Medycyna Wet. 2006, 62 (11) 1219
Artyku³ przegl¹dowy Review
Zaka¿enia bakteryjne ró¿nych tkanek i narz¹dów wywo³ane przez lekooporne formy bakterii stwarzaj¹ w praktyce medycznej powa¿ne problemy terapeutycz-ne (3, 13, 17). Wi¹¿¹ siê oterapeutycz-ne ze sta³ym pojawianiem siê szczepów bakteryjnych, opornych na antybiotyki, w tym na antybiotyk tzw. ostatniej szansy wanko-mycynê. W pimiennictwie coraz czêciej u¿ywa siê stwierdzenia, ¿e wchodzimy w erê przedantybiotyko-w¹ (13).
Antybiotykoopornoæ bakterii
Jednym z najwa¿niejszych mechanizmów opor-noci bakterii na najczêciej stosowane antybiotyki laktamowe jest ich zdolnoæ do wytwarzania beta--laktamaz enzymów zdolnych do zablokowania dzia-³ania antybiotyków tej grupy. Enzymy te posiadaj¹ zdolnoæ rozbijania piercienia beta-laktamowego an-tybiotyku, co ca³kowicie blokuje jego aktywnoæ bio-logiczn¹ (9).
Zjawisko powszechnej antybiotykoopornoci bak-terii stwarza powa¿ne problemy terapeutyczne. Powa¿-ny niepokój budzi tak¿e fakt pojawienia siê w ostat-nich latach szczepów enterokoków opornych na wan-komycynê, a tak¿e ostatnio na linezolid.
Opornoæ bakterii na antybiotyki, jak równie¿ ich nadmierne i nie zawsze w pe³ni uzasadnione stosowa-nie, wyjania z jednej strony zjawisko wystêpowania zaka¿eñ wywo³anych przez antybiotykooporne bakte-rie, a z drugiej strony stwarza koniecznoæ zastosowa-nia innych czynników zdolnych do opanowywazastosowa-nia tych zaka¿eñ.
Bakteriofagi wirusy niszcz¹ce bakterie Bakteriofagi (fagi) nale¿¹ do grupy szeroko rozpo-wszechnionych w przyrodzie wirusów, których cykl ¿yciowy zwi¹zany jest wy³¹cznie z komórk¹ bakteryj-n¹ (1). Opisano dot¹d ponad 5000 fagów aktywnych wobec wielu znanych gatunków bakterii. S¹ wszech-obecne izoluje siê je ze wszystkich rodowisk natu-ralnych wód s³odkich i s³onych (tak¿e z gor¹cych róde³) i gleby oraz z organizmów ludzi i zwierz¹t.
Potencjalne mo¿liwoci wykorzystania bakteriofagów
w leczeniu zaka¿eñ bakteryjnych zwierz¹t*
)
BEATA WEBER-D¥BROWSKA, ANDRZEJ GÓRSKI, MICHA£ ZIMECKI,
MARZANNA £USIAK-SZELACHOWSKA, MIROS£AW GRZÊDA*, MA£GORZATA LIS*, RYSZARD MIÊDZYBRODZKI, WOJCIECH FORTUNA, ANDRZEJ DUBIEL**,
KINGA WITA£A-JELEÑ, JANUSZ BORATYÑSKI
Instytut Immunologii i Terapii Dowiadczalnej PAN, ul. R. Weigla 12, 53-114 Wroc³aw *Biowet Pu³awy Sp. z o.o., ul. Arciucha 2, 24-100 Pu³awy
**Katedra i Klinika Rozrodu, Chorób Prze¿uwaczy oraz Ochrony Zdrowia Zwierz¹t Wydzia³u Medycyny Weterynaryjnej AR, pl. Grunwaldzki 49, 50-366 Wroc³aw
Weber-D¹browskaB., GórskiA., ZimeckiM., £usiak-SzelachowskaM., GrzêdaM., Lis M., MiêdzybrodzkiR., FortunaW., DubielA., wita³a-Jeleñ K., Boratyñski J.
Potential application of bacteriophages in bacterial infections in animals
Summary
Antibioticresistant bacterial infections have caused serious therapeutic problem in medicine and veterinary practice. Resistance to antibiotics is currently increasing, which is related to, among other factors, the capability of bacteria to produce specific enzymes rendering them resistant to most available antibiotics. Renewed interest in the possibilities of using bacteriophages, viruses that can attack and destroy bacterial cells, in antibacterial therapy in humans and animals has been observed in many countries. Phage therapy of bacterial infections in humans has been conducted by our Institute since 1980. The most successful results were obtained in cases of meningitis, furunculosis, otitis media, cancer, and septicemia (100% of patients). Experimental phage therapy in animals is provided by many centers. Successful therapeutic and protective phage therapy has been observed in calves, piglets, lambs, chickens and mice. Our results on the phage treatment of colibacterosis in foxes, piglets and balanoposithis in bears have demonstrated its high effectiveness. A study on phage preparates for their use in bovine mastitis is currently underway.
