Minimal residual disease in acute leukemias in children and adults

(1)

Praca poglądowa/Review

Minimalna choroba resztkowa w ostrych bia łaczkach u dzieci i doros łych

Minimal residual disease in acute leukemias in children and adults

Ewelina Pukownik

¹

, Lidia Gil

²

, Jan Styczyński

^1,

*

1KatedraPediatrii,HematologiiiOnkologii,CollegiumMedicum,UniwersytetMikołajaKopernika,Kierownik:

prof.drhab.n.med.MariuszWysocki,Bydgoszcz,Polska

2KatedraiKlinika Hematologiii TransplantacjiSzpiku,UniwersytetMedyczny,Kierownik:prof.dr hab. n.med.

MieczysławKomarnicki,Poznań,Polska

informacje o artykule

Historiaartykułu:

Otrzymano:16.03.2014 Zaakceptowano:14.07.2014 Dostępneonline:30.07.2014

Słowakluczowe:

minimalnachorobaresztkowa

MRD

ostrabiałaczkaszpikowa

ostrabiałaczkalimfoblastyczna

dzieci

dorośli

Keywords:

Minimalresidualdisease

MRD

Acutemyeloidleukemia

Acutelymphoblasticleukemia

Children

Adults

abstract

Biologicalandgeneticheterogeneityofacuteleukemiasisamajorcauseoftherapeutic difficulties.Responsetochemotherapyisoneofthemostimportantprognosticfactors in this group of diseases. In acute lymphoblastic leukemia (ALL), and progressively more in acute myeloid leukemia (AML), the best parameter of that response is the presenceof minimalresidual disease (MRD).MRD monitoring isperformed based on theflowcytometeranalysisofleukemicimmunophenotypesordetectionofgenerear- rangementbyPCR.Bothmethodsarecharacterizedbyhighsensitivityandspecificity, which clearly distinguishes them from the standard morphologic examination. This reviewpresentsthe currentstate ofknowledgeofthe importanceanduse ofMRDin childrenandadults,inALLandAML,emphasizingsimilaritiesanddifferences.Current opinionsshow that the MRDis the most important prognosticfactor in ALLand an importantfactorinAML.Basedon currentdatainchildrenandadults,itseems that inacutelymphoblasticleukemia,presenceofMRDis acontinuousvariable;theolder thepatient, thehigher the riskofMRDand therapyfailure.Thispaperpresentsalso anewinsighttotheconcept ofMRD, becauseofthepresenceofleukemicstemcells that survivechemotherapyin AML and anyof the maturationalstages of leukemia- propagating cells in ALL. This ideacombines the phenomenon of drugresistance of tumorstemcellsandthepresenceofresidualcellsundetectablebymethodsofoptical microscopy afterappliedchemotherapy.The conceptofleukemicstemcells explains the occurrenceofresistant clonesboth inALLand AML. Basedon studiesof genetic profiles,thereisgrowingevidencetosuggestthatacuteleukemiaisahighlyheteroge- neous disease,which goes hand in hand with the hierarchy of leukemic stem cells

*Adresdokorespondencji:KlinikaPediatrii,HematologiiiOnkologii,ul.Skłodowskiej-Curie9,85-094Bydgoszcz,Polska.

Tel.:+48525854860;fax:+48525854867.

Adresemail:jstyczynski@cm.umk.pl(J.Styczyński).

ContentslistsavailableatScienceDirect

Acta Haematologica Polonica

journal homepage:www.elsevier.com/locate/achaem

http://dx.doi.org/10.1016/j.achaem.2014.07.002

(2)

Ostre białaczki

Ostre białaczki to heterogenna grupazłośliwych nowotwo- rów hematologicznych charakteryzująca się niekontrolo- waną proliferacją i zahamowaniem dojrzewania komórek prekursorowych linii białokrwinkowej w szpiku kostnym.

Bazując na rozwoju ontogenetycznym układu krwiotwór- czego,wyróżniasiędwiegrupyostrychbiałaczek:szpikowe (AML; acute myeloid leukemia) i limfoblastyczne (ALL; acute lymphoblasticleukemia).

Według Światowej Organizacji Zdrowia (WHO; World Health Organization), częstość występowania ostrej białaczki szpikowej szacuje się na około 2,5–3 przypadków/100 tys./

rokiwzrastaonawrazzwiekiem,natomiastostrejbiałaczki limfoblastycznej na około 1–4,75 przypadków/100 tys./rok [1]. Ostre białaczki częściej (3:2) rozpoznawane są u płci męskiej.Poszczególnerodzajebiałaczekswojąmaksymalną częstośćwystępowaniawykazująwróżnychgrupachwieko- wych. AML stanowi około 75–80% przypadków ostrych białaczek u dorosłych i 20–25% u dzieci. ALL stanowi natomiast 15–20% ostrych białaczek u dorosłych i ponad 80%udzieci,znajwyższączęstościąwystępowaniawwieku 2–5 lat. Ostra białaczka limfoblastyczna jest najczęstszym nowotworem dziecięcym i obejmuje około 25–30% wszyst- kichnowotworówupacjentówwwiekudo15lat[2].

Minimalna choroba resztkowa

Minimalna choroba resztkowa (MRD; minimal residual die- sease) to obecność populacji komórek białaczkowych, która przetrwała stosowane leczenie, a której liczebność nie wywołujeuchorego objawówklinicznych.MRDjestniewy- krywalna przy użyciu mikroskopii optycznej, natomiast rezydualnekomórkinowotworowemogązostaćzidentyﬁko- wane z zastosowaniem metod o wysokiej czułości, np.

poprzez ich analizę immunofenotypową lub molekularną [3, 4]. Analiza cytogenetyczna nie ma w chwili obecnej zastosowaniadomonitorowaniaMRDjakometodaobardzo niskiejczułości.

Monitorowanieminimalnej chorobyresztkowej jestcen- nym narzędziem diagnostycznym wykorzystywanym do oszacowaniaodpowiedzinaleczenieindukcyjneorazwcelu określaniawłaściwegopostępowaniaporemisyjnego,wopar- ciuoindywidualnąocenęryzykawznowyupacjenta.Jestto także ważny element monitorowania choroby pozwalający nawczesnewykrycienawrotubiałaczki.

Wśród technik służących identyﬁkacji MRD największe znaczenie mają obecnie cytometria przepływowa (FC;

ﬂow cytometry) oraz reakcja łańcuchowej polimerazy (PCR;

polymerase chain reaction).Badanie cytometryczne polega na wieloparametrowej analizie antygenowej pozwalającej na określenie immunofenotypu białaczkowego, a tym samym na odróżnienie komórek nowotworowych od zdrowych.

