTIN 1994). ParA w formie zwi¹zanej z ATP mo¿e przy³¹czaæ siê do kompleksu centromerowego poprzez interak-cjê z ParB (BOUETi FUNNELL1999). Oczyszczo-ne ParA in vitro ma s³ab¹ aktywnoœæ ATPazow¹Ryc. 3. Organizacja plazmidowych kaset partycyjnych typu I (IA i IB) i typu II.
Geny koduj¹ce ATPazy partycyjne typu Walkera i ich produkty wyró¿niono przy pomocy poprzecznych pr¹¿ków, geny koduj¹ce ATPazy aktynopodobne i ich produkty przy pomocy skoœnych pr¹¿ków. Rejony centro-merowe oznaczono czarnym kolorem. Kropkowane linie zakoñczone strza³kami obrazuj¹ interakcje bia³ek par-tycyjnych z rejonami centromerowymi i regulatorowymi poszczególnych operonów. W operonach typu IA (par plazmidu P1 i sop plazmidu F) sekwencje rejonów regulatorowych (parOP i sopOP) przedstawiono powy¿ej, a sekwencje rejonów centromerowych (parS i sopC) poni¿ej schematów organizacji genów tych operonów. Miej-sca wi¹zania bia³ka ParA lub SopA w rejonach regulatorowych podœwietlono na szaro. W operonach typu IB i II miejsca centromerowe i pokrywaj¹ce siê z nimi rejony regulacyjne przedstawiono powy¿ej schematów organi-zacji genów. Sekwencje wi¹¿¹ce bia³ka ParB lub ParR obwiedziono czarnymi prostok¹tami. Grot strza³ki na koñ-cu ka¿dej sekwencji znajduje siê nad pocz¹tkowym kodonem genu dla ATPazy partycyjnej ka¿dego operonu. Fragmenty DNA koduj¹ce miejsca wi¹zania rybosomów przed startem translacji (SD) oznaczono kropkowan¹ lini¹.
(DAVISi wspó³aut. 1992). Jest ona stymulowa-na przez bia³ko ParB i DNA. Chocia¿ aktywnoœæ ATPazowa ParA nie jest niezbêdna dla w³¹cza-nia ParA do kompleksu centromerowego in
vi-tro, jest ona niezbêdna dla partycji in vivo
(DAVIS i wspó³aut. 1996).
Niezale¿nie od aktywnoœci partycyjnej, bia³ko ParA bierze udzia³ w autoregulacji ope-ronu par. Rozpoznaje ono sekwencjê DNA zlo-kalizowan¹ pomiêdzy promotorem operonu
par i pocz¹tkiem genu parA. Poprzez
interak-cjê z t¹ sekwencj¹ ParA przeszkadza w wi¹za-niu polimerazy RNA do promotora i w ten spo-sób reprymuje transkrypcjê (DAVISi wspó³aut. 1992, DAVEY i FUNNELL 1994,). Samo ParA s³abo wi¹¿e siê do DNA. W komórce ParA wy-stêpuje g³ównie w kompleksie z ATP lub ADP. Oba nukleotydy stymuluj¹ wi¹zanie ParA do DNA poprzez indukcjê zmiany konformacji ca³ej cz¹steczki bia³ka (DAVEYi FUNNELL1997, FUNGi wspó³aut. 2001). Konformacje ParA w kompleksie z ATP i ADP ró¿ni¹ siê. ParA-ADP jest lepszym represorem ni¿ ParA-ATP. Jednak ATP lepiej wi¹¿e siê z ParA i wystêpuje w ko-mórce w stê¿eniu kilkakrotnie wy¿szym ni¿ ADP. Dlatego wewn¹trz komórek, ParA w kom-pleksie z ATP jest form¹ dominuj¹c¹. ParB wzmacnia represjê operonu par przez ParA-ATP poprzez stymulacjê zmiany konformacji tego kompleksu do formy tak efektywnej w re-presji jak ParA-ADP. Dodatkowe wzmocnienie represji zachodzi w obecnoœci centromeru P1,
parS (HAOi YARMOLINSKY2002). Przypuszcza siê, ¿e bia³ka partycyjne zwi¹zane z rejonem
promotorowo-operatorowym i z rejonem cen-tromerowym operonu par mog¹ oddzia³ywaæ ze sob¹ powoduj¹c utworzenie kompleksu su-perrepresorowego.
W oparciu o ró¿nice w zmianach konforma-cyjnych ParA indukowanych przez ATP i ADP oraz ró¿ny wp³yw obu nukleotydów na ró¿ne aktywnoœci ParA zaproponowano, ¿e wi¹zanie i hydroliza nukleotydów adeninowych przez ParA pe³ni¹ rolê molekularnych prze³¹czników kontroluj¹cych zapocz¹tkowanie dwóch nieza-le¿nych procesów z udzia³em ParA, reakcji zwi¹zanych z autoregulacj¹ i reakcji partycyj-nych (BOUETi FUNNELL1999). Ani autoregula-cja ani wi¹zanie ParA do kompleksu parS-Par-B-IHF nie wymaga hydrolizy ATP co sugeruje, ¿e aktywnoœæ ATPazowa ParA jest niezbêdna w zaawansowanych reakcjach partycyjnych.
U dzikiego plazmidu P1 kombinacja funkcji partycyjnych oraz funkcji systemu tzw. ,,addyk-cji”, dzia³aj¹cego poprzez aktywacjê toksyny plazmidowej w komórkach, które utraci³y pla-zmid, powoduje obni¿enie utraty plazmidu do czêstoœci mniejszej ni¿ 10–5 na ka¿dy podzia³ komórkowy (patrz artyku³ U. ZIELENKIEWICZi P. CEG£OWSKIEGOw tym numerze KOSMOSU). Udzia³ systemu partycji w stabilizacji plazmidu jest znacz¹cy. Utrata z populacji plazmidów P1 pozbawionych kasety addykcyjnej wynosi po-ni¿ej 1% po czasie oko³o 25-ciu generacji. Czê-stoœæ utraty zwiêksza siê do ponad 99% w po-pulacjach komórek nios¹cych pochodne tego plazmidu z mutacjami inaktywuj¹cymi geny
parA lub parB, lub rejon centromerowy. KASETY PARTYCYJNE KODUJ¥CE ATPAZY TYPU AKTYNOWEGO
Operony partycyjne typu II-go, koduj¹ce ATPazy aktynopodobne wystêpuj¹ w plazmi-dach rzadziej ni¿ operony koduj¹ce ATPazy typu Walkera. Sekwencja aminokwasowa akty-nopodobnych ATPaz partycyjnych jest ewolu-cyjnie najbardziej zbli¿ona do kodowanych przez chromosomy bakteryjne bia³ek rodziny MreB, uznanych za prokariotyczne homologi aktyny (VANDENENTi wspó³aut. 2001, JONESi wspó³aut. 2001, MOLLER-JENSEN i wspó³aut. 2002). Bia³ka rodziny MreB tworz¹ filamenty podobne do filamentów eukariotycznej aktyny. U E. coli filamenty MreB formuj¹ pod b³on¹ ko-mórkow¹ cytoszkielet, który umo¿liwia komór-kom utrzymanie pa³eczkowatego kszta³tu.
