Borelioza z Lyme. Diagnostyka laboratoryjna, trudności i wyzwania

(1)

Joanna M. Zajkowska | Justyna Dunaj

Borelioza z Lyme. Diagnostyka laboratoryjna,

trudności i wyzwania

Lyme borreliosis. Challenges and difficulties of laboratory diagnosis

Klinika Chorób Zakaźnych i Neuroinfekcji Uniwersytetu Medycznego w Białymstoku

} Joanna M. Zajkowska, Klinika Chorób Zakaźnych i Neuroinfekcji, Uniwersytet Medyczny w Białymstoku, ul. Żurawia 14, 15-540 Białystok, Tel.: (85) 740 95 14, Fax: (85) 740 95 15, e-mail: zajkowsk@umb.edu.pl

Wpłynęło: 29.07.2013 Zaakceptowano: 15.08.2013

Streszczenie: Rozpoznanie boreliozy z Lyme opiera się na roz-poznaniu klinicznym oraz immunoserologicznym potwierdze-niu zakażenia B. burgdorferi. Potwierdzenia laboratoryjnego nie wymaga jedynie wczesna postać boreliozy – rumień wędrujący. Standardem diagnostycznym jest metoda dwustopniowa, pole-gająca na zastosowaniu testu o mniejszej swoistości i dużej czuło-ści (ELISA lub EIA), a następnie wykonaniu testu metodą western blot (WB), immunoblot (IB) lub multiplex. Istotnym problemem klinicznym jest odsetek wyników dodatnich u osób klinicznie zdrowych, a także długie utrzymywanie się przeciwciał po zakoń-czeniu leczenia i ustąpieniu objawów chorobowych. Testy bez-pośrednie – hodowla oraz metoda PCR (ang. polymerase chain reaction) mają liczne ograniczenia. Leczenie boreliozy – zgodnie z obowiązującymi standardami – trwa od 10 do 28 dni. W profilak-tyce ważna jest rzetelna ocena ryzyka zachorowania.

Abstract: The diagnosis of Lyme disease is a combination clinical diagnosis with laboratory immunoserologic confirmation. Labo-ratory confirmation is not required in the form of erythema mi-grans. The diagnostic standard is it 2-tier testing. First it is use of a test that has less specificity and high sensitivity, ELISA or EIA, and then performing the test, western blot (WB), immunoblott (IB) or multiplex. Clinical problem is the percentage of positive results in healthy persons, and the persistence of the antibody after treat-ment and resolution of symptoms. Direct-culture tests and PCR (polymerase chain reaction) are numerous limitations. Treatment takes 10 to 28 days, in accordance with the accepted standards. Extremely important in preventive actions seem to reliably esti-mate the risk.

Wstęp

Borelioza z Lyme jest bakteryjną chorobą zakaźną, prze-noszoną na człowieka przez kleszcze z rodzaju Ixodes.

W odróżnieniu od Ameryki Północnej, gdzie występuje przede wszystkim szczep Borrelia burgdorferi sensu stricto

(B. burgdorferi ss), w Eurazji za boreliozę jest

odpowiedzial-nych co najmniej 5 patogenodpowiedzial-nych (spośród kilkunastu) geno-gatunków bakterii Borrelia burgdorferi, należących

do Bor-relia burgdorferi sensu lato complex, przez co obraz kliniczny

choroby jest bardziej zróżnicowany. Spośród bakterii kom-pleksu Borrelia burgdorferi sensu lato (B. burgdorferi sl), krętki wywołujące boreliozę z Lyme to przede wszystkim

B. burgdorferi ss, B. afzelii oraz B. garinii, a także według

nie-których doniesień: B. valaisiana, B. lusitaniae, B. spielmanii oraz B. bissetti. Opisy kliniczne różnych postaci boreliozy są znane w Europie od niemal 100 lat, jednak dopiero 30 lat temu w Stanach Zjednoczonych Willy Burgdorfer zi-dentyfikował bakterię Borrelia burgdorferi oraz wskazał na związek zachorowań ludzi z pokłuciami przez zakażone kleszcze [1, 2]. Zebrane przez ten czas doświadczenia, a tak-że dynamiczny rozwój metod diagnostycznych, wymiana doświadczeń oraz szeroki dostęp do informacji naukowej (bazy internetowe) pozwalają obecnie na zweryfikowanie opinii dotyczących boreliozy i zawężenie szerokiego wa-chlarza objawów z nią związanych, ponieważ do niedawna przypisywano jej niemal wszystkie możliwe symptomy (Ta-bela 1).

Zaledwie niewielki procent ukąszeń przez kleszcze po-woduje wystąpienie objawów chorobowych (Ryc. 1). Więk-szość zakażeń jest bezobjawowa i eliminowana przez własne mechanizmy obronne, co pozostawia ślad w postaci swo-istych przeciwciał. Tylewska i wsp. wykazali, że przeciwciała anty-Borrelia są obecne nawet u 12% badanych zdrowych osób [3].

jest zabronione i stanowi poważne naruszenie przepisów prawa autorskiego oraz grozi sankcjami prawnymi.

(2)

Diagnostyka zakażenia

Pomino stałego rozwoju i udoskonalania testów, diagno-styka laboratoryjna boreliozy z Lyme stanowi duże wyzwa-nie. Wynika to z wielu przyczyn, m.in.: występowania kilku różniących się antygenowo genogatunków bakterii wywołu-jących boreliozę, zmiany prezentowanych w trakcie zakaże-nia antygenów oraz zmienności antygenowej pojedynczych antygenów. Ponadto interpretację kliniczną utrudniają: dłu-gie utrzymywanie się odpowiedzi immunologicznej, brak standaryzacji obowiązujących testów oraz brak testu jed-noznacznie związanego z aktywnym okresem choroby. Te-sty diagnoTe-styczne są stale udoskonalane, jednak chronione patentami, co utrudnia ich standaryzację i porównywanie wyników uzyskanych w różnych ośrodkach zarówno dia-gnostycznych, jak i naukowych [4].

Do prawidłowego rozpoznania boreliozy wywołanej przez krętka Borrelia burgdorferi s.l. niezbędna jest zatem znajomość nie tylko obrazu klinicznego choroby, lecz także rodzajów stosowanych testów laboratoryjnych, ich właści-wości oraz ograniczeń.

Rozpoznanie boreliozy z Lyme opiera się na połączeniu rozpoznania klinicznego oraz immunoserologicznego po-twierdzenia zakażenia B. burgdorferi.

Laboratoryjnego potwierdzenia nie wymaga jedynie wczesna postać boreliozy – rumień wędrujący

(erythe-ma migrans), którego charakterystyczny wygląd

pozwa-la na jednoznaczne rozpoznanie. Ponadto, gdy pojawia

się erythema migrans, przeciwciała potwierdzające za-każenie mogą być jeszcze niewykrywalne w badaniu laboratoryjnym.

Rumień w miejscu ukłucia przez kleszcza pojawia się około 3–4 dni po pokłuciu, a jego cechą wyróżniającą jest powiększanie się obwodu. W środku zmiany może wystę-pować przejaśnienie, które ma charakter homogenny lub składa się z koncentrycznych pierścieni (Ryc. 2). Niekiedy rumień przybiera bardzo duże rozmiary, opasując niemal cały tułów czy kończynę lub jest ukryty w owłosionej skó-rze głowy. Zmiana typu erythema migrans może utrzymy-wać się przez kilka miesięcy. Charakterystyczne dla niej jest rozszerzanie się, a następnie zanikanie przez stopniowe blednięcie w tych samych granicach. Rozpoznanie rumie-nia nie wymaga potwierdzerumie-nia badarumie-niami laboratoryjnymi (także po zakończeniu leczenia). Diagnostyki laboratoryj-nej wymagają jedynie rumienie o wyglądzie, który nasuwa wątpliwości.

Potwierdzenie klinicznego rozpoznania boreliozy

z Lyme

Do właściwego rozpoznania i interpretacji wyników ba-dań laboratoryjnych niezbędna jest znajomość nie tylko obrazu klinicznego choroby, lecz także parametrów diagno-stycznych stosowanego testu. Diagnostyka laboratoryjna boreliozy polega na potwierdzeniu lub wykluczeniu udziału

B. burgdorferi w zakażeniu.

Postać kliniczna Kliniczna definicja Potwierdzenie laboratoryjne istotne

Potwierdzenie laboratoryjne uzupeł-niające

Rumień wędrujący

Erythema migrans

Ryc. 2

Rozszerzający się czerwonawy rumień (>5 cm), nie unoszący skóry, ostro od-graniczony

Żadne Wykrycie materiału genetycznego krętka metodą PCR lub w hodowli

Chłoniak limfatyczny skóry

Borrelial lymphocytoma

Ryc. 3

Niebolesne zgrubienie, zwykle na uchu, brodawce sutkowej lub mosznie Częściej występuje u dzieci

Pojawienie się przeciwciał (z wyniku negatywnego na pozytywny) Pozytywny wynik serologiczny

Histologiczne – wykrycie krętków w hodowli lub/i PCR z biopsji skóry

Przewlekłe zanikowe zapalenie skóry kończyn

Acrodermatitis chronica atrophicans

Ryc. 4

Długo utrzymujące się zaczerwienienie i ścieńczenie skóry na wyprostnych częściach kończyn

Wysokie wartości przeciwciał w klasie IgG w surowicy

Histologiczne – wykrycie krętków w hodowli lub/i PCR z biopsji skóry

Neuroborelioza

Lyme neuroborreliosis

Ryc. 5

U dorosłych głównie objawy korzonkowe z zapaleniem opon; rzadko – zapalenie mózgu, rdzenia; bardzo rzadko – zapale-nie naczyń mózgu

Obecność pleocytozy i wykazanie synte-zy wewnątrzoponowej

Hodowla lub PCR

Wewnątrzoponowa synteza przeciwciał IgM lub/i IgG

W wywiadzie współistniejący rumień wędrujący

Zapalenie stawu

Lyme arthritis

Ryc. 6

Nawracający lub długo utrzymujący się obrzęk stawu obejmujący jeden lub kilka dużych stawów

Wysokie miana przeciwciał Badanie płynu stawowego

Hodowla lub PCR z płynu stawowego lub tkanek okołostawowych

Objawy oczne

Ocular manifestations

Obecność przeciwciał w surowicy Wcześniejsze lub współistniejące objawy boreliozy z Lyme

(3)

Testy pośrednie

Testy serologiczne opierają się na pomiarze stężenia swoistych przeciwciał przeciwko antygenom B. burgdorferi. Najczęściej stosuje się diagnostykę serologiczną i poszukuje się przeciwciał w surowicy lub płynie mózgowo-rdzeniowym (PMR).

