Wpływ konserwacji krwi na zawartość kwasów nukleinowych i aktywności enzymów nukleolitycznych w limfocytach ludzkiej krwi obwodowej

A C T A U N I V E R S I T A T I S L O D Z I E N S I S FOLIA BIOCHIMICA ET BIOPHYSICA 6, 1988

W o j c i e c h Ge rem ek , Z of i a W a l te r

W P Ł Y W K O N S E R W AC J I KRWI N A Z A W A R T O Ś Ć K W A S Ó W N U K L E I N O W Y C H I A KT Y W N O Ś C I E N Z Y M Ó W N U K L E O L I T Y C Z N Y C H W L I M F O C Y T A C H L U D Z K I E J KR WI O B W O D O W E J

Materiałem do badań były limfocyty izolowane z ludzkiej krwi

obwo-dowej, pobieranej od zdrowych dawców, przechowywanej w temperaturze

4°-6°C w 3 różnych płynach konserwujących; 1) ACD formuły B o składzie

- 0,045 M cytrynian sodu, 0,025 M kwas cytrynowy, 0,035 M glukoza,

pH - 4,9; 2) CPD o składzie - 0,088 M cytrynian sodu, 0,015 M kwas

cy-trynowy, 0.139 M glukoza, 0,158 M fosforan sodu, pH = 5,63; 3) CPD z

dodatkiem adeniny i adenozyny. Czas konserwacji krwi wynosił: 0, 7, 14,

21 dni dla ACDf.B; 0, 7, 14, 21 i 28 dni dla CPD; 0, 7, 14, 21, 28 i 42

dni dla CPD z adeniną i adenozyną. W limfocytach oznaczono zawartość

RNA i DNA metodą spektrofotometryczną Markova i Tsaneva, oraz

aktyw-ność rybonukleazową metodą Frih-Niggemeyer-Reddi, dezoksyrybonukleazy

metodą Rotherham i fosfatazy kwaśnej metodą Kin ga-Armstronga.

Stwierdzono pewne zmiany w zawartości RNA i DNA oraz w aktywności

badanych enzymów, zależne od czasu i warunków konserwacji krwi,

przy-pominające zmiany zachodzące w limfocytach stymulowanych mitogenami.

WSTĘP * Z a c h o w a n i e si ę k r w i n e k b i a ł y c h w kr wi lu dzki ej ko ns e rw o wa n ej ma d u ż e z n a cz e n i e z t e o r e t y c z n e g o i p r a k t y c z n e g o p u n k t u Wi dz en ia. W p r o c e s i e " s t ar z en i a" s ię l e uk o c y t ó w w c za s i e k o n se r w o w a n i a k rw i lu dzk ie j w t e m p e r a t u r z e +4 d o + 6 °C, p r z y u ż y c i u p ł y n ó w k o n -s e r w u j ą c y c h z wr a ca u w a g ę o d m i e n n a w r a ż l i w o ś ć p o s z c z e g ó l n y c h p o -st a ci l e u k o c y t ó w o ra z r óż n a k ole j no ś ć, w jakiej u l e g a j ą on e roz

padowi. Na jb a rd z ie j w r aż l i w e są k om ór ki uk ł a d u gr an ul o oy t ów , n a -t om i as -t w l i m f o cy -t a c h p ro c e s y z wy r o dn i e n i a p r z e b i e g a j ą wolniej .

I s t n i ej ą b a d a n ia [28, 29] w y ka zu ją ce , że l i mf o c y ty są nie ty lko zdoln e p r z eż y ć w krw i ko ns e rw o wa n ej p ł yn a mi k on s er wu ją cy mi, ale t ak ż e z ac h ow u j ą sw o ją f u nk c j ą m it o ty czn ą. B a da n i a P e t r a- k i s a i wsp. [19] po kaz ał y, że li m fo c yt y krwi ko ns er wow an ej p ł yn e m A CD f or m u ł y B, pr z ec h o w yw a n e j do 22 dni w t em p e r at u rz e + 4 ° C , w y k a z u j ą w h o do wl i a k t y w n oś ć m i t o t y c z n ą p o d o b n ą jak l im f o -c y ty k rwi świeżej. N a t om i a s t Q u a g l i n o i wsp. [20] stw ie rd zi li, że w h o do w li bez P H A (fi to he ma g lu t yn i ny ) ró wni eż o b -s e rw u je -sią pr o c e -s t r a n s f o rm a c j i limfoc ytów , a w z r o s t l icz by bla- st ó w idz ie w pa r ze z r o zp a d e m g r a n u l o c y t ó w i p r o c es a m i ich z w y -r od n i en i a [28] .