Najlepiej zbadanym operonem typu II-go jest operon par plazmidu R1, wyizolowanego
jako czynnik lekoopornoœci ze szczepu
Salmo-nella typhimurium (Ryc. 3). Oprócz genu parM koduj¹cego ATPazê, zawiera on gen parR, koduj¹cy bia³ko wi¹¿¹ce siê do
centro-meru (GERDES i wspó³aut. 2000). Centromer plazmidu R1, parC, znajduje siê przed genem
parM. Sk³ada siê on z dwóch ci¹gów
piêcio-krotnych powtórzeñ podobnej, 12-to nukleoty-dowej sekwencji, przedzielonych krótkim frag-mentem DNA zawieraj¹cym promotor opero-nu par (DAMi GERDES1994). Bia³ko ParR ma zdolnoœæ do wi¹zania siê do centromeru. Jed-noczeœnie poprzez interakcjê z sekwencjami s¹siaduj¹cymi z promotorem reprymuje ono transkrypcjê operonu par (JENSEN i wspó³aut. 1994). Bia³ko ParM nie bierze udzia³u w autore-gulacji ale uczestniczy w kompleksie
centro-merowym poprzez oddzia³ywanie z ParR (JENSEN i GERDES 1997). W komórce ParM mo¿e wystêpowaæ zarówno w kompleksie z ATP, jak i z ADP (MOLLER-JENSEN i wspó³aut.
2002). Aktywnoœæ ATPazowa ParM jest silnie stymulowana w obecnoœci kompleksu ParR z
parC.
PORÓWNANIE PLAZMIDOWYCH SEKWENCJI CENTROMEROWYCH
Ze wzglêdu na obecnoœæ dwóch rodzajów sekwencji wi¹¿¹cych bia³ko ParB i sekwencji wi¹¿¹cej bia³ko bakteryjne IHF, centromer zmidu P1 reprezentuje grupê centromerów pla-zmidowych o najbardziej skomplikowanej bu-dowie. Jednak dla zachowania minimalnej funk-cji partycyjnej, wystarczy 22 nukleotydowy fragment jego prawego ramienia obejmuj¹cy dwa miejsca wi¹zania ParB typu A (A2, A3) i jed-no miejsce typu B (B2, Ryc. 3, MARTIN i wspó³aut. 1991). Chocia¿ „minimalny” frag-ment centromeru powoduje niewielk¹ stabili-zacjê plazmidu w porównaniu z kompletnym
parS, jego aktywnoœæ wskazuje, ¿e zarówno
po-zosta³e miejsca wi¹zania ParB, jak i miejsce wi¹zania IHF s¹ krytyczne dla efektywnoœci tycji, ale nie niezbêdne dla zajœcia procesów par-tycyjnych. Sekwencje centromerowe podobne do parS P1 s¹ wysoce efektywne w partycji. Przypuszczalnie dlatego w znanych plazmidach podobne centromery wystêpuj¹ w jednej kopii.
Struktura wiêkszoœci centromerów plazmi-dowych w operonach typu IA jest inna ni¿ struktura parS. Zawieraj¹ one najczêœciej wie-lokrotne powtórzenia podobnej sekwencji (BIGNELL i THOMAS2001). Centromer plazmi-du F (sopC) sk³ada siê a¿ z 12-tu 43-nukleoty-dowych powtórzeñ (Ryc. 3, LANE i wspó³aut. 1987). Ka¿de z nich zawiera sekwencjê o cha-rakterze palindromu (IR), do której wi¹¿e siê bia³ko SopB plazmidu F (homolog ParB P1, MORI i wspó³aut. 1989). Ju¿ obecnoœæ na pla-zmidzie jednej z powtórzonych sekwencji cen-tromerowych powoduje jego zauwa¿aln¹ sta-bilizacjê w obecnoœci bia³ek partycyjnych F (BIEK i SHI 1994, RAVIN i LANE1999). Jednak dopiero obecnoœæ co najmniej kilku
powtó-rzeñ zapewnia wysok¹ efektywnoœæ partycji. Powtórzone sekwencje centromerowe w ope-ronach typu IA cechuje niezale¿noœæ. Ich zgru-powanie w jednym odcinku DNA nie jest nie-zbêdne dla funkcji. Byæ mo¿e dlatego warian-tem organizacji tego typu centromerów jest rozproszenie pojedynczych powtórzeñ w ró¿-nych rejonach DNA, gdzie ka¿de z nich mo¿e pe³niæ funkcjê centromeru. Taka organizacja sekwencji centromerowych wystêpuje u szere-gu plazmidów i jest typowa dla chromosomów bakteryjnych koduj¹cych ATPazy partycyjne typu Walkera (BIGNELLi THOMAS2001, G RIGO-RIEV i £OBOCKA, 2001, GODFRIN-ESTEVENON i wspó³aut. 2002).
W plazmidach posiadaj¹cych kasety party-cyjne typu IB i II rejony centromerowe pokry-waj¹ siê z rejonami promotorowo-operatoro-wymi operonów partycyjnych (BREUNER i wspó³aut. 1996, KALNINi wspó³aut. 2000). Ty-powe centromery tych plazmidów sk³adaj¹ siê z kilku do kilkunastu powtórzeñ podobnej se-kwencji. Integralnoœæ ci¹gu powtórzeñ mo¿e byæ istotna dla funkcji centromerowej, ponie-wa¿ jego niepe³ne fragmenty okazywa³y siê niefunkcjonalne w partycji. Rejon centralnych powtórzeñ w obrêbie centromeru pokrywa siê lub s¹siaduje z sekwencjami promotorowymi operonów partycyjnych (Ryc. 3). Dziêki temu w tego typu operonach sekwencje centrome-rowe mog¹ pe³niæ funkcjê regulacyjn¹. Dwu-funkcyjnoœæ elementów centromerowych sprawia, ¿e bia³ka wi¹¿¹ce centromer tych ope-ronów (np. ParB pTAR i ParR R1) s¹ elementa-mi bezpoœrednio kontroluj¹cyelementa-mi ich tran-skrypcjê, a kodowane przez nie ATPazy party-cyjne nie bior¹ udzia³u w regulacji.
NIEZGODNOŒÆ PARTYCYJNA I PAROWANIE CZ¥STECZEK PLAZMIDÓW
Plazmidowe rejony centromerowe s¹ czyn-nikami tzw. niezgodnoœci partycyjnej (ang. partition incompatibility) (AUSTIN i N ORD-STROM1990). Wyra¿a siê ona tym, ¿e dwa ró¿ne plazmidy nios¹ce taki sam centromer nie mog¹ stabilnie wspó³istnieæ w komórce w obecnoœci
rozpoznaj¹cych ten centromer bia³ek partycyj-nych. Niestabilnoœæ plazmidów wynikaj¹ca z niezgodnoœci nie jest dramatyczna. Po d³u¿-szym czasie wzrostu w nieobecnoœci antybioty-ków selekcyjnych dla obu plazmidów pocz¹tkowo dwuplazmidowe komórki tworz¹
dwie populacje. Komórki jednej z nich zawie-raj¹ wy³¹cznie jeden, komórki drugiej wy³¹cznie drugi plazmid.
Zjawisko niezgodnoœci partycyjnej sta³o siê podstaw¹ do zaproponowania modelu party-cji. Zak³ada on, ¿e przed podzia³em komórko-wym plazmidy ³¹cz¹ siê w pary przy pomocy re-jonów centromerowych, a nastêpnie ka¿dy z elementów pary jest przemieszczany do prze-ciwleg³ej po³ówki dziel¹cej siê komórki. Nie-zgodnoœæ partycyjna by³aby konsekwencj¹ tworzenia par zawieraj¹cych dwa ró¿ne pla-zmidy. Ich rozdzia³ prowadzi³by do segregacji ka¿dego z plazmidów pary tylko do jednej z ko-mórek potomnych.
Ostatnio potwierdzono zdolnoœæ plazmido-wych centromerów do tworzenia par w obec-noœci bia³ek partycyjnych. Pary fragmentów DNA zawieraj¹cych rejon centromerowy pla-zmidu R1, parC, zaobserwowano na zdjêciach z mikroskopu elektronowego (JENSEN i wspó³aut. 1998). Tworzenie par wymaga³o zwi¹zania bia³ka ParR do parC i by³o silnie sty-mulowane w obecnoœci ATPazy partycyjnej plazmidu R1, ParM. Mo¿na za³o¿yæ, ¿e parowa-nie kolistych cz¹steczek plazmidów poprzez
rejony centromerowe prowadzi do zablokowa-nia swobodnej rotacji s¹siaduj¹cego z centro-merami DNA. Rzeczywiœcie, w eksperymen-tach in vivo pokazano, ¿e obecnoœæ miejsc cen-tromerowych P1, parS, w cz¹steczkach plazmi-dów blokuje dyfuzjê wzd³u¿ cz¹steczki wywo³anych transkrypcj¹ zmian w superskrê-ceniu DNA (EDGARi wspó³aut. 2001). Efekt ten wystêpowa³ tylko w komórkach zawieraj¹cych bia³ko ParB P1, co uznano za dowód tworzenia par plazmidów zawieraj¹cych parS w obecno-œci tego bia³ka.
Wydaje siê, ¿e in vivo jednostk¹ w partycji nie jest pojedynczy rejon centromerowy, a ca³a cz¹steczka DNA zawieraj¹ca jeden lub wiêcej centromerów. Partycja dwóch fragmentów centromerowych tej samej cz¹steczki plazmi-du prowadzi³aby do rozerwania plazmiplazmi-du i jego utraty. Tymczasem plazmidy zawieraj¹ce dwa identyczne nawet odleg³e od siebie cen-tromery nie s¹ mniej stabilne ni¿ plazmidy jed-nocentromerowe (AUSTIN, 1984). Najprawdo-podobniej in vivo parowanie zachodzi prefe-rencyjnie pomiêdzy centromerami dwóch ró¿-nych cz¹steczek plazmidowych (LANE i wspó³aut. 1987, GRIGORIEVi £OBOCKA2001).
WIZUALIZACJA PROCESU PARTYCJI
Rozwój technik mikroskopii fluorescen-cyjnej umo¿liwi³ obserwacjê cz¹steczek pla-zmidów w komórkach i potwierdzenie mode-lu partycji (Ryc. 2, 4). W pierwszych doœwiad-czeniach tego typu u¿yto plazmidów P1 i F ze wstawionymi do cz¹steczek wielokrotnymi kopiami sekwencji wi¹¿¹cej bia³ko bakteryj-ne LacIQ. Komórki z tak skonstruowanymi plazmidami, zamiast normalnego bia³ka LacIQ, zawiera³y jego fuzjê z fluoryzuj¹cym na zielono bia³kiem, Gfp (GORDON i wspó³aut. 1997). Wi¹¿¹ce siê do DNA plazmi-dowego bia³ko fuzyjne LacIQ-Gfp tworzy³o ogniska fluorescencji w miejscach odpowia-daj¹cych lokalizacji plazmidów. W ma³ych ko-mórkach powsta³ych œwie¿o po podziale za-obserwowano pojedyncze ogniska fluore-scencji umiejscowione w rejonie centrum komórki. W wiêkszych komórkach zaobser-wowano po dwa ogniska fluorescencji odpo-wiadaj¹ce rozsegregowanym po replikacji kopiom plazmidów. By³y one rozmieszczone symetrycznie w rejonach bliskich 1/4 i 3/4 d³ugoœci komórki. Podobn¹ lokalizacjê za-równo P1 i F, jak i niskokopiowego plazmidu
RK2 pokazano tzw. metod¹ FISH (ang. fluore-scent in situ hybridization), w której utrwalo-ne komórki przytwierdzoutrwalo-ne do szkie³ka mi-kroskopowego, poddawano hybrydyzacji ze znakowanymi fluorescencyjnie fragmentami DNA komplementarnymi do DNA tych
pla-Ryc. 4. Lokalizacja plazmidów P1 w komórkach E. coli na ró¿nych etapach cyklu komórkowego (zdjêcie barwne na ok³adce).
Ogniska fluorescencji (jasne plamki) reprezentuj¹ kompleksy DNA plazmidu P1 z fluoryzuj¹cym bia³kiem fuzyjnym ParB-Gfp wi¹¿¹cym siê do DNA tego plazmidu (patrz tekst; Bugajska i £obocka, dane nieopublikowane).
zmidów (BIGNELL i wspó³aut. 1999, POGLIANO i wspó³aut. 2001, HO i wspó³aut. 2002). Lokalizacja rozsegregowanych kopii plazmidów przy granicach æwiartek komór-kowych wydaje siê charakterystyczna dla pla-zmidów zawieraj¹cych operony partycyjne typu I-go. Rozsegregowane plazmidy R1 loka-lizuj¹ siê odmiennie, g³ównie w rejonach bie-gunów komórkowych (JENSEN i GERDES
1999, WEITAOi wspó³aut. 2000). Dopiero po podziale komórkowym s¹ one przemieszcza-ne do centrów komórek potomnych.