Test ELISA (ang. enzyme-linked immunosorbent assay) jest jednym z najpowszechniej stosowanych testów w bada-niach biomedycznych – zarówno naukowych, jak i diagno-stycznych. Testów tych nie powinno się stosować do mo-nitorowania leczenia boreliozy z Lyme, ponieważ u części zakażonych miano przeciwciał jest podwyższone przez wie-le miesięcy, a nawet wiewie-le lat po eliminacji bakterii [5–9]. Przyczynia się to często do postawienia błędnej diagnozy, a w następstwie – do zlecenia pacjentowi zbędnej

antybioty-koterapii. ELISA jest jednak najczęściej stosowaną metodą diagnostyczną, zalecaną jako badanie przesiewowe. Testy mogą być jakościowe, półilościowe i ilościowe. W testach wstępnych metodą ELISA wykorzystywana jest mieszanina antygenów pochodzących z jednego lub kilku genogatun-ków z hodowli, tzw. antygenów natywnych, wzbogaconych antygenami syntetyzowanymi, tzw. rekombinowanymi. Czułość testu jest tym większa, im szerszy zestaw gatunków

B. burgdorferi wchodzi w skład antygenów testu [7]. ELISA

jest z definicji testem bardzo czułym, jednak zakładającym nadrozpoznawalność, czyli względnie częste wyniki fałszy-wie dodatnie, które mogą być spowodowane także innymi niż zakażenie B. burgdorferi sytuacjami klinicznymi [5, 7, 8].

Standaryzacja oraz powtarzalność testów dotyczą jedne-go produktu (własne jednostki producenta). Wiele wątpli-Ryc. 1. Kleszcz żerujący w skórze.

Ryc. 2. Rumień wędrujący, różne postacie.

(4)

wości wynika z faktu, że testy diagnostyczne opracowuje się na podstawie różnych zestawów antygenowych. Ze wzglę-du na heterogenność genogatunków i niejednakową kon-strukcję testów oraz brak ich standaryzacji (podobny, ale niejednakowy skład antygenowy), mają one różne jed-nostki nadawane przez producenta (np.: U/ml, BBU/ml, AU/ml), a porównywanie otrzymywanych wyników róż-nych testów może prowadzić do rozbieżności i trudności interpretacyjnych.

Metoda ELISA z założenia cechuje się nadrozpozna-walnością (duża czułość, mniejsza swoistość), a wynik te-stu otrzymuje się w postaci wartości liczbowej, sumującej wszystkie reakcje antygen–przeciwciało, wychwycone przy użyciu danego testu. Po uzyskaniu dodatniego wyniku z za-stosowaniem tej metody należy go potwierdzić przez ozna-czenie przeciwciał przeciwko poszczególnym antygenom z wykorzystaniem metod: western blot, immunoblot lub multiplex.

Ryc. 4. Późna postać zmian skórnych (Acrodermatiitis chronica atrophicans).

Ryc. 5. Porażenie nerwu twarzowego, jednostronne i obustronne w przebiegu neuroboreliozy.

Ryc. 6. Lyme arthritis – boreliozowe zapalenie stawu.

(5)

W teście western blot mieszanina antygenów bakterii jed-nego lub kilku gatunków, wzbogacona antygenami rekombi-nowanymi, podlega rozdziałowi elektroforetycznemu, co po-zwala na wyodrębnienie przeciwciał skierowanych przeciw pojedynczym antygenom uszeregowanym według ciężaru cząsteczkowego. W wyniku rozdziału elektroforetycznego lizatu całych komórek zidentyfikowano około 30 różnych pasm białkowych o różnym znaczeniu [8]. W teście immu-noblot wybrane, istotne dla diagnostyki, antygeny zostały na-niesione na wyznaczone pola na paskach, co znacznie ułatwia interpretację wyniku. Dodatkowo mogą zawierać antygeny istotne dla diagnostyki różnicowej, jak np. wirusa Epsteina-Barr (EBV) lub kiły [10]. Innowacją jest zastosowanie testów w technice multiplex, gdy badane jest stężenie przeciwciał przeciw pojedynczym wybranym antygenom równocześnie w technice innej niż wizualizacja prążków na paskach [11].

Wykazanie obecności przeciwciał przeciw pojedynczym swoistym antygenom potwierdza dodatni wynik badania me-todą ELISA. Test oceniany jest wzrokowo przez porównanie z szablonem identyfikującym pola dla poszczególnych prze-ciwciał lub za pomocą skanera, który mierzy natężenie wysy-cenia porównywanych prążków. Wynik badania nie ma stan-daryzacji. Za wynik dodatni zaleca się uznawanie obecności co najmniej dwóch prążków w klasie IgM i trzech w klasie IgG, jednak nie ma identycznych zaleceń ze względu na brak stan-daryzacji stosowanych testów i zróżnicowane występowanie genogatunków Borrelii w poszczególnych rejonach świata [8].

Znaczenie antygenów w diagnostyce boreliozy z Lyme

Wśród białek immunogennych B. burgdorferi, które ge-nerują przeciwciała w czasie zakażenia, zidentyfikowano liczną grupę białek pospolitych (dających reakcje krzyżowe z innymi krętkami, a nawet niespokrewnionymi bakteriami) oraz białka specyficzne, uznane za charakterystyczne dla

Borrelia burgdorferi. Należy pamiętać, że szczepy

laborato-ryjne mogą się różnić od szczepów dzikich podlegających zmianom w czasie zakażenia [7, 9, 12].

Białka specyficzne są kluczowe dla rozpoznania. Istotne są również antygeny, tzw. in vivo, czyli takie, których nie ma w szczepach laboratoryjnych, a które pojawiają się do-piero w zakażonym kręgowcu (np. VlsE). Ważne są również komponenty białkowe o stałej masie molekularnej 41 kDa (p41 lub flagellina) i 60 kDa (HSP60) [8, 9, 12]. Obie wy-mienione grupy białek pospolicie występują w przyrodzie i w związku z tym często dają reakcje krzyżowe z innymi bakteriami. Obecność przeciwciał przeciwko nim, wraz z przeciwciałami przeciw antygenom swoistym, ma znacze-nie w interpretacji uzyskanych wyników. Obecność przeciw-ciał skierowanych przeciw antygenowi p41 stanowi potwier-dzenie odpowiedzi immunologicznej na kontakt z krętkami

krętkowe) [9]. Inne często stwierdzane antygeny pospolite to: p66, p68, p71, p73 [8, 9].