Cytometriaprzepływowajestmetodąznajdującązastosowa- nie w większości przypadków ostrych białaczek, zarówno szpikowych, jak i limfoblastycznych. Pozwala na wykrycie 1 komórki białaczkowej w 1000–10 000 komórek prawidło- wych. Jest to metodaszybka i znacznie tańsza odtechnik genetycznych. Utrudnienia w monitorowaniu MRD za pomocą FC spowodowane są obecnością subklonów lub pojawieniemsięnowychimmunofenotypówwtrakcielecze- nia[3–5].PCRjestmetodąpolegającąnawybiórczympowie- leniuokreślonegofragmentuDNA.Technikatapreferowana jestprzede wszystkimdomonitorowaniaMRDupacjentów z klonalnymi rearanżacjami genów, ze względu na możli- wośćichprecyzyjnegozidentyﬁkowania[6].PCRjestmetodą bardziejczułąodFC(10 ⁵–10 ⁶),jednakczasoczekiwaniana wynikjestdłuższy[3].

MRDbadasięwekrwiobwodowejlubwszpiku. Wydaje się, że czułość metod wykrywaniaMRD w oparciu o szpik kostnyjestokoło10-krotniewyższa.

DonajnowszychmetodocenyMRDnależysekwencjono- wanie genów nowej generacji [7, 8]. Metoda ta, chociaż bardzo dokładna, stawia duże wymagania techniczne iinterpretacyjne.

Czynniki rokownicze w ALL u dzieci i dorosłych

GrupyryzykawALLcharakteryzujesięnapodstawiezróżni- cowanych cech klinicznych i biologicznych, do których zalicza się: wiek,leukocytozę,liczbęblastów,immunofenotyp, czynniki genetyczne, MRD i odpowiedź na leczenie.

CzynnikiprognostycznewALLmożnapodzielićna3grupy:

Związane z pacjentem: wiek, płeć, rasa, współistniejące schorzenia(np.trisomia21,zespołyzaburzeńodporności).

Związane z chorobą: leukocytoza blastyczna, zajęcie narządówpozaszpikowych,immunofenotypkomórek bia- łaczkowych, obecność specyﬁcznych zaburzeń genetycznych,lekooporność.

Związane z leczeniem: wczesna odpowiedź na leczenie (steroidoterapię),czasosiągnięciaremisji,minimalnachorobaresztkowa.

Ze względu na wysokie zróżnicowanie ALL zależne od wieku, czynnikiprognostyczne w tych grupachwiekowych sąodmienne,coprzedstawionezostałowtabeliI.

Wiek(niemowlętalub>10.rokużycia),liczbaleukocytów

>50 G/l, rasa czarna, płeć męska i immunofenotyp T-komórkowystanowiągłówneniekorzystneczynnikiprog- nostyczne u dzieci. Istotnym czynnikiem rokowniczym andleukemiainitiatingcells. In thelightofthe currentknowledgebased onMRD, it seemsnecessary toreviewthe conceptofcompleteremissionin MRD-positiveleuke- micpatients.

(3)

związanym z pacjentemjest wiek jakozmienna ciągła: im starszywiek,tymwiększeryzykoniepowodzeniaterapii[9].

Wyjątkiem sąniemowlęta z rearanżacją MLL, zwłaszcza te młodsze niż 6 miesięcy z leukocytozą powyżej 300 G/L w chwilirozpoznania, które mają szczególnie niepomyślne rokowanie[10].

Młodzież i dorośli charakteryzują się większączęstością występowania białaczki biologicznie wysokiego ryzyka (np.

BCR-ABL1, MLL-AF4), mniejszą częstością występowania korzystnych podtypów (np. ETV6-RUNX1, hiperdiploidia) orazznaczniegorszątolerancjąleczeniaonkologicznego[11– 14]. Młodzież idorośli wydająsięmieć dużo korzystniejsze wynikiwówczas,gdyichleczenieopartejestnaschematach pediatrycznych, które zapewniają większe dawki leków, wczesną i częstą terapię dokanałową, terapię reindukcyjną ipodtrzymującąorazlepszedostosowywaniesiędozaleceń lekarskich[14].Ze złymrokowaniem nieodłączniezwiązany jest też starszy wiek (zwłaszcza powyżej 60 lat) i wysoka liczbaleukocytów[14].

W chwili obecnej najistotniejszym wskaźnikiem prognostycznym w ostrych białaczkach limfoblastycznych jest poziom minimalnej choroby resztkowej [14, 15]. Odsetek pacjentówzobecnościąMRDokreślanąpokonsolidacjiterapii (10.–16.tygodnia)rośniezwiekiempacjentów.MRDjestwięc również zmienną ciągłą, tj. im wyższy wiek pacjenta, tym większeryzykoobecnościMRDiniepowodzeniaterapiiALL.

Minimalna choroba resztkowa w ostrych białaczkach limfoblastycznych

Znamiennejinformacjiprognostycznej,nadrzędnejwstosun- kudoklasycznychczynnikówryzyka,dostarczamonitorowa- nieMRD,zarównowpierwszejremisji,jakipowznowieoraz potransplantacji szpiku kostnego [16–18]. Poziom MRD jest bardzo silnym wskaźnikiem prognostycznym, zarówno udzieci,jakiudorosłychzALL[5,19,20].

Rutynowo wykonywane oznaczenia cytometryczne i molekularne pozwalają na określenie wielkości MRD w granicach 0,1–0,001% (Ryc. 1). W większości badań MRD określa się jako dodatnią przy obecności 0,01% lub więcej komórek całkowitej populacji badanej. Ryzyko nawrotu choroby jest generalnie proporcjonalne do poziomu MRD, zwłaszcza przy pomiarze w trakcie lub po zakończeniu leczeniaindukującegoremisję[5,21].

MRD w ALL u dzieci

Pięcioletni czas przeżycia bez objawów chorobowych u dzieci z ostrą białaczką limfoblastyczną dotyczy 76–86%

pacjentów [22]. Osiągnięcie takich wyników było możliwe dzięki wprowadzeniu badań MRD i modyﬁkacji leczenia woparciuoMRD[23].

Obecnie większość laboratoriów określa MRD u dzieci z ALL w oparciu oklonalne rearanżacjegenówkodujących immunoglobuliny (Ig) lub białka receptorowe limfocytów T (TCR)poprzezzastosowanie technikiPCR[21, 24].Powyż- sze markery molekularne ma około 90% pacjentów pediatrycznych. Limfoblasty mogą być także rozpoznane na podstawie ich chromosomalnych zmian powstałych w wy- nikufuzjigenowych,wśródktórychwyróżniamy:BCR-ABL1, MLL-AFF1, TCF3-PBX1 i ETV6-RUNX1. Najczęściej występu- jąceaberracjecytogenetyczneobserwujesięuokoło1/3lub mniej pacjentów [24]. Technika PCR pozwala na wykrycie 1 komórki białaczkowej w 100000 badanych komórek, co czyni ją metodą bardziej czułą niż FC [21, 24]. Ma to znaczenieudziecizMRD<0,01%,albowiempomimodobrze ugruntowanej wiedzy wartość prognostyczna MRD poniżej tego progu pozostajeniejasna. WykorzystującmetodęPCR, wykazano, że pacjenci z MRD 0,001–0,01% mieli wyższe ryzyko nawrotu choroby niż pacjenci z niższą wartością MRDlubcałkowicieniewykrywalnąchorobą[21].