W komórkach zawieraj¹cych plazmidy P1, F i RK2 bia³ka wi¹¿¹ce centromer tych plazmi-dów, ParB, SopB i KorB, lokalizuj¹ siê w tych sa-mych miejscach co cz¹steczki DNA plazmido-wego (ERDMANN i wspó³aut. 1999, HIRANO i wspó³aut. 1998, BIGNELL i wspó³aut. 1999). Dziêki wi¹zaniu siê do swoistych centrome-rów i interakcji z DNA plazmidowym w ich s¹siedztwie (omówionym w dalszej czêœci tego artyku³u) fuzje tych bia³ek z bia³kami fluory-zuj¹cymi (np. Gfp) s¹ dogodnymi wskaŸnikami wewn¹trzkomórkowej lokalizacji plazmidów zawieraj¹cych rozpoznawane przez nie se-kwencje centromerowe (Ryc. 4).
Chocia¿ w wiêkszoœci komórek z P1, F, czy RK2 cz¹steczki plazmidów znajduj¹ siê w rejo-nach bliskich 1/4 i 3/4 d³ugoœci komórki, a w
nielicznych ma³ych komórkach w jej centrum, lokalizacja niektórych plazmidów odpowiada etapom poœrednim ich przemieszczania. W wolno rosn¹cych komórkach przemieszczanie cz¹steczek plazmidów jest równie¿ powolne i odbywa siê w tempie wielu minut (BIGNELL i wspó³aut. 1999, BUGAJSKA i £OBOCKA, dane niepublikowane). Przemieszczanie plazmidów jednej pary zachodzi synchronicznie, nato-miast procesy partycyjne w dwóch komórkach powsta³ych z jednej po podziale czêsto odby-waj¹ siê w ró¿nym czasie.
Mimo, ¿e liczne plazmidy umiejscowione s¹ podczas partycji w tych samych rejonach ko-mórkowych ogl¹dane wspólnie w komórce nie lokalizuj¹ siê dok³adnie w tych samych miej-scach (HOi wspó³aut. 2002). Ponadto ich par-tycja nie jest zsynchronizowana w czasie. W prawie wszystkich badanych komórkach se-gregacja kopii plazmidu RK2 powsta³ych po re-plikacji poprzedza³a segregacjê kopii plazmidu F, a segregacja F poprzedza³a segregacjê P1. Obserwacje te wskazuj¹, ¿e albo ró¿ne plazmi-dy podczas partycji oddzia³ywuj¹ z ró¿nymi strukturami komórki, albo segreguj¹ niezale-¿nie od struktur komórkowych, albo te¿ ich od-dzia³ywanie z tymi samymi strukturami odby-wa siê w ró¿nym czasie.
PARTYCJA PLAZMIDÓW A KOMÓRKOWE CENTRA REPLIKACYJNE
Zaskakuj¹cym odkryciem ostatnich lat by³o wykazanie, ¿e replikacja DNA w komórkach
Ba-cillus subtilis nie zachodzi, jak przypuszczano,
przez przesuwanie siê kompleksu replikacyjne-go wzd³u¿ DNA, a odwrotnie, przez przesuwa-nie siê DNA chromosomalnego przez kompleks enzymów replikacyjnych ulokowany w cen-trum komórki lub w rejonach odpowiadaj¹cym przysz³ym centrom komórek potomnych (LEMON i GROSSMAN1998, 2000). Przypuszcza siê, ¿e ulokowany centralnie replisom móg³by dzia³aæ jako rodzaj „silnika biosyntetycznego”, który wypycha zreplikowane kopie chromoso-mu w przeciwnych kierunkach (LEMON i GROSSMAN2001). Zarówno u B. subtilis, jak i u
E. coli zreplikowane rejony startu replikacji
chromosomu przemieszczaj¹ siê z replisomu w kierunku przeciwnych biegunów komórki, przy których lokalizuj¹ siê przez wiêkszoœæ cy-klu komórkowego. Najprawdopodobniej repli-kacja DNA niskokopiowych plazmidów rów-nie¿ odbywa siê w obrêbie kompleksu komór-kowych enzymów replikacyjnych. Mo¿liwe, ¿e ka¿dy z plazmidów mo¿e inicjowaæ monta¿ no-wego kompleksu bia³ek replikacyjnych z u¿y-ciem mechanizmu, który sprzêga centralnie tworzony kompleks z tym rejonem cz¹steczki plazmidu gdzie zaczyna siê replikacja DNA (HO
i wspó³aut. 2002). Ostatnio doliczono siê zwiêk-szonej liczby replisomów na komórkê w szcze-pie Caulobacter crescentus zawieraj¹cym wie-lokopiowy plazmid (JENSENi wspó³aut. 2001).
WYCISZANIE TRANSKRYPCJI PRZEZ BIA£KA PLAZMIDOWE WI¥¯¥CE CENTROMERY
Badania in vitro wskazuj¹, ¿e interakcje bia³ek wi¹¿¹cych centromer z DNA plazmido-wym s¹ ograniczone do sekwencji w obrêbie
centromeru rozpoznawanych przez te bia³ka. Jednak w³aœciwoœci bia³ek typu ParB in vivo su-geruj¹, ¿e interakcje te mog¹ obejmowaæ
szer-sze rejony DNA plazmidowego. Chocia¿ natu-raln¹ funkcj¹ systemu partycji jest stabilizacja plazmidów, bia³ka z rodzin ParB mog¹ powo-dowaæ destabilizacjê plazmidów nios¹cych centromery, do których siê wi¹¿¹ (FUNNELL
1988a, £OBOCKA i YARMOLINSKY 1996, K USU-KAWAi wspó³aut. 1987, GRIGORIEVi £OBOCKA
2001, JAGURA-BURDZYi wspó³aut. 1999). Desta-bilizacja prowadzi do utraty plazmidów cen-tromerowych z czêstoœci¹ wiêksz¹ ni¿ wyni-ka³oby to z ich przypadkowego rozdzia³u w nieobecnoœci systemu partycji. Zale¿y ona od stê¿enia bia³ka typu ParB i od kontekstu DNA w jakim znajduje siê specyficzna dla tego bia³ka sekwencja centromerowa. Na przyk³ad du¿y nadmiar bia³ka ParB P1 prowadzi do destabili-zacji wszystkich badanych plazmidów nios¹cych parS, niezale¿nie od obecnoœci ParA.
Destabilizacja plazmidów centromero-wych przez bia³ka rodziny ParB zale¿y od zdol-noœci tych bia³ek do wyciszania transkrypcji genów w s¹siedztwie rozpoznawanych przez nie sekwencji centromerowych (Y ARMOLIN-SKY2000). Wydaje siê, ¿e zdolnoœæ ParB P1 do wyciszania transkrypcji ma zwi¹zek z jego funkcj¹ w reakcjach partycyjnych nastê-puj¹cych po zwi¹zaniu centromeru. Bia³ka mu-tantów parB P1, które wi¹za³y parS, lecz by³y niezdolne do wyciszania transkrypcji, straci³y tak¿e aktywnoœæ partycyjn¹.
Mechanizm wyciszania transkrypcji nie jest znany. Liczne obserwacje wskazuj¹, ¿e ParB plazmidu P1 i SopB plazmidu F, po zwi¹zaniu z DNA centromerowym, mog¹ poœrednio lub bezpoœrednio wi¹zaæ siê z DNA pozacentrome-rowym. Dowodem takiej interakcji jest izolacja z komórek nios¹cych plazmid P1 kompleksów bia³ka ParB tego plazmidu z DNA P1 reprezen-tuj¹cym rejony odleg³e o kilka tysiêcy par zasad od sekwencji parS (RODIONOV i wspó³aut. 1999). Zaproponowano, ¿e zwi¹zanie SopB lub ParB do specyficznych dla nich sekwencji
cen-tromerowych zapocz¹tkowuje wi¹zanie dodat-kowych cz¹steczek tych bia³ek do s¹sia-duj¹cego DNA. Wyciszanie transkrypcji mog³oby wynikaæ z ochrony DNA pokrytego przez ParB lub SopB przed dostêpem innych bia³ek. Niestety w warunkach in vitro nie uzy-skano kompleksów ParB ani SopB z DNA poza rejonem centromeru, co mo¿e sugerowaæ udzia³ nieznanych bia³ek komórkowych w tworzeniu takich kompleksów. Ciekawych wy-ników dostarczy³y badania nad fragmentem SopB zawieraj¹cym 82 reszty aminokwasowe z N koñca tego bia³ka. Okaza³ siê on niezbêdny dla wyciszania transkrypcji przez SopB choæ jest niezale¿ny od ulokowanego centralnie re-jonu SopB niezbêdnego dla wi¹zania DNA (KIM i WANG 1999). N-koñcowy fragment SopB w po³¹czeniu z fragmentami innych bia³ek zdolnymi do wi¹zania specyficznych se-kwencji DNA, lecz niezdolnymi do wyciszania transkrypcji, nadawa³ bia³kom fuzyjnym zdol-noœæ do wyciszania transkrypcji genów w s¹siedztwie tych sekwencji. Mo¿liwe, ¿e wyci-szanie transkrypcji po utworzeniu kompleksu SopB-sopC zale¿y od oddzia³ywania N-koñco-wego fragmentu SopB z niezidentyfikowanym czynnikiem komórkowym zdolnym do wi¹za-nia pozacentromerowego DNA. Podobieñstwo N-koñcowych fragmentów SopB plazmidu F, ParB plazmidu P1 oraz ich homologów kodo-wanych przez inne plazmidy wskazuje na wspólny mechanizm wyciszania transkrypcji genów przez te bia³ka (HANAI i wspó³aut. 1996). Samo wyciszanie mog³oby byæ przejœ-ciowym efektem ubocznym tworzenia struk-tur bia³ko-DNA niezbêdnych dla wewn¹trzko-mórkowego przemieszczania plazmidu. Kom-pleksy ParB z pozacentromerowym DNA pla-zmidu P1 wystêpuj¹ w komórkach równie¿ podczas aktywnej partycji tego plazmidu. Wskazuje to, ¿e w warunkach fizjologicznych reakcje zwi¹zane z tworzeniem tych komplek-sów nie prowadz¹ do zaburzeñ partycji.
UDZIA£ ATPAZ PARTYCYJNYCH W PRZEMIESZCZANIU PLAZMIDÓW
Pozycjonowanie plazmidów podczas par-tycji wymaga ATPaz partycyjnych i zale¿y od ich zdolnoœci do hydrolizy ATP. W nieobecno-œci tych ATPaz niskokopiowe plazmidy lokali-zuj¹ siê w dowolnych miejscach komórki, g³ównie w przestrzeniach nie zajêtych przez nukleoid.
Mechanizm lokalizacji plazmidów podczas partycji z udzia³em ATPaz typu Walkera mo¿e przypominaæ mechanizm regulacji powstawa-nia przegród podzia³owych wewn¹trz komó-rek E. coli zale¿ny od bia³ek MinC, MinD i MinE (YAMAICHI i NIKI 2000). Potencjalne miejsca tworzenia przegród znajduj¹ siê zarówno w
centrum komórki, jak i w p³aszczyznach odpo-wiadaj¹cych 1/4 i 3/4 jej d³ugoœci, które wyzna-czaj¹ przysz³e centra komórek potomnych. Bia³ka MinCDE umo¿liwiaj¹ tworzenie prze-grody centralnej blokuj¹c jednoczeœnie two-rzenie przegród blisko rejonów biegunowych. Jedno z nich, MinD, jest ATPaz¹, której sekwen-cja aminokwasowa jest podobna do sekwencji bia³ek rodziny ParA. Ponadto z u¿yciem fuzji z fluoryzuj¹cym bia³kiem Gfp pokazano, ¿e za-równo MinD, jak i jego homologi partycyjne, bia³ko ParA kodowane przez plazmid pB171 patogennego szczepu E. coli i bia³ko Soj kodo-wane przez chromosom B. subtilis, oscyluj¹ po-miêdzy przeciwnymi biegunami komórki (RASKIN i DE BOER 1999, QUISEL i wspó³aut. 1999, EBERSBACHi GERDES2001). Oscylacja po-lega na przemieszczaniu siê wewn¹trzkomór-kowej puli MinD, ParA lub Soj na przemian z jednego do drugiego bieguna i zale¿y od aktyw-noœci ATPazowej tych bia³ek. Kinetyka oscyla-cji MinD i bia³ek partycyjnych jest ró¿na: MinD oscylowa³o w odstêpach sekundowych, bia³ko ParApB171 w odstêpach minutowych. W prze-ciwieñstwie do MinD, ParApB171 by³o zdolne do oscylacji tylko w komórkach zawieraj¹cych plazmid z centromerem pB171 i bia³ko ParB tego plazmidu, co wskazuje na zale¿noœæ oscy-lacji od wczeœniejszego utworzenia kompleksu bia³kowo-centromerowego i jej zwi¹zek z za-awansowanymi reakcjami partycyjnymi. Nie wiadomo czy oscylacja bia³ek typu ParA jest w jakiœ sposób zsynchronizowana z ruchem pla-zmidów wewn¹trz komórki i czy dostarcza si³y motorycznej dla tego ruchu.