Do białek specyficznych należą: OspA (31 kDa), OspB (34 kDa), OspC (21–24 kDa), BmpA (p39), p93, p83/100, OspE (19 kDa), OspF (26 kDa). Białkiem, które zwiększyło jakość testów jest białko VlsE (C6) – powierzchowna lipoproteina, która podlega antygenowej zmienności [7–9, 12]. Wysoko heterogenne białko VlsE zawiera konserwatywne epitopy, wspólne dla większości genogatunków. Znajomość właści-wości poszczególnych antygenów i kolejności ich pojawiania się w trakcie zakażenia jest istotna dla interpretacji wyników badań wykonywanych metodą western blot lub immunoblot.

Znaczenie klas swoistych przeciwciał w rozpoznaniu boreliozy z Lyme

Przeciwciała IgM pojawiają się najwcześniej, utrzymują się długo, często są skierowane przeciwko flagelli, części ze-wnętrznej i weze-wnętrznej (41 kDa) i występują wraz z po-liklonalną aktywacją limfocytów B. Obecność izolowanych przeciwciał IgM nie powinna być podstawą rozpoznania późnej boreliozy, ponieważ przeciwciała mogą utrzymy-wać przez wiele miesięcy, często dając wyniki fałszywie dodatnie [5–9]. Odpowiedź immunologiczna w klasie IgG pojawia się po około 3–6 tygodniach od zakażenia [7, 10, 13]. Przeciwciała w klasie IgG towarzyszą zmianom na-rządowym i podlegają ewolucji w czasie – reagują z coraz większą liczbą antygenów. Mogą nie zapobiegać reinfek-cjom [6, 12]. Przeciwciała w klasie IgG mogą pozostawać wykrywalne po latach od klinicznej remisji choroby, nawet po wyleczeniu boreliozy. Są bardziej swoiste od przeciwciał klasy IgM [8–10]. Testy nieróżnicujące klasy przeciwciał nie są zalecane, z wyjątkiem testu, w którym użyto antygenu C6 [5, 8, 9]. Ze względu na wczesną serokonwersję przeciw-ciał z klasy M do G i dużą swoistość, test ten zyskał popular-ność w Stanach Zjednoczonych.

Standardy w diagnostyce boreliozy z Lyme

Standardem diagnostycznym jest metoda dwustopniowa, która polega na zastosowaniu w pierwszej kolejności testu o mniejszej swoistości i dużej czułości (ELISA lub EIA), a następnie wykonanie oznaczeń metodą potwierdzającą western blot, immunoblot lub multiplex.

Wybór klasy przeciwciał

We wczesnej fazie boreliozy można spodziewać się obec-ności przeciwciał w klasie IgM, natomiast w późnej – prze-ciwciał w klasie IgG. Jeśli objawy chorobowe trwają kilka tygodni, oczekuje się serokonwersji przeciwciał z klasy IgM do klasy IgG.

(6)

ze znaczną heterogennością szczepów B. burgdorferi, stwa-rza również trudności interpretacyjne.

Wyniki fałszywie ujemne

Negatywny wynik badania serologicznego nie wyklucza choroby, szczególnie we wczesnej zlokalizowanej postaci za-każenia wyniki większości testów są ujemne (u około 50% badanych) [5, 10]. Leczenie antybiotykiem we wczesnym etapie może spowodować szybką eliminację antygenów, niską produkcję przeciwciał i brak możliwości ich wykry-cia [5, 13]. Zatem negatywny wynik nie wyklucza wczesnej boreliozy, ponieważ próbkę surowicy można pobrać zanim pojawią się przeciwciała lub gdy wystąpią one w ilości niż-szej niż próg wykrywalności testu.

Wyniki fałszywie dodatnie

Reakcja krzyżowa może spowodować pojawienie się wy-ników fałszywie dodatnich, będących przyczyną nadroz-poznawalności boreliozy. W zdrowej populacji stwierdza się 8–12% wyników fałszywie dodatnich [3, 7]. Reakcja krzyżowa może nastąpić zarówno z niektórymi bakteriami (Treponema pallidum, Treponema pertenue i inne borrelie niepatogenne, leptospiry), jak i w czasie niektórych infekcji wirusowych, które wzbudzają poliklonalną produkcję prze-ciwciał, takich jak na przykład zakażenie wirusem EBV. Fał-szywie dodatnia odpowiedź może się pojawić w chorobach autoimmunizacyjnych (np. reumatoidalne zapalenie stawów – RZS, toczeń układowy) i schorzeniach wątroby (wirusowe zapalenie wątroby typu C – WZW C) [6, 9, 12, 13].

Problemem klinicznym jest odsetek wyników dodatnich u osób klinicznie zdrowych, a także długie utrzymywanie się przeciwciał po zakończeniu leczenia i ustąpieniu objawów chorobowych.

W Stanach Zjednoczonych dużą popularnością cieszy się test wykrywający przeciwciała przeciw antygenowi VlsE (C6) w obu klasach IgM i IgG (tzn. total), który wychwytuje prze-ciwciała w początkowej fazie choroby (IgM) oraz w czasie i po konwersji do IgG. Testy oparte na konserwatywnym biał-ku C6 z grupy VlsE mają wyższą czułość, gdyż umożliwiają wykrywanie swoistych przeciwciał przeciw bakteriom o dużej zmienności antygenowej, a nawet wewnątrzgatunkowej [8, 9].

Monitorowanie przeciwciał po leczeniu

Monitorowanie stężenia przeciwciał po leczeniu nie ma uzasadnienia, o ile nie podejrzewa się reinfekcji [12]. Bezwładność produkcji przeciwciał jest duża i nie idzie w parze z eliminacją zakażenia. Częstym zjawiskiem jest utrzymywanie się przeciwciał IgM po skutecznym leczeniu, bez serokonwersji do IgG.

nych, gdzie możliwa jest reinfekcja. Wskazuje na nią po-jawienie się nowych objawów oraz nasilenie dolegliwości połączone z istotnym wzrostem miana przeciwciał [5, 6, 12].

Diagnostyka neuroboreliozy

Oznaczanie przeciwciał potwierdzających zakażenie układu nerwowego jest trudne. Stosowanie metody ELISA do badania PMR ma te same zastrzeżenia interpretacyjne jak w przypadku surowicy (nadrozpoznawalność).

Ponadto stężenie przeciwciał w poszczególnych prze-strzeniach płynowych różni się od siebie. Zależy to od lo-kalnej zmienności (sekwestracji anatomicznej) reakcji od-pornościowych, które przebiegają odmiennie w miejscach immunologicznie uprzywilejowanych, takich jak np. ośrod-kowy układ nerwowy (OUN) [14]. W praktyce wykazanie syntezy przeciwciał w OUN wymaga pomiaru przeciwciał w surowicy i PMR oraz takiego przeliczenia, które uwzględ-nia różnice stężeń białek w obu przestrzeuwzględ-niach, a wynik po-dawany jest w postaci tzw. indeksu syntezy (ang. antibody index – AI) [5, 7, 9, 10]:

Indeks PMR/surowica [AI]=

ELISA jednostki w PMR × total IgG w surowicy ELISA jednostki w surowicy × total IgG w PMR

Wynik dodatni to wartość >1,3 [8].

Metodą alternatywną, wskazującą na syntezę wewnątrz-oponową, jest porównanie oznaczeń wyników przeciwciał metodą western blot lub immunoblot, wykonanych jedno-cześnie w płynie mózgowo-rdzeniowym i surowicy. Obec-ność silniej wybarwionych pasków w PMR lub pojawienie się pasków nieobecnych w surowicy wskazuje na syntezę wewnątrzoponową [10].

Testy WB oraz IB, skonstruowane identycznie dla su-rowicy i PMR, umożliwiają wykrycie przeciwciał przeciw poszczególnym antygenom, obiektywizując wynik badania uzyskany metodą ELISA. Spełniają one również funkcję testu na obecność pasm oligoklonalnych – pojawienie się pasm w PMR, jednocześnie nieobecnych w surowicy, wska-zuje jednoznacznie na syntezę wewątrzoponową innych przeciwciał w płynie mózgowo-rdzeniowym niż w surowicy.

W praktyce klinicznej nie należy zapominać, że (neu-ro) borelioza z Lyme jest rozpoznaniem klinicznym potwier-dzanym w badaniu laboratoryjnym [7, 8, 10].

Chemokina CXCL13 w diagnostyce neuroboreliozy

Obiecującym markerem w diagnostyce wczesnej neu-roboreliozy jest oznaczanie w PMR i surowicy chemokiny CXCL13. W płynie mózgowo-rdzeniowym – w przeciwień-stwie do surowicy – stężenie CXCL13 jest wysokie i obniża się wraz z zastosowaniem leczenia [10].

(7)

Do testów bezpośrednich, które pozwalają bezpośrednio wykryć czynnik zakaźny należą: metoda PCR (amplifikacja bakteryjnego DNA), hodowla bakterii Borrelia burgdorferi oraz uwidocznienie ich w materiałach biologicznych [5, 8, 9, 12, 13]. Mikroskopia elektronowa w różnych modyfikacjach może być przydatna zwłaszcza w wykrywaniu komórek bak-teryjnych przebywających wewnątrzkomórkowo.

Testy bezpośrednie – hodowla i metoda PCR – mają licz-ne ograniczenia, wiążą się z wysokimi kosztami oraz długim czasem oczekiwania na wynik, co powoduje, że nie mają zastosowania w standardowej diagnostyce klinicznej [9]. Diagnostyka mikrobiologiczna w kierunku krętków

Borre-lia jest długotrwała i daje znikome efekty. Hodowla bakterii

na podłożu BSK II (ang. Barbour-Stoenner-Kelly) lub MKP (ang. Marsic-Kelly-Preac) przez około 5 dni w warunkach mikroaerofilnych pozwala na uzyskanie dodatniego wyniku w I fazie choroby u 40–50% chorych, a w kolejnych stadiach zaledwie u 5% pacjentów [8, 9].

Metoda PCR

Zastosowanie metody PCR w diagnostyce boreliozy z Lyme

We wczesnym okresie po ułuciu przez kleszcza (bore-lioza wczesna zlokalizowana i rozsiana), od wprowadzenia bakterii (B. garinii wnika do organizmu człowieka w ciągu 24 godzin od kontaktu z wektorem, podczas gdy B.

burg-dorferi ss – po upływie 48 godzin) do momentu pojawienia

się wykrywalnego poziomu swoistych przeciwciał przeciw antygenom krętków B. burgdorferi sl (do 4–8 tygodni), uza-sadnione jest zastosowanie techniki PCR, służącej potwier-dzeniu rozpoznania lub wykryciu koinfekcji innymi patoge-nami odkleszczowymi [7, 13]. W późniejszej fazie choroby (borelioza późna) metoda PCR może wspomagać badania immunoserologiczne w grupie pacjentów z defektami im-munologicznymi, z innymi chorobami współistniejącymi, współzakażeniami lub w przypadkach reinfekcji, gdy swoiste przeciwciała są już obecne [12, 13]. Metoda PCR może być także przydatna w wypadkach bezobjawowego przebiegu oraz utajonego okresu choroby (aktywacja zakażenia może nastąpić po miesiącach od kontaktu z wektorem) ze względu na wewnątrzkomórkowe umiejscowienie krętków w niszach organizmu (stawy, serce, mielina) [7, 13]. Metoda PCR stwa-rza także dodatkowe możliwości w sposobie diagnozowania pacjentów z długotrwale utrzymującymi się swoistymi prze-ciwciałami, szczególnie w klasie IgM [4, 8, 9, 13].

Materiał do badań PCR

Technika PCR umożliwia diagnostykę boreliozy z Lyme w zróżnicowanym materiale klinicznym: wycinki skórne,

z granicy EM (erythema migrant – borelioza wczesna) oraz u osób z ACA (acrodermatitis chronica atrophicans – prze-wlekłe zanikowe zapalenie skóry kończyn) dają pozytywne wyniki amplifikacji materiału genetycznego krętków

B. burg-dorferi sl w 50–70% przypadków i mogą służyć potwierdzeniu

zakażenia, zwłaszcza w przypadkach niecharakterystycznych zmian skórnych, jak na przykład mini-EM [4]. U pacjentów z LA (Lyme arthritis – zapalenie stawu) dodatni wynik PCR w płynie stawowym – oprócz potwierdzenia zakażenia – może również wskazywać na oporne na leczenie zapalenie stawów wynikające z obecności krętków Borrelia [9, 13]. Według wy-tycznych EFNS (ang. European Federation of Neurological Societes) badanie PCR w kierunku krętków B. burgdorferi sl w PMR ma znaczenie jedynie w bardzo wczesnym (do 6 tygo-dni) okresie zakażenia, gdy brak jest wskaźników serologicz-nych neuroboreliozy, z tym że ze względu na niewielką liczbę bakterii w tym materiale oraz ich powinowactwo do struktur mielinowych należy liczyć się z uzyskaniem wyniku ujem-nego (70–85% przypadków) [5, 10, 13]. Wykrywanie DNA

B. burgdorferi sl we krwi ogranicza się do wczesnego okresu

zakażenia, gdyż spirochotemia jest przejściowa i krótkotrwa-ła, a krętki ze względu na wysoki tropizm tkankowy wędrują z krwiobiegu do różnych narządów i tkanek, określanych czę-sto jako nisze organizmu (serce, stawy, mielina, opony mó-zgowe). Diagnostyka moczu w kierunku boreliozy z Lyme jest według wszelkich standardów odradzana [4, 8, 9, 13].

Rodzaje reakcji PCR

Reakcja typu End-Point PCR: qPCR (ang. qualitative PCR), nPCR (ang. nested PCR) lub FEP PCR (ang. Flu-orescent End-Point PCR) o charakterze jakościowym jest wystarczająca do celów diagnostycznych w przypadku bo-reliozy z Lyme [2, 13]. Wykrywa specyficzne, unikatowe fragmenty genomu B. burgdorferi sl, do których należą se-kwencje DNA plazmidowego (OspA, OspB, OspC, VlSE) oraz DNA chromosomalnego (gen fla, rec A, 16S rDNA, p66, hbb, rpoB, przestrzeń międzygenowa 5S–23S) [13, 15].

Trudności związane z zastosowaniem metody PCR do diagnostyki boreliozy z Lyme

Pomimo możliwości diagnostycznych, jakie stwarza re-akcja PCR w potwierdzeniu zakażenia krętkami Borrelia, należy również pamiętać o trudnościach związanych z jej prawidłowym przeprowadzeniem. Do otrzymania nega-tywnych rezultatów testu PCR mogą prowadzić: ryzyko wystąpienia kontaminacji, inhibicji reakcji (m.in. związka-mi w organizzwiązka-mie człowieka: hemoglobina, heparyna, mela-nina lub substancjami utrwalającymi, takimi jak parafina, etanol), cechy własne krętków Borrelia (przejściowa

(8)

spi-zdolność do wiązania się za pomocą licznych receptorów, np. glikozaminoglikanowych, z różnymi komórkami orga-nizmu gospodarza), wcześniej wdrożona antybiotykoterapia oraz brak standaryzacji metody (wynikający z rozbieżności wyników otrzymywanych w różnych ośrodkach naukowych i diagnostycznych). Natomiast dodatni wynik nie pozwala na potwierdzenie aktywnego zakażenia, gdyż nie różni-cuje czy materiał genetyczny pochodzi z żywych bakterii, czy z ich fragmentów jakie mogą pozostać w organizmie na przykład po leczeniu [4, 8, 9, 13, 15].

Testy nie zalecane w diagnostyce

boreliozy z Lyme

Testy nie zalecane w diagnostyce boreliozy to:

t poszukiwanie krętków w kleszczu;

t test transformacji limfocytów LTT Melisa, Elispot LTT;

t poszukiwanie postaci „cyst”;

t ocena liczebności subpopulacji limfocytów CD57;

t biorezonans, kanały energetyczne itd.;

t testy VCS (ang. visual contrast sensitivity test).

Leczenie boreliozy z Lyme

W leczeniu boreliozy z Lyme najistotniejsza jest elimina-cja krętków za pomocą antybiotyku. Bakteria pochodząca ze środowiska zwierzęcego nie posiada oporności na anty-biotyki. Długość leczenia wynosi – zgodnie ze standardami obowiązującymi w Europie według EBM (ang. Evidence Ba-sed Medicine) – od 10 do 28 dni [6, 7, 16]. Ponadto ważne jest minimalizowanie zapalenia za pomocą niesteroidowych leków przeciwzapalnych i rehabilitacja ruchowa we wcze-snej rozsianej i późnej boreliozie z Lyme [7]. Schemat lecze-nia boreliozy, zgodny z zalecelecze-niami Polskiego Towarzystwa Epidemiologów i Lekarzy Chorób Zakaźnych, przedstawio-no w Tabeli 2.

Reinfekcja

Ponowne zachorowanie na boreliozę z Lyme u pacjentów z wcześniej rozpoznaną chorobą jest mało prawdopodob-ne, lecz możliwe zwłaszcza u osób pochodzących z obsza-rów endemicznych. W takich przypadkach konieczne jest wykazanie serokonwersji miedzy ostrą fazą choroby a fazą rekonwalescencji.

Ciąża

Nie udowodniono szkodliwego wpływu zakażenia

Bor-relia burgdorferi u kobiet w ciaży na rozwój płodu.

Kobie-z Lyme powinny być leczone zgodnie z zaleceniami zawarty-mi w Tabeli 1, lecz z wyłączeniem doksycykliny [16].

Profilaktyka

Kleszcze nie mają w środowisku naturalnych wrogów, lecz same wywierają znaczący wpływ na populacje różnych grup zwierząt, szczególnie na terenach endemicznych pół-kuli północnej [12, 17]. Liczba kleszczy może zmniejszyć się po wyjątkowo suchych latach bądź długich mroźnych zimach, które wpływają na liczbę gryzoni, ptaków, a także zwierząt z rodziny jeleniowatych, które to grupy są główny-mi żywicielielasą główny-mi kleszczy [17]. W ostatnim czasie obser-wowane są jednak tendencje zupełnie odwrotne, skutkujące wzrostem liczebności kleszczy. Można próbować stosować środki kleszczobójcze na pewnych grupach zwierząt, jednak te działania mają zastosowanie ograniczone do określone-go terenu, natomiast w parkach pomaga tworzenie ścieżek utrudniających poruszanie się drobnym zwierzętom.

Ochrona osobista polega na unikaniu ukłucia przez klesz-cze dzięki odpowiednim ubieraniu się w czasie wycieklesz-czek do lasu (długie rękawy, spodnie utrudniające kleszczom przedostanie się do gołej skóry) oraz stosowaniu repelentów. Ważne jest zachowanie szczególnej ostrożności w okresie nasilenia aktywności kleszczy (od czerwca do październi-ka). Istotne jest również mycie ciała po pobycie w lesie, ko-szeniu trawy, a także dokładne oglądanie szczególnie często atakowanych części ciała (Ryc. 1). Kleszcz żerujący w skó-rze może być słabo widoczny, a nawet przypominać drob-ne znamię. Często lokalizuje się w okolicach karku, pach, pachwin czy dołów podkolanowych, gdzie może pozostać długo niezauważony. Nimfa ma wielkość kropki w tekście pisanym (1 mm). Aby uniknąć zakażenia Borrelia

burgdorfe-ri należy nie tylko szybko, lecz przede wszystkim

prawidło-wo usunąć kleszcza. Wprowadzenie bakterii B. burgdorferi do skóry następuje po co najmniej 24 godzinach żerowa-nia [13, 17]. Wczesne usunięcie zapobiega zatem zakażeniu. Wkłutego kleszcza należy chwycić pęsetą jak najbliżej skóry i wyciągnąć zdecydowanym prostym ruchem na zewnątrz. Niebezpieczne jest nie tyle pozostawienie aparatu gębowego kleszcza (hypostomu) w skórze, co może skutkować wpro-wadzeniem bakterii, ile wciśnięcie treści jelit do ranki, gdy kleszcz został nieprawidłowo wyjęty (ściśnięty palcami, po-drażniony toksycznymi chemikaliami lub rozerwany w ten sposób, że jego wnętrzności miały kontakt z raną po ukąsze-niu), co zwiększa ryzyko zakażenia [18]. Niezwykle ważna w działaniach profilaktycznych wydaje się rzetelna ocena ryzyka zachorowania, edukacja pacjentów oraz lekarzy.

Oświadczenie: Autorki posiadają zgodę pacjentów na publikację zdjęć

(9)

Konflikt interesów: nie zgłoszono.

Deklaracja przejrzystości: Justyna Dunaj jest stypendystką w ramach

projek-tu: „Studiuję, badam, komercjalizuję – program wsparcia doktorantów UMB”, poddziałanie 8.2.1 Programu Operacyjnego Kapitał Ludzki, współfinansowa-nego przez Unię Europejską w ramach Europejskiego Funduszu Społeczwspółfinansowa-nego.

Piśmiennictwo

1. Stanek G, Reiter M. The expanding Lyme Borrelia complex – clinical signi-ficance of genomic species? Clin Microbiol Infect 2011;17(4):487–493. 2. Steere AC, Coburn J, Glickstein L. The emergence of Lyme disease. J Clin

Invest 2004;113(8):1093–1101.

3. Chmielewski T, Tylewska-Wierzbanowska S. Występowanie przeciwciał swoistych dla Borrelia burgdorferi u ludzi zdrowych na terenie Polski. Prz Epidemiol 2002;56:33–38.

4. Wilske B. Diagnosis of Lyme borreliosis in Europe. Vector Borne Zoonotic Dis 2003;3(4):215–227.

5. Stanek G, Fingerle V, Hunfeld KP et al. Lyme borreliosis: clinical case de-finitions for diagnosis and management in Europe. Clin Microbiol Infect 2011;17(1):69–79.

6. Pancewicz SA, Zajkowska JM, Kondrusik M, Moniuszko A, Grygorczuk S. Znaczenie epidemiologiczne i kliniczne chorób przenoszonych przez kleszcze. In: Żmudziński JF. Epidemiologiczne Zagrożenia dla Zdrowia Człowieka. PIWet-PIB, Puławy, 2010, pp. 107–125.

7. Zajkowska JM, Pancewicz SA, Grygorczuk S, Kondrusik M, Moniuszko A, Lakwa K. Neuroborelioza – wybrane aspekty patogenezy, diagnostyki i leczenia. Pol Merk Lek 2008;24(143):453–457.

8. Wang G, Aguero-Rosenfeld ME, Wormser GP, Schwartz I. Detection of

Borrelia burgdorferi. In: Samuels S, Radolf JD (eds). Borrelia. Molecular

Biology, Host Interaction and Pathogenesis. Caister Academic Press, Nor-folk, UK, 2010, pp. 443–466.

9. Aguero-Rosenfeld ME, Wang G, Schwartz I, Wormser GP. Diagnosis of lyme borreliosis. Clin Microbiol Rev 2005;18(3):484–509.

10. Mygland A, Ljøstad U, Fingerle V et al. EFNS guidelines on the diagno-sis and management of European Lyme neuroborreliodiagno-sis. Eur J Neurol 2010;17(1):8–16.

11. Porwancher RB, Hagerty CG, Fan J et al. Multiplex immunoassay for Lyme disease using VlsE1-IgG and pepC10-IgM antibodies: improving test perfor-mance through bioinformatics. Clin Vaccine Immmunol 2011;18(5):851–859. 12. Radolf JD, Salazar JC, Dattwyler RJ. Lyme disease in humans. In: Samu-els S, Radolf JD (eds). Borrelia. Molecular Biology, Host Interaction and Pathogenesis. Caister Academic Press, Norfolk, UK, 2010, pp. 487–533. 13. Dunaj J, Moniuszko A, Zajkowska JM, Pancewicz S. The role of PCR in

dia-gnostics of Lyme borreliosis. Prz Epidemiol 2013;67(1):35–39. 14. Zajkowska JM, Pancewicz SA. Wybrane aspekty patogenezy

i diagnosty-ki neuroboreliozy. Pol Prz Neurol 2007;3(2):116–122.

15. Lee SH, Vigliotti VS, Vigliotti JS, Jones W, Pappu S. Increased sensitivity and specifity of Borrelia burgdorferi 16S ribosomal DNA detection. Am J Clin Pathol 2010;133(4):569–576.

16. Flisiak R, Pancewicz S. Diagnostyka i leczenie boreliozy z Lyme. Reko-mendacje Polskiego Towarzystwa Epidemiologów i Lekarzy Chorób Za-kaźnych. Prz Epdemiol 2008;62(1):193–199.

17. Zajkowska JM. Transmisja i krążenie patogenów odkleszczowych (KZM i boreliozy) i rola zmieniającego się środowiska. Prz Epidemiol 2010;64(4):525–531.

18. Wanyura H, Wagner T, Kowalska K. Borelioza – choroba z Lyme. Czas Sto-matol 2006;59(9):640–648.

Obraz kliniczny Lek Dawkowanie Droga Czas terapii dni)

Ukłucie przez kleszcza Obserwacja i uświadomienie możliwych objawów* Liczne ukłucia kleszczy w rejonie endemicznym

osoby spoza tego terenu

Doksycyklina 1×200 mg p.o. 1

Rumień wędrujący

Borrelial lymphocytyma

Porażenie nerwów czaszkowych

Amoksycylina 3×500 mg (dzieci: 50 mg/kg/dzień) p.o. 14–21 Doksycyklina 2×100 mg lub 1×200 mg p.o. 14–21 Aksetyl cefuroksymu 2×500 mg (dzieci: 30 mg/kg/dzień) p.o. 14–21 Azytromycyna** 1 dzień: 2×500 mg 2–5 dni: 1×500 mg

(dzieci: 1 dzień 1×20 mg; 2–5 dzień 1×10 mg)

p.o. 5 Penicylina V 3×1000 mg p.o. 14–21 Zapalenie stawów (pierwszy rzut) Amoksycylina 3×500–1000 mg (dzieci: 50 mg/kg/dzień) p.o. 14–28 Doksycyklina 2×100 mg lub 1×200 mg p.o. 14–28 Aksetyl cefuroksymu 2×500 mg (dzieci: 30 mg/kg/dzień) p.o. 14–28 Neuroborelioza (zapalenie opon

mózgowo-rdzeniowych, mózgu, korzeni) Zapalenie stawów (nawrót) Zapalenie mięśnia sercowego***

Ceftriakson 1×2000 mg i.v. 14–28 Cefotaksym 3×2000 mg i.v. 14–28 Penicylina G 3–4 MU co 4 godziny i.v. 14–28 Przewlekłe zanikowe zapalenie skóry Amoksycylina 3×500–1000 mg p.o. 14–28 Doksycyklina 2×100 mg lub 1×200 mg p.o. 14–28 Ceftriakson 1×2000 mg i.v. 14–28 Cefotaksym 3×2000 mg i.v. 14–28 Peniciylina G 3–4 MU co 4 godziny i.v. 14–28 Zapalenie stawów oporne na antybiotykoterapię Niesteroidowe leki przeciwzapalne lub inna terapia objawowa; należy poszukiwać innej przyczyny

dolegliwości

* – Ewentualne zastosowanie jednorazowej dawki doksycykliny (p.o. 200 mg) jest uzasadnione tylko w przypadku mnogiego pokłucia przez kleszcze podczas pobytu w rejonie endemicznym osoby pochodzącej spoza tego terenu.

** – Azytromycyna jest zalecana wyłącznie w przypadku oporności na antybiotyki beta-laktamowe tylko w rumieniu wędrującym, gdzie ma potwierdzoną skuteczność. *** – Zapalenie mięśnia sercowego może być leczone do 21 dni, przy czym w przypadku szybkiej poprawy dopuszczalne jest kontynuowanie leczenia anty-biotykami doustnymi (jak rumień wędrujący).