Z a s t o s o wa n i e w le c ze n i u p r e p a r a t ó w z aw i e r a j ąc y c h li mf oc yty jest do ś ć sz e ro k i e [36],^m. in. m o ż n a w ym i e n i ć le cz en ie im mun ode- pr e s j i r óż n eg o st op n ia i p oc h od z en i a, u p o ś l e dz e n i e z ja wi sk o d p o r -n oś c io wy ch , l ec ze ni e c h o r y c h z h i p o p l a z j ą k rwi o tw ó rc z ą, z a b u r z e -niam i ak t yw n o ś c i i t r a n s f or m a c j i lim focy tów, w r o d z o n y m i ni epra - w i d ł o ś c i a m i m e t a b o l i z m u l i m f o cy t ó w p ro w a d z ąc y m i do z ab ur z eń o d -p o rn o ś c i komó rko we j, it-p. W s z y s t k o to jest p r z y c z y n ą ni e z b ęd n o ś c i t w o r z en i a z a pa s ów p r e p a r a t ó w z a w i e r a j ą c yc h l i m f oc y ty z w y s o k ą a- k t yw n o ś c i ą b io lo gi czn ą.

J a k w y k a z u j ą bad ania, k o n c e n t r a t y k rw i n e k j ed n oj ą d r z as t y c h (li mfocyty, mo no cy ty) m o g ą b yć p r ze c h o w y w a n e w o s o c z u a u ^ ol o gi c z- ny m w t e m p e r a tu r z e +4 °C w cz a s i e ni e d ł u ż s z y m jak 48 h, bez z m i a -ny w ł a ś c i w o ś c i b i o l o g i c z n y c h (str uktury, z mi a n y z do l no ś ci do t r a n s f o r m a c j i b la st ycz ne j) [6, 12]. M e to d a g ł ęb o k i e g o za mr oż e ni a p o z w a l a na z a t rz y ma n ie p r o c e s ó w b i o l o g i c z n y c h w k o mó r ce prz ez ba r d z o dł ug i ok re s [6, 33], je dn ak ni e m o ż e by ć ob e c n i e st o so w an a p o w s z e c h n i e m. in. ze w z g l ą d ó w ek on om ic zn y ch . Zatem, pr ak ty cz n ym , p o w s z e c h n i e d o s t ę p n y m w l ec z n i ct w i e ź r ód ł em l im f o cy t ó w m o g ł a b y by ć l ud z ka k re w k o n s er w o w a n a w t e m p e r a t u rz e +4 d o +6°C, w o k re s ie d ł u ż s z y m jak 48 h. N a l e ż y (p o d k r e ś l i ć , że b r a k jest w d o s t ę p n y c h d o n i e si e n i a c h d a n y c h d o t y c z ą c y c h b ad a ń m e t a b o l i z m u li m f o cy t ó w w k rwi k o n s e r w o -wan ej w t e m p e r a t ur z e +4 d o +6°C, w a s p e k ci e w y k o r z y s t a n i a jej j a -ko ź ró d ło t yc h k r w i n e k d la lec zni ct wa , po o k r e s a c h d ł u ż s z y c h jak 48 h ko ns er wo w an i a.

C e l e m p r a c y by ła p ró b a o k re ś l e n i a zmi an z a wa r to ś ci k w as ó w n u -k l e i n o w y c h D NA i R N A , or az zm i an a kt y w n oś c i n i e k t ó r y c h e n z ym ó w n uk l e ol i t y c z n yc h , jak: r y b o n u k l e a z a (RN-aza), d e z o ks y r y b o n u k l e a z a

(DNraza) o ra z a k t y w n o ś c i f o s f a t a z y kw aso we j (FK) w l im fo c yt a ch lu dzki ej k r wi k on s e r w o w an e j w t e m p e r a t ur z e +4 do +6°C, w z a l e ż n o -ści od c z a s u p r z e c h o w y w a n i a i u ż y t y c h r od z aj ó w p ł y n ó w k o n s e r w u -jących, ja ko jedn e z k r y t e r i ó w o c e n y w a r t o ś c i b io l o g ic z ne j ty ch k r wi n e k p o d k ą t e m p r z y d a t n o ś c i w lec znic twie .

MATERIAŁ I METODY 1. K o n s e r w o w a n i e krw i lu dz kiej . S k ł a d p ł y n ó w i w a r u n k i k o n -s e r w o w a n i a kr wi lu dzki ej p r z e d -s t a w i o n o w tab. 1. 2. I z o l o w an i e l i m f o c y t ó w [23]. L i m f o c y t y i z o l o wa n o m e t o d ą w i -r o wa n i a k-rw i k on s e -r w o w an e j po n a w a r s t w i e n i u jej na m i e s z a n i n ę u- r o p o l i n u m i d ek s tr a nu . W m e t o d z i e tej z a st o s o w a n o m o d y f i k a c j ę wł asną. 3. I z o l o w an e l i m f o c y t y z a w i e s z a n o w f i z j o l o g i c z n y m r oz t wo r ze c h l o r k u sodu, o b l i c z a n o z aw a rt o ś ć k o m ó r e k / m m 3 pr óbki, o c e ni a no ż y wo t n o ś ć li mf oc ytó w, m e t o d ą b a r w i e n i a b ł ę k i t e m try panu, oraz z a n i e c z y s z c z e n i a in ny mi ko m órk am i, m e t o d ą m i k r o s k o p o w ą po ic h wy- ba rw i en i u. P r ó b k i l i m f o c y t ó w z a m r a ż a n o w t e m p e r a t u r z e 3 5° C i p r z e c h o w y -w a n o -w -20°C, do m o m e n t u w y k o n a n i a b ad a ń bi o ch e m i c zn y c h . Prz ed w y k o n a n i e m t yc h b a d a ń p r z e p r o w a d z o n o h o m o g e n i z a c j ę li m fo c y t ó w w h o m o g e n i z a t o r z e P o t t e r a w t e m p e r a t u r z e 0°C. W l i m f o c y t a c h o z n a c z o n o z a w a r to ś ć k w a s ó w n u k l e i n o w y c h D N A i R N A m e t o d ą s p e k t r o f o t o m e t r y c z n ą w g T s a n e v a i M a r -k o v a [30], o r az a k t y w n o ś c i en zymó w: - R N - a z y (E . C. 2 . 7 .7 . 1 7 - t j . n u k l e o t y d y l o - 2 - t r a n s f e r a z y rybo- n u k l e i n i a nu , c y k l i z u j ą c e j ) na p o d s t a w i e p r o c e d u r y F r ih - N i g g e ma - y e r - R e d d i [5]; - D N - a z y ( E.C .3 .1 .4 .6 . - tj. n u k l e o t y d y l o h y d r o l a z y d e zo k s yr y - b o n u kl e i n i a n u ) m e t o d ą R o t h e r h a m a [21]; - FK (E .C .3 .1 .3. 2. - tj. f o s f o h y d r o l a z y m o n o e s t r ó w o r to f os f o- r a no wy ch ) m e t o d ą K i n g a - A r m s t r o n g a [11].

V C _(O S k ł a d p ł y n ó w k o n s e r w u j ą c y c h i w a r u n k i p r z e c h o w y w a n i a k r w i l u d z k i e j C o m p o s i t i o n o f c o n s e r v i n g f l u i d s a n d c o n d i t i o n s o f h u m a n b l o o d s t o r e d R o d z a j p ł y n u k o n s e r w u -j ą c e g o C y t r y -n i a n t r ó j s o -d o w y d w u -w o d n y K w a s c y t r y -n o w y j e d n o -w o d n y G l u k o z a b e z -w o d n a F o s f o r a n j e d n o -s o d o w y j e d n o -w o d n y A d e n i n a A d e n o z y n a A q u a b i d e -s t i l -l a t a a p y r o -g e n n a P H T e m p e r a t u r a k o n s e r w a c j i C z a s k o n s e r w a c j i ( w d n i a c h ) A C D f . B 0 , 0 4 5 M 0 , 0 2 3 M 0 , 0 3 5 M -• -a d 1 0 0 0 4 , 9 d o 5 , 1 2 7 7 . 1 5 d o 2 7 9 . 1 5 K ( + 4 d o + 6 ° C ) 0 7 1 4 2 1 -C P D 0 , 0 8 8 M 0 , 0 1 5 M 0 , 1 3 9 M 0 , 1 5 8 M “ a d 1 0 0 0 5 , 6 3 2 7 7 . 1 5 d o 2 7 9 . 1 5 K ( + 4 d o + 6 ° c ) 0 7 1 4 2 1 2 8 C P D + A d e + A d o 0 , 0 5 M 0 , 0 1 1 M 0 , 1 1 1 M 0 , 0 1 1 M 0 , 0 0 5 M 0 , 0 0 5 7 M a d 1 0 0 0 5 , 6 2 7 7 . 1 5 d o 2 7 9 . 1 5 K ( + 4 d o + 6 ° C ) 0 7 1 4 2 1 2 8 4 2 U w a g a : A C D f . B , C P D , C P D + A d e + A d o -p ł y n y k o n s e r w u j ą c e d o p r z e c h o w y w a n i a k r w i l u d z k i e j ; A d e -a d e n i n a , A d o -a d e n o z y n a . Geremek, Z. Walter

WYNIKI I DYSKUSJA

P r o c e s y d e g r a d ac j i t o cz ą ce s ię w l im f o c y ta c h p o dc z as k o n s e r w o -w a n i a kr-wi ludzkiej d o t y c z ą w z n a cz n ym s t op n iu k w as ó w n u k l e i n o -w y c h za ró -w no DNA, jak i RNA, k t ó r y c h o dp o w ie d n i p o z i o m st an ow i

je den z n a j w a ż n i e j s z y c h w a r u n k ó w za ch o wa n ia zd ol no ś ci li mf oc y tó w do t ra n s f o r ma c j i b l a s t y c z n y c h ora z do p o dj ę c i a o d p o w i e dn i c h f u n -kcji w m e c h a n i z m a c h o br on ny ch . S t w i e r d zo n e z mi an y z a war to śc i k w a -sów n u k l e i n o w y c h w l im f o c yt a c h ludzkiej krw i k on s er wo wan ej p r z e d -s t aw i on o na ry-s. 1 i 2.