Mechanizm przemieszczania plazmidów zale¿ny od aktynopodobnych ATPaz partycyj-nych mo¿e ró¿niæ siê istotnie od mechanizmu przemieszczania zale¿nego od ATPaz typu Wal-kera. Wydaje siê on dzia³aæ na zasadzie podob-nej do generacji ruchu przez polimeryzacjê ak-tyny (patrz: STRZELECKA-GOLASZEWSKA 2001). Wskazuj¹ na to w³aœciwoœci ATPazy partycyj-nej plazmidu R1, ParM, oraz zaobserwowane w komórkach, utrwalonych podczas aktywnej partycji R1, dynamiczne zmiany w lokalizacji i sposobie organizacji cz¹steczek ParM (MOLLER-JENSEN i wspó³aut. 2002). W czêœci komórek bia³ko ParM tworzy³o filamenty ci¹gn¹ce siê wzd³u¿ d³ugiej osi komórki od bie-guna do biebie-guna, w czêœci by³o rozproszone w cytoplazmie, w czêœci skupia³o siê w postaci ognisk w pozycjach biegunowych lub w cen-trum komórki. Obserwowane zmiany mo¿na uznaæ za dowód naprzemiennej polimeryzacji i
depolimeryzacji ParM. Tworzenie filamentów zale¿a³o od obecnoœci w komórkach plazmidu zawieraj¹cego centromer R1, parC, i bia³ka ParR wi¹¿¹cego siê do centromeru, natomiast nie zale¿a³o od aktywnoœci ATPazowej ParM. Ta ostatnia okaza³a siê niezbêdna dla depolime-ryzacji ParM i w konsekwencji dla wewn¹trz-komórkowej dynamiki tworzenia filamentów. Bia³ka ParM mutantów, pozbawione aktywno-œci ATPazowej tworzy³y stabilne filamenty we wszystkich komórkach, niezale¿nie od obecno-œci ParR i parC. Równie¿ in vitro tworzenie fila-mentów ParM wymaga³o ATP, a ich depolime-ryzacja nastêpowa³a spontanicznie i zale¿a³a od hydrolizy ATP. Poprzez dodawanie do oczyszczonego ParM kolejnych porcji ATP uda³o siê odtworzyæ cyklicznoœæ procesu poli-meryzacji i depolipoli-meryzacji. Polimeryzacja ParM w obecnoœci ATP stymuluje jego aktyw-noœæ ATPazow¹ niezbêdn¹ do depolimeryzacji zwi¹zanej z hydroliz¹ ATP do ADP i wolnego fosforanu. Dodanie œwie¿ej porcji ATP zwiêk-sza iloœæ kompleksów wolnego ParM-ATP w stosunku do ParM-ADP, co powoduje przesu-niêcie równowagi w stronê ponownego za-pocz¹tkowania procesów polimeryzacyjnych. Obserwowana in vivo zale¿noœæ tworzenia fi-lamentów ParM od ParR i parC ma miejsce równie¿ in vitro w roztworach ParM zawie-raj¹cych zbyt niskie stê¿enia ATP dla za-pocz¹tkowania spontanicznie reakcji polime-ryzacyjnych. Jednoczesne dodanie œladowych iloœci ParR i DNA zawieraj¹cego parC za-pocz¹tkowuje polimeryzacjê ParM w tych roz-tworach. Filamenty ParM maj¹ szerokoœæ 7 nm, podobn¹ do szerokoœci zawieraj¹cych dwa protofilamenty filamentów eukariotycznej ak-tyny.
Aktynopodobna struktura ParM oraz jego cechy zwi¹zane z tworzeniem i depolimeryza-cj¹ filamentów sta³y siê podstaw¹ do zapropo-nowania modelu przemieszczania plazmidów z udzia³em ATPaz rodziny ParM (Ryc. 5). Zak³ada on, ¿e po procesie replikacji plazmidów w centrum komórki i parowania zreplikowa-nych kopii z udzia³em kompleksów centrome-rowych parC-ParR, bia³ko ParR w tych komplek-sach staje siê miejscem przy³¹czania i polimery-zacji obecnego w komórce wolnego ParM-ATP. Kolejne kompleksy ParM-ATP do³¹czaj¹c do tworz¹cego siê filamentu poprzez interakcjê z ParR s¹ wstawiane pomiêdzy kompleks centro-merowy, a utworzony dotychczas filament, co powoduje odsuwanie plazmidów pary od sie-bie, w kierunku biegunów komórkowych.
Po-limeryzacja ParM stymuluje jego aktywnoœæ ATPazow¹. Prowadzi to do zapocz¹tkowania hydrolizy ATP wewn¹trz struktury filamen-tów, tak jak w przypadku filamentów aktyny. Konwersja ATP w filamentach do ParM-ADP + Pi oraz dyfuzja nieorganicznego fosfo-ranu powoduj¹ zmiany konformacji ParM, a w konsekwencji destabilizacjê struktury fila-mentu i jego depolimeryzacjê na koñcu prze-ciwnym do koñca do³¹czania nowych kom-pleksów ParM-ATP. Wymiana ADP na ATP w od³¹czonych od filamentu kompleksach Par-M-ADP mo¿e inicjowaæ nastêpn¹ rundê poli-meryzacji z udzia³em tych samych cz¹steczek ParM. Poniewa¿ przed podzia³em plazmidy R1
w komórce lokalizuj¹ siê blisko jej biegunów za³o¿ono, ¿e po podziale komórkowym sam proces replikacji móg³by w nieznany jeszcze sposób powodowaæ przemieszczanie plazmi-dów do centrum komórki i powtórzenie cyklu. W proponowanym modelu przemieszczanie plazmidów podczepionych do rosn¹cego ko-ñca filamentów by³oby generowane poprzez zaobserwowany poprzednio w przypadku fila-mentów aktynowych proces tzw. „przep³ywu monomerów” (ang. treadmiling) przez fila-menty rosn¹ce od strony kompleksu centro-merowego, a depolimeryzuj¹ce na przeciw-nym koñcu.
PARTITIONING OF LOW-COPY NUMBER PLASMIDS S u m m a r y
Partitioning of low-copy number plasmids at cell division resembles mitosis in that prior to cell divi-sion paired plasmid molecules are separated from each other and actively moved apart from the center of the mother cell into positions corresponding to the centers of future daughters. Two plasmid pro-teins and a cis-acting site in plasmid DNA, an analog of eukaryotic centromere, are essential for partitioning to occur. Typically, partition proteins are encoded within an operon whose expression is regulated by one or both of its products. The product of the first gene of the partition operon (ParA, SopA or ParM) is an ATPase, the product of the second gene (ParB,
SopB or ParR) is a centromere-binding protein. Parti-tioning ATPases belong to the Walker-type or actin-type ATPase families. They interact with their target centromeric complexes indirectly, via plasmid specific centromere- binding proteins. Two types of partitioning ATPases may provide two different ways of plasmid translocation within a cell. The movement of plasmid Rl, which encodes the actin-type ParM ATPase, is associated with extension of ParM fila-ments at their polar end and depolymerization at the opposite end. Extension might possibly occur by in-sertion of new ParM molecules between the centromere-bound ParR proteins of paired Rl Ryc. 5. Model partycji plazmidu R1 z uwzglêdnieniem roli ATPazy partycyjnej ParM w przemiesz-czaniu cz¹steczek plazmidu wewn¹trz komórki (wg MOLLER -JENSENAi wspó³aut. 2002, zmody-fikowany). Opis w tekœcie.
plasmids and ParM molecules bound to ParR, thus pushing the plasmids towards the opposite cell poles. The role of Walker-type ATPases in plasmid translocation is not clear. In their structure they re-semble some ion pump proteins. They may either par-ticipate in plasmid movement by themselves or con-nect plasmids to unknown partition machinery of a host. Some of them can oscillate between cellular poles, reminiscent of the behavior of related bacterial
proteins, MinD, that specify the sites of septum place-ment.
Partitioning mechanisms in bacteria are evolutionarily conserved and of universal occurrence. Plasmid partition operons with centromeric sites can function as gene cassettes able to stabilize other unsta-ble low-copy number plasmids. Certain bacterial chro-mosomes encode homologs of plasmid partition genes essential for chromosome partitioning.
LITERATURA
A
BELES, A. L., FRIEDMANS. A., AUSTINS. J., 1985. Partitionof unit-copy miniplasmids to daughter cells. III. The DNA sequence and functional organization of the P1 partition region. J. Mol. Biol. 185,
261–272.
AUSTINS., FRIEDMANS., LUDTKED., 1986. Partition
func-tions of unit-copy plasmids can stabilize the main-tenance of plasmid pBR322 at low copy number.
J. Bacteriol. 168, 1010–103.
AUSTINS., NORDSTROMK., 1990. Partition-mediated
in-compatibility of bacterial plasmids. Cell 60,
351–354.
AUSTINS. J., 1984. Bacterial plasmids that carry two
functional centromere analogs are stable and are partitioned faithfully. J. Bacteriol. 158, 742–745.
BARTOSIKD., 2001. Bacterial plasmid stability. Postepy Biochem. 47, 138–145.
BARTOSIK D., BAJ J., PIECHUCKA E., WALKER E., W£ODARCZYKM., 2002. Comparative
characteriza-tion of repABC-type replicons of Paracoccus versu-tus composite plasmids. Plasmid (w druku).
BIEKD. P., SHIJ., 1994. A single 43-bp sopC repeat of plasmid mini-F is sufficient to allow assembly of a functional nucleoprotein partition complex. Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 91, 8027–8031.
BIGNELL C., THOMAS C. M., 2001 The bacterial
Pa-rA-ParB partitioning proteins. J. Biotechnol. 91,
1–34.
BIGNELLC. R., HAINES A. S., KHARE D., THOMAS, C. M., 1999. Effect of growth rate and incC mutation on
symmetric plasmid distribution by the IncP-1 par-titioning apparatus. Mol. Microbiol. 34, 205–216.
BORKP., SANDERC., VALENCIAA., 1992. An ATPase do-main common to prokaryotic cell cycle proteins, sugar kinases, actin, and hsp70 heat shock prote-ins. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 7290–7294.
BOUETJ. Y., FUNNELLB. E., 1999. P1 ParA interacts with
the P1 partition complex at parS and an ATP-ADP switch controls ParA activities. Embo J. 18,
1415–1424.
BREUNERA., JENSENR. B., DAMM., PEDERSENS., GERDESK., 1996. The centromere-like parC locus of plasmid
R1. Mol. Microbiol. 20, 581–592.
DAMM., GERDESK., 1994. Partitioning of plasmid R1. Ten direct repeats flanking the parA promoter constitute a centromere-like partition site parC, that expresses incompatibility. J Mol. Biol. 236,
1289–1298.
DAVEYM. J., FUNNELLB. E., 1994. The P1 plasmid
parti-tion protein ParA. A role for ATP in site-specific DNA binding. J. Biol. Chem. 269, 29908–29913.
DAVEYM. J., FUNNELLB. E., 1997. Modulation of the P1
plasmid partition protein ParA by ATP, ADP, and P1 ParB. J. Biol. Chem. 272, 15286–15292.
DAVISM. A., MARTINK. A., AUSTINS. J., 1992.
Biochemi-cal activities of the parA partition protein of the P1 plasmid. Mol. Microbiol. 6, 1141–1147.
DAVIS M. A., RADNEDGE L., MARTIN K. A., HAYES F., YOUNGRENB., AUSTINS. J., 1996. The P1 ParA
prote-in and its ATPase activity play a direct role prote-in the segregation of plasmid copies to daughter cells.
Mol. Microbiol. 21, 1029–1036.
DELAHOZA. B., AYORAS., SITKIEWICZI., FERNANDEZS., PANKIEWICZ R., ALONSO J.C., CEG£OWSKI P., 2000.
Plasmid copy-number control and better-than-random segregation genes of pSM19035 share a common regulator. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97,
728–733.
EBERSBACHG., GERDES, K., 2001. The double par locus of
virulence factor pB171: DNA segregation is corre-lated with oscillation of ParA. Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 98, 15078–15083.
EDGARR., CHATTORAJD. K., YARMOLINSKYM., 2001. Pa-iring of P1 plasmid partition sites by ParB. Mol.
Microbiol. 42, 1363–70.
ERDMANNN., PETROFFT., FUNNELLB.E., 1999.
Intracellu-lar localization of P1 ParB protein depends on ParA and parS. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96,
14905–14910.
FUNGE., BOUETJ.Y., FUNNELLB. E., 2001. Probing the
AT-P-binding site of P1 ParA: partition and repres-sion have different requirements for ATP binding and hydrolysis. EMBO J. 20, 4901–4911.
FUNNELL B. E., 1988a. Mini-P1 plasmid partitioning: excess ParB protein destabilizes plasmids conta-ining the centromere parS. J. Bacteriol. 170,
954–960.
FUNNELLB. E., 1988b. Participation of Escherichia coli integration host factor in the P1 plasmid partition system. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 6657–6661.
FUNNELLB. E., 1991. The P1 plasmid partition complex
at parS. The influence of Escherichia coli integra-tion host factor and of substrate topology. J. Biol.
Chem. 266, 14328–14337.
FUNNELLB. E., GAGNIERL., 1993. The P1 plasmid parti-tion complex at parS. II. Analysis of ParB protein binding activity and specificity. J. Biol. Chem. 268,
GERDESK., MOLLER-JENSENJ., BUGGEJENSENR., 2000.
Pla-smid and chromosome partitioning: surprises from phylogeny. Mol. Microbiol. 37, 455–466.
GODFRIN-ESTEVENONA. M., PASTAF., LANED., 2002. The
parAB gene products of Pseudomonas putida exhibit partition activity in both P. putida and Escherichia coli. Mol. Microbiol. 43, 39–49.
GORDON G. S., SITNIKOV D., WEBB C. D., TELEMAN A., STRAIGHT A., LOSICK R., MURRAY A. W., WRIGHT A., 1997. Chromosome and low copy plasmid
segre-gation in E. coli: visual evidence for distinct me-chanisms. Cell 90, 1113–1121.
GRIGORIEVP., £OBOCKAM. B., 2001. Determinants of
se-gregational stability of the linear plasmid propha-ge N15 of Escherichia coli. Mol. Microbiol. 42,
355–368..
HANAIR., LIUR., BENEDETTIP., CARONP. R., LYNCHA. S., WANGJ. C., 1996. Molecular dissection of a protein
SopB essential for Escherichia coli F plasmid parti-tion. J. Biol. Chem. 271, 17469–17475.
HAOJ. J., YARMOLINSKYM., 2002. Effects of the plasmid
centromere on expression of P1 partition genes. J.
Bacteriol. 184, 4857–4867.
HAYESF., AUSTINS., 1994. Topological scanning of the
P1 plasmid partition site. J. Mol. Biol. 243,
190–198.
HIRAGA S., 2000. Dynamic localization of bacterial
and plasmid chromosomes. Annu. Rev. Genet. 34,
21–59.
HIRANO M., MORI H., ONOGI T., YAMAZOE M., NIKI H., OGURA T., HIRAGA S., 1998. Autoregulation of the
partition genes of the mini-F plasmid and the in-tracellular localization of their products in Esche-richia coli. Mol. Gen. Genet. 257, 392–403.
HOT. Q., ZHONGZ., AUNGS., POGLIANOJ., 2002.
Compa-tible bacterial plasmids are targeted to indepen-dent cellular locations in Escherichia coli. EMBO
J. 21, 1864–1872.
JAGURA-BURDZY G., MACARTNEY D. P., ZATYKA M., CUNLIFFE L., COOKED., HUGGINS C., WESTBLADEL., KHANIMF., THOMASC. M., 1999. Repression at a
di-stance by the global regulator KorB of promiscu-ous IncP plasmids. Mol. Microbiol. 32, 519–532.
JENSENR. B., DAMM., GERDESK., 1994. Partitioning of
plasmid R1. The parA operon is autoregulated by ParR and its transcription is highly stimulated by a downstream activating element. J. Mol. Biol.
236, 1299–1309.
JENSENR. B., GERDESK., 1997. Partitioning of plasmid
R1. The ParM protein exhibits ATPase activity and interacts with the centromere-like ParR-parC com-plex. J. Mol. Biol. 269, 505–513.
JENSENR. B., GERDESK., 1999. Mechanism of DNA
segre-gation in prokaryotes: ParM partitioning protein of plasmid R1 co-localizes with its replicon during the cell cycle. EMBO J. 18, 4076–4084.
JENSENR. B., LURZR., GERDESK., 1998. Mechanism of
DNA segregation in prokaryotes: replicon pairing by parC of plasmid R1. Proc. Natl. Acad. Sci. USA
95, 8550–8555.
JONES L. J., CARBALLIDO-LOPEZ R., ERRINGTON J., 2001.
Control of cell shape in bacteria: helical, actin-like filaments in Bacillus subtilis. Cell 104, 913–922.
KALNINK., STEGALKINAS., YARMOLINSKYM., 2000.
pTA-R-encoded proteins in plasmid partitioning. J.
Bac-teriol. 182, 1889–1894.
KIMS. K., WANGJ. C., 1999. Gene silencing via
prote-in-mediated subcellular localization of DNA.
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96, 8557–8561. KOONIN E. V., 1993. A superfamily of ATPases with
diverse functions containing either classical or deviant ATP-binding motif [published erratum
appears in J. Mol. Biol. 1993232(3), 1013]. J. Mol. Biol. 229, 1165–1174.
KUSUKAWAN., MORIH., KONDOA., HIRAGAS., 1987.
Par-titioning of the F plasmid: overproduction of an essential protein for partition inhibits plasmid maintenance. Mol. Gen. Genet. 208, 365–372.
LANED., ROTHENBUEHLERR., MERRILLATA. M., AIKENC. 1987. Analysis of the F plasmid centromere. Mol. Gen. Genet. 207, 406–412.
LEMONK. P., GROSSMANA. D., 1998. Localization of bac-terial DNA polymerase: evidence for a factory mo-del of replication [see comments]. Science 282,
1516–159.
LEMONK. P., GROSSMANA. D., 2000. Movement of repli-cating DNA through a stationary replisome. Mol.
Cell 6, 1321–1330.
LIND. C., GROSSMANA. D., 1998. Identification and
cha-racterization of a bacterial chromosome partitio-ning site. Cell 92, 675–685.
LOBOCKAM., YARMOLINSKYM., 1996. P1 plasmid
parti-tion: a mutational analysis of ParB. J. Mol. Biol.
259, 366–382.
MARTINK. A., DAVISM. A., AUSTINS., 1991.
Fine-structu-re analysis of the P1 plasmid partition site. J.
Bac-teriol. 173, 3630–3634.
MOHLD. A., GOBERJ. W., 1997. Cell cycle-dependent
po-lar localization of chromosome partitioning pro-teins in Caulobacter crescentus. Cell 88, 675–684.
MOLLER-JENSENJ., JENSENR. B., LOWEJ., GERDESK., 2002. Prokaryotic DNA segregation by an actin-like fila-ment. EMBO J. 21, 3119–3127.
MORIH., MORIY., ICHINOSEC., NIKIH., OGURAT., KATO A., HIRAGAS., 1989. Purification and
characteriza-tion of SopA and SopB proteins essential for F pla-smid partitioning. J. Biol. Chem. 264, 15535–15541.
POGLIANOJ., HOT. Q., ZHONGZ., HELINSKID. R., 2001.
Multicopy plasmids are clustered and localized in Escherichia coli. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98,
4486–4491.
QUISELJ. D., LIND. C., GROSSMANA. D., 1999. Control of
development by altered localization of a trans-cription factor in B. subtilis. Mol. Cell 4, 665–672.
RASKIND. M., DE BOERP. A.,1999. Rapid pole-to-pole oscillation of a protein required for directing divi-sion to the middle of Escherichia coli. Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 96, 4971–4976.
RAVINN., LANED., 1999. Partition of the linear plasmid
N15: interactions of N15 partition functions with the sop locus of the F plasmid. J. Bacteriol. 181,
6898–6906.
RODIONOVO., LOBOCKAM., YARMOLINSKYM., 1999.
Silen-cing of genes flanking the P1 plasmid centromere.
STRZELECKA-GOLASZEWSKA H., 2001. Generacja ruchu
przez polimeryzacjê aktyny. Kosmos, 50, 411–425.
TREPTOWN., ROSENFELDR., YARMOLINSKYM., 1994
Parti-tion of nonreplicating DNA by the par system of bacteriophage P1. J. Bacteriol. 176, 1782–1786.
VANDENENTF., AMOSL. A., LOWEJ., 2001. Prokaryotic
origin of the actin cytoskeleton. Nature 413,
39–44.
WEITAOT., DASGUPTAS., NORDSTROMK., 2000. Plasmid
R1 is present as clusters in the cells of Escherichia coli. Plasmid 43, 200–204.
YAMAICHIY., NIKIH., 2000. Active segregation by the
bacillus subtilis partitioning system in Escheri-chia coli. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97, 14656–14661.
YARMOLINSKY M., 2000. Transcriptional silencing in