Keywords: bacterial infections, bacteriophages, phage therapy
*) Badania finansowane ze rodków Ministra Nauki w latach 2003-2006 jako
projekt badawczy zamawiany (grant nr PBZ-MIN-007/P04/33) oraz jako granty KBN nr 5P06K 00518 i nr 3P06K 01125.
Medycyna Wet. 2006, 62 (11) 1220
Wystêpuj¹ tak¿e w produktach spo¿ywczych pocho-dzenia zwierzêcego.
Jak wspomniano, cykl ¿yciowy bakteriofagów zwi¹-zany jest z komórk¹ bakteryjn¹, przy czym mo¿liwe s¹ dwa ró¿ne typy oddzia³ywania faga na gospodarza. Cykl lityczny (wirulentny), prowadzi do ca³kowitego zniszczenia komórki bakteryjnej, a bakteriofagi zosta-j¹ uwolnione do rodowiska w procesie lizy komórki bakteryjnej, m.in. z udzia³em fagowych enzymów li-tycznych. W cyklu lizogenicznym (³agodnym) mate-ria³ genetyczny faga po wnikniêciu do komórki bakte-ryjnej ulega wbudowaniu w chromosom bakteryjny (tzw. profag) i jest przekazywany komórkom potom-nym podczas podzia³u komórki. Proces namna¿ania fagów zachodzi zarówno w warunkach in vitro, jak i in vivo.
Praktyczne zastosowanie bakteriofagów. Swoistoæ gatunkowa fagów i lizotypia bakterii Wiêkszoæ bakteriofagów cechuje wysoka swoistoæ dzia³ania. Oznacza to, i¿ ich aktywnoæ lityczna zwi¹-zana jest zwykle z jednym gatunkiem drobnoustroju. I w³anie ta cecha pozwoli³a, z jednej strony, na wyko-rzystanie bakteriofagów do okrelania przynale¿noci gatunkowej bakterii, a z drugiej strony, na zró¿nico-wanie szczepów bakteryjnych w obrêbie tego samego gatunku. Opracowano wiele zestawów fagów typuj¹-cych, umo¿liwiaj¹cych ró¿nicowanie bakterii na pod-stawie ich reakcji z fagami typuj¹cymi (tzw. lizotypia) (1).
Wykorzystanie bakteriofagów w terapii zaka¿eñ bakteryjnych
Jak wspomniano, zaka¿enia bakteryjne wywo³ane lekoopornymi szczepami bakterii, stanowi¹ powa¿ny problem wymagaj¹cy poszukiwañ nowych terapii do walki z patogennymi drobnoustrojami. Krótko po od-kryciu bakteriofagów podjêto pierwsze próby ich za-stosowania w terapii antybakteryjnej u ludzi. W ci¹gu ostatnich kilku lat opublikowano wiele prac postulu-j¹cych celowoæ rozszerzenia badañ nad wykorzysta-niem bakteriofagów w terapii antybakteryjnej (3, 5, 17), co równie¿ potwierdzaj¹ wyniki uzyskane w tej dziedzinie przez Instytut Immunologii i Terapii Do-wiadczalnej PAN (1, 17).
Badania w³asne wykaza³y wysok¹ skutecznoæ te-rapii fagowej w grupie 2000 chorych w zaka¿eniach lekoopornymi szczepami bakteryjnymi, zarówno w zaka¿eniach jednorodnych, jak i mieszanych, bez wzglêdu na rodzaj schorzenia, wiek pacjenta czy wczeniej prowadzon¹ antybiotykoterapiê (19). Szcze-gólnie wysok¹ skutecznoæ fagoterapii (85%) obser-wowano u chorych z posocznic¹, a pe³ny efekt tera-peutyczny uzyskano u 20 chorych, u których zaka¿e-nia bakteryjne wyst¹pi³y w przebiegu procesu nowo-tworowego. Na szczególne podkrelenie zas³uguje fakt, i¿ w czasie prowadzonej fagoterapii nie obserwowa-no istotnych objawów ubocznych.
