BROMATOLOGIA
I CHEMIA TOKSYKOLOGICZNA
Czasopismo poświęcone zagadnieniom badań ochrony zdrowia i środowiska
Wersja internetowa wydawanego czasopisma jest wersją pierwotną
TOM LI 2018 Nr 4
TREŚĆ
A. Kukułowicz: Ocena jakości mikrobiologicznej wybranych wędlin . . . 239 J. Stankiewicz, A. Małkiewicz: Ocena wybranych parametrów mikrobiologicznych mlecznych
na-pojów wysokoproteinowych dostępnych na rynku Trójmiasta . . . 245 D. Mogut, I. Szerszunowicz: Kazeina mleka wybranych zwierząt hodowlanych jako prekursor
„funkcjonalnych” peptydów – analiza bioinformatyczna . . . 250 M. S. Majewski, F. Żebrowski: Wpływ wybranych aminokwasów szlaku przemian tryptofanu na
układ naczyniowy . . . 259 J. Czaja, M. Stachowicz, A. Lebiedzińska: Ocena soków owocowych, wód pitnych i mleka
spo-żywczego w aspekcie napojów izotonicznych stosowanych w sportach wytrzymałościowych 266 N. Żurek, W. Szwerc, M. Bilek, K. Słowik, R. Kocjan: Zawartość wybranych pierwiastków w tranach
płynnych dostępnych na rynku krajowym . . . 272 M. Bilek, N. Żurek, W. Szwerc, P. Staniszewski, R. Kocjan: Składniki mineralne i metale ciężkie
w butelkowanych sokach brzozowych . . . 284 G. Cichosz, H. Czeczot: Bezzasadne utożsamianie kwasów tłuszczowych izomerii trans z
nasyco-nymi, w oświadczeniach żywieniowych i zdrowotnych . . . 293 J. Brzezińska, D. Błażejewicz, M. Grembecka, J. Brzezicha-Cirocka, P. Szefer: Substancje o
dzia-łaniu antyoksydacyjnym w żywności pochodzenia roślinnego i metody ich ekstrakcji . . . 302 E. Szura, M. Misiarz, E. Malczyk, D. Pietras: Zachowania żywieniowe jako czynniki ryzyka
osteoporozy wśród wybranej grupy kobiet . . . 309 J. Żwirska, E. Błaszczyk-Bębenek, P. Jagielski, M. Bajer, M. Schlegel-Zawadzka: Porównanie
czę-stotliwości spożycia wybranych produktów żywnościowych oraz stanu odżywienia w dwukrot-nym badaniu tych samych uczniów w odstępie sześciu lat w powiecie Myślenickim . . . 313 A. Bielaszka, J. Kardas, A. Kiciak, E. Szczepańska, E. Grochowska-Niedworok, J. Romańska,
M. Kardas:Preferencje spożycia słodyczy oraz innych przekąsek wśród dzieci w wieku wcze-snoszkolnym . . . 320 M. Zołoteńka-Synowiec, B. Całyniuk, M. Jędrzejowska: Zawartość witamin i soli mineralnych
w jadłospisach realizowanych w ośrodkach lecznictwa uzdrowiskowego na terenie Kotliny Kłodzkiej . . . 325 M. Więch, M. Barańska, G. Rowicka, H. Weker:Woda w żywieniu dzieci – kryteria doboru,
wy-magania jakościowe, promocja . . . 333 K. Zujko, J. Ciżewska, M. E. Zujko: Niekonwencjonalne metody redukcji masy ciała stosowane
wśród młodzieży licealnej . . . 340 E. Jarząbska, K. Zujko, M. E. Zujko: Analiza suplementów diety stosowanych przez studentów
Uniwersytetu Medycznego . . . 345 M. Wołonciej, E. Milewska, Ł. Dębek, S. Szajda, W. Roszkowska-Jakimiec: Żelazo we krwi
Anita Kukułowicz
OCENA JAKOŚCI MIKROBIOLOGICZNEJ WYBRANYCH WĘDLIN
Katedra Towaroznawstwa i Zarządzania Jakością Uniwersytet Morski w Gdyni
Kierownik: prof. dr hab. P. Przybyłowski
Wędliny należą do produktów cieszących się dużą popularnością wśród kon-sumentów. Niestety, przetwory mięsne mogą zawierać bakterie powodujące zarówno zmiany organoleptyczne, jak też zagrażające bezpieczeństwu zdrowia. Celem badań była ocena zanieczyszczenia mikrobiologicznego wybranych wę-dlin bakteriami chorobotwórczymi. Najwyższym stopniem zanieczyszczenia mikrobiologicznego odznaczała się metka.
Słowa kluczowe: wędliny, mięso, jakość, zanieczyszczenie mikrobiologiczne. Key words: cold cuts, meat, quality, microbiological contamination.
Mięso i produkty mięsne oprócz zawartości białka o wysokiej wartości biolo-gicznej, stanowią również cenne źródło kwasów tłuszczowych, niezbędnych pier-wiastków śladowych (miedź, żelazo, jod, mangan, selen, cynk), większości witamin z grupy B i szeregu mikroelementów (1). Pojawiające się problemy związane z za-fałszowaniami, które dotykają przemysł mięsny oraz dyskusje dotyczące konse-kwencji zdrowotnych przetworzonych produktów mięsnych sprawiły, że produkcja i konsumpcja tych wyrobów budziła szereg kontrowersji. Mimo tych negatywnych opinii przetwory mięsne pozostają nadal ważne w diecie człowieka (2). Zgodnie z danymi koncernu zajmującego się badaniem opinii publicznej GfK PGD, mię-so świeże stanowi obecnie ok. 60% nabywanych produktów mięsnych, natomiast pozostałe 40% to wędliny (3). Jeszcze do niedawna o zakupie wędlin decydowała cena, obecnie konsumenci przy wyborze tych produktów coraz częściej kierują się jego jakością. Z danych wynika, że polski konsument wydaje ponad dwa razy więcej na wędliny niż na świeże mięso. Średnia miesięczna częstotliwość spożycia przetworów mięsnych osiągnęła historyczny rekord wynosząc obecnie niemal 18 razy w miesiącu (3, 4).
Mięso i produkty mięsne mogą stanowić nośnik groźnych dla zdrowia drobno-ustrojów patogennych przenoszonych przez żywność, m.in.: Campylobacter,
Sal-monella, Escherichia coli czy Staphylococcus aureus. Powszechnie wiadomo, że
żywe zwierzęta są naturalnym siedliskiem bakterii chorobotwórczych, które powo-dują skażenie tusz podczas uboju. Bakterie chorobotwórcze mogą również zanie-czyszczać mięso i jego przetwory przechodząc ze środowiska w wyniku skażenia
Nr 4
240 A. Kukułowicz
krzyżowego, następującego podczas przetwarzania lub przechowywania (5, 6, 7). W związku z powyższym, kontrola skażenia mikrobiologicznego mięsa i produktów mięsnych ma szczególne znaczenie dla bezpieczeństwa zdrowia konsumentów (7).
Celem badań była ocena zanieczyszczenia mikrobiologicznego wybranych wę-dlin bakteriami chorobotwórczymi.
MATERIAŁ I METODY
Materiał do badań stanowiło 8 różnych wędlin, których formę sprzedaży i rodzaj zestawiono w tab. I. Produkty zakupiono w sklepach na terenie Trójmiasta, a na-stępnie po przetransportowaniu do laboratorium poddawano je analizie.