Rys. 1. Wpływ przechowywania ludzkiej krwi obwodowej w różnych płynach kon -serwujących na zawartość DNA w

limfo-cytach

-x- płyn ACDf.B; -A- płyn CPD; -D-

płyn CPD + Ade + Ado

Fig. 1. Effect of the storage of hu

-man peripheral blood conserved in

different fluids on DNA content in lymphocytes

-x- conserving fluid ACDf.B;

-A- co

n-serving fluid CPD;

-O'

fluid CPD + Ade + Ado

Rys. 2. Wpływ przechowywania ludzkiej krwi obwodowej w różnych płynach kon -serwujących na zawartość RNA w

limfo-cytach

-x- płyn ACDf.B;

-A-

płyn CPD + Ade + Ado

Fig. 2. Effect of the storage of h u

-man peripheral blood conserved in

different fluids on RNA content in lymphocytes

-x- conserving fluid ACDf.B;

-A-

con-serving fluid 'CPD;

-D-

N a j w y ż s z e za wa r to ś ci c a ł k o w i t e D NA w p o r ó w n a n i u z p r ób a mi k o n -tr ol n ym i o t rz y m a n o dl a p ł y n u C P D + a de n in a + ad eno zyna , w 28 dn i u ko n se r wo w an i a. W z ro s t był 4 5 - k r o t n y i z na cz ni e w y ż s z y n iż w p o z o -s t ał y c h p ł y n a c h k on-s er w uj ą cy c h. J e d n o c z e śn i e z aw ar to ści D N A l im f o -c yt ó w w o s t a t n i -c h d n i a -c h k o n s e r w o w a n i a b ył y w y ż s z e w k a ż d y m z z a -s t o -s ow a n y c h p ł y n ó w k o n -s e r w u j ą c y c h od w a rt o ś c i kon tr ol ny ch .

O t r z y m a n o ta kże i st ot ne s t a t y s t y cz n i e zm i an y z a wa r to ś ci c a ł k o -witej RNA, kt ór e p o d o bn i e jak d la D NA są n aj w i ęk s z e w o dn i e s ie n i u do p ł y n u C PD + a d en i na + a d e n o z y n a w o k re s ie o d 21 do 28 d n ia k o n -ser wacj i. W A C D f. B o b s e r wu j e się, o d m i e n ni e od p o zos ta ły ch , s y -s t e m a t y c z n y -s pa d ek z a wa r to ś ci RNA, aż do w a r t o ś c i n i ż s z y c h o d w y j -ś c i o wy c h w o s t a t n i c h d n i a c h k on s erw ac ji .

Z d ję c ia o b r a z ó w l im f o c yt ó w w m i k r o s k o p i e świe tlny m, i z o l o w a -n yc h p o r ó ż -ny c h c z a sa c h k o n s e r w o w a n i a k rw i l u d z k i e j , w o ma w i a ny c h p ł y n a c h k o n s e rw u j ą c y c h w y k a z u j ą w y r a ź n e z mi an y m o r f o l o g i c z n e (z wi ę-k s za n ie r o z mi a r ó w ę-kom óreę-k, r o z p u l c h ni e n i e jądra), za l eż nie od c z a -su p r z e c h o w y w a n i a i p ły n u k o n s e r w u j ą c e g o (rys. 3). Z m ia n y te p r z y -p o mi n a j ą z mi any w l im f o c yt a c h s t y mu l o w a n y c h mi to ge na mi. 14

_I

₂₁

luj

P P P P

k J k ^ k .

.

n

Rys. 3. Zdjęcia z mikroskopu świetlnego limfocytów z ludzkiej krwi obwodowej:

I - płyn ACDf.B; II - CPD; III - CPD + Ade + Ado; 0, 7, U , 21, 28, 42 - dni

konserwacj i

Fig- 3- Light microscope picture of the lymphocytes isolated from human

peri-pheral blood. Conserving fluids: I - ACDf.B; II - CPD, III - CPD + Ade + Ado.

W w y n i k u p r z e p r o w a d z o n y c h b a d a ń s t w i e r d z o n o z mi a n y a k ty w no ś ci R N - a z y z a r ó w no w b u f o r z e o c t a n o w y m o p H = 5,0, jak i w b u f or z e f o s f o r a n o w y m o p H ■ 7,0. Z m i a n y te m a j ą b a r d z o p o d o b n y p r z e b i e g w o bu ś ro d ow i s k a ch , a r ó żn i ą s ię t y l k o w a r t o ś c i a m i (rys. 4 i 5). M a k s y m a l n e a k t y w n o ś c i e n z y m u d la o bu b u f o r ó w i r ó ż n yc h p ł y n ó w k o n s e r w u j ą c y c h p r z y p a d a j ą n a 21 d z i e ń k o n s er w ow a ni a . A k t y w n o ś ć D N a z y w y k a z u j e o d m i e n n y p r z e b i e g w o b rą b i e p o s z c z e -g ó l n y c h p ł y n ó w k o n se r w u j ą c yc h . P r z e d s t a w i a to rys. 6. inj* lim fo cy tó w U 21 28 42 dni konserwowania