W ALL u dzieci blasty białaczkowe, poza specyﬁcznymi zmianami genetycznymi, charakteryzują siętakżeunikato- wymi kombinacjami markerów komórkowych, co przez użycie odpowiednich przeciwciał monoklonalnych pozwala je wykryć w badaniucytometrycznym. Niezmiernie ważne jest, abyzdeﬁniowanew rozpoznaniu markeryróżnicowały komórkinowotworoweodzdrowychkomórek,wtymlimfoi- dalnych komórek progenitorowych [24]. Ocena MRD tech- niką cytometrii przepływowej u dzieci z ostrą białaczką limfoblastyczną możebyćwykorzystana wokoło98% przy- padków [25]. Czułość tego badania jest równa około 0,01%

[24]. W chwili obecnej cytometryczna analiza MRD w pediatrycznych ALL jest metodą dobrze wystandaryzo- waną, co znacząco przyczynia się do poszerzenia możli- wościstosowania terapiidostosowanej dogrupryzyka [23, 26]. Pełna standaryzacja metody cytometrycznej jest na chwilę obecną jedynie realna przy wstępnym rozpoznaniu choroby[27].

TabelaI–NiekorzystneczynnikiprognostycznewALLudzieciidorosłych TableI–AdverseprognosticfactorsinchildrenandadultswithALL

Czynnikryzyka Prognosticfactors

Dzieci Children

Dorośli Adults

wiek <1.rżlub>10.rż >35.rż

wstępnaleukocytoza >20G/l B-liniowa>30G/l

T-liniowa>100G/l

typbiałaczki T-komórkowa niemaznaczenia

zmianycytogenetyczneimolekularne rearanżacjeBCR-ABL,MLL;

hipodiploidia

rearanżacjaBCR-ABL,MLL;

złożonykariotyp(>5zaburzeń) odpowiedźnasteroidoterapię złaodpowiedźnaprednizolonpo7dniach

terapii

niestosujesię

czasuzyskaniacałkowitejremisji brakremisjipo4tyg.leczeniaindukującego brakremisjipo4tyg.leczeniaindukującego

MRDpoleczeniuindukcyjnym obecna obecna(zwłaszczapokonsolidacji)

(4)

Cytometria przepływowa jest metodą rozwojową. Cous- tan-Smith i wsp. na podstawie różnicy w ekspresji genów komórekbiałaczkowych i prawidłowych odkrylinowe markery mogące potencjalnie służyć do monitorowania MRD metodącytometrii przepływowej:CD44, BCL2,HSPB1,CD73, CD24, CD123,CD72, CD86, CD200,CD164,CD97, CD102oraz CD99[15].

Zróżnicowanecechygenetyczneibiologiczneposzczegól- nychpodtypówbiałaczeklimfoblastycznychwtakcieterapii mogąmiećwpływnawystępowanieMRD[5].UdziecizALL linii B-komórkowej MRD jest rzadziej obserwowana wśród pacjentów z ETV6-RUNX1, hiperdiploidią (>50 chromoso- mów)iTCF3-PBX1.CzęściejnatomiastobecnośćMRDmożna zaobserwować u osób z BCR-ABL1 i delecją IKZF1. Wyjąt- kowo wysokie wartości MRD występują u dzieci z ALL zwczesnychprekursorówkomórekT[5,14].

MRD ma istotne znaczenie w stratyﬁkacji leczenia po wznowie ALL. Kwaliﬁkacja pacjentów z obecną MRD (np.

>10³)pozakończeniuterapii indukcyjnejdoprzeszczepie- nia allogenicznych komórek krwiotwórczych (allo-HSCT;

allogeneic hematopoietic stem cel transplantation) przyczyniła się do istotnej poprawy wyników leczenia [28–30]. Na skuteczność allo-HSCT u pacjentów z ALL istotny wpływ mastanremisji przedtransplantacją.Ocena MRDudzieci z ALL przed allo-HSCT jest ważnym czynnikiem progno- stycznymryzykanawrotuchorobypotransplantacji.Ozna- czenie MRD przed allo-HSCT pozwala na identyﬁkację pacjentówwymagających zastosowaniawzmocnionej chemioterapii oraz tych, którzy mogą być poddani terapii standardowej[31–33].

Kliniczne znaczenie MRD w pediatrycznych ALL jest stosunkowodobrze określone [34]. Włączenie detekcjiMRD do protokołów klinicznych znacznie udoskonaliło ocenę

ryzyka nawrotu oraz przyczyniło się do poprawy wyników terapii[21,23,35].

MRD w ALL u dorosłych

U dorosłych z ostrą białaczką limfoblastyczną całkowitą remisję uzyskuje się w około 85–90% przypadków [36].

Pomimo tak dobrych wyników, u połowy tych pacjentów ostatecznie następuje nawrót choroby, który jest związany zbardzoniskimodsetkiemwyleczeń<10%.Głównymcelem optymalizacjileczeniaw ALLudorosłychjestzmniejszenie częstościwystępowanianawrotubiałaczki[11](Ryc.2).

Opracowane w ciągu ostatniej dekady metody pozwa- lają na ocenę ilościową resztkowych komórek białaczko- wych z coraz większą czułością i precyzją. W ostrych białaczkach limfoblastycznych u dorosłych większość doświadczeń i stosunkowo wysoki poziom standaryzacji zostały zgromadzone na podstawie oceny rearanżacji genów TCR i IG, badanych z wykorzystaniem metod molekularnych (grupa ESG-MRD-ALL) [37]. Monitorowanie MRD na podstawie powyższych aberracji genetycznych umożliwia szczegółową ocenę odpowiedzi na leczenie w ALL u dorosłych. Wyniki MRD uzyskane po indukcji remisji oraz po I konsolidacji pozwalają na identyﬁkację nowej podgrupy pacjentów z brakiem remisji molekularnej, czyli takich z wysokim ryzykiem nawrotu choroby, wymagających wczesnej intensyﬁkacjileczenia. Chorzy ci zazwyczajsąoporninakonwencjonalneleki isąkandyda- tami do terapii celowanej i allogenicznego przeszczepu komórekkrwiotwórczych[36].

Szeroko stosowane do monitorowania MRD są też geny fuzyjne, takie jak: BCR-ABL1, MLL-AFF1, TCF3-PBX1, Ryc.1–PoziomyMRD:czułośćiznaczeniekliniczne

Fig.1–MRDlevel:sensitivityandclinicalvalue

(5)

ETV6-RUNX1, obecne u około 40% dorosłych z ALL. Wśród ostatniozidentyﬁkowanychnieprawidłowości,którewzasa- dziemogąbyć wykorzystywanedomonitorowanieMRD,są geny fuzyjne obejmujące CRLF2 (np. IGH@-CRLF2 i P2RY8- CRLF2)występująceuokoło6%dorosłychzALL[5,38].

Doroślipacjenciz ALL,podobniejakdzieci,mająkomórki nowotworowecharakteryzującesięniepowtarzalnymikombi- nacjamiimmunofenotypowymi,które mogązostaćzidentyﬁ- kowanewbadaniucytometrycznymuponad95%chorych[11, 39]. Określenie immunofenotypu komórek białaczkowych pozwala na monitorowanie MRD, natomiast jednoczesne wykrycieutychpacjentówspecyﬁcznychantygenówpowierz- chniowych, takich jak np. CD19, CD20 lub CD22, umożliwia zastosowanie leczenia przeciwciałami monoklonalnymi. Pa- cjencizALLliniiB-komórkowejzobecnym antygenemCD20 mogąbyćleczeniprzeciwciałamianty-CD20(rytuksymab)[11].

PoziomMRDupacjentówPh- równy0,1% lub więcejpo leczeniuindukcyjnym stanowiniezależny czynniknawrotu choroby[40]. Wtejsamej grupiechorychprawdopodobień- stwo5-letniego przeżyciawolnego odbiałaczkijestistotnie wyższe upacjentówz MRD<0,1%,aniżeli utychz wyższą wartościąMRD(57% vs17%). U pacjentówdorosłych z ALL Ph+, nieobecność MRD, uzyskana po chemioterapii z zastosowaniem inhibitorów kinazy tyrozynowej, jest przed HSCT korzystnym czynnikiem prognostycznym przeżycia wtejgrupiechorych[5].

Wczesna ocena MRD u dorosłych z ALL jest silnym iniezależnym czynnikiemprognostycznym w dużym stop- niuwspomagającympodejmowaniedecyzjiterapeutycznych bądźich modyﬁkację [36]. BadanieMRD jest uwzględnione w aktualnie obowiązujących protokołach leczenia PALG (PolishAdultLeukemiaGroup)dlaALL.

Czynniki rokownicze w ostrej białaczce mieloblastycznej u dzieci i dorosłych

Wysoka heterogenność ostrychbiałaczekszpikowych spra- wia, że ta grupa chorób znacznie różni się między sobą przebiegiemklinicznymirokowaniem.CzynnikiryzykaAML u dorosłych obejmują: wiek >55–60 lat, wtórny charakter choroby, aberracjecytogenetyczno-molekularne, brak remisji poleczeniu indukującym. Współcześnie, aberracje cyto- genetyczno-molekularne mająnajwiększe znaczenierokow- nicze (Tab. II) [41, 42]. Osoby powyżej 60. roku życia [41]

mająwięcejchoróbwspółistniejących,częściejsąwgorszym stanie ogólnym w chwili rozpoznania i gorzej tolerują agresywnąchemioterapię[43].Wyższaopornośćnaleczenie występująca u starszych dorosłych wynika również zekspresjibiałekopornościwielolekowej[44].

Minimalna choroba resztkowa w ostrych białaczkach szpikowych

NowymkierunkiemwstrategiileczeniaAMLjestwykrywanie resztkowych komórekbiałaczkowychinnymi metodami,bar- dziejczułymiimniejsubiektywnyminiżocenamorfologiczna.

Obiecującą techniką w monitorowaniu MRD jest PCR.

Metoda ta jednak znajduje zastosowanie tylko u części pacjentówmającychokreśloneaberracjegenetyczne.Ograni- czonajestzatemdospecyﬁcznychpodtypówAML[6].Szeroko wykorzystywana w ostrejbiałaczce limfoblastycznej rearan- żacja genów immunoglobulin i receptorów limfocytów T jest bardzo rzadka w AML [16]. Obecnie oznaczanie MRD Ryc.2–StrategiaterapiiudorosłychzALLzuwzględnieniemminimalnejchorobyresztkowej(wg[9])

Fig.2–StrategyoftherapyinadultALL,withtheuseofminimalresidualdisease(acc.to[9])

(6)

rutynowowykonujesięgłówniewostrej białaczcepromielo- cytowej(APL;acutepromyelocyticleukemia).

W odróżnieniu od PCR, cytometria przepływowa ma potencjalnie znacznie szersze zastosowanie, analiza immu- nofenotypowaMRDmożezostaćbowiemwykonanauponad 80%pacjentów[45,46].Pomimodobrzeugruntowanejwiedzy na temat przydatności immunofenotypowania do diagnos- tyki,klasyﬁkacji,określaniaczynnikówryzykaorazmonitoro- wania MRD w ostrych białaczkach limfoblastycznych, ilość danychnatentematwostrychbiałaczkachszpikowychjest bardzo ograniczona [4]. Do monitorowania MRD w AML zwykorzystaniemFCniezbędnejestwmomenciediagnozo- waniapacjentazdeﬁniowanieekspresjiaberrentnychmarke- rów,powszechnieokreślanychjakoimmunofenotypybiałacz- kowe(LAIP; leukemia associatedimmunophenotypes). Zawierają one kombinację4–5 białek powierzchniowych, które wystę- pują w znikomej ilości bądź są całkowicie nieobecne na komórkachkrwiiszpikuosobyzdrowej[4,46].Kluczowąich cechą jest to,że poza ekspresją zróżnicowanych markerów mieloidalnych zawierają one także kompleksy niecharakte- rystycznedlatejlinii,cotworzykompozycjębiałeknormalnie reprezentującychodrębneetapydojrzewania[6].

Najbardziej znane zaburzenia antygenowe występujące wAMLobjawiająsiępoprzez:[4]

asynchronizmekspresjiantygenów(jednoczesnewystępo- waniewczesnychipóźnychmarkerównajednejkomórce, np.koekspresjaantygenówCD34iCD15)

,,nieścisłość’’ liniową (np. ekspresja markerów limfoidal- nych, takich jak CD2, CD3, CD5, CD7, CD10 i CD19, na blastachmieloidalnych)

nadekspresjęantygenową(ponadnormalnywzrostekspre- sjipewnegookreślonegoantygenunajednejkomórce)

aberrentnewłaściwości rozpraszania światła(mieloidalne blastyz nieprawidłowymtzn. niecharakterystycznym dla komórekzdrowychusytuowaniemnawykresiezależności wielkościodziarnistości)

nieobecność liniowo-specyﬁcznych antygenów (np. brak spodziewanej na blastach mieloidalnych ekspresji CD13 iCD33)

MRD w AML u dzieci

Ukierunkowana terapia uwzględniająca ryzyko oraz zopty- malizowane leczenie wspomagające znacznie poprawiły

wyniki wyleczalności dzieci z ostrą białaczką szpikową.

Pięcioletniczasprzeżyciawolnyodchorobyosiągaaktualnie 50–60%dzieciAML[16].Obecnieuokoło35%chorychmożna monitorować MRD za pomocą PCR, opierając się na zmia- nach genetycznych RUNX1-RUNX1T1, CBFB-MYH11 oraz MLL-AF9.PonadtowAPLMRDjestmonitorowanawoparciu o rearanżacjęPML-RARa [6,24]. Tentyp białaczki,zarówno udzieci, jakiudorosłych,wiążesięzdobrym przeżyciem, sięgającym 75–90% [22]. Monitorowanie MRD u pacjentów z APL, zarówno w pierwszej remisji, jak i po wznowie molekularnej, wpołączeniuz chemioterapiązapewnia ewi- dentnezmniejszenieilościnawrotówwtym typiebiałaczki, a tym samym służy jako wzór zindywidualizowanego podejściadokażdegozpacjentów[47–49].

MutacjeNPM1iFLT3-ITDwystępująodpowiedniouokoło 8% i 15% dzieci z AML i mogą być również potencjalnymi markerami wykorzystywanymi do detekcji MRD techniką PCR [13]. W podgrupie pacjentów z zaburzeniami MLL ocenaMRDpolegającanawykrywaniu genówfuzyjnychna poziomie DNA jest obecnie najlepszą metodą, która zastą- piła wykrywanie obecności transkryptów fuzyjnych MLL [50,51].

LAIP są identyﬁkowane u większości dzieci z ostrymi białaczkami, jednak w 40% przypadków osiąga się czułość niewyższąniż1:1000,cowynikazczęściowegopokryciasię fenotypukomórekbiałaczkowychznormalnymikomórkami progenitorowymi szpiku kostnego [24]. Analiza MRD bazu- jąca na metodzie FC znajduje szerokie zastosowanie i jest silnym czynnikiemprognostycznym,stosowanym dooceny odpowiedzi naleczenie[52, 53]. Jednakuczęści pacjentów, pomimowykryciachorobyresztkowej,następujedługotrwa- ła remisja, a z drugiej strony, nawet w przypadku braku MRD może wystąpić nawrót choroby. Takie zróżnicowanie wynika prawdopodobnie z heterogenności biologicznej, jak i czułości zastosowanej metody. Według Lokena i wsp., połączenieFCzbadaniami genetycznymimogłobyprzyczy- nićsiędobardziejprecyzyjnejocenyryzykawprowadzeniu klinicznym wszystkich pacjentów z AML [52]. Campana i wsp.wykazali natomiastbrakzależnościpomiędzy wyni- kami uzyskanymi metodą cytometrii przepływowej i PCR, jednak nie ustalili powodu braku tej zgodności [24]. Brak spójności w wynikach i wnioskach wysuwanych na ich podstawie przez różne ośrodki badawcze świadczy o koniecznościwystandaryzowaniametodsłużącychocenie MRD.

TabelaII–NiekorzystneczynnikiprognostycznewAMLudzieciidorosłych TableII–AdverseprognosticfactorsinchildrenandadultswithAML

Czynnikryzyka Prognosticfactors

Dzieci Children

Dorośli Adults

wiek >10.rokużycia >55.–60.rokużycia

wstępnaleukocytoza >100G/l niemaznaczenia

typbiałaczki AMLM0;AMLM7 niemaznaczenia

zmianycytogenetyczneimolekularne inv(3)(q21q26.2)/t(3;3)(q21;q26.2);RPN1-EVI1;t(6;9)(p23;q34);DEK-NUP214.t(v;11) (v;q23);rearanżacjeMLL.-5/del(5q);7/abnl(17p);złożonykariotyp>3zaburzenia

wtórne poprzedzającyzespółmielodysplastycznylubmieloproliferacyjny,poprzedza-

jącachemio-lubradioterapia

odpowiedźnaleczenie późnaremisja brakremisjipoleczeniuindukującym

MRD brakkryteriów wAPL:obecna

(7)

MRD w AML u dorosłych

Udorosłychpacjentówz ostrąbiałaczką szpikowączęstość uzyskiwania całkowitej remisji oscyluje wokół 50–80%.

Pomimotakichrezultatów,zaledwie20–30%przypadkówma szanseprzeżycia5latodustaleniadiagnozy[54,55].

Pomimo że w pediatrycznych AML ocena MRD została wniektórychprotokołachdodanadokonwencjonalnejstraty- ﬁkacjiryzyka, udorosłychsystematycznejejstosowanie nie jestjeszczeosiągnięte(zwyjątkiemAPL).Leczenieopartena monitorowaniuMRDuchorychbędącychwremisjimorfolo- gicznejjestraczejrzadkościąniżnormą[55].Zainteresowanie oceną MRD jako narzędziem prognostycznym u dorosłych z AML stopniowo jednak wzrasta [45]. Obecność MRD, wprzeciwieństwiedocytogenetycznychczynnikówrokowni- czych, reprezentuje zbiorowy wynik końcowy wszystkich mechanizmówkomórkowych,którepozwalająnaokreślenie odpowiedzipacjentanazastosowanąterapię[54].

Markery molekularne, choć zapewniają wysoką czułość, mogąbyćstosowanetylkouczęścipacjentów,zarównowdia- gnostyce,jakiwocenierokowania[28].Niewszystkiemarkery wAMLnadająsiędomonitorowaniaMRD.Najbardziejznane istosowanetoFLT3orazPML-RARwAPL.Niejestjednozna- czneznaczenieNPM1wmonitorowaniuMRD: jesttomarker korzystnegorokowania,jednakjegoobecnośćpozakończeniu leczenia może wskazywać na zwiększone ryzyko nawrotu.

Brak też odpowiedniej standaryzacjii niezbędnych wartości punktówgranicznychwtechnikachgenetycznych[54].

Immunofenotypowanie oparte na badaniu cytometrycz- nym może obejmować większą część przypadków AML, jednakże w tej metodzie brakuje jeszcze wystandaryzowa- nych procedur. Problememw normalizacjitej techniki jest przedewszystkimwysocezróżnicowanaekspresjaaberrent- nych immunofenotypów [45]. W sferze badań naukowych pozostajebadanieobecnościbiałaczkowychkomórekmacie- rzystychjakomarkeraMDR.

MRD jako koncepcja białaczkowych komórek macierzystych

Aktualnepoglądypokazują,żeMRDstajesięnajważniejszym czynnikiem rokowniczym w ALL oraz ważnym czynnikiem

w AML. Obecność MRD w AML może być tłumaczona jako obecnośćbiałaczkowych komórekmacierzystych(LCS; leukemic stem cells), które przetrwały chemioterapię. Natomiast wALLobecnośćMRDmożebyćefektemobecnościwczesnych stadiów rozwojuklonu komórek białaczkowych, któreprze- trwały chemioterapię, co wynika z faktu, że ALL może rozwinąćsięwkażdymstadiumróżnicowaniabiałaczkowych komórek prekursorowych limfocytów B [56]. Tym samym koncepcja ta łączy oporność nowotworowych komórek macierzystychnacytostatyki[57,58]orazobecnośćkomórek rezydualnych, niewykrywanych metodami mikroskopii optycznej,pozastosowanejchemioterapii[59].

Koncepcja białaczkowych komórek macierzystychtłuma- czywystępowanieklonówopornych[60].Woparciuobadania proﬁligenetycznychistniejecorazwięcejdowodówsugerują- cych,żeostrebiałaczkisąchorobamiwysoceheterogennymi [61]. Idzie to w parze z hierarchią białaczkowych komórek macierzystychikomórekinicjującychbiałaczkę.

Obecnie pojawia się również pytanie czy określenie ,,remisja całkowita’’może byćstosowane w odniesieniu do chorych ,,MRD-dodatnich’’? Należy podkreślić, że pacjent w ,,remisji całkowitej’’, u którego stwierdza się obecność MRD,maprzecieżdużeryzykonawrotuchoroby.

Podsumowanie

Niewątpliwie aktualnie najsilniejszym czynnikiem rokowni- czymterapii przeciwbiałaczkowejjestodpowiedź napocząt- kowąterapię.Wtychkategoriachnajlepszymparametremtej odpowiedzi jest obecność minimalnej choroby resztkowej.

Pod względem terapeutycznym MRD dostarcza najbardziej racjonalnejinformacjioodpowiedzinaleczenie,jakrównież przedipoprzeszczepieniukomórekkrwiotwórczych.Aktual- ny stan wiedzy w zakresie znaczenia i wykorzystania MRD jest zróżnicowanypomiędzydziećmii dorosłymi,pomiędzy ALLiAML.NajistotniejszeróżniceprzedstawionowtabeliIII.

Monitorowanie MRD znacznie częściej wykorzystywane jest u pacjentów z ALL, w tym szczególnie u dzieci [62].

Zgromadzone doświadczenie przyczyniło się do ustalenia niezbędnychprocedur,m.in.punktówgranicznych,punktów czasowychitp.Ponadtocechybiologiczneigenetycznelim- foblastów, pomimo stosunkowo wysokiej heterogenności TabelaIII–PodobieństwairóżnicewMRDwALLiAMLudzieciidorosłych

TableIII–SimilaritiesanddifferencesinMRDinALLandAMLinchildrenandadults

MRD Dzieci

Children

Dorośli Adults ALL najsilniejszyczynnikrokowniczy

wskaźnikdointensyﬁkacjiterapiiiHSCT

elementwiększościprotokołówleczniczych

wystandaryzowaneproceduryoznaczania MRDtechnikąFC

FCrówniedobrejakPCR

możnastosowaću98%pacjentów

czynnikrokowniczy

wskaźnikdointensyﬁkacjiterapiiiHSCT

elementwieluprotokołówleczniczych

odsetekpacjentówzobecnąMRDpokonsolidacji rośniezwiekiem

brakstandaryzacji

AML znaczeniewAPL

FCjestmetodąobiecującą

PCR–około35%dziecimaspecyﬁczneaberracje genetycznesłużącedetekcjiMRD

brakzgodnościpomiędzyFCiPCR

znaczeniewAPL

brakdanych(brakstandaryzacjiFCiPCR)

(8)

ALL, poprzez zastosowanie FC i PCR, pozwalają na ocenę MRD u prawie wszystkich pacjentów. U dorosłych z ALL MRD jest elementem wielu protokołów leczniczych, jed- nakżestandaryzacjametodsłużącychjejocenieniejesttak dobrze rozwinięta jak w pediatrii. W AML znaczenie MRD stopniowo wzrasta. Trudności w dokładnej ocenie choroby resztkowej w tym typie białaczki wynikają głównie z jej znacznej odmienności biologicznej, cytogenetycznej oraz zróżnicowanych mechanizmów oporności. Obecnie rutynowo monitoruje się poziom MRD w APL u dzieci i dorosłych. Ponadto 1/3 dzieci ma specyﬁczne aberracje genetyczne służące ocenie MRD techniką PCR. Obiecującą metodąjestjednakcytometriaprzepływowa,zewzględuna fakt możliwości określenia fenotypu każdej z badanych populacji komórek białaczkowych. Wydaje się, że ocena MRDwkrótcestaniesięjednymz najważniejszychparame- trówbadanychukażdegopacjentazostrąbiałaczką.

Wkład autorów/Authors' contributions

EP – zebranie piśmiennictwa, napisanie artykułu; LG – krytyczna rewizja artykułu, pisanie artykułu, akceptacja artykułu; JS – koncepcja pracy, pisanie artykułu, zebranie piśmiennictwa,akceptacjaartykułu.

Konﬂikt interesu/Conﬂict of interest

Niewystępuje.

Finansowanie/Financial support

Niewystępuje.

Etyka/Ethics

Treści przedstawione w artykule są zgodne z zasadami DeklaracjiHelsińskiej,dyrektywamiEUorazujednoliconymi wymaganiamidlaczasopismbiomedycznych.

pi smiennictwo/references

[1] SwerdlowSH,CampoE,HarrisNL,etal. WHOclassiﬁcation oftumoursofhaematopoieticandlymphoidtissues,17–30.

Lyon:IARC;2008.p.167–178.

[2] HungerSP,LuX,DevidasM,etal.Improvedsurvivalfor childrenandadolescentswithacutelymphoblastic leukemiabetween1990and2005:areportfromthe Children'sOncologyGroup.JClinOncol2012;30:1663–1669.

[3] Al-MawaliA,GillisD,HissariaP,etal.Incidence,sensitivity andspecificityofleukemia-associatedphenotypesinacute myeloidleukemiausingspecificfive-colormultiparameter flowcytometry.AmJClinPathol2008;129:934–945.

[4] Al-MawaliA,GillisD,LewisI.Theroleofmultiparameter ﬂowcytometryfordetectionofminimalresidual diseaseinacutemyeloidleukemia.AmJClinPathol 2009;131:16–26.

[5] CampanaD.Minimalresidualdiseaseinacute lymphoblasticleukemia.HematologyAmSocHematol EducProgram2010;7–12.

[6] ShookD,Coustan-SmithE,RibeiroRC,etal.Minimal residualdiseasequantitationinacutemyeloidleukemia.

ClinLymphomaMyeloma2009;9:281–285.

[7] TholF,KölkingB,DammF,etal.Next-generation sequencingforminimalresidualdiseasemonitoringin acutemyeloidleukemiapatientswithFLT3-ITDorNPM1 mutations.GenesChromosomesCancer2012;51:689–695.

[8] LadettoM,BrüggemannM,MonitilloL,etal.Next- generationsequencingandreal-timequantitativePCRfor minimalresidualdiseasedetectioninB-celldisorders.

Leukemia2013Dec17.http://dx.doi.org/10.1038/

leu.2013.375[Epubaheadofprint].

[9] StyczyńskiJ,WysockiM.Invitrodrugresistanceproﬁlesof adultacutelymphoblasticleukemia:possibleexplanation fordifferenceinoutcometosimilartherapeuticregimens.

LeukLymphoma2002;43:301–307.

[10] PietersR,SchrappeM,DeLorenzoP,etal.Atreatment protocolforinfantsyoungerthan1yearwithacute lymphoblasticleukaemia(Interfant-99):anobservational studyandamulticentrerandomisedtrial.Lancet2007;370 (9583):240–250.

[11] HoelzerD.Monitoringandmanagingminimalresidual diseaseinacutelymphoblasticleukemia.AmSocClin OncolEducBook2013;290–293.

[12] BrüggemannM,RaffT,KnebaM.HasMRDmonitoring supersededotherprognosticfactorsinadultALL?Blood 2012;120:4470–4481.

[13] Jaworska-PosadzyA,StyczyńskiJ,KubickaM,etal.

Prognosticvalueofpersistentperipheralbloodandbone marrowlymphoblastonday15oftherapyinchildhood acutelymphoblasticleukemiaasdetectedbyﬂow cytometry.AnticancerRes2011;31:1453–1458.

[14] InabaH,GreavesM,MullighanChG.Acutelymphoblastic leukemia.Lancet2013;381:1943–1955.

[15] Coustan-SmithE,SongG,ClarkCh,etal.Newmarkersfor minimalresidualdiseasedetectioninacutelymphoblastic leukemia.Blood2011;117:6267–6276.

[16] BoeckxN,WillemseMJ,SzczepanskiT,etal.Fusiongene transcriptsandIg/TCRgenerearrangementsare complementarybutinfrequenttargetsforPCR-based detectionofminimalresidualdiseaseinacutemyeloid leukemia.Leukemia2002;16:368–375.

[17] CavéH,vanderWerfftenBoschJ,SuciuS,etal.,Clinical signiﬁcanceofminimalresidualdiseaseinchildhoodacute lymphoblasticleukemia.EuropeanOrganizationfor ResearchandTreatmentofCancer:ChildhoodLeukemia CooperativeGroup.NEnglJMed1998;27(339):591–598.

[18] ConterV,BartramCR,ValsecchiMG,etal.Molecular responsetotreatmentredeﬁnesallprognosticfactorsin childrenandadolescentswithB-cellprecursoracute lymphoblasticleukemia:resultsin3184patientsofthe AIEOP-BFMALL2000study.Blood2010;115:3206–3214.

[19] MorleyAA,LathamS,BriscoMJ,etal.Sensitiveandspeciﬁc measurmentofminimalresidualdiseaseinacute lympoblasticleukemia.JMolDiagn2009;11:201–210.

[20] Coustan-SmithE,BehmFG,SanchezJ,etal.Immunological detectionofminimalresidualdiseaseinchildrenwith acutelymphoblasticleukaemia.Lancet1998;351(9102):

550–554.

[21] StowP,KeyL,ChenX,etal.Clinicalsigniﬁcanceoflow levelsofminimalresidualdiseaseattheendofremission inductiontherapyinchildhoodacutelympoblastic leukemia.Blood2010;115:4657–4663.

[22] PuiCH,CarrollWL,MeshinchiS,ArceciRJ.Biology,risk stratiﬁcation,andtherapyofpediatricacuteleukemias:an update.JClinOncol2011;29:551–565.

(9)

[23] GaipaG,BassoG,BiondiA,CampanaD.Detectionof minimalresidualdiseaseinpediatricacutelymphoblastic leukemia.CytometryBClinCytom2013;84:359–369.

[24] CampanaD,Coustan-SmithE.Measurementsoftreatment responseinchildhoodacuteleukemia.KoreanJHematol 2012;47:245–254.

[25] PuiCH,CampanaD,PeiD,etal.Treatingchildhoodacute lymphoblasticleukemiawithoutcranialirridation.NEnglJ Med2009;360:2041–2730.

[26] DworzakMN,GaipaG,RateiR,etal.Standarizationofﬂow cytometricminimalresidualdiseaseevaluationinacute lymphoblasticleukemia:multicentricassessmentis feasible.CytometryBClinCytom2008;74:331–340.

[27] KalinaT,Flores-MonteroJ,vanderVeldenVH,etal.

EuroFlowstandardizationofﬂowcytometerinstrument settingsandimmunophenotypingprotocols.Leukemia 2012;26:1986–2010.

[28] EckertC,BiondiA,SeegerK,etal.Prognosticvalueof minimalresidualdiseaseinrelapsedchildhoodacute lymphoblasticleukaemia.Lancet2001;358:1239–1241.

[29] EckertC,vonStackelbergA,SeegerK,etal.Minimal residualdiseaseafterinductionisthestrongestpredictorof prognosisinintermediateriskrelapsedacute

lymphoblasticleukaemia-long-termresultsoftrialALL- REZBFMP95/96.EurJCancer2013;49:1346–1355.

[30] EckertC,HenzeG,SeegerK,etal.Useofallogeneic hematopoieticstem-celltransplantationbasedonminimal residualdiseaseresponseimprovesoutcomesforchildren withrelapsedacutelymphoblasticleukemiainthe intermediate-riskgroup.JClinOncol2013;31:

2736–2742.

[31] KnechtliCJ,GouldenNJ,HancockJP,etal.Minimalresidual diseasestatusbeforeallogeneicbonemarrow

transplantationisanimportantdeterminantofsuccessful outcomeforchildrenandadolescentswithacute

lymphoblasticleukemia.Blood1998;92:4072–4079.

[32] BaderP,HancockJ,KreyenbergH,etal.Minimalresidual disease(MRD)statuspriortoallogeneicstemcell transplantationisapowerfulpredictorforpost-transplant outcomeinchildrenwithALL.Leukemia2002;16:1668–1672.

[33] BaderP,KreyenbergH,HenzeGH,etal.Prognosticvalueof minimalresidualdiseasequantiﬁcationbeforeallogeneic stem-celltransplantationinrelapsedchildhoodacute lymphoblasticleukemia:theALL-REZBFMStudyGroup.J ClinOncol2009;27:377–384.

[34] vanDongenJJ,SeriuT,Panzer-GrümayerER,etal.

Prognosticvalueofminimalresidualdiseaseinacute lymphoblasticleukaemiainchildhood.Lancet1998;352 (9142):1731–1738.

[35] SchrappeM,ValsecchiMG,BartramCR,etal.LateMRD responsedeterminesrelapseriskoverallandinsubsetsof childhoodT-cellALL:resultsoftheAIEOP-BFM-ALL2000 study.Blood2011;118:2077–2084.

[36] GökbugetN,KnebaM,RaffT,etal.Adultpatientswith acutelymphoblasticleukemiaandmolecularfailure displayapoorprognosisandarecandidatesforstemcel transplantationandtargetedtherapies.Blood

2012;120:1868–1876.

[37] vanderVeldenVH,CazzanigaG,SchrauderA,etal.

AnalysisofminimalresidualdiseasebyIg/TCRgene rearrangements:guidelinesforinterpretationofreal-time quantitativePCRdata.Leukemia2007;21:604–611.

[38] EnsorHM,SchwabC,RussellLJ,etal.Demographic,clinical, andoutcomefeaturesofchildrenwithacutelymphoblastic leukemiaandCRLF2deregulation:resultsfromtheMRC ALL97clinicaltrial.Blood2011;117:2129–2136.

[39] Coustan-SmithE,CampanaD.Immunologicminimal residualdiseasedetectioninacutelymphoblasticleukemia:

acomparativeapproachtomoleculartesting.BestPractRes ClinHaematol2010;23:347–358.

[40] HołowieckiJ,Krawczyk-KulisM,GiebelS,etal.Statusof minimalresidualdiseaseafterinductionpredictsoutcome inbothstandardandhigh-riskPh-negativeadultacute lymphoblasticleukaemia.ThePolishAdultLeukemia GroupALL4-2002MRDStudy.BrJHaematol2008;142:

227–237.

[41] DöhnerH,EsteyEH,AmadoriS,etal.Diagnosisand managementofacutemyeloidleukemiainadults:

recommendationfromaninternationalexpertpanel, onbehalfoftheEuropeanLeukemiaNet.Blood 2010;115:453–474.

[42] PatelJP,LevineRL.Howdonovelmoleculargenetic markersinﬂuencetreatmentdecisionsinacutemyeloid leukemia?HematologyAmSocHematolEducProgram 2012;2012:28–34.

[43] JuliussonG,AntunovicP,DerolfA,etal.Ageandacute myeloidleukemia:realworlddataondecisiontotreatand outcomesfromtheSwedishAcuteLeukemiaRegistry.

Blood2009;113:4179–4187.

[44] StyczyńskiJ.Drugresistanceinchildhoodacutemyeloid leukemia.CurrentPharmaceuticalBiotechnology2007;8:

59–75.

[45] FellerN,vanderVeldenVHJ,BrooimansRA,etal.Deﬁning consensusleukemia-associatedimmunophenotypesfor detectionofminimalresidualdiseaseinacutemyeloid leukemiainamulticentersetting.BloodCancerJournal 2013;3:e129.

[46] BuccisianoF,MaurilloL,SpagnoliA,etal.Monitoringof minimalresidualdiseaseinacutemyeloidleukemia.Curr OpinOncol2009;21:582–588.

[47] MandelliF,DiverioD,AvvisatiG,etal.,Molecularremission inPML/RARalpha-positiveacutepromyelocyticleukemia bycombinedall-transretinoicacidandidarubicin(AIDA) therapy.GruppoItaliano-MalattieEmatologicheMaligne dell'AdultoandAssociazioneItalianadiEmatologiaed OncologiaPediatricaCooperativeGroups.Blood 1997;90:1014–1021.

[48] DiverioD,RossiV,AvvisatiG,etal.Earlydetectionof relapsebyprospectivereversetranscriptase-polymerase chainreactionanalysisofthePML/RARalphafusiongenein patientswithacutepromyelocyticleukemiaenrolledinthe GIMEMA-AIEOPmulticenter‘‘AIDA’’trial.GIMEMA-AIEOP Multicenter‘‘AIDA’’Trial.Blood1998;92:784–789.

[49] GrimwadeD,JovanovicJV,HillsRK,etal.Prospective minimalresidualdiseasemonitoringtopredictrelapse ofacutepromyelocyticleukemiaandtodirectpre-emptive arsenictrioxidetherapy.JClinOncol2009;27:3650–3658.

[50] BurmeisterT,MarschalekR,SchneiderB,etal.Monitoring minimalresidualdiseasebyquantiﬁcationofgenomic chromosomalbreakpointsequencesinacuteleukemias withMLLaberrations.Leukemia2006;20:451–457.

[51] VanderVeldenVH,CorralL,ValsecchiMG,etal.Prognostic signiﬁcanceofminimalresidualdiseaseininfantswith acutelymphoblasticleukemiatreatedwithintheInterfant- 99protocol.Leukemia2009;23:1073–1079.

[52] LokenMR,AlonzoTA,PardoL,etal.Residualdisease detectedbymultidimensionalﬂowcytometrysigniﬁeshigh relapseriskinpatientswithdenovoacutemyeloid leukemia:areportfromChildren'sOncologyGroup.Blood 2012;120:1581–1588.

[53] InabaH,Coustan-SmithE,CaoX.Comparativeanalysisof differentapproachestomeasuretreatmentresponsein acutemyeloidleukemia.JClinOncol2012;30:3625–3632.

[54] BuccisianoF,MaurilloL,DelPrincipeMI,etal.Prognosticand therapeuticimplicationsofminimalresidualdisease detectioninacutemyeloidleukemia.Blood2012;119:332–341.

(10)

[55] PaiettaE.Minimalresidualdiseaseinacutemyeloid leukemia:comingofage.HematologyAmSocHematol EducProgram2012;2012:35–42.

[56] LeViseurC,HotﬁlderM,BomkenS,etal.Inchildhoodacute lymphoblasticleukemia,blastsatdifferentstagesof immunophenotypicmaturationhavestemcellproperties.

CancerCell2008;14:47–58.

[57] StyczyńskiJ,DrewaT.Leukemicstemcells:frommetabolic pathwaysandsignalingtoanewconceptofdrugresistance targeting.ActaBiochimPol2007;54:717–726.

[58] DrewaT,StyczynskiJ,SzczepanekJ.Isthecancerstemcell population‘‘aplayer’’inmulti-drugresistance?ActaPol Pharm2008;65:493–500.

[59] StyczyńskiJ,PiątkowskaM,Jaworska-PosadzyA,etal.

Comparisonofprognosticvalueofinvitrodrugresistance

andbonemarrowresidualdiseaseonday15oftherapyin childhoodacutelymphoblasticleukemia.AnticancerRes 2012;32:5495–5500.

[60] StyczynskiJ,WysockiM.Exvivodrugresistancein childhoodacutemyeloidleukemiaonrelapseisnothigher thanatﬁrstdiagnosis.PediatrBloodCancer2004;42:

195–199.

[61] SzczepanekJ,JarzabM,Oczko-WojciechowskaM,etal.

Geneexpressionsignaturesandexvivodrugsensitivity proﬁlesinchildrenwithacutelymphoblasticleukemia.J ApplGenet2012;53:83–91.

[62] DębskiR,SędekŁ,Jaworska-PosadzyA,etal.

Monitorowanieiwalidacjaminimalnejchorobyresztkowej metodącytometriiprzepływowejwostrejbiałaczce limfoblastycznejudzieci.PostNaukMed2014;27:225–230.