Eksperymentalna fagoterapia zaka¿eñ bakteryjnych u zwierz¹t
Zaka¿enia bakteryjne wywo³ane przez lekooporne bakterie stwarzaj¹ powa¿ne problemy terapeutyczne w praktyce weterynaryjnej. Sta³e pojawianie siê wieloopornych szczepów gronkowców, enterokoków, paciorkowców i bakterii z rodzajów Escherichia, Salmonella, Pseudomonas oraz Campylobacter stano-wi zagro¿enie dla zdrostano-wia i ¿ycia zstano-wierz¹t hodowla-nych (4, 6, 7). Badania nad mo¿liwoci¹ wykorzysta-nia bakteriofagów w terapii antybakteryjnej s¹ prowa-dzone na zwierzêtach dowiadczalnych od kilkudzie-siêciu lat (4-8, 10-12, 14, 15, 18). W 1943 r. Dubos i wsp. (8) wykazali m.in. skuteczne dzia³anie fagów podanych dootrzewnowo myszom z zapaleniem opon mózgowo-rdzeniowych wywo³anym letaln¹, domózgo-w¹ dawk¹ Shigella dysenteriae. Bardzo interesuj¹ce wyniki eksperymentalnego zastosowania fagów przed-stawili Smith i wsp. (14-16). Autorzy ci wykazali sku-teczne, terapeutyczne dzia³anie fagów w biegunce dowiadczalnie wywo³anej enteropatogennym szcze-pem Escherichia coli u ciel¹t, prosi¹t i jagni¹t (15). W badaniach tych uzyskano skuteczniejsze dzia³anie fagów w porównaniu do antybiotyków. Podane bakte-riofagi w 1 do 8 godzin przed zaka¿eniem wykazywa-³y dzia³anie ochronne. W kolejnych badaniach auto-rzy ci wykazali równie¿ ochronne dzia³anie fagów Escherichia coli u zwierz¹t trzymanych w pomiesz-czeniach, w których uprzednio przebywa³y zwierzêta leczone fagami lub fagi by³y w nich rozprowadzone (16). Autorzy wykazali tak¿e zdolnoæ fagów do na-mna¿ania siê in vivo, a tak¿e wp³yw ró¿nych czynni-ków zewnêtrznych na prze¿ycie bakteriofagów w ro-dowisku. Podobnie skuteczne dzia³anie fagów w prze-biegu posocznicy i zapalenia opon mózgowo-rdzenio-wych u ciel¹t i drobiu wykazali Barrow i wsp. (5). Izo-lowany ze cieków fag E. coli R wykazywa³ dzia³anie lityczne szczepu E. coli K1. Jednoczesne domiênio-we podanie faga i bakterii ca³kowicie chroni³o zwie-rzêta przed rozwojem zaka¿enia. Autorzy ci wykazali tak¿e, ¿e u kurcz¹t zaka¿onych drog¹ doczaszkow¹ fagi przechodz¹ barierê krewmózg.
Interesuj¹ce wyniki zosta³y przedstawione przez zespó³ W. E. Huffa i wsp. (10, 11). W wielokierunko-wych badaniach autorzy wykazali zarówno ochronne, jak i terapeutyczne dzia³anie fagów w eksperymental-nym zaka¿eniu dróg oddechowych u drobiu, wywo³a-nym przez patogenny szczep E. coli O2. Badano sku-tecznoæ fagów w zale¿noci od drogi podania (do-miêniowo, wziewnie), od jednoczesnego lub opó-nionego podania faga w stosunku do zaka¿enia, od wielokrotnoci podawanych dawek faga oraz od faga podanego bez jednoczesnego u¿ycia antybiotyku lub z antybiotykiem. Wykazano wiêksz¹ skutecznoæ te-rapii fagowej przy domiêniowym podaniu faga oraz statystycznie istotne lepsze wyniki terapii fagowej sko-jarzonej z podaniem antybiotyku. Tak¿e wyniki
przed-Medycyna Wet. 2006, 62 (11) 1221
stawione przez innych autorów wskazuj¹ na skutecz-n¹ fagoterapiê eksperymentalnie wywo³anej posocz-nicy u myszy po dootrzewnowym podaniu letalnej dawki wankomycynoopornego szczepu Enterococcus faecium (6), natomiast Atterbury i wsp. (4) wskazuj¹ na mo¿liwoæ skutecznego zastosowania bakteriofa-gów do eliminacji szczepów Campylobacter koloni-zuj¹cych skórê kurcz¹t, co mog³oby w przysz³oci pro-wadziæ do wykorzystania bakteriofagów do celów te-rapeutycznych.
Fagi w weterynarii badania w³asne
Pierwsze próby zastosowania bakteriofagów by³y prowadzone przez nasz Instytut ju¿ w latach 1970-1979 w przypadkach kolibakteriozy u lisów (18) i prosi¹t (12). Bakteriofagi zastosowano u 175 lisów z objawa-mi ostrego zapalenia b³ony luzowej jelit, wywo³ane-go zaka¿eniem pa³eczk¹ Escherichia coli. Bakteriofa-gi (o mianie 105 czf/ml) podano doustnie (dwukrotnie
w odstêpach dwudniowych), uzyskuj¹c pe³ne wylecze-nie 173 zwierz¹t. Skuteczna tak¿e okaza³a siê terapia fagowa kolibakteriozy 1213 prosi¹t. Po zastosowaniu swoistego bakteriofaga E. coli odsetek wyleczonych zwierz¹t wynosi³ 95,6%, co dawa³o korzystniejszy wynik w porównaniu do grupy kontrolnej leczonej chemioterapeutykami.
W zwi¹zku z problemem niep³odnoci wystêpuj¹-cej u knurów, zwi¹zanej z zapaleniem b³ony luzowej pr¹cia i napletka (balanoposthitis), wywo³anym zaka-¿eniem Pseudomonas, w ramach wspólnie realizowa-nego grantu KBN z Akademi¹ Rolnicz¹ we Wroc³a-wiu, bakteriofagi zastosowano u 15 knurów z ró¿nych stacji unasienniania. Poliwalentny preparat fagowy zosta³ przygotowany w oparciu o okrelenie wra¿li-woci na swoiste bakteriofagi 50 szczepów Pseudo-monas. U wszystkich zwierz¹t uzyskano ca³kowite ust¹pienie objawów zaka¿enia po 2 tygodniach doust-nej i miejscowej fagoterapii. Uzyskany efekt terapeu-tyczny okaza³ siê trwa³y w kilkukrotnych badaniach bakteriologicznych nie wykazano obecnoci pa³eczek Pseudomonas. Wykazano tak¿e statystycznie istotny wp³yw fagoterapii na prze¿ywalnoæ plemników (o 230%) (7).
Zapalenie gruczo³u mlekowego u krów (mastitis) stanowi powa¿ny, o wiatowym wymiarze problem terapeutyczny (2). Organizmy bakteryjne bêd¹ce przy-czyn¹ mastitis to g³ównie szczepy z rodzaju Strepto-coccus i StaphyloStrepto-coccus. Stosowane dot¹d metody te-rapii antybakteryjnych w mastitis z u¿yciem antybio-tyków i szczepionek nie przynosz¹ zadowalaj¹cych rezultatów. W ramach realizowanego przez Instytut wspólnie ze spó³k¹ Biowet Pu³awy grantu zamawia-nego prowadzone s¹ m.in. badania zmierzaj¹ce do opracowania preparatów bakteriofagowych, swoistych dla szczepów bakteryjnych bêd¹cych najczêstsz¹ przy-czyn¹ zapalenia gruczo³u mlekowego u byd³a. Zgro-madzono blisko 200 szczepów gronkowca z³ocistego izolowanego z mleka krów, pochodz¹cych z okolic
Pu³aw, Kielc oraz województwa warmiñsko-mazur-skiego. Okrelono profil wra¿liwoci szczepów na antybiotyki oraz na poliwalentne bakteriofagi Staphy-lococcus aureus, co bêdzie podstaw¹ do przygotowa-nia preparatów fagowych dla potrzeb terapeutycznych. Zjawisko opornoci bakterii na aktualnie dostêpne chemioterapeutyki stwarza koniecznoæ opracowania nowych strategii do walki z lekoopornymi drobnoustro-jami. Uzyskane dot¹d wyniki badañ nad terapeutycz-nym zastosowaniem bakteriofagów w leczeniu zaka-¿eñ bakteryjnych u ludzi i zwierz¹t uzasadniaj¹ celo-woæ ich kontynuowania. Opracowanie preparatów fagowych o dzia³aniu zarówno terapeutycznym, jak i profilaktycznym mo¿e okazaæ siê w przysz³oci jed-n¹ z najskuteczniejszych metod do walki z bakteriami patogennymi dla ludzi i zwierz¹t.
Pimiennictwo
1.Ackermann H. W., Dubow M. S.: Viruses of Prokaryotes I. General Properties of Bacteriophages. CRC Press. Boca Raton FL. 1987, 1-172.
2.Adesiyun A. A.: Characteristic of Staphylococcus aureus strains isolated from bovine mastitic milk: bacteriophage and antimicrobial agent susceptibility and enterotoxigenicity. J. Vet. Med. B. 1994, 42, 129-139.
3.Alisky J., Iczkowski K., Rapoport A., Troitsky N.: Bacteriophage show promise as antimicrobial agents. J. Infect. 1998, 36, 5-15.
4.Atterbury R. J., Connerton P. L., Dodd C. E., Rees C. E., Connerton J. F.: Application of host specific bacteriophages to the surface of chicken skin leads to a reduction in recovery of Campylobacter jejuni. Appl. Environ. Microbiol. 2003, 69, 6302-6306.
5.Barrow P. A., Lovell M., Berchieri A. Jr.: Use of lytic bacteriophage for control of experimental Escherichia coli septicemia and meningitis in chickens and calves. Clin. Diagn. Lab. Immunol. 1998, 5, 294-298.
6.Biswas B., Adhya S., Washard B.: Bacteriophage therapy rescues mice bacte-remic from a clinical isolate of vancomycin-resistant Enterococcus faecium. Infect. Immun. 2002, 70, 204-210.
7.Dubiel A., Kozdrowski R., Bielas W., Siemieniuch M., Weber-D¹browska B., Mulczyk M.: Wp³yw swoistych bakteriofagów na w³aciwoci nasienia knurów zaka¿onych pa³eczk¹ ropy b³êkitnej. Med. Vet. 2005, 4(2), 33-40.
8.Dubos R. J., Straus J. H., Pierce C.: The multiplication of bacteriophage in vivo and its protective effect against an experimental infection with Shigella dysen-teriae. J. Exp. Med. 1943, 20, 161-168.
9.Dzier¿anowska D.: Mechanizmy bakteryjnej opornoci na chemioterapeutyki oraz znaczenie kliniczne tego zjawiska. Medycyna po Dyplomie, wydanie spe-cjalne wrzesieñ 1995, 3-15.
10.Huff W. E., Huff G. R., Rath N. C., Balong J. M., Donoghue A. M.: Prevention of Escherichia coli infection in broiler chicken with a bacteriophage aerosol spray. Poult. Sci. 2002, 81, 1486-1491.
11.Huff W. E., Huff G. R., Rath N. C., Balong J. M., Donoghue A. M.: Evaluation of aerosol spray and intramuscular injection of bacteriophage to treat an Esche-richia coli respiratory infection. Poult. Sci. 2003, 82, 1108-1112.
12.Kaszubkiewicz Cz., Kucharewicz-Krukowska A., Michalski Z., Bocianowski M., So³tysiak Z., Durlak J.: Próba zastosowania bakteriofagów w leczeniu koli-bakteriozy prosi¹t. Medycyna Wet. 1982, 38, 281-282.
13.Merril C. R., Biswas B., Carlton R.: Long-circulating bacteriophage as anti-microbial agents. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1996, 93, 3188-3192.
14.Smith H. W., Huggins M. B.: Successful treatment of experimental Escherichia coli infection in mice using phage: its general superiority over antibiotics. J. Gen. Microbiol. 1982, 129, 307-318.
15.Smith H. W., Huggins M. B.: Effectiveness of phages in treating experimental Escherichia coli diarrhoea in calves piglets and lambs. J. Gen. Microbiol. 1983, 129, 2659-2675.
16.Smith H. W., Huggins M. B., Shaw K. M.: Factors infuencing the survival and multiplication of bacteriophages in calves and in their environment. J. Gen. Microbiol. 1987, 133, 1127-1135.
17.Sulakvelidze A., Alavidze Z., Morris J. G. Jr.: Bacteriophage therapy. Anti-microb. Agents Chemother. 2001, 45, 649-659.
18.lopek S., Kucharewicz-Krukowska A., Kotz J., Michalski Z., So³tysiak Z.: Próba leczenia bakteriofagami kolibakteriozy u lisów. Medycyna Wet. 1979, 34, 672-673.
19.Weber-D¹browska B., Mulczyk M., Górski A.: Bacteriophage therapy of bacte-rial infections: an update of our Institutes experience. Arch. Immunol. Ther. Exp. 2000, 48, 547-551.
Adres autora: dr Beata Weber-D¹browska, ul. R. Weigla 12, 53-114 Wroc³aw; e-mail: weber@iitd.pan.wroc.pl
