Application of flow cytometry to immunohematological tests of red blood cells

(1)

Praca poglądowa/Review

Zastosowanie cytometrii przepływowej

w badaniach immunohematologicznych krwinek czerwonych

Application of ﬂow cytometry to immunohematological tests of red blood cells

Jadwiga Fabijańska-Mitek *, Anna Stachurska

ZakładImmunohematologii,CentrumMedyczneKształceniaPodyplomowego,Warszawa,Polska

informacje o artykule

Historiaartykułu:

Otrzymano:28.06.2017 Zaakceptowano:18.07.2017 Dostępneonline:27.07.2017

Słowakluczowe:

cytometriaprzepływowa

przeciekpłodowo-matczyny

erytrofagocytoza

CDkomórekkrwi

przechowywanieKKCz

mikrocząstki

Keywords:

Flowcytometry

Feto-maternalhemorrhage

Erythrophagocytosis

CDoferythrocytes

RBCsstorage

Microparticles

abstract

Flowcytometry(FC)hasbeenprimarilyappliedtothediagnosisofhematologicalmalig- nancies,andthereafter, todetection andquantiﬁcationofCD34+cellsinbonemarrow transplants,andgranulocytesinneutropeniasandparoxysmalnocturnalhemoglobinuria (PNH).InPNHandhereditaryspherocytosis,changesinsomeoftheerythrocytemem- braneproteinsaretested(CD59,CD55,andband3).Thepurposeofthispaperistofocus ontheuseofFCinRBCtesting.Withanti-D,-HbF,and-CA(carbonicanhydrase),wecan detect RhD+, HbF+, and CA- fetal RBCs in the maternal RhD-, HbF-, and CA+ blood sample.Obtained results allowto selectthe appropriate dose ofanti-D Igin the RhD prophylaxis of feto-maternal incompatibility, or to detect the cause of fetal anemia.

Expressionofantigensandtheirweakvariants,andconcentrationofspeciﬁcantibodies, canalsobeassessed.ItispossibletoobservechangesinselectedCDmoleculesduring storageof RBCunits. IfRBCs for transfusionare unavailable,due to patient'sunusual antibody speciﬁcity,some ofthe availableRBCs are opsonised, andthen phagocytosis withtherecipientmonocytesisassessed.Themicroscopictime-consumingandsubjec- tive assay is usually used. Stained CD14+ monocytes and CD235a+ erythrocytes are visible on cytograms as wellas their interaction. It makes evaluation ofphagocytosis easierand objective. Microparticlesof RBCs released during storage are also detected.

Theyare235a+.Indifferentiationofhemolysiscauses,itisimportanttomeasureosmo- ticfragility,andthatcanbealsoachievedusingFC.Flowcytometryshouldbeappliedto immunohematologicaltestingofredbloodcellsmoreoftenthannow.

*Adresdokorespondencji:ZakładImmunohematologii,CentrumMedyczneKształceniaPodyplomowego,ul.Marymoncka99/103, 01-813Warszawa,Polska.Tel.:+48225693820.

Adresemail:immunohematologia@cmkp.edu.pl(J.Fabijańska-Mitek).

ContentslistsavailableatScienceDirect

Acta Haematologica Polonica

journalhomepage:www.elsevier.com/locate/achaem

http://dx.doi.org/10.1016/j.achaem.2017.07.005

zo.o.Allrightsreserved.

(2)

powaniekomórekbiałaczkowychichłoniakowych,którema kluczowe znaczenie dla ustalenia rozpoznania, klasyﬁkacji i wyboru leczenia chorób rozrostowych. Badaniu podlega występowanie cząsteczek różnicowania CD (cluster of diffe- rentiation),które sąswoiście charakterystycznedla poszcze- gólnych stadiów hematopoezy oraz dla różnych procesów nowotworowych[1].ZapomocąFCustalasięliczbęmacie- rzystych komórek krwiotwórczych CD34+ w materiale do transplantacji (szpik, komórki z krwi obwodowej). Stosuje sięteżFC doocenyiróżnicowaniawrodzonychi nabytych neutropenii[2].Wnocnejnapadowejhemoglobinurii(NNH), mimożegłównymobjawem chorobyjesthemolizakrwinek czerwonych,ocenia sięstan granulocytówimonocytów,co umożliwiapostawienierozpoznania. Chorobowozmienione granulocytyimonocytycechujebraklubobniżonaekspresja niektórych cząstek CD umiejscowionych na kotwicy gliko- zylo-fosfatydylo-inozytolowej (GPI), której synteza w NNH jestzaburzona.Badasiętakżekrwinkiczerwoneioceniate, które nieposiadająlub mają mało inhibitorów dopełniacza CD59(MIRL–membraneinhibitorofreactivelysis)iCD55(DAF – decay acceleratingfactor), zależnych odubytku GPI [3]. We wrodzonej sferocytozie wykonuje się test EMA (od nazwy barwnika 5-maleimid eozyny), który służy do ocenybiałka prążka 3. Gdy białkojest defektowe, to wiązanie barwnika jest obniżone w stosunku do krwinek prawidłowych. Uzy- skanie wartości <75% wiązania w stosunku do krwinek kontrolnych jest ważnym kryterium rozpoznania choroby [4].

Oprócz powyższych dwóch zastosowań FC w badaniu krwinek czerwonych, inne wykonuje się w Polsce rzadko.

Niektóre z niżej opisanych powinny być upowszechnione wlaboratoriachdiagnostycznychibadawczych.

Badanie przecieku krwinek czerwonych płodu do krążenia matki (FMH – feto-maternal hemorrhage)

Wiadomo, że podczas ciąży i szczególnie podczas porodu pewnailośćkrwinekpłodowychmożedostaćsięzkrążenia dziecka do sąsiadujących w łożysku naczyń krwionośnych matki. Antygeny tychkrwinek mogą uodpornić matkęi w kolejnejciążydoprowadzićdochorobyhemolitycznejpłodu/

noworodka(ChHPN).Wzależnościodswoistościprzeciwciał, ich stężenia, podklas IgG i aktywności makrofagów płodu, hemoliza możemieć różny przebieg,ale często bywanasi- lona,ajejskutkiemjestobrzękpłodu,żółtaczkagwałtownie narastającawpierwszychdobachpoporodzie,powiększenie śledziony,wątroby iserca.Bezleczenia, głównie przetacza- niakrwiwciążyipoporodzie,możedojśćdośmiercipłodu lubnoworodka.Ze względunadużąimmunogennośćanty- genuRhDorazjegoobecnośćuponad80%ojców orazbrak

W Europie zachodniej i w Ameryce Północnej bada się obligatoryjnie kobiety RhD ujemne na obecność krwinek płodowychwichkrążeniuisprawdzasię,czyzastosowana dawka jestodpowiednia. Dodatkowo w tychkrajach wpro- wadzonoproﬁlaktykęśródciążowąpolegającąnapodawaniu Ig anty-D w okresie od 28. do 34. tygodnia i zmniejszono immunizację do 0,1%. Podstawowym badaniem FMH może być test mikroskopowy Kleihauera-Betkego (KB), w którym wykrywa się krwinki płodu HbF+ wśród krwinek matki z HbA. Hemoglobina płodowa (HbF) nie ulega elucji wśrodowiskukwaśnym,natomiastkrwinkimatkipozostają w rozmaziekrwi jako „cienie”. Wykrycie objętości krwinek większejniż2mljestwskazaniemdowykonaniabadaniaza pomocą FC. Rozpoznaje się krwinki czerwone płodu na podstawie ich różnic z krwinkami matki i może to być obecność HbF, brak anhydrazy węglanowej (carbonic anhyd- rase; CA) lub obecność jakiegoś antygenu, najczęściej RhD [5,6].

Wróżnych ośrodkachoceniano poszczególnetestycyto- metryczne, zazwyczaj porównując je z testem KB lub z drugim testem FC. Opinie nie były jednoznaczne [7, 8].

Wnaszymzakładzieprzeprowadzonobadaniaporównawcze trzech testówcytometrycznych itestu KB. Stosowanomie- szaniny krwinek kobiet z krwinkami z pępowiny o ściśle określonej procentowości i wykonywano wszystkie testy w tych samych próbkach. Uzyskane wyniki wskazały, że testy cytometryczne miały porównywalną czułość, swoi- stość, powtarzalność iodtwarzalność [9]. Jednakże,badając kobiety po porodach oraz śledząc doniesienialiteraturowe, stwierdzono występowanie przypadków, w których każdy ztestówmógłmiećograniczenia[10,11].

Stosowanieprzeciwciałanty-Dznakowanychﬂurorochro- memumożliwiawykryciewpróbcekrwiRhDujemnejmatki krwinek RhD dodatnich płodu. Nie można mieć jednak pewności, że u wszystkich matek oznaczonych jako RhD ujemne, które posiadają słaby antygen D (i zgodnie z obowiązującymi przepisami są zaliczane do RhD ujemnych),niezdarzysięwynikfałszywy,ponieważprzeciwciało może zareagować z takimi krwinkami. Z kolei jest bardzo prawdopodobne, że przeciwciała te nie wykryją nawet dużegoFMH,gdydzieckobędziemiałosłabąodmianęRhD.

Można stosować przeciwciało anty-HbF, które wykrywa krwinki płodowe.Mimo że HbFzanikastopniowo po porodzie, tojejniewielkieilościwystępująteżuosóbdorosłych.

HbF dodatnie krwinki osoby dorosłej różnią sięnajczęściej od krwinek płodu małą zawartością tej hemoglobiny i stanowią przeważnie 1–2% wszystkich erytrocytów. Poza tym osoba dorosła ma zazwyczaj krwinki czerwone o średniej objętości (MCV) ponad 20% mniejszej od MCV krwinek płodu i na cytogramie znajdują się one w innym miejscu.Zdarzasięjednak,żekrwinkipłodunieodróżniają

(3)

sięodkrwinekmatki,szczególniegdymaonahemoglobino- patię, talasemię, zespół przetrwałej hemoglobiny płodowej lub dużą populacjękrwinekHbF dodatnich oinnej, niewy- jaśnionejetiologii[10].Wówczasmożnaodróżnićjejkrwinki od krwinek płodowych, stosując przeciwciała anty-CA, bowiemanhydrazawęglanowajestenzymemujawniającym się w krwinkach czerwonych po urodzeniu (oddychanie płucami). Krwinki płodowe są HbF dodatnie i CA ujemne, a matki HbF ujemne CA dodatnie, nieliczne HbF dodatnie iCAdodatnie. Niemożnawykluczyć, żew chorobachkrwi jakaś populacja krwinek czerwonych matki będzie niepra- widłowa i dlatego CA ujemna [11]. Wniosek z badań jest w takim razie następujący: testy cytometryczne do oceny FMHsąbardzoczułe,aleczasem,choćbardzorzadko,mogą być nieswoiste. Wskazana jest możliwość wykonania wlaboratoriumwięcejniżjednegotestucytometrycznego.

Procedura znakowaniakrwinek czerwonychpłodu może byćmniejlubbardziejskomplikowana.Oznaczającantygen powierzchniowy, stosuje się przeciwciało bezpośrednio z nim reagujące. Jeżeli jest to antygen D, to można użyć gotowychsprzężonychzﬂuorochromem przeciwciałanty-D (Ryc.1).Jeżelichcesięszukaćróżnicywinnychantygenach, totrzeba użyć przeciwciałao danejswoistości, anastępnie znakowanego przeciwciała anty-IgG. W obu przypadkach krwinki pozostają żywe. Do wykrywania HbF i CA trzeba poddać krwinki utrwaleniu i permeabilizacji, czyli trzeba uczynić ich błonę komórkową przepuszczalną dla przeciw- ciał. Procedura testu możebyćopracowana w danymlabo- ratorium. Dobiera się odpowiednie roztwory, ustala ich stężenia do permeabilizacji i miareczkuje się przeciwciała dlauzyskania optymalnegorozcieńczenia.Można też kupić gotowyzestawodczynnikówzinstrukcjąkrokpokrokudla danegotestu[12].

Ocena ilościowa FMH umożliwia dobór odpowiedniej dawki Ig anty-D dla kobiet RhD ujemnych, rodzących dziecko RhDdodatnie. Dodatkowo maona znaczenie diag- nostyczne przy ustaleniu przyczyny nieoczekiwanej niedo- krwistości płodu, która może być spowodowana FMH. Jeśli wynikFMH jest ujemny,to poszukujesięinnych przyczyn np.niedokrwistościwrodzonejlub nabytej–spowodowanej patogenemhemolitycznym (parwowirus B19, paciorkowiec, laseczkazgorzeli)lubnieoczekiwanymiprzeciwciałami.Jeże- liistniejeróżnicaantygenowamiędzymatkąadawcąkrwi- nek użytych do transfuzji dopłodowej, to można ocenić efektywność transfuzji. Zazwyczaj dobiera się krwinki

O RhD ujemne, gdyż przed pierwszym przetoczeniem nie wiadomo, jaką grupękrwi ma płód. Jeżeli matka jest RhD dodatnia, to można w jej krążeniu szukać krwinekdawcy RhD ujemnych oraz HbF ujemnych i ewentualnie znaleźć przyczynę braku poprawy stanu płodu, gdy ze względu na defektłożyska zarównokrwinkiHbFdodatnieiCA ujemne płodowe jak i krwinki HbF ujemne i CA dodatnie dawcy przedostają się do krążenia matki. W takim przypadku, zależnie od okresu ciąży i stanu płodu, można podjąć decyzjęo cesarskimcięciu ileczeniunoworodkatransfuzją uzupełniającą[12].

W Polsce nie stosuje się rutynowo badania FMH. Dla ustalenia dawki Ig anty-D próbka krwi matki powinna być pobranapoupływieok.1godzinypoporodzie,podobniejak wprzypadkuposzukiwaniaprzyczynniedokrwistościnowo- rodka, w tym nieoczekiwanej śmierci noworodka. Badanie powinno sięodbyć w ciągu 2–3godzin. Jestto szczególnie ważne,gdymatkamagrupękrwiO,adzieckoAlubB,gdyż takie krwinki są niszczone przez przeciwciała anty-A lub anty-Bwjejkrążeniu.Pobraniekrwimatkidzieńlubdwapo porodzie, szczególnie gdy płód urodził się martwy i nie wiadomo, jaką miał grupę krwi, a także przechowywanie i transport doodległego laboratorium mogą być przyczyną wynikufałszywieujemnego.

Wykrywanie oraz ocena przeciwciał i antygenów

W badaniach immunohematologicznych krwinek czerwonych rutynowo stosuje się aglutynacyjne techniki serolo- giczne dowykrywaniaprzeciwciałi antygenów.Cytometrię przepływową, jako technikę bardzo czułą wprowadza się w celu wykrycia bardzo słabych reakcji. Służy ona też do ilościowejocenyprzeciwciałiobserwacjizmianwichliczbie napowierzchnikrwinkilubstężeniawsurowicy.Intensyw- ność ﬂuorescencji może być miarąliczbyprzeciwciałzwią- zanych z krwinkączerwoną np.w niedokrwistościautoim- munohemolitycznej(NAIH)[13],astworzeniekrzywejwzor- cowejdlasurowicyoznanymstężeniuIgpozwalanaocenę stężeniawinnychsurowicach,np.ukobietywciążylubdla celów produkcyjnych w surowicy immunizowanych daw- ców,np.Iganty-D[14].

FCjestjednąz nowoczesnychmetodwykorzystywanych w badaniach nad nowymi układami grupowymi oraz sła- bymiodmianamiantygenów.Stosujesięjądoposzukiwania Ryc.1–Wykrywaniekrwinekczerwonychpłoduwpróbcekrwimatkizzastosowaniemprzeciwciałanty-D,anty-HbF ianty-HbF+anty-CA(P2–krwinkipłodu)

Fig.1–DetectionoffetalRBCsinmaternalbloodsamplesusinganti-D,anti-HbF,andanti-HbF+anti-CA(P2–fetalRBCs)

(4)

(monocytemonolayerassay).Użytesąmonocytyzkrwibiorcy, które kontaktuje się z erytrocytami kolejnych dawców opłaszczonymi przeciwciałami biorcy. Reakcja zachodzi na specjalnych szkiełkach iocenia sięjąmikroskopowo. Liczy się,ileerytrocytówzostałopochłoniętychizaadherowanych przez monocyty. Wybiera się tego dawcę, którego krwinki najsłabiej reagowały z monocytami biorcy. Ograniczeniem metodyjestsubiektywnośćodczytuiniemożność odróżnie- nia na szkiełku, czy krwinki czerwone przylegające do monocytów weszły w reakcję z nimi, czy przypadkowo dotykajądonich.FCdajewtymzakresielepszemożliwości.

Dla potrzeb odczytu znakuje się monocyty swoistymi dla nichprzeciwciałamianty-CD14ierytrocytyswoistymiprze- ciwciałami anty-CD235a. Na cytogramie widoczne są od- dzielniemonocyty,erytrocytyorazmonocytyzerytrocytami.

Odczyt jest obiektywny, bez reakcji fałszywie dodatnich [17,18](Ryc.2).

Badania immunohematologiczne krwinek czerwonych przechowywanych jako jednostki koncentratów przeznaczonych do transfuzji

Od kilku lat rozważa się problem jakości koncentratów krwinekczerwonych(KKCz)w końcowym okresieichprze- chowywania (obecnie 42 dni) z leukocytami lub ﬁltrowa- nych.Prowadzi siębadaniakliniczneilaboratoryjne.Ocena erytrofagocytozyokazałasięprzydatna.Wkońcowymokre-

CD55, CD58, CD59, CG235a (GPA – glikoforyna A). Okazało się, że ekspresja CD związanych z adhezją, wymianą gazową, ochroną przed hemolizą, mierzona nasileniem ﬂuorescencjiz odpowiednimiznakowanymiprzeciwciałami, istotnie statystycznie zmieniała się w końcowym okresie przechowywania, szczególnie, gdy były to KKCz nieﬁltro- wane,czyliprzechowywanewobecnościleukocytów[19].

W badaniachnadjakościąKKCzzainteresowanieskupia siętakżenauwalnianychwtrakcieprzechowywaniamikro- cząstkach – mikropęcherzykach. Cytometria przepływowa jestbardzodobrymnarzędziemdoichwykrywaniaianalizy ilościowej[20].Wnadsączu, uzyskanympowirowaniukrwi ocenia się mikrocząstki, znakując je swoistymdla krwinek czerwonych przeciwciałem anty-CD325aidla krwinekpłyt- kowychanty-CD41.Poszukujesięmikrocząstekwśródstruk- turookreślonejwielkości,porównującjedostandardowych kulek o różnych średnicach, przeznaczonych do badań metodąFC.

Oporność osmotyczna krwinek czerwonych

Badania immunohematologiczne krwinekczerwonych mają na celu poszukiwanie przyczyn hemolizy lub sposobu jej uniknięcia. W hematologiido różnicowania przyczynskró- conego czasu przeżycia erytrocytów bada sięich oporność osmotyczną. Tradycyjnie mierzy się ją, dodając dejonizo- waną wodę do próbki zawiesiny krwinek i obserwuje się tempo zwiększania stężenia uwalnianej hemoglobiny. FC umożliwiaocenęopornościosmotycznejprzezpomiarilości pozostałycherytrocytówpohemoliziewokreślonymczasie np. co 30 sekund przez 200 lub 300 sekund. Uzyskuje się cytogramy dokumentujące przebieg hemolizy krwinek pa- cjentawodniesieniudokrwinekprawidłowych[21](Ryc.3).

Problemy techniczne

Krwinki czerwone są specyﬁcznymi komórkami, są małe w stosunku do innych komórek krwi, nie mają jądra komórkowego, mają mało organelli komórkowych i cyto- plazmy (wypełnia jehemoglobina), mająszczególny kształt i dużą elastyczność oraz błonę komórkowąbogatą w kwas sjalowynadającyimujemnyładunek,dziękiktóremuodpy- chają się. Pod wpływem zmian w środowisku reakcji, utrwalaniu, wirowaniu, stosowaniu różnych temperatur można spowodować agregację erytrocytów, używając nie- właściwychprzeciwciałaglutynację.WodczyciewFCnależy stosować skalę logarytmiczną zamiast liniowej, używanej dla krwinek białych. Przeprowadzona w 2010 roku analiza artykułów opublikowanych przez 88 zespołów Ryc.2–Cytogramzbadaniaerytrofagocytozy(P2–

monocyty,P3–erytrocyty,P4–monocytyzerytrocytami) Fig.2–Cytogramoferythrophagocytosistest(P2–monocytes, P3–erythrocytes,andP4–monocyteswitherythrocytes)

(5)

badawczych wykazała, że 75% z nich stosowało procedury znakowaniatakiejakdlakrwinekbiałych,nieuwzględniając możliwościaglutynacjiiagregacji,atym samymuzyskania fałszywychwyników[22].Wdrożeniebadańkrwinekczerwo- nych z użyciem FC jest wyzwaniem dla pracowników laboratoriówmedycznych, jednakpoichrozwiązaniu uzys- kujesięnowebardzoważnenarzędziedobadaniakrwinek czerwonychwróżnychsytuacjachklinicznych.

Wkład autorów/Authors’ contributions

Wedługkolejności.

Konﬂikt interesu/Conﬂict of interest

Niewystępuje.

Finansowanie/Financial support

Niewystępuje.

Etyka/Ethics

Treści przedstawione w artykule są zgodne z zasadami DeklaracjiHelsińskiej,dyrektywamiEUorazujednoliconymi wymaganiamidlaczasopismbiomedycznych.

pi smiennictwo/references

[1] Kopeć-SzlęzakJ.Immunofenotypowaniekomórek białaczkowychichłoniakowych.Zastosowaniew diagnostyce–przewodnik.Warszawa:FundacjaPro PharmaciaFutura;2011.

[2] PiątosaB,Klaudel-DreszlerM.Zastosowaniecytometrii przepływowejwdiagnostyceneutropenii.PostNMed 2012;25:569–575.

[3] BorowitzMJ,CraigFE,DiGiuseppeJA,IllingworthAJ,Rosse W,SutherlandDR,etal.Guidelinesforthediagnosisand monitoringofparoxysmalnocturlanhemoglobinuriaand

relateddisordersbyﬂowcytometry.CytometryB 2010;78B:211–230.

[4] Adamowicz-SalachA.Sferocytozawrodzonaudzieci– badaniadiagnostyczneipostępowanieterapeutyczne.Post NMed2013;9:646–650.

[5] CampbellTA,WareRE,MasonM.DetectionofFetal HemoglobininErythrocytesbyFlowCytometry.AnnNew YorkAcadSci1998;850:446–448.

[6] KumpelBM,MacDonaldAP,BishopDR,YatesAF,LeeE.

QuantitationoffetomaternalhaemorrhageandFcellsin unusualmaternalbloodsamplesbyﬂowcytometryusing anti-Dandanti-HbF.TransfusMed2013;23:175–186.

[7] KennedyGA,ShawR,JustS,BrysonG,BattistuttaF,Rowell J,etal.Quantiﬁcationoffeto-maternalhaemorrhage(FMH) byﬂowcytometry:anti-fetalhemoglobinlabelling potentiallyunderestimatesmassiveFMHincomparisonto labellingwithanti-D.TransfusMed2002;13:25–33.

[8] FongEA,FinlaysonJ,RobinsF,DaviesJ,JosephJ,RossiE, etal.Evaluationofanewrapidanti-HbFFITCassay, TrilliumQuickQuantfordetectionandquantitationof foetomaternalhaemorrhage.IntJLabHem2013;35:106–110.

[9] GieleżyńskaA,StachurskaA,Fabijańska-MitekJ,DębskaM, MuzykaK,KraszewskaE.Quantitativefetomaternal hemorrhageassessmentwiththeuseofﬁvelaboratory tests.IntJLabHematol2016;38:419–425.

[10] GieleżyńskaA,StachurskaA,Fabijańska-MitekJ,DębskaM, BurzyńskaB,RawaK,etal.Feto-maternalhaemorrhage assessmentinawomanwithalargepopulationofred bloodcellscontainingfetalhemoglobin.GinekolPol 2014;85:614–618.

[11] PrusE,FibachE.HeterogenityofFcellsinb-thalasemia.

Transfusion2013;53:499–504.

[12]Fabijańska-MitekJ,BochenekJantczakD,GajewskaA, WieczorekK.Konﬂiktserologicznymatczyno-płodowy.

ProﬁlaktykaIleczeniekrwiąwchorobiehemolitycznejpłodu/

noworodka(ChHPN).W:BadaniaimmunohematologiczneI organizacjakrwiolecznictwa–compendium.Warszawa:

FundacjaProPharmaciaFutura;2017.p.76–89.

[13] WangZ,ShiJ,ZhouY.Detectionofredbloodcell-bound immunoglobulinGbyﬂowcytometryanditsapplicationin thediagnosisofautoimmunehemolyticanemia.IntJ Hematol2001;2:188–193.

[14] ChristenssonM,BremmeK,ShanwellA,WestgrenM, ChristenssonB.Flowcytometricquantitationofserum anti-Dinpregnancy.Transfusion1996;36:500–505.

[15] HeliasV,SaisonC,BallifBA,PeyrardT,TakahashiJ, TakahashiH,etal.ABCB6isdispensableforerythropoiesis andspeciﬁesthenewbloodgroupsystemsLangereis.Nat Genet2012;44:170–173.

Ryc.3–Cytogramzbadaniaopornościosmotycznej Fig.3–Cytogramofosmoticfragilitytest

(6)

[19] GmerekK,Fabijańska-MitekJ.Zmianyzachodzącew krwinkachczerwonychprzechowywanychwbankachkrwi.

PostNMed2016;29:119–125.

withredcellagglutination.TransfusMedRev2010;24:

172–194.