Rys. 4. Wpływ

przechowywania

krwi obwodowej

w

-serwujących na aktywność RN-azy w pH 5.0

-x- płyn

-A- płyn

płyn

Fig. 4. Effect of the storage of human peripheral blood conserved in d iffe-rent fluids on RN-ase activity in pH

5.0

-x- conserving fluid ACDf.B;

-A-

n-serving fluid CPD; conserving

1 .id CPD + Ade + Ado

7 14 21 28 42

dni konserwowania

Rys. 5. Wpływ przechowywania ludzkiej krwi obwodowej w różnych płynach k o n-serwujących na aktywność RN-azy w pH

7.0

-x- płyn ACDf.B; -A- płyn CPD; -D-

płyn CPD + Ade + Ado

Fig. 5. Effect of the storage of h u -man peripheral blood conserved in dif ferent fluids on RN-ase activity in

ph 7.0

“X- conserving fluid ACDf.B; -A-

con-serving fluid CPD; - O - conserving

fluid CPD + Ade + Ado mj-e^

- ' W lim fo cy tó w

m.j.e^

S W

limfocytów

Rys. 6. Wpływ przechowywania ludzkiej

krwi obwodowej w różnych płynach k o n-serwujących na aktywność FK limfocytów

-x- płyn ACDf.B; - A - płyn CPD; - □ -

płyn CPD + Ade + Ado

Fig. 6. Effect of the storage of human peripheral blood conserved in diffe-rent fluids on FK activity in

lympho-cytes

-x- conserving fluid ACDf.B; A con

-serving fluid C P D ; - □ - Con-serving fluid CPD + Ade + Ado

dni konserwowania

Rys. 7. Wpływ przechowywania ludzkiej krwi obwodowej,w różnych płynach ko n-serwujących na aktywność DN-azy w lim-

/ focytach

-x- płyn ACDf.B; "A-płyn CPD; - D - p ł y n CPD + Ade + Ado

Fig. 7. Effect of the storage of human peripheral blood conserved in diffe-rent fluids on DN-ase activity in

lym-phocytes

-x- conserving fluid ACDf.B; -A-

con-serving fluid CPD; ~ D _concon-serving fluid CPD + Ade + Ado

N a j n i ż s z e w ar toś ci , bez w y r a ź n e g o m aks im um , w y s t ę p u j ą w p ł yn i e CPD. D l a p ły n u A CD f . B s t w i er d z a si ę stały, r ó w no m i e r n y pr z yr o st a kt y wn oś ci, z jej m a k s i m u m w 14 d n i u k on se rw ow an ia. W p ły n i e CP D + a d e n o z y n a + a d en i na w y s t ę p u j e p o c z ą t k o w o o bn i ż en i e ak tywn oś ci , a n a s t ę p n i e b a r d z o s z yb k ie p r z y r o s t y aż d o 42 d n i a kon serw ow an ia.

Z a o b s e r w o w a n o w z r o s t akt ywności^ FK l im f oc y t ó w w m i a r ę u pł y wu c z as u k o n s e r w a c j i k rw i w e w s z y s t k i c h r o d z a j a c h u ż y t y c h p ł y n ó w k o n -se rw u ją c yc h . Z m i en n y p r z e b i e g i r ó żn i ce a kt y w n oś c i w w a r u n k a c h k o n s e r w o w a n i a p r z e d s t a w i a rys. 7.

W y n i k i n i n i e j s z y c h b ad a ń n ie s u g e r u j ą ja sn o ty lk o u s zk o d ze ń f i z y k o - c h e m i c z n y c h k o m ó r e k l i m f o c y t a r n y c h i d a l s z y c h n a s t ą p s t w - d e s t r u k c j i w m i a r ą u p ł y w u c z a s u k o n s e r w o w a n i a krwi. Ś w i a d c z y o t ym z n ac z ne z w i ę k s z en i e z a w a r t oś c i D N A i R N A w l im f o c y ta c h krwi k o n s e r w o w an e j p ł y n e m C PD + a d e n i n a + ad eno zyna . Z w i ęk s z e n i e d o t y -c z y s z -cz e g ó l n i e d ł u ż s z y c h o k r e s ó w p rz e ch o w y w a ni a : 14- 21 -28 dni. P o w s t a j e w i ę c p yt an ie : c o m o ż e b y ć p r z y c z y n ą t ego zj aw is ka ? L i m f o c y t y lud zkie j k rw i o bw o d ow e j w w a r u n k a c h "in vi vo" i "in v i tr o " ja ko k o m ó rk i s p o c z y n k o w e c h a r a k t e r y z u j ą s ię m. in. m a ł ą w y d a j n o ś c i ą s y n t e z y k w a s ó w n u k l ei n o wy c h. S y t u a c j a ta u le g a z m i a -n i e w c z a s i e s t y m u l ac j i t y c h k o m ó r e k c z y n n i k a m i m i t o g e n o w y m i . w l i m f o c y t a c h k rw i k o n se r w o w a n ej p ł y n e m C P D + a d e ni n a + a d e -n o z y -n a o b s e r w u j e m y z n a c zn e z w i ę k s z e n ie z a w a r t oś c i DNA. M o ż e to ś w i a d c z y ć o w z m o ż o ne j r e p l i k a c j i w c y k l u k o m ó r k o w y m t yc h l i m f o c y -tów, . a c z k o l w i e k z n a cz n ie m n i e js z ej w p o r ó w n a n i u z li m fo c yt a mi s t y m u l o w a n y m i m i t o g e n a m i [13, 31].

W z r o s t z a w a r t oś c i R N A w t y c h s a m y c h w a r u n k a c h jest t ak że n i ż -s z y w p o r ó w n a n i u ze s t y m u l a c j ą m i to g e n a mi , c o m o ż e ś wi a d c zy ć t u -taj o u p o ś l e d z o n ej je go s ynt ez ie , a z aw a r t oś ć c a ł k o w i t a m o ż e być f u n k c j ą s z y b k o ś c i s y n t e z y i d e g r a d a c j i RNA. U z y s k a n y o b r az z mi a n z a w a r t o ś c i k w a s ó w n u k l e i n o w y c h sk ła ni a d o p r z y p u s z c z eń , że w l i m f o c y t a c h k rw i k o ns e r w o w a ne j p ł y n e m C PD + +. a d e n i n a + a d e n o z y n a m o ż e z a c h o d zi ć j aki ś s z c z e g ó l n y t y p s t y m u l a -cji, p o ł ą c z o n y z n i e w ą t p l i w i e t o c z ą c y m i s i ę t a m p r o c e s a m i d e g r a -d a c j i i -d e s t r u k c j i ko mór ek . J ed n ak ż e, " s t y mu l ac j a" ta w p o r ó w n a -n i u ze s t y m u l a c j ą m i t o g e -n a m i je st z n a cz n ie w o l n i e j s z a i r o z c i ą -g n i ę t a w cz as ie . P o t w i e r d z a j ą to o t ę z y m a n e o b r a z y m i k r o s k o p o w e l i m f o c y t ó w (rys. 3). I s t n i e j ą b a d a n i a [16] s u ge ru ją ce , że m o ż l i w y je st d o d a t k o w y wpływ : e r y t r o c yt ó w , g ra n u l o c y tó w , t r o m b o c y t ó w i a u t ol o g i c z n e g o o s o c z a n a o d p o w i e d ź m i t o g e n o w ą l i mf oc yt ów . P r a w d o p o d o b n y m c z y n n i -k i e m s t y m u l u j ą c y m m o ż e b yć też o p i s a n y p rz e z T c h ó r z e- w s k i e g o i wsp. [25, 26, 27] o ra z V i s c h e r a i wsp. [32] c z y n n i k b i a ł k o w y u w a l n i a n y z k o m ó r e k g r a n u l o c y t ó w w c z a s i e ic h r o z p a d u i s t y m u l u j ą c y l i m f o c y t y a l l og e n i c z n e do k o mó r e k b l a s ty c z n y c h . S t w i e r d z o n o też [28], że im szy bc iej z mn i ej s z a się li c z b a g r a n u l o c y t ó w s eg m e n t o w an y c h , ty m szy bci ej o d s e t e k k om ó r e k b l a s t y c z n y c h o s i ą g a sw o je m a k s i m u m z a ró w n o w ho d owl i, jak i w kr wi k o n s e r w o w an e j p ł y n e m ACD. P o n a d t o z a o bs e rw o wa n o, iż po u- p r z e d n i m u s u n i ę c i u z h o d o w l i g r a n u l o c y t ó w w s z y s t k i e m a ł e l i m f o -c y t y u l e g a j ą p o w i ę k s ze n i u .

B io r ąc po d u w a g ę d o t yc h c z a s o w e s t w ie r d ze n ia n al e ż y w ys u n ą ć s u g e s t ię o p r a w d o p o d o b n y m w p ł y w i e g r a n u l o c y t ó w w c z as i e k o n s e r w o w a -n ia kr wi p ł y -n a mi k o -n se r w u j ą c ym i u ż y ty m i w p r z e ds t aw i on e j p ra c y ( sz cz eg ó ln i e z z a s t o s o w a n ie m p ł y n u C P D + a d e ni n a + a de nozy na) na z a ch o wa n ie si ę limfoc ytów . M i ę d z y 2 a 3 t y g od n i e m ko n se r wa c ji r o zp a d g r a n u l o c y t ó w jest n a j w i ę k s z y i po t y m c z a si e o b s e r w uj e się istotne, s ko r e l ow a n e zmiany, jak: zw i ęk s ze n ie c ał ko wi te j z a w a r -to śc i k w a só w n u k l e i n o w y c h i z m ia n y m or f ol o gi c zn e , tj. z w ię ks za ni e r o z m i a r ó w k o mó r e k i r oz p u l c h ni e n i e jądra.

I s t n i ej ą lic zne d o n i e s i e n i a o w z r o ś c i e a k t yw n oś c i t ak i ch e n -zy mó w jak: RN-a za, DN-a za, FK w l i m f oc y ta c h s t y m u l o w a n y c h "in vi tro" ‘[1/ 2 > 3 ' 7 ' 8 ' 1 0 ' 1 4 ' 1 5 ' 17, 34]. B U s e n i wsp. s tw i e r d zi l i w z r o s t a k ty w no ś ci R N - a z y i j ed n o c z es n ą s y n te z ę D NA [4]. N a t o m i a s t O p h i r i wsp. [18] o raz S 1 o r i wsp. [24] s t w i e r dz i l i w z r o s t s y n t e z y D NA w r az z p r z y r o s t e m a kty w no ś ci DN-az y. B a d a n i a G r ee n a ró wn ie ż p o t w i e r d z i ł y z mi an y a k ty w no ś ci k w a ś n y c h h y d r o la z l i zos om u (w t y m R N - a z y i FK) w c z a si e s t y m u l a -c ji [7]. S u g e r uj e się także, że u w al n i a ni e F K d o c y t o p l a z m y s t y -m u l u j e d e r e p r e s j ę s p o c z yn k o w y c h l i -m f o c yt ó w [9].

P o r ó w nu j ą c d an e l it e r a t u ro w e z o t r z y m an y m i w y n ik a m i ba d ań a- k t y w no ś ci enz ymów: RN- azy, D N - a z y i F K z h o m og e n a t u l i mf o cy t ów kr wi k o n s e r w o w a n e j , z n a j d uj e m y p e w n ą a n al o g i ę w o d n i e s i e n i u do w y n i k ó w z p ł y n u CP D + a de n i n a + ad eno zyna , b o w i e m z wi ę k s za n ie z a -w a rt o ś c i DN A (w m n i e j s z y m s to p n i u RNA) jest tutaj ró w no l e g ł e ze w z r o s t e m a k t y wn o ś c i D N - a z y i FK. N ie w i d a ć tej r ów n o l e g ło ś c i w o d n i e s i e n i u d o RN-azy. Na p o d st a w i e p r z e d s t a w i o n y c h w y n i k ó w m o ż n a s u g e ro w a ć ce l ow o ść d a l s z y c h b a d a ń w k i e r u n k u w y k o r z y s t a n i a ludzkiej k rwi k o n s e r w o w a -nej p ł y n e m C PD + a d en i na + a d e n o z y n a d o ok. 14 d n i a p r z e c h o w y w a -nia w t e m p e r a t u r z e +4 d o +6°C, ja ko ź ród ła l i m f o c y tó w d l a c e ló w t e r a pe u t yc z ny c h. W s k a z u j ą na to w y n i k i z a ch o wa n ia si ę t y ch k o m ó -re k w c z a si e k on se r wo w an i a, t j . u t r z y m a ni e w z g l ę d n i e sta biln ej c a łk o wi t ej z a wa r to ś ci k w a s ó w n u k l e i n o w y c h D N A i R N A o ra z o t r z y m a -ne o b r a z y m o r f ol o gi c zn e . LITERATURA [1 ] A s t a l d i G., L i s i e w i c z J. (1971), Lymphocyte

struc-ture production, function, Idelson, Naples, 49-52.

[ 2 ] B r y n i a k C., L i s i e w i c z J-, S e i b e r t K. (1974),

[ 3 ] B r y n i a k C., L i s i e w i c z J., S e i b e r t K. (1975), Pediatr. Pol., 50(12), 1417-1424. [ 4 ] B u s e n W., P e t t e r s J., H a n s e n P. (1977), Eur. J. Bioch., 74(1), 203-208. [ 5 ] F r i h-N i g g e m e y e r W., R e d d i K. K. (1957), Biochim. Biophys. Acta, 2 2 6 , 40.

[ 6 ] G a c z k o w s k i A. (1980), Probl. Krwiod. i Lecz. Krwią, J7, 35-76.

[ 7 ] G r e e n R. G. (1977), Exp. Cell. Res., U 0 , 215-223.

[ 8 ] H i r s c h o r n R., H i s h o r n K.,- W e i s s m a n G., (1968), J. Cell. B io l ., 37, 394-403. [ 9 ] H i r s c h o r n R., B r i t t i n g e r G., H i s c h o r n K. W e i s s m a n G. (1968), J. Celi. Biol. 37, 412-423. [10] K a y H. D., B o n n a r d D. G., W e s' t H., H e r b e r - m a n R. (1977), J. Immunol., 118. 2058-2066.

[11] K i n g J. (1966), Practical elinical enzymology, London, 196.

[ 1 2 ] K o t e l b a - W i t k o w s k a B. , D u d a W., D a s z y ń

-s k i J,, T r a c z y k Z. (1972), Acta Haemat. Pol. 3(1), 71-78.

[13] L i n g N. R. (1968), Lymphocyte Stimulation, North-Holland

Publi-shing Company, Amsterdam.

[14] L i s i e w i c z J., S o w a J. (1975), Prz. Epid. 29(2) 169-172.

[15] N a d l e r H. L., D o w b e n R., H s i a D.Y.Y. (1969),

Blood, 34, 52-62. ,

[16] N i s s e n C., A 1 b r e c h t R., C r n e o. M., B r u n n

D., S p e c k B. (1981), Blut, 43, 41-46.

[17] 0 p h i r R., B e n-E f r a i m S. (1980), Cell. Immunol., 52,

359-369.

[18] O p h i r R., B e n-E f r a i m S. (1979), Ann. Immunol., (Inst.

Pasteur.), 1 30 0. 355-345.

[19] P e t r a k i s N. J., P o l i t i s C. (1962), New. Engl. J.

Med., 267, 286-291.

[20] P u s z k a r N. S., P o l y a k o v a A., T s u t s a e v a Yu

I t k i n A. (1974), Probl. Giemat. Pereliv. Krovi, 19, 23-26.

[21] Q u a g l i n o D., H a y h o e R. G., F l e m a n s R. J.

(1962), Nature, 196, 338-342.

[22] R o t h e r h a m J., S c h o t e l i u s D. D., I r v i n J.,

L. J. Biol. Chem., (1956), 233, 817-825.

[23] S a g a n Z., K e n d z i o r e k A., U ś c i n o w i c z B.

(1975), Diagn. Lab. U.(5-6), 405-409.

[24] S l o r H., B u s t a n H., L e v T. (1973), Biochem. Bi

[25] T c h ó r z e w s k i H. (1972), Arch. Immunol, et Ther. Exp., 2 0 , 831-835.

[26] T c h ó r z e w s k i H . , F i d e l s k i R., D e n y s A.,

S u ł k o w s k a Z., P ł u s a T. (1973), Ann. Immunol. 15, 29-36.

[27] T c h ó r z e w s k i H., S u ł k o w s k a Z. (1980), Arch.

Immunol, et Ther. Exp., 28, 1-8.

[28] T r a c z y k Z. (1970), Dynamics of morphological changes of white

blood cells "in vitro", Warszawa.

[29] T r a c z y k Z., D a s z y ń s k i J. (1971), Acta Haemat. Pol.

1, 55-61.

[30] T s a n e v R., M a r k o v C. (1960), Biochim. Biophys. Acta,

42, 442-452.

[31] U r b a ń c z y k J. (1973), Synthesis of nucleic acid and activity

of ribonuclease in the lymphocytes stimulated by phytohemagglutinin War- szawa-Wrocław, 1-63.

[32] V i s c h e r T., B e r t z U., B a g g i o l i n i H. (1976),

J. Exp. Med., 144, 863-872.

[33] Z d e b s k a E. (1975), Probl. Krwiod. i Lecz. Krwią, \ 2, 129-165.

[34] Z o l l n e r E., B e c k J. D., L e m m e l E. M . , Z a h n

R. K. (1975), Cancer. Lett., I, 119-126.

Zakład Genetyki Molekularnej Uniwersytet Łódzki Wojewódzka Stacja Krwiodawstwa w Kaliszu

Wojciech Geremek, Zofia Walter

INFLUENCE OF BLOOD CONSERVATION ON NUCLEIC ACIDS CONTENT AND ACTIVITY OF NUCLEOLYTIC ENZYMES

IN HUMAN PERIPHERAL BLOOD LYMPHOCYTES

The lymphocytes from human peripheral blood of healthy donors stored from 4°C to 6°C in three different conserving fluids of the following composition:

1) ACDf.B: 0.045 M trisodium citrate, 0.025 M citric acid, 0.035 M glucose,

pH « 4.9; 2) CPD: 0.088 M trisodium citrate, 0.015 M citric acid 0.139 M

adeni-ne and adenosiadeni-ne, were used as the material for investigations. The conserva-tion time of blood was 0, 7, 14, 21 days for ACDf.B; 0, 7, 14, 21, 28 days for CPD and 0, 7, 14, 21, 28, 42 days for CPD with adenine and adenosine. The con -tents of RNA and DNA were determined by spectrophotometry method of Markov and

Tsanev, the activity of ribonuclease by the method of Frih-Niggemayer-Reddi,

deoxyribonuclease by the method of Rotherham and acid phosphatase by King-Arm- strong s method.

Some changes were found in the DNA and RNA contents and in the activity of

Investigated enzymes, depending on the time and conditions of blood

conserva-tion.

These changes resemble the processes observed in mitogen stimulated lympho- yctes.