Ta b e l a I. Charakterystyka materiału badanego Ta b l e I. Characteristics of the research material
Forma sprzedaży
Rodzaj wędliny/liczba próbek (n)
Kod
próbki Podstawowy skład
Pacz-kowane i plaster-kowane
Kiełbasa parzona mortadela
(n=8) MoP
Mięso drobiowe oddzielane mechanicznie, tłuszcz wieprzowy, skórki z kurcząt, woda, sól, azotyn sodu
Kiełbasa drobiowa parzona
(n=10) DrP Mięso z piersi kurcząt, woda, azotyn sodu
Pacz-kowane i porcjo-wane
Podrobowa – pasztetowa
pa-rzona (n=12) PaP
Mięso wieprzowe, woda, tłu szcz wieprzowy, wątroba wieprzowa, skórki wieprzowe, płuca wieprzowe, mięso oddzielone mechanicznie z kurczaka lub wieprzowe, azotyn sodu Kiełbasa surowa – metka
(n=10) MeP
Mięso wieprzowe i wołowe, tłuszcz wieprzowy, sól, azotyn sodu Plaster-kowane, naważa-ne przez sprze-dawcę
Kiełbasa parzona mortadela
(n=8) MoW
Mięso drobiowe oddzielane mechanicznie, tłuszcz wieprzowy, skórki z kurcząt, woda, sól, azotyn sodu
Kiełbasa drobiowa parzona
(n=10) DrW Mięso z piersi kurcząt, woda, azotyn sodu Porcjo-wane, naważa-ne przez sprze-dawcę
Podrobowa – pasztetowa
pa-rzona (n=12) PaW
Mięso wieprzowe, woda, tłuszcz wieprzowy, wątroba wieprzowa, skórki wieprzowe, płuca wieprzowe, mięso oddzielone mechanicznie z kurczaka lub wieprzowe, azotyn sodu Kiełbasa surowa – metka
(n=10) MeW
Mięso wieprzowe i wołowe, tłuszcz wieprzowy, sól, azotyn sodu
Źródło: na podstawie danych z etykiet produktów
Badane produkty poddano analizie mikrobiologicznej prowadząc oznaczenia w kierunku liczby Staphylococcus aureus oraz pałeczek Escherichia coli, jak też obecności pałeczek Salmonella sp. Analizy wykonywano na podstawie zaleceń norm PN-A-82055 i PN-A-82007. Przy analizie uzyskanych wyników posłużono się elementami statystyki opisowej, określając maksimum i minimum, wartość
śred-nią i odchylenie standardowe. W celu wyliczenia danych wartości wykorzystano arkusz kalkulacyjny Excel 2013.
WYNIKI I ICH OMÓWIENIE
Na podstawie uzyskanych wyników badań stwierdzono różny stopień zanieczysz-czenia mikrobiologicznego badanych wędlin. Wyniki przeprowadzonych analiz mi-krobiologicznych zamieszczono w tab. II. W żadnej badanej próbce nie stwierdzono obecności pałeczek Salmonella sp., których zgodnie z Rozporządzeniem Komisji (WE) nr 1447/2007 (8) nie powinno być w 25 g materiału pobranego do analizy. Obecności tych drobnoustrojów nie stwierdzili również Migowska-Calik i współpr. (9) w tradycyjnych wędlinach podrobowych, natomiast Higenyi i współpr. (10) wykryli obecność pałeczek Salmonella w badanych wędlinach drobiowych.
Ta b e l a II. Liczba drobnoustrojów obecnych w badanych produktach mięsnych Ta b l e II. The number of microorganisms present in the tested meet products
Produ-cent
Staphylococcus aureus
koagulazo-dodatnie (log10jtk/g) Escherichia coli (log10jtk/g)
SD M Min Max SD M Min Max
PaW 0,74 2,49 1,30 3,79 0,61 0,41 0 1,30 PaP 0,68 0,75 0 1,60 – 0 0 0 MeW 0,12 3,05 2,91 3,32 0,95 1,35 0 3,04 MeP 0,73 0,80 0 1,90 – 0 0 0 MoW 0,16 2,57 2,32 2,76 0,54 0,29 0 1,30 MoP 0,63 0,58 0 1,30 – 0 0 0 PoW 0,46 2,42 1,78 3,10 0,78 0,67 0 1,95 PoP 0,69 0,53 0 1,48 – 0 0 0
SD – odchylenie standardowe; M – wartość średnia; Min – wartość maksymalna; Min – wartość minimalna Źródło: badania własne
Występowanie pałeczek Escherichia coli stwierdzono tylko w badanych wędli-nach przechowywanych w ladach chłodniczych i sprzedawanych na wagę (ryc. 1). Należy przypuszczać, że ich obecność wynikać mogła z niewłaściwych praktyk higienicznych panujących w danym punkcie sprzedaży, podczas przygotowywania i przechowywania analizowanych przetworów mięsnych, co potwierdzają także dane literaturowe (11).
Najwyższy poziom E. coli (1,35 log jtk/g) stwierdzono w przypadku metki, dla której obserwowano również najwyższą wartość maksymalną wynoszącą 3,04 log jtk/g (tab. II). Występowanie pałeczek Escherichia coli w tym produkcie mógł spo-wodować brak obróbki termicznej stosowanej podczas procesu technologicznego. Mięso wykorzystywane jako główny składnik metki zostało poddane tylko zabie-gowi peklowania. Średnie wyniki uzyskane dla metki zgodnie z Rozporządzeniem Komisji (WE) nr 1447/2007 uznać można za dopuszczalne, natomiast wyniki
pozo-Nr 4
242 A. Kukułowicz
stałych przetworów mięsnych okazały się zadowalające (8). Higenyi i współpr.(10) podobnie jak Migowska-Calik i współpr. (9) w badanych produktach nie stwierdzili pałeczek Escherichia coli, jednak obserwowali obecność bakterii z grupy coli prze-kraczających poziom 3 log jtk/g (10).
Ryc. 1. Średni poziom zanieczyszczenia mikrobiologicznego badanych wędlin. Fig. 1. The average level of microbiological contamination of the tested cold cuts.
We wszystkich badanych próbkach stwierdzono występowanie Staphylococcus
aureus, a ich ilość wahała się w granicach od 0 do 3,79 log jtk/g, w zależności
od rodzaju wędlin (tab. II). Pomimo, iż w metce sprzedawanej na wagę wykaza-no najwyższy średni poziom komórek gronkowca, wywykaza-noszący 3,05 log jtk/g, to zgodnie z Rozporządzeniem Ministra Zdrowia z dnia 13 stycznia 2003 r. uzyska-ne wyniki nie przekroczyły wartości progowej 3,7 log jtk/g, dla wędlin surowych i surowo wędzonych (12). Pozostałe wyroby „na wagę”, odznaczały się obecnością tych bakterii na podobnym poziomie wynoszącym ok. 2,5 log jtk/g (ryc.1). Ponad 63% badanych pozostałych wędlin przekroczyło dopuszczalną w Rozporządzeniu wartość 2 log jtk/g (12). Stankiewicz i współpr. (13) w badanych w dniu zakupu przetworach mięsnych stwierdziły obecność S.aureus w polędwicy z piersi indyczej na poziomie > 4,48 log jtk/g, natomiast Ehrampoush i współpr. (11) w badanych kiełbasach po krojeniu wykazali gronkowce na poziomie 0,47 log jtk/g. Pomimo, iż podroby wchodzące w skład wielu gatunków wędlin (np. pasztetowej, mortadeli) mogą stanowić źródło bakterii chorobotwórczych, to Migowska-Calik i współpr. (9) nie stwierdzali występowania Staphylococcus aureus w badanych produktach regionalnych. Bardzo wysoką ilość komórek gronkowca wynoszącą od 5,25 do 7,34 log jtk/g w kiełbasach pochodzących ze sklepów obserwowali natomiast Oluwafemi i współpr. (14). Ilość komórek Staphylococcus aureus w wędlinach paczkowanych
wynosiła < 1,0 log jtk/g (tab. II). Najwyższą ilość komórek gronkowca stwierdzono dla pasztetowej oraz metki, odpowiednio – 0,75 i 0,8 log jtk/g (tab. II). Gronkowce jako bakterie względnie beztlenowe mogą dalej namnażać się w produktach pako-wanych.
WNIOSKI
1. Stwierdzono wyższe zanieczyszczenie badaną mikrofl orą wędlin sprzedawa-nych „na wagę” niż paczkowasprzedawa-nych.
2. Najwyższym stopniem zanieczyszczenia mikrobiologicznego charakteryzo-wała się kiełbasa surowa typu metka sprzedawana „na wagę”.
3. W żadnym badanym produkcie nie stwierdzono obecności pałeczek
Salmo-nella sp., natomiast wędliny paczkowane były wolne od pałeczek Escherichia coli.
4. Średnia liczebność populacji gronkowca w badanych kiełbasach parzonych oraz pasztetowych przekraczała dopuszczalne kryteria bezpieczeństwa.
A. K u k u ł o w i c z
ASSESSMENT OF MICROBIOLOGICAL QUALITY OF SELECTED COLD CUTS S u m m a r y
Introduction. Cold cuts are products of high popularity among consumers. There has been growing
tendency among consumers to select cold meats regarding their quality, not price. Unfortunately, meat preparations are characterized by the presence of bacteria which can cause signifi cant organoleptic changes in them and may also reduce their safety for consumption.
Aim. The aim of the research was to evaluate microbiological contamination of selected cold cuts
with pathogenic bacteria, which can increase health hazards for consumers.
Material and methods. Material for research constituted 40 different packed cold cut types as well
as those sold in bulk. Investigated products were subjected to microbiological analysis and marked for the presence and number of Staphylococcus aureus and Escherichia coli as well as to state the pres-ence of Salmonella sp. in them.
Results. All samples were free of Salmonella sp., however Escherichia coli was found only in cold
cuts stored in chilled counters and sold by weight. The highest level of E.coli (1,35 log cfu/g) was found in mett and the lowest level of contamination (0,29 log cfu/g) was found in parboiled cold cuts of mortadella type. The number of Staphylococcus aureus in packed cold cuts amounted to <1,0 log cfu/g. The number of Staphylococcus in cold cuts sold by weight fl uctuated between 1,3 and 3,79 log cfu/g.
Conclusions. 1. Higher level of contamination with investigated microfl ora was stated in cold cuts
sold by weight than in packed ones. 2. The highest level of microbiological contamination was found in mett sold by weight. 3. All products were free of Salmonella sp., what is more, packed cold cuts were also free of Escherichia coli. 4. Average size of staphylococcus population in investigated cold cuts exceeded the allowed criterion for health safety.
PIŚMIENNICTWO
1. De Smet S., Vossen E.: Meat: The balance between nutrition and health. A review. Meat Science, 2016; 120: 145-156. – 2. Hung Y., De Kok T.M., Verbeke W.: Consumer attitude and purchase intention towards processed meat products with natural compounds and a reduced level of nitrite. Meat Science, 2016; 121: 119-126. – 3. Mięso przegoniło wędliny. Wiadomości handlowe, www.wiadomoscihandlowe.
Nr 4
244 A. Kukułowicz
pl/drukuj pdf/artykul/7194 [2016.06.07]. – 4. Spożywcza kontrola jakości; Polacy zwracają uwagę na wędliny i mięso, które jedzą. www.portalspożywczy.pl (2017.04.28). – 5. Sánchez-Ortega I.,
García-Almendárez B.E., Santos-López E.M.,Amaro-Reyes A., Barboza-Corona J.E., Regalado C.: Antimicrobial
edible fi lms and coatings for meat andmeat products preservation. Scientifi c World J., 2014; Article ID 248935, www.dx.doi.org/10.1155/2014/248935. – 6. Sienkiewicz J.J., Marmajewska A.: Jakość mi-krobiologiczna tusz zwierząt rzeźnych oraz mięsa mielonego. Zeszyty Problemowe Postępów Nauk Rolniczych, 2013; 575: 107-118. – 7. Osimani A., Aquilanti L., Clementi F.: Microbiological quality of meat-based meals and operation of control systems within a food service environment. Int. Food Res. J., 2015; 22(4): 1692-1698. – 8. Rozporządzenie Komisji (WE) nr 1447/2007 z dnia 5 grudnia 2007 r. zmieniające rozporządzenie (WE) nr 2073/2005 w sprawie kryteriów mikrobiologicznych dotyczą-cych. – 9. Migowska-Calik A., Gomółka-Pawlicka M., Uradziński J., Wojtacka J., Lachowicz T.: Jakość mikrobiologiczna wybranych tradycyjnych polskich wędlin podrobowych wytwarzanych na terenie Pomorza. Med. Weter., 2014; 70 (11): 699-703. – 10. Higenyi J., Kabasa J.D., Muyanja Ch.: Evaluation of microbial and sensory quality of raw and processed poultry sausages from native poultry in Uganda. Int. J. Sci. Technol. Society, 2014; 2(2): 18-27, doi: 10.11648/j.ijsts.20140202.11.
11. Ehrampoush M.H., Mazloomi S.M., Zarei S., Hemmati F., Ghaneian M.T., Hajimohammadi B.,
Dehghan A.: Microbiological quality of sausage during slicing at food retail stores in Shiraz. Iran.
Int. J. Nutr. Sci., 2017; 2(1): 20-25. – 12. Rozporządzenie Ministra Zdrowia z dnia 13 stycznia 2003 r. w sprawie maksymalnych poziomów zanieczyszczeń chemicznych i biologicznych, które mogą znaj-dować się w żywności, składnikach żywności, dozwolonych substancjach dodatkowych, substancjach pomagających w przetwarzaniu albo na powierzchni żywności (DzU z dnia 4 marca 2003 r.). – 13.
Stankiewicz J., Steinka I.: Ocena wpływu rodzaju opakowania na jakość mikrobiologiczną wędlin
przechowywanych w domowych warunkach chłodniczych. Zeszyty Naukowe AM w Gdyni, 2016; 93: 64-71. – 14. Oluwafemi F., Simisaye M.T.: Extent of Microbial Contamination of Sausages sold in two Nigerian cities. Afr. J. Biomed. Res., 2006; 9: 133-136.
Jadwiga Stankiewicz, Aleksandra Małkiewicz
OCENA WYBRANYCH PARAMETRÓW MIKROBIOLOGICZNYCH MLECZNYCH NAPOJÓW WYSOKOPROTEINOWYCH
DOSTĘPNYCH NA RYNKU TRÓJMIASTA Katedra Towaroznawstwa i Zarządzania Jakością
Uniwersytet Morski w Gdyni Kierownik: prof. dr hab. inż. P. Przybyłowski
Celem pracy była ocena wpływu dodatku smakowego na wybrane parametry mikrobiologiczne mlecznego napoju wysokoproteinowego. Analizie mikrobiolo-gicznej poddano 45 próbek produktów o smaku truskawkowym, czekoladowym i bananowym. W materiale badawczym pochodzącym z placówek handlowych oznaczano ogólną liczbę bakterii mezofi lnych tlenowych, liczebność popula-cji grzybów oraz gronkowców. Próbki napojów wysokoproteinowych o smaku truskawkowym wykazały najwyższy poziom zanieczyszczenia gronkowcami koagulazododatnimi i grzybami strzępkowymi oraz najwyższą liczebność po-pulacji mezofi li tlenowych.
Słowa kluczowe: mleko, napoje mleczne, dodatki smakowe, jakość mikrobiolo-giczna.
Key words: milk, milk drinks, fl avor additives, microbiological quality.
Cenne właściwości mleka wynikają z wielu aspektów, a wśród nich najistotniej-sze to mleko jako źródło białka o dobrze zbilansowanym składzie aminokwasowym, łatwo przyswajalnego wapnia oraz witamin z grupy B. Istotnym czynnikiem żywie-niowym mleka jest przewaga pierwiastków zasadotwórczych nad kwasotwórczymi warunkująca stabilność kwasowo-zasadową krwi (1, 2, 3). Wśród bogatej gamy nowości przemysł mleczarski oferuje konsumentom zarówno mleczne napoje fer-mentowane oraz mleko wzbogacane substancjami dodatkowymi o właściwościach prozdrowotnych. Jednocześnie producenci chcąc zaspokoić oczekiwania konsumen-tów, zachowując wysoką jakość i bezpieczeństwo produkkonsumen-tów, coraz częściej stosują substancje smakowe. Jakość mikrobiologiczna fi nalnego produktu determinowana jest zarówno czystością mikrobiologiczną surowca, higieną produkcji oraz jakością stosowanych substancji dodatkowych. Wśród mikrofl ory mleka na szczególną uwa-gę zasługują pochodzące ze środowiska drobnoustroje psychrofi lne z rodzaju
Pseu-domonas, Alcaligenes, Proteus i Acinetobacter. Mikroorganizmy te mają zdolność
wytwarzania ciepłoopornych egzoenzymów, lipaz i proteaz zachowujących swoją aktywność również w mleku poddanym obróbce termicznej (4). Źródłem zakażenia mogą być także substancje smakowe dodawane do mleka poddanego termicznemu
Nr 4
246 J. Stankiewicz, A. Małkiewicz
utrwaleniu. Przykładem takiego niepożądanego działania było masowe zatrucie sy-ropem czekoladowym zainfekowanym bakteriami Yersinia enterocolitica, stosowa-nym jako dodatek smakowy do mleka UHT (5). Mleko, które w procesie produkcji poddaje się działaniu wysokiej temperatury może być także źródłem zakażenia
Staphylococcus aureus. Obróbka cieplna niszczy komórki gronkowca, jednakże
je-śli termooporna enterotoksyna została wytworzona przed zastosowaniem wysokiej temperatury mleko takie będzie stanowiło zagrożenie dla zdrowia konsumenta (6, 7, 8, 9). Biorąc powyższe pod uwagę oraz fakt, iż mleczne produkty wysokobiał-kowe stają się coraz bardziej popularne nie tylko wśród konsumentów aktywnych fi zycznie, ale również dbających o kontrolę wagi oraz zaspokojenie uczucia sytości, podjęto próbę oceny jakości mikrobiologicznej wybranych produktów mleczarskich.
MATERIAŁ I METODY
Analizie mikrobiologicznej poddano 45 próbek mlecznych napojów wysokobiał-kowych (n=45) o smaku truskawkowym (n=15), czekoladowym (n=15) i banano-wym (n=15), pochodzących od jednego producenta. W skład wszystkich napojów wchodziło mleko UHT, glikozydy stewiolowe, karagen i aromaty naturalne, nato-miast napój o smaku czekoladowym dodatkowo posiadał kakao, mono- i diglicery-dy kwasów tłuszczowych. W materiale badanym pochodzącym z różnych placówek handlowych oznaczano (OLD) ogólną liczbę bakterii psychrofi lnych i mezofi lnych tlenowych na podłożu agar odżywczy fi rmy Merck, liczebność populacji grzybów strzępkowych i drożdży na podłożu YGC z chloramfenikolem fi rmy Merck oraz gronkowców koagulazododatnich Staphylococcus aureus na podłożu selektywnym Baird-Parker RPF fi rmy bioMérieux. Inkubację psychrofi li i mezofi li tlenowych prowadzono w temp. 21°C i 30°C przez 72 godz., grzybów w 25°C przez 120 godz., natomiast gronkowców w temp. 37°C przez 48 godz. Badania mikrobiologiczne przeprowadzono w 2 powtórzeniach, tradycyjną metodą płytkową wg obowiązują-cych norm metodycznych (10, 11, 12, 13, 14). Wszystkie badania mikrobiologiczne przeprowadzano na próbkach, których dzień przydatności do spożycia wynosił mi-nimum 1 miesiąc. Analizy przeprowadzono w dniu przewiezienia zakupionych pro-duktów do laboratorium. Ponieważ próbki w miejscu ich sprzedaży eksponowane były zgodnie z zaleceniami producenta, w temperaturze pokojowej, ich transport do laboratorium nie wymagał zachowania łańcucha chłodniczego. Badania wykonano w okresie od października 2016 do maja 2017 r. Do analizy uzyskanych wyników badań zastosowano elementy statystyki opisowej tj. wartości średnich i odchyleń standardowych przy wykorzystaniu arkusza kalkulacyjnego Excel 2010.
WYNIKI I ICH OMÓWIENIE
Z analizy danych przedstawionych w tab. I. wynika, iż otrzymane wyniki badań w ramach jednego smaku próbek były rozbieżne, co może oznaczać niestabilność procesu produkcyjnego, bowiem próbki pochodziły z różnych partii produkcyjnych. Badane próbki mlecznych napojów wysokobiałkowych odznaczały się ogólną liczbą
bakterii psychrofi lnych tlenowych w 21°C na poziomie (wartości średnie) 2×101
do 2,8×102 jtk w 1 cm3. Najwyższą wartością OLD w 21°C cechowały się próbki
o smaku czekoladowym, natomiast najniższą próbki o smaku bananowym. Nie-obecność ogólnej liczny bakterii psychrofi lnych wykazywało 40% próbek o sma-ku truskawkowym, niemal 47% próbek bananowych i co piąta próbka o smasma-ku czekoladowym. Zgodnie z wymaganiami zawartymi w Rozporządzeniu Ministra Rolnictwa i Rozwoju Wsi z dnia 18 maja 2005 r. (15) ogólna liczba drobnoustro-jów w temp. 21°C w płynnych niefermentowanych produktach mlecznych powinna mieścić się w zakresie od 5×104 do 1×105 jtk w 1 cm3. Zatem wszystkie badane
próbki wysokobiałkowych napojów o smaku truskawkowym, bananowym i czeko-ladowym spełniały te wymagania. Mezofi le tlenowe w temp. 30°C w najwyższym stopniu obecne były w próbkach o smaku truskawkowym (wartość średnia 7×103
jtk/cm3), natomiast próbki o smaku bananowym i czekoladowym wykazywały
po-dobny poziom obecności OLD w 30°C, odpowiednio 4,2×101 oraz 3,9×101 jtk
w 1 cm3. Śmietana i współpr. (16) w badaniach porównawczych jakości
mikrobio-logicznej mleka pasteryzowanego i UHT zaobserwowali podobne liczebności OLD w temp. 30°C, na poziomie 1,1×101 jtk w 1 cm3. Wymagania Rozporządzenia
Mi-nistra Rolnictwa i Rozwoju Wsi z dnia 18 maja 2005 r. dotyczące liczebności OLD w 30°C określają dopuszczalną liczbę poniżej 1×102 jtk w 1 cm3. W 47% próbek
o smaku truskawkowym stwierdzono przekroczenie dopuszczalnej liczby mezo-fi li tlenowych w 30°C, przy czym w 2 badanych próbkach odnotowano znaczne przekroczenie ponad dopuszczalny limit (1×105 i 1×104 jtk/1 cm3). Wśród próbek
o smaku bananowym jedynie w dwu przypadkach stwierdzono przekroczenie limitu OLD w 30°C (2×102 jtk/1 cm3), natomiast wśród próbek o smaku czekoladowym
tylko jedna wykazała obecność tych drobnoustrojów ponad wartości dopuszczalne (3×102 jtk/1 cm3) (tab.I).
Ta b e l a I. Wartości średniej i odchylenia standardowego dla liczebności OLD w badanych próbkach w temp. 21°C i 30°C w jtk/cm3
Ta b l e I. In the tested samples Average values (x) and the standard deviations values (SD) for the number of aerobic mesophilic bacteria at 21°C i 30°C in cfu/ml
Próbki o smaku truskawkowym Próbki o smaku bananowym Próbki o smaku czekoladowym 21°C 30°C 21°C 30°C 21°C 30°C Zakres nb – 3×102 nb – 1×105 nb – 1×102 nb – 2×102 nb – 4×103 nb – 3×102 Średnia 2,7×101 7×103 2×101 4,2×101 2,8×102 3,9×101 SD 7,4×101 2,5×104 3,3×101 6,4×101 9,9×102 7,4×101
Obecność gronkowców koagulazododatnich stwierdzono w ponad połowie ba-danych próbek napojów wysokobiałkowych o smaku truskawkowym oraz w co trzeciej próbce napojów o smakach bananowym i czekoladowym. Przy czym li-czebność populacji Staphylococcus aureus w próbkach o smaku truskawkowym osiągała wyższe wartości w porównaniu do próbek o pozostałych smakach (tab. II). W Rozporządzeniu Komisji (WE) nr 1447/2007 z dnia 5 grudnia 2007 r. w sprawie kryteriów mikrobiologicznych dotyczących środków spożywczych nie określono
Nr 4
248 J. Stankiewicz, A. Małkiewicz
dopuszczalnych limitów gronkowców koagulazododatnich w mleku UHT oraz na-pojach na bazie tego mleka, jako kryterium bezpieczeństwa. Limit liczebności tych mikroorganizmów w grupie produktów mleczarskich wyznaczono jedynie dla serów produkowanych z mleka poddanego obróbce termicznej w temperaturach wyższych niż pasteryzacja (1×100 do 1×102 jtk w g produktu) (17). Uzyskane wyniki badań
liczebności Staphylococcus aureus koagulazododatnich we wszystkich badanych próbkach nie przekroczyły w/w wartości.
Ta b e l a II. Wartości średniej i odchylenia standardowego dla liczebności populacji Staphylococcus aureus w ba-danych próbkach w jtk/cm3
Ta b l e II. In the tested samples Average values (x) and the standard deviations values (SD) for the number
Sta-phylococcus aureus in cfu/ml
Próbki o smaku truskawkowym Próbki o smaku bananowym Próbki o smaku czekoladowym Zakres nb – 3×101 nb – 1×101 nb – 1×101 Średnia 9 ×100 3 ×100 3 ×100 SD 1×101 5×100 5×100
W badanym materiale analizowano także obecność grzybów strzępkowych i drożdży. Wśród wszystkich badanych próbek jedynie w materiale o smaku tru-skawkowym stwierdzono obecność grzybów strzępkowych w liczebności 2×101 jtk
w 1 cm3, wartości te dotyczyły trzech spośród analizowanych próbek. Obecności
drożdży nie stwierdzono w żadnej próbce analizowanych napojów wysokoprote-inowych.
WNIOSKI
1. Próbki napojów wysokoproteinowych o smaku truskawkowym wykazały najwyższy poziom zanieczyszczenia gronkowcami koagulazododatnimi i grzybami strzępkowymi oraz najwyższą liczebność populacji mezofi li tlenowych.
J. S t a n k i e w i c z, A. M a ł k i e w i c z
EVALUATION OF SELECTED MICROBIOLOGICAL PARAMETERS OF MILK HIGH-DRY BEVERAGES AVAILABLE ON THE TRICITY MARKET
S u m m a r y
Introduction. Due to its special properties, milk is a valuable ingredient in the daily diet of a human
being. However, consumers in the dairy segment are increasingly looking for enriched products. On the other hand, producers wanting to meet the needs of consumers, while maintaining high quality and safety of products, launch innovative products, supplemented with fl avors.
Aim. Evaluation of the infl uence of the fl avoring additive on selected microbiological parameters
of the high-protein milk drink
Material and methods. The microbiological analysis was carried out on 45 samples of strawberry,
chocolate and banana fl avors. In the research material coming from commercial establishments, the total number of mesophilic aerobic bacteria in 21 i 30°C, the number of fungi and Staphylococcus
popula-tions was determined. Microbiological tests were performed using the dilution method in accordance with the applicable standards.
Results. The mesophilic aerobic OLD reached different levels depending on the temperature of the
culture. At 30°C, it achieved the highest results in strawberry fl avored samples, while samples with other fl avors were characterized by similar levels of this group of microorganisms. The presence of fungi was found only in 7% of the samples tested. The highest degree of Staphylococcus contamination was characterized by strawberry fl avor samples.
Conclusion. Samples of strawberry-fl avored high-protein beverages showed the highest levels of
contamination with coagula-positive staphylococci and fi lamentous fungi and the highest number of aerobic mesophilic populations.
PIŚMIENNICTWO
1. Cichosz G., Czeczot H.: Żywieniowy fenomen mleka. Wyd. UWM. 2013; 76-79. – 2. Kuczyńska
B., Nałęcz-Tarwacka T., Puppel T.: Bioaktywne składniki jako wyznacznik jakości prozdrowotnej
mleka. Medycyna Rodzinna, 2013; 1: 11-18. – 3. Ziajka S.: Mleczarstwo, T.1., Wyd. 2., Wyd. UWM Olsztyn 2008; 53-76. – 4. Molenda J.: Mikrobiologia żywności pochodzenia zwierzęcego. Wyd. Uniw. Przyrodniczego we Wrocławiu, 2010; 304-307. – 5. Center for Disease Control and Prevention CDC, Notes from the Field: Yersinia enterocolitica infections Associated with Pasteurized Milk-Southwestern Pennsylvania, March-August, 2011, MMWR Morb Mortal Wkly Rep. 2011; 60: 1428. – 6. Czerwińska
E., Piotrowski W.: Potencjalne źródła skażenia mleka wpływające na jego jakość spożywczą. Rocznik
Ochrona Środowiska, Środowisko-Pomorskie Towarzystwo Naukowe Ochrony Środowiska, 2011; 13: 635-652. – 7. Maćkw E., Mąka Ł, Stasiak M., Długokęcka J.: Gronkowce koagulazododatnie w żywności. Przem. Spożywczy, 2017; 71(2): 18-21. – 8. Podkowik M., Schubert J., Bania J., Bystroń J.: Enterotoksyny gronkowcowe w żywności – nowe zagrożenia. Życie Weterynaryjne, 2015; 90(5): 310-313. – 9. Kmieciak
W., Szewczyk E.M.: Gatunki koagulazododatnie rodzaju Staphylococcus – taksonomia,
chorobotwór-czość. Post. Mikrobiol., 2017; 56(2): 233-244. – 10. PN-A-86034-13:1993, Mleko i przetwory mleczar-skie. Badania mikrobiologiczne. Staphylococcus aureus (gronkowce chorobotwórcze) – wykrywanie obecności, oznaczanie najbardziej prawdopodobnej liczby (NPL), oznaczanie liczby metodą płytkową.
11. PN-A-86034-02:1993, Mleko i przetwory mleczarskie. Badania mikrobiologiczne. Ogólne zasady badań. – 12. PN-A-86034-03:1993, Mleko i przetwory mleczarskie. Badania mikrobiologiczne. Przygo-towywanie próbek i rozcieńczeń. – 13. PN-A-86034-04:1993, Mleko i przetwory mleczarskie. Badania mikrobiologiczne. Ogólna liczba drobnoustrojów – oznaczanie metodą płytkową w temperaturze 30°C. – 14. PN-A-86034-07:1993, Mleko i przetwory mleczarskie. Badania mikrobiologiczne. Pleśnie i droż-dże – oznaczanie metodą płytkową w temperaturze 25°C. – 15. Rozporządzenie Ministra Rolnictwa i Rozwoju Wsi z dnia 18 maja 2005 r. zmieniające rozporządzenie w sprawie wymagań weterynaryjnych dla mleka oraz produktów mlecznych, Dz.U.05.96.819. – 16. Śmietana Z., Krajewska-Kamińska E.,
Bohdziewicz K., Nalepa B.: Porównanie jakości mikrobiologicznej mleka pasteryzowanego,
mikro-fi ltrowanego i UHT. Żywność. Nauka. Technologia. Jakość, 2007; 2(51): 29-39. – 17. Rozporządzenie Komisji (WE) nr 1441/2007 z dnia 5 grudnia 2007 r. zmieniające Rozporządzenie (WE) nr 2073/2005 w sprawie kryteriów mikrobiologicznych dotyczących środków spożywczych, D.U.U.E.7.12.2007.
Damir Mogut, Iwona Szerszunowicz
KAZEINA MLEKA WYBRANYCH ZWIERZĄT HODOWLANYCH JAKO PREKURSOR „FUNKCJONALNYCH” PEPTYDÓW –
ANALIZA BIOINFORMATYCZNA Katedra Biochemii Żywności, Wydziału Nauki o Żywności
Uniwersytetu Warmińsko-Mazurskiego w Olsztynie Kierownik: prof. dr hab. inż. M. Darewicz
Produkty mleczarskie są jednym z podstawowych pokarmów spożywanych przez ludzi. Rynek funkcjonalnych produktów wciąż się rozwija. Jednym z ele-mentów projektowania żywności funkcjonalnej jest analiza surowców pod kątem zawartości potencjalnie bioaktywnych peptydów za pomocą programów kom-puterowych. Narzędzie dostępne na stronie uwm.edu.pl/biochemia umożliwia wyszukiwanie peptydów o wybranej biologicznej aktywności w białkach żywno-ści. Udowodniono, że kazeina mleka owczego jest bogatym źródłem potencjalnie aktywnych peptydów, w szczególności inhibitorów DPP4 i ACE odpowiedzialnych za obniżanie poziomu glukozy we krwi oraz nadciśnienia. Kontrolowana pro-teoliza umożliwiałaby otrzymywanie produktów spożywczych wspomagających profi laktykę cukrzycy typu 2 oraz nadciśnienia tętniczego.
Hasła kluczowe: żywność funkcjonalna, kazeina, peptydy, BIOPEP-UWM. Key words: functional food, casein, peptide, BIOPEP-UWM.
Mleko jest pierwszym „funkcjonalnym” pokarmem jaki człowiek spożywa. Funkcjonalne produkty mleczarskie stanowią bardzo szeroki asortyment. Mogą one być różnie klasyfi kowane w zależności od kryteriów podziału. W literaturze można zauważyć podział żywności funkcjonalnej na dwa główne nurty:
• uwzględniające ich specyfi czny skład jak np.: probiotyczna, wzbogacana, nisko-energetyczna, wysokobłonnikowa czy o obniżonej zawartości cholesterolu; • uwzględniające pokrywania określonych potrzeb organizmu jak np.: dla osób
obciążonych stresem, sportowców, kobiet karmiących, niemowląt, osób starszych czy produkty zmniejszające ryzyko wybranych chorób.
Najczęstszym podziałem produktów mleczarskich pod względem ich właściwości prozdrowotnych jest:
• artykuły podstawowe tj. mleko spożywcze, fermentowane produkty mleczarskie, niefermentowane napoje mleczarskie, itp.);
• produkty mleczarskie o zmodyfi kowanym składzie tj.: nisko- i bezlaktozowe, hipoalergiczne, fortyfi kowane wapniem i/lub magnezem;
• funkcjonalne produkty mleczarskie z udowodnionym korzystnym wpływem na organizm np.: wzbogacone w składniki funkcjonalne tj. bakterie probiotyczne i/ lub prebiotyki) (1).
Inną metodą podejścia do zagadnienia żywności funkcjonalnej jest analiza składu makroskładników danego produktu. Mleko, w zależności od gatunku, zawiera od 3 do 6% białka (kozie 2,9, krowie 3,2, owcze 6,2%, w tym odpowiednio 2,47, 2,63 oraz 5,16% kazeiny) (2). Białka te są niezwykle cenne biologicznie. Już w 1951 r. analizowano skład aminokwasowy mleka i produktów mleczarskich. Ustalono wówczas, że białka mleka są źródłem wszystkich egzogennych aminokwasów (3). Są one zatem przedmiotem badań naukowych od ponad 60-ciu lat. Można je po-dzielić na trzy główne grupy: kazeinę, białka serwatkowe oraz białka otoczki ku-leczek tłuszczowych (4). Wśród białek mleka ilościowo dominuje kazeina. Należy ona do rodziny heterogenicznych fosfoprotein (5), różniących się zarówno składem aminokwasowym jak i stopniem ufosforylowania czy glikozylacji. Wyróżniamy następujące główne formy kazeiny: αs1, αs2, β i ϰ. W mleku znaczna część kazeiny
(95%) występuje w formie micel koloidalnych (6).
Bioaktywne peptydy pochodzące z mleka i produktów mleczarskich mogą po-wstawać w wyniku hydrolizy białek enzymami trawiennymi, fermentacji mleka przy udziale kultur starterowych, proteolizy z udziałem enzymów pochodzenia mi-krobiologicznego, roślinnego lub endogennych enzymów mleka. Najskuteczniej-szą metodą otrzymywania biopeptydów jest kombinacja enzymatycznej hydrolizy z udziałem enzymów trawiennych z fermentacją mleka za pomocą kultur startewych lub hydrolizy z wykorzystaniem enzymów mikrobiologicznych czy też ro-ślinnych (7). Niektóre bioaktywne peptydy znalazły już zastosowanie w produkcji i projektowaniu żywności jak też leków. Przykładem są produkty zawierające ka-zeinofosfopeptydy, stosowane do produkcji artykułów przeznaczonych do higieny jamy ustnej. Peptydy te wykazują również działanie przeciwnowotworowe (8).
Coraz więcej badań wskazuje na to, że produkty mleczarskie mogą być pomocne w profi laktyce wielu chorób cywilizacyjnych tj. cukrzyca typu 2 czy nadciśnienie tętnicze (9). Peptydy bioaktywne pochodzące np. z kazeiny, oddziałując z odpo-wiednimi receptorami mogą regulować funkcjonowanie organizmu (10). Peptydo-we inhibitory DPP4 (dipeptydylopeptydazy 4) oraz ACE (enzymu konPeptydo-wertującego angiotensynę) przyczyniają się odpowiednio do obniżania poziomu glukozy we krwi i ciśnienia krwi (11). Analiza badań wykonanych na pacjentach chorych na cukrzycę typu 2 oraz na populacji kontrolnej potwierdzają, że regularne spożywanie produktów mleczarskich, w tym serów dojrzewających, pozytywnie wpływało na poziom glukozy we krwi na czczo i tym samym zmniejszało ryzyko zachorowania na cukrzycę typu 2 (12). Według badań produkty mleczarskie, oprócz obniżania ciśnienia tętniczego krwi, mogą również wpływać pozytywnie na metabolizm trój-glicerydów i cholesterolu, co może wspomóc profi laktykę chorób układu krążenia (13). Badania in vitro potwierdzają, że kazeina jest prekursorem zarówno peptydów biorących udział w obniżaniu glikemii (14) jak i ciśnienia krwi (15).
Przydatnym narzędziem w rozwoju strategii produkcji żywności o fi zjologicz-nych właściwościach mogą być badania z wykorzystaniem narzędzi komputero-wych dotyczące poszukiwania białek jako prekursorów bioaktywnych peptydów. Celem pracy była analiza porównawcza składu kazein pochodzących z mleka
Nr 4
252 D. Mogut, I. Szerszunowicz
owczego, koziego i krowiego. Analiza ta umożliwi ocenienie, który surowiec może być potencjalnie najlepszy do produkcji funkcjonalnych produktów mleczar-skich.
MATERIAŁY I METODY
W bazie BIOPEP-UWM dostępnej na stronie http://www.uwm.edu.pl/biochemia w panelu „Analysis” wygenerowano profi l potencjalnej biologicznej aktywności wybranych sekwencji białek (zakładka „Profi les of proteins biological activity”) oraz obliczono częstość występowania motywów o określonej aktywności w łań-cuchu polipeptydowym białka (zakładka „A, B, Y Calculation”). Profi l potencjal-nej aktywności biologiczpotencjal-nej białka określa rodzaj, ilość i położenie występujących w białku fragmentów aktywnych. Częstość występowania fragmentów o określonej aktywności biologicznej w łańcuchu białkowym wyrażana jest parametrem A, ob-liczanym równaniem (16):
A = a/N; gdzie:
a – liczba fragmentów o danej aktywności w łańcuchu białka, N – liczba reszt aminokwasowych w łańcuchu polipeptydowym.
Sporządzono i przeanalizowano profi l potencjalnej aktywności biologicznej 12 sekwencji białkowych tj.: frakcji αs1, αs2, β i ϰ kazeiny trzech gatunków ssaków:
owcy, kozy i krowy. Sekwencje pobrano z bazy danych Uni-Prot dostępnej na stronie: https://www.uniprot.org/. Numery identyfi kacyjne poszczególnych białek: P02662, P18626, P04653, P02663, P33049, P04654, P02666, P33048, P11839, P02668, P02670, P02669 (dostęp: kwiecień 2018). Uzupełnieniem wyznaczonych profi li potencjalnej aktywności biologicznej białek było obliczenie składu amino-kwasowego poszczególnych frakcji kazein za pomocą programu ProtParam, dostęp-nego na stronie web.expasy.org (dostęp: kwiecień 2018).
WYNIKI I ICH OMÓWIENIE
W tab. I. przedstawiono wyniki analizy profi li potencjalnej aktywności biolo-gicznej poszczególnych frakcji kazeiny owczej, koziej i krowiej. Na przykładzie inhibitorów DPP4 można zauważyć, że potencjalnie najlepszym prekursorem spo-śród przeanalizowanych sekwencji białek jest owcza i kozia kazeina-β (A = 0,820). Analiza profi lu również wykazała, że najwięcej zidentyfi kowano peptydów o ak-tywności inhibitorowej wobec DPP4, ACE oraz peptydów przeciwutleniających i to niezależnie od gatunku zwierzęcia i frakcji kazeiny.
Z analizy składu aminokwasowego poszczególnych frakcji kazeiny z mleka owczego, koziego i krowiego wynika, że pomimo małych różnic w składzie jako-ściowym, to różnice w profi lu są znaczne (tab. II i III). Krowia kazeina-αs1 składa
się z 222 reszt aminokwasowych, a kozia i owcza ma po 223. Jednak w sekwen-cji krowiej kazeiny-αs1, w stosunku do koziej, występuje więcej następujących
T
abela I
.
Profile potencjalnej biologicznej aktywności analizowanych sekwencji kazeiny (parametr A) (BIOPEP
-UWM)
T
able I
.
Profiles of potential biological activity of chosen casein sequences (parameter A) (BIOPEP
-UWM) Aktywność / frakcja Kazeina-αs1 Kazeina-αs2 Kazeina-β Kazeina-ϰ owcza kozia krowia owcza kozia krowia owcza kozia krowia owcza kozia krowia Inhibitorowa DPP4 0,598 0,622 0,617 0,664 0,673 0,694 *0,820 * 0,820 0,817 0,776 0,771 0,774 Inhibitorowa ACE 0,477 0,477 0,542 0,426 0,426 0,455 0,518 0,518 0,638 0,448 0,422 0,495 Przeciwutleniająca 0,117 0,117 0,136 0,076 0,072 0,081 0,054 0,054 0,085 0,125 0,125 0,147 Stymulująca 0,089 0,079 0,084 0,085 0,085 0,086 0,086 0,086 – 0,031 0,042 0,032 Przeciwbakteryjna 0,009 – 0,028 0,018 0,018 0,054 – – – 0,010 0,010 0,058 Przeciwnowotworowa – – 0,019 – – – 0,005 0,005 0,018 – – – Immunomodulująca – 0,005 0,014 – – 0,005 0,018 0,010 0,010 0,011 Opioidowa 0,009 0,014 0,014 – – – 0,009 0,009 0,013 0,010 0,010 0,011
Aktywująca ubikwitynozależna proteolizę
0,009 0,009 0,009 0,009 0,009 0,009 0,009 0,009 0,013 0,005 0,010 0,005 Neuropeptyd 0,014 0,014 0,009 0,018 0,014 0,018 ––––––
Ligand permeazy bakteryjnej
0,005 0,005 0,005 0,014 0,014 0,014 0,005 0,005 0,005 0,005 0,005 0,005 Inhibitorowa (inne) 0,005 0,005 0,005 0,018 0,018 0,014 0,005 0,005 0,005 0,005 0,005 0,016 Antagonista opioidowy 0,005 0,005 0,005 –––––– 0,010 0,010 0,011 Przeciwamnezyjna – – 0,005 0,009 0,009 0,005 0,018 0,018 0,045 ––– Immunostymulująca 0,005 0,005 0,005 ––– 0,005 0,005 0,005 ––– Regulująca 0,005 0,005 0,005 0,009 0,009 0,005 0,014 0,014 0,027 ––– Agonista opioidowy 0,005 0,005 0,005 ––––– 0,013 ––– Przeciwzakrzepowa – – – 0,014 0,009 0,005 0,014 0,014 0,027 0,031 0,031 0,032 Skurczowa ––––––––– 0,010 0,010 0,011 Przeciwnadciśnieniowa – – – 0,018 0,018 0,014 0,005 0,005 0,005 – – 0,005 Anorektyczna –––––––– 0,005 ––– Chemotaktyczna –––––––– 0,005 ––– W iążąca ––––– 0,023 –––––– Hemolityczna ––––– 0,023 –––––– * p o g ru b io n ą c zc io n k ą z a zn a c zo n o n a jw y ż s ze w a rt o ś c i p a ra m e tr u A d la d a n e j a k ty w n o ś c i
Nr 4
254 D. Mogut, I. Szerszunowicz
T
abela
II.
Skład aminokwasowy analizowanych sekwencji białek (ProtP
aram)
T
able
II.
Amino acid composition of analyzed protein sequences (ProtP
aram) Aminokwas Kazeina-αs1 Kazeina-αs2 Kazeina-β Kazeina-ϰ krowia kozia owcza krowia kozia owcza krowia kozia owcza krowia kozia owcza A la (A ) 1 2 1 5 1 5 1 1 1 2 1 2988 1 6 1 8 2 1 A rg (R ) 676677433556 A sn (N ) 8 1 1 1 0 1 4 1 3 1 2544899 A sp (D ) 777456444477 C y s (C ) 111333111233 Gln (Q) 14 14 15 16 16 16 20 21 21 15 15 15 Glu (E) 25 20 20 24 25 25 19 19 19 12 11 11 G ly (G ) 999222555322 H is (H ) 544355555344 Ile (I) 12 10 12 12 13 12 11 11 10 13 11 11 Leu (L) 22 22 23 16 13 14 27 26 27 13 13 12 L y s (K) 15 14 15 25 25 25 12 13 13 10 9 9 M e t (M ) 666555777434 P h e (F ) 8779 1 09999777 Pro (P) 17 19 17 10 13 12 35 33 34 21 20 20 Ser (S) 16 18 19 17 14 15 16 15 14 14 14 13 Thr (T) 6 6 4 16 15 15 9 1 1 1 1 1 7 1 7 1 4 T rp (W ) 222233111111 Ty r (Y ) 1 0 1 1 1 1 1 2 1 2 1 2433999 V a l (V) 13 11 11 15 12 13 21 23 23 13 14 14 Suma 214 214 214 222 223 223 224 222 222 190 192 192
reszt aminokwasowych: kwasu glutaminowego – 5, waliny – 2, izoleucyny – 2, lizyny – 1, histydyny – 1 oraz fenyloalaniny – 1 (po myślniku podano liczbę reszt aminokwasowych). Peptydy te biorą udział w tworzeniu peptydów biologicznie aktywnych, co spowodowało, że w profi lu krowiej kazeiny-αs1 zidentyfi kowano
322 biopeptydy, natomiast w koziej o 30 sekwencji biopeptydów mniej (tab. IV). Najwięcej biopeptydów zidentyfi kowano w kazeinie-β i to niezależnie od gatun-ku zwierzęcia. Wśród analizowanych gatunków, kazeina krowia odznacza się naj-większą liczbą biopeptydów (409). Kazeina-β, niezależnie od gatunku zwierzęcia, okazała się również potencjalnie najlepszym prekursorem peptydów pomocnych w profi laktyce cukrzycy typu 2 i nadciśnienia tętniczego, co jest zgodne z dany-mi literaturowydany-mi (17). Liczba zidentyfi kowanych inhibitorów DPP4 w kazeinie-β (z mleka owczego, koziego i krowiego) wynosiła odpowiednio 184, 182 i 183, natomiast inhibitorów ACE 116, 115, 143 sekwencji.
WNIOSKI
Wszystkie biopeptydy z 4 głównych białek mleka (kazeiny αs1, αs2, β i ϰ)
otrzy-mano odpowiednio 1226, 1231 i 1375 peptydów biologicznie aktywnych dla od-powiednio kazeiny koziej, owczej i krowiej. Z tej liczby biopeptydów 77,8% sta-nowiły inhibitory DPP4 i ACE dla kazeiny krowiej oraz 49,5 i 50% odpowiednio dla owczej i koziej. Biorąc to pod uwagę oraz fakt, że w mleku owczym znajduje się prawie dwa razy więcej białka niż w krowim, można stwierdzić, iż potencjalnie najlepszym prekursorem biopeptydów funkcjonalnych może być kazeina z mleka owczego, w szczególności w otrzymywaniu produktów funkcjonalnych w profi lak-tyce cukrzycy typu 2 oraz nadciśnienia tętniczego.
Kolejnym etapem badań będzie ustalenia jaka kombinacja enzymów będzie naj-skuteczniejsza w uwalnianiu konkretnej puli biopeptydów. Badania bioinformatycz-ne, a w szczególności analiza profi li potencjalnej aktywności biologicznej białek mleka potwierdza, że są one wyjątkowo bogatym źródłem potencjalnie bioaktyw-nych peptydów. Uwolnione z nich peptydy mogą stanowić suplementy diety lub naturalne konserwanty oraz nutraceutyki. Badania w tym zakresie mogą przyczynić się do rozwoju rynku produktów funkcjonalnych o korzystnym działaniu zdrowot-nym.
Ta b e l a III. Liczba biopeptydów w profilu potencjalnej biologicznej aktywności poszczególnych frakcji kazeiny (BIOPEP-UWM)
Ta b l e III. Number of biopeptides identified in the profile of potential biological activity of given casein fraction (BIOPEP-UWM)
Gatunek Kazeina-αS1 Kazeina-αS2 Kazeina-β Kazeina-ϰ
Krowia *322* 338 409 306
Kozia 292 306 347 281
Owcza 289 307 351 284
Nr 4
256 D. Mogut, I. Szerszunowicz
T
abela I
V.
Liczba peptydów o danej aktywności zidentyfikowanych w profilu potencjalnej biologicznej aktywności [BIOPEP
-UWM]
T
able I
V .
Number of peptides of given activity identified in the profile of potential biological activity [BIOPEP
-UWM] Aktywność / frakcja Kazeina-αS1 Kazeina-αS2 Kazeina-β Kazeina-ϰ Owcza K ozia Krowia Owcza K ozia Krowia Owcza K ozia Krowia Owcza K ozia Krowia Inhibitorowa DPP4 128 133 132 148 150 154 *184 182 183 149 148 147 Inhibitorowa ACE 102 102 116 95 95 101 116 115 143 86 81 94 Przeciwutleniająca 25 25 29 17 16 18 12 12 19 24 24 28 Stymulująca 19 17 18 19 19 19 19 19 19 686 Przeciwbakteryjna 2 –644 17 – – –22 1 1 Przeciwnowotworowa – – 4 – – –11 4 ––– Immunomodulująca – 1 3 – – 1 4 222 Opioidowa 2 33 – – –22 3 222
Akt. Ub-zależna proteolizę
222222 3 2 3 121 Neuropeptyd 3 3 2 4 3 4 ––––––
Ligand permeazy bakterynej
1 1 1 333 111111 Inhibitorowa (inne) 1 1 1 44 3111113 Antagonista opioidowy 1 1 1–––––– 222 Przeciwamnezyjna – –122144 10 ––– Immunostymulująca 111 ––– 111 ––– Regulująca 11122133 6 ––– Agonista opioidowy 1 1 1––––– 3 ––– Przeciwzakrzepowa – – –32133 6666 Skurczowa – – – 222 Przeciwnadciśnieniowa – – – 44 3111 – – 1 Anorektyczna –––––––– 1 ––– Chemotaktyczna –––––––– 1 ––– W iążąca ––––– 5 –––––– Hemolityczna ––––– 5 –––––– Suma 289 292 322 307 306 338 351 347 409 284 281 306 * P o g ru b io n ą c zc io n k ą z a zn a c zo n o n a jw y ż s z ą l ic zb ę p e p ty d ó w d la d a n e j a k ty w n o ś c i
D. M o g u t, I. S z e r s z u n o w i c z
CASEIN FROM MILK OF CHOSEN LIVESTOCK AS A PRECURSOR OF “FUNCTIONAL” PEPTIDES – A BIOINFORMATIC ANALYSIS
S u m m a r y
Introduction. Dairy products are one of the basic foods consumed by people. Milk proteins are
a great potential source of biologically active peptides. These peptides can be used in functional foods. The functional products market is still growing. Bioinformatic analyses of raw materials are one of the elements of designing functional foods. The use of IT tools enables the search for potentially bioactive peptides in the structure of a protein.
Aim. The aim of the study was to analyze milk caseins of three mammalian species (bovine, ovine
and caprine) in order to obtain peptides with health-promoting effects. Selected bioinformatic tools made it possible to create profi les of potential biological activity of the four main casein fractions.
Material and methods. The bioinformatic analysis was performed with the use of the
BIOPEP-UWM tool, available on the website www.uwm.edu.pl/biochemia/index.php/pl/biopep. The sequences of the analyzed proteins were obtained from the Uni-Prot database, available at: https://www.uniprot. org/. Additionally, the amino acid compositions of the individual casein fractions were calculated using the ProtParam program, available at web.expasy.org.
Results. The profi les of potential biological activity of the individual casein fractions indicate
that ovine and caprine casein-β are potentially the best precursors of DPP4 inhibitors (parameter A = 0.820). Caseins of all three mammalian species are also good potential precursors of ACE inhibitors and antioxidant peptides. Total amounts of the biopeptides indentifi ed in the four major milk proteins (αs1, αs2, β and ϰ casein) are 1226, 1231 and 1375 of biologically active peptides for caprine,
ovine, and bovine casein respectively. From this number of biopeptides 77.8% were DPP4 and ACE inhibitors for bovine casein, and 49.5% and 50% for ovine and caprine respectively. Taking this into account together with the fact that ovine milk contains almost twice as much protein than bovine milk, it can be concluded that the best potential precursor of functional biopeptides can be caseins from ovine milk, in particular in the preparation of functional products for the prevention of type 2 diabetes and hypertension
Conclusions. The tool BIOPEP-UWM, available at uwm.edu.pl/biochemia, makes it possible to
search for biologically active peptides within food proteins. It has been proven that ovine milk caseins are rich in potentially biologically active peptides, in particularly DPP4 and ACE inhibitors responsible for lowering blood glucose level and hypertension. Controlled proteolysis would enable the preparation of functional food products supporting the prevention of type 2 diabetes and hypertension.
PIŚMIENNICTWO
1. Błaszczak A., Grześkiewicz W.: Żywność funkcjonalna – szansa czy zagrożenie dla zdrowia? Medycyna Ogólna i Nauki o Zdrowiu, 2014: 20(49), 2: 214-221. – 2. Jandal J.M.: Comparative as-pects of goat and sheep milk. Small Ruminant Research, 1996; 22(2): 177-185. – 3. Block R.J.: Some Amino Acids, Peptides and Amines in Milk, Concentrated Milks and Cheese. J. Dairy Sci., 1951; 34(1): 1-10. – 4. Farrell H.M., Jimenez-Florez R., Bleck G.T., Brown E.M., Butler J.E., Creamer L.K.,
Hicks C.L., Hollar C.M., Ng-Kwai-Hang K.F., Swaisgood H.E.: Nomenclature of the proteins of cows’
milk – Sixth revision. J. Dairy Sci., 2004; 87: 1641-1674. – 5. Chemiczne i funkcjonalne właściwości składników żywności. Red. Sikorski Z.E., Wyd. 2. Warszawa, WNT, 1996. – 6. Dziuba J., Żbikowska
A.: Enzymatic coagulation of casein micelles. Post Biochem, 1988; 34(4): 429-33. – 7. Korhonen H., Pihlanto A.: Food-derived bioactive peptides – opportunities for designing future foods. Curr. Pharm.
Des., 2001; 9: 1297-1308. – 8. Meisel H., FitzGerald R.J.: Biofunctional peptides from milk proteins: mineral binding and cytomodulatory effects. Curr. Pharm. Des., 2003; 9: 1289-1295. – 9. Lovegrove
J.A., Givens D.I.: Dairy food products: good or bad for cardiometabolic disease? Nutrition Res. Rev.,
2016; 29: 249-267. – 10. Kostyra H., