Widok Zastosowanie metody fluorymetrycznej do oszacowania całkowitego potencjału antyoksydacyjnego

U N I V E R S I T A T I S M A R I A E C U R I E - S K Ł O D O W S K A

L U B L I N – P O L O N I A

VOL. LXI, 6 SECTIO DD 2006

*_{Zakład Farmakologii Katedry Przedklinicznych Nauk Weterynaryjnych}

Akademii Rolniczej w Lublinie

**_{Instytut Przemysłu Mi snego i Tłuszczowego, ul. Jubilerska 4, 04-190,Warszawa}

CEZARY KOWALSKI

_{, MAŁGORZATA POMORSKA}

_,

BRONISŁAW K. GŁÓD

_{, ANNA KONIOR}

Zastosowanie metody fluorymetrycznej do oszacowania

całkowitego potencjału antyoksydacyjnego

STRESZCZENIE

Całkowity potencjał antyoksydacyjny (CPA) opisuje wła ciwo ci antyoksydacyjne zło onych układów biologicznych (takich jak ekstrakty ziół czy osocze krwi) cz sto lepiej ni st enia wszystkich antyoksydantów zawartych w próbce mierzonych oddzielnie. W pracy przedstawiono i porównano metody wyznaczenia CPA odniesione do ró nych wolnych rodników. Metody te wykorzystuj termolabilny zwi zek AAPH [2,2’-diazobis (2-amidinopropan) dichlorowodorku], generuj cy rodniki peroksylowe, reakcj Fentona, w wyniku której wytwarzane s rodniki hydro-ksylowe i SIN-1 (3-morfolino-sydnonimin) generuj cy nadtlenoazotyny. Rodniki te utleniaj analizowane próbki i tzw. „detektor”. Próbka współzawodniczy z detektorem w reakcji z wolnymi rodnikami, co opó nia pojawienie si sygnału detektora. Opó nienie to, zale ne od st enia antyoksydantów w próbce, stanowi podstaw analizy wyników. Pomiary CPA, odnosz ce si do ró -nych wol-nych rodników, wykonano na próbkach ekstraktów ziół i napojów alkoholowych

.

Słowa kluczowe: wolne rodniki, antyoksydanty, całkowity potencjał antyoksydacyjny, fluorymetria

WST P

Wolne rodniki s uwikłane w patogenez wielu chorób, w tym nowotworów, chorób Alzhei-mera i Parkinsona, czy te mia d ycy. Maj tak e znacz cy udział w procesach degeneracyjnych, zachodz cych w komórkach w czasie ich starzenia si i mierci [Halliwell 1994, Głód i in. 2000]. Obserwowane w patologii zmiany w st eniach antyoksydantów s wynikiem ich współdziałania z wolnymi rodnikami. W literaturze przedmiotu s opisy wielu metod wyznaczenia st enia ka -dego z wolnych rodników [Głód i in. 2000]. Mo na oznaczy st enia poszczególnych antyoksy-dantów, wydaje si jednak, e oszacowanie całkowitego potencjału antyoksydacyjnego (CPA) jest zdecydowanie bardziej u yteczne [Valkonem i Kuusi 1999, Malinka i in. 2002]. Współdziałanie mi dzy ró nymi antyoksydantami skutkuje cz sto lepsz ochron ni mo na by s dzi po

własno-ciach antyoksydacjnych poszczególnych zwi zków. Przykładem mo e by glutation, który rege-neruje askorbinian czy sam kwas askorbinowy, odtwarzaj cy -tokoferol [Halliwell 2000]. Warto

zaznaczy , e stres oksydacyjny i całkowity potencjał antyoksydacyjny s to wielko ci skorelowa-ne ze sob . Zdolno do wymiatania wolnych rodników jest ró nie definiowana, a samo zjawisko jest te ró nie nazywane (TAC – total antioxidant capacity, FRAP – ferric reducing ability of plasma, TRAP – total redox antioxidant potential, ORAC – oxygen radical absorbance capacity, TEAC – trolox-equivalent antioxidant capacity czy TAR – total antioxidant reactivity) [Buhmann i in. 2004]. W tej pracy b dzie u ywana nazwa całkowity potencjał antyoksydacyjny, CPA. Metody pomiaru CPA zostały opracowane do oszacowania zdolno ci antyoksydacyjnej zło onych próbek biologicznych, takich jak osocze krwi. Testy te wykorzystuj generatory ró nych wolnych rodni-ków (zwykle s to termolabilne zwi zki diazowe, generuj ce rodniki peroksylowe) i utlenianie analizowanych próbek. Próbka dodana do mieszaniny reakcyjnej opó nia współdziałanie pomi -dzy detektorem a wolnym rodnikiem. Wyniki pomiarów oznaczane s na podstawie opó nienia zaj cia reakcji detektor-rodnik, w czasie którego zu ywane s antyoksydanty zawarte w analizo-wanym materiale. Istotne jest, aby stała szybko ci reakcji utleniania próbki była du o wi ksza ni stała szybko ci utleniania zwi zku u ywanego jako detektor. Metody opisane w literaturze opieraj si na wygenerowaniu rodników peroksylowych i pomiarze kinetyki fluorescencji lub chemiluminescen-cji produktu ich reakchemiluminescen-cji z tzw. detektorem, zwi zkiem łatwym do wykrycia. Zwykle jako detektor stosuje si pochodne fluoresceiny w pomiarach fluorescencyjnych, a luminol w pomiarach chemiluminescencyj-nych [Wang i Joseph 1999]. Opisano tak e zastosowanie metody fotometrycznej do oznaczania potencja-łu antyoksydacyjnego w komórkach [Valkonem i Kuusi 1999].

Celem bada było sprawdzenie mo liwo ci zastosowania metody fluorymetrycznej do osza-cowania potencjału antyoksydacyjnego w stosunku do wygenerowanych rodników peroksylowych, hydroksylowych i nadtlenoazotynów. Metod testowano na grupie naturalnych antyoksydantów.

MATERIAŁ

Odczynniki: dioctan 2,7-dichlorofluorescyny (DCFH-DA) 2,2’-diazobis (2-amidinopropan) dichlorowodorek (AAPH – generator rodników perksylowych), chlorowodorek 3-morfolino-sydnoniminu (SIN-1 – generator nadtlenoazotynów) oraz bufor fosforanowy w tabletkach (pho-sphate buffered saline, PBS) zakupiono w firmie Sigma (St. Louis, MO, USA). Pozostałe odczyn-niki były klasy cz.d.a. i stosowano je bez dalszego oczyszczania. Wod Milli-Q (Millipore, Bed-ford, USA) u ywano do przygotowania wszystkich roztworów.

Do bada wykorzystano tak e zielon herbat , aroni i imbir. Napoje alkoholowe stosowane w pomiarach (Wódka oł dkowa Gorzka – Polmos, Lublin, Polska; Bols Vodka – Bols Royal Distillers, Amsterdam, Holandia; Unicum Herb Liqueur – Zwack Unicum Co. Ltd., W gry; Sal-miaki Cosken Corva – Altia Oyj, Helsinki, Finlandia; Metaxa – S. E. A. Metaxa, A.B.E. Grecja; Whisky Johnnie Walker – Red Label, Szkocja) zakupione zostały w pobliskim supermarkiecie.

Aparatura: produkt utleniania DCFH mierzono przy u yciu czytnika fluorescencji z płytek (Thermo Labsystems, Finland); pomiary wykonywano w temperaturze pokojowej, zastosowano długo ci fali wzbudzenia i emisji odpowiednio 485 i 538 nm; poziom fluorescencji mierzono co minut .

METODA

W przeprowadzonych badaniach u ywano jako detektora dioctan 2,7-dichlorofluorescyny (DCFH-DA), która pod wpływem esteraz komórkowych ulega przekształceniu do scyny (DCFH). Ostatecznie, po reakcji z rodnikiem peroksylowym, otrzymuje si dichlorofluore-scein (DCF), która charakteryzuje si maksimum adsorpcji przy 520 nm.

Pomiary całkowitego potencjału antyoksydacyjnego (CPA) w stosunku do rodników peroksy-lowych oparto na zmodyfikowanej procedurze Valkonena i Kuusi [1997], w której rodniki perok-sylowe generowane s metod rozkładu termicznego AAPH (ko cowe st enie – 56 mM).

W pierwszym etapie reakcji pojawiaj si dwa rodniki w glowe, które nast pnie szybko reaguj z cz steczkami tlenu, daj c rodniki peroksylowe. Ich st enie mierzono poprzez konwersj diocta-nu dichlorodihydrofluorescyny (DCFH-DA) do silnie fluoryzuj cej dichlorofluoresceiny (DCF). Reakcj przeprowadzano w 50 mM roztworze PBS w 24°C. DCFH-DA rozpuszczano w DMSO, a nast pnie dwukrotnie rozcie czano wod do ko cowego st enia 14 µM.

Rodniki hydroksylowe były generowane w reakcji Fentona. 0,5 mM Fe2+ _{i 2 mM H} 2O2

inku-bowano w 5 mM buforze fosforanowym (pH 7,4) w obecno ci 1 mM pHBA w 37°C. SIN-1, donor nadtlenoazotynów (ko cowe st enie 200 µM) został wykorzystany do generowania tlenku azotu (NO). SIN-1 spontanicznie hydrolizuje w fizjologicznym pH do tlenku azotu NO i anionorodnika ponadtlenkowego O2-. Anion ten nie wpływa na fluorescencj DCF (1). Tlenek azotu, jak i

wytwo-rzony z nich nadtlenoazotyn utleniaj DCFH, co zwi ksza fluorescencj (3). Analizowana próbka przesuwa mierzone sigmoidalne krzywe kinetyczne. Mierzono czas, po jakim warto fluorescen-cji wzrastała o zadan warto (w naszym przypadku wynosiła ona w jednostkach wzgl dnych 0,2). Wielko ta, definiowana jako CPA, zale na jest od sumy iloczynów st enia wszystkich antyoksydantów w próbce i ich stałych szybko ci reakcji.

Pomiary powtarzano 3-krotnie dla ka dej próbki. Wyniki u redniono i wyra ono wzgl dem redniej warto ci uzyskanej dla próbki kontrolnej. Wyj ciowe roztwory ekstraktów analizowanych ziół przygotowano w st eniu 10 mg/ml, za roztwory alkoholi w st eniu 10 µl/ml. Roztwory przygotowano w wodzie Milli-Q.

Procedura do wiadczalna została oparta na metodzie, w której produkty reakcji wygenerowa-nych wcze niej rodników peroksylowych z DCFH były mierzone fluorometrycznie. Nie u ywano esterazy, DCFH-DA rozpuszczano w DMSO (50% ko cowej obj to ci). Sigmoidalne krzywe kinetyczne uzyskane dla badanych próbek były przesuni te wzgl dem krzywych uzyskanych dla próbek niezawieraj cych antyoksydantów. Dla ka dej krzywej okre lono czas, po którym kine-tyczna krzywa fluorescencyjna przyrasta o 0,2 swojej warto ci pocz tkowej. Ró nice mi dzy wyznaczonymi z krzywych czasami dla próbki z antyoksydantem i bez niego były miar całkowi-tego potencjału antyoksydacyjnego CPA.

WYNIKI I DYSKUSJA

W ostatnim czasie obserwuje si wzrost zainteresowania naturalnymi

antyoksydan-tami, w ród nich zwłaszcza barwnikami ro linnymi – flawonoidami i antocyjanami.

Przykładem mo e tu by antocyjan C3G (3-O- -D glikozyd cyjanidyny) i jego aglikol –

cyjanidyna. Zwi zki te, obecne w wielu herbatach i ziołach, s silnymi antyoksydantami

[Tsuda i in. 2000]. Szczególnie du e ich ilo ci znajduj si w aronii (Aronia

melanocar-pa). Cyto- i neuroprotekcyjne wła ciwo ci tych zwi zków s szeroko opisywane w

litera-turze. Szczególnie bogatym we flawonoidy ziołem jest herbata. Jej prozdrowotne

wła-ciwo ci s znane ju od czterech tysi cy lat.

Warto ci CPA 1 mg/ml ekstraktów ziół, odniesione do rodników hydroksylowego

i peroksylowego oraz nadtlenoazotynu, przedstawiono na rys. 1. W przeprowadzonych

badaniach stwierdzono, e najsilniejszymi własno ciami antyoksydacyjnymi ze

wszyst-kich badanych substancji charakteryzowała si zielona herbata (przy czym były one

najsłabsze w stosunku do rodnika hydroksylowego). Warto ci CPA mocnych alkoholi obj

-tych badaniem przedstawiono na rys. 2. Stwierdzono, e najsilniejszym antyoksydantem

w ród alkoholi był w gierski Unicum. Ponadto potwierdzono spostrze enie, e wzgl dne

warto ci CPA zale od generowanego rodnika, co oznacza, e zawsze powinny by one

odniesione do rodnika, którego dotycz wykonywane pomiary.

Ziel. Herb Aronia Imbir RO2 OH ONOO 0 20 40 60 80 100 120 140 160 CPA [min] RO2 OH ONOO

Rys. 1. Warto ci CPA 1 mg/ml ekstraktów ziół, odniesione do rodników hydroksylowego i peroksylowego oraz nadtlenoazotynu

U ni cu m Sa lm ia ki M et ax a W hi sk y oł dk ow a K ru pn ik B ol s A bs yn t 0 20 40 60 80 100 120 140 160 CPA [min]

RO2

OH

ONOO

Rys. 2. Warto ci CPA badanych alkoholi Fig. 2. TAP values of the examined alcohols

Ziel. herb.

Fig. 1. TAP values of 1mg/ml of herb extracts related to peroxyl and hydroxyl radicals and peroxynitrite

Zgodnie z wyprowadzonym równaniem CPA, odniesionym do rodnika

peroksylowe-go, powinno si ono charakteryzowa liniow krzyw kalibracji, co zostało potwierdzone

w badaniach. Liniowa krzywa kalibracji umo liwia łatwe porównywanie wyników ró

-nych próbek. Krzywe kalibracyjne odniesione do rodnika hydroksylowego i

nadtlenoazo-tynu nie wykazywały zale no ci liniowej, w tych przypadkach otrzymano zale no ci

wykładnicz i logarytmiczn .

PI MIENNICTWO

Bass D.A., Parce J.W., Dechatelet L.R., Szejda P., Seeds M.C., Thomas M. 1983. Flow cytometric studies of oxidative product formation by neutrofils: a graded response to membrane stimula-tion. J. Immunol. 130, 1910–1917.

Buhmann C., Arlt S., Kontush A., Moller-Bertram T., Sperber S. 2004. Plasma and CSF markers of oxidative stress are increased in Parkinson’s disease and influenced by antiparkinsonian medication. Neurobiol. Disease 15, 160–170.

Gabriel C., Camnis A., Sureda F.X., Aquirre L., Escubedo E., Pallas M., Comarasa J. 1997. De-termination of nitric oxide generation in mammalian neurons using dichlorofluorescin diaceta-te and flow cytometry. J. Pharmacol. Toxicol. Methods 38, 93-98.

Ghiselli A., Serafini M., Nautella F., Scaccini C. 2000. Total antioxidant capacity as a tool to assess redox status: critical view and experimental data. Free Rad. Biol. Med. 29, 1106–1114. Głód B.K., Czapski G.A., Haddad P. 2000. Application of high-performance liquid

chromatogra-phy to the of free radical reactions in biological systems. Trends Anal. Chem. 19, 492–449. Halliwell B. 1994. Free radicals, antioxidants and human diseases: Curiosity, cause, or

consequen-ce? Lancet 344, 721–724.

Halliwell B. 2000. The antioxidant paradox. Lancet 355, 1179–1180.

Malinka W., Kaczmarz M., Filipek B., Sapa J., Głód B. 2002. Preparation of novel derivatives of pyridothiazine-1,1-dioxide and thair CNS and antioxidant properties. Farmaco. 57, 737–746. Tsuda T., Horio F., Osawa T. 2000. The role of anthocyanins as an antioxidant under oxidative

stress in rats. BioFactors. 13, 133–139.

Valkonen M., Kuusi T. 1997. Spectrophotometric assay for total peroxyl radical-trapping antioxi-dant potential in human serum. J. Lipid Res. 38, 823–833.

Wang H., Joseph J.A. 1999. Quantifying cellular oxidative stress by dichlorofluorescein assay using microplate reader. Free Rad. Biol. Med. 27, 612–616.

SUMMARY

Total Antioxidant Potential (TAP) frequently better describes the antioxidant properties of the complex biological samples (such as herbal extracts or blood plasma) than concentrations of all individual antioxidants in the sample. In the paper improved fluorometric assays of the TAP measurements have been described. These tests adopt thermolabile diazocompound [2,2’-diazobis (2-amidinopropane) dihydrochloride – AAPH] generating peroxyl radical, Fenton reaction pro-duced hydroxyl radicals and SIN-1 (3-morpholino-sydnonimine) generating peroxynitrite. These radicals oxidize the analyzed samples and so called „detector”. Sample competes with the reaction be-tween detector and radical; therefore, it delays this reaction. Results are calculated from the delay time during which antioxidants are consumed. Assays related to different radicals are described and compared. They will be tested measuring antioxidant potentials of different herb extracts and alcohol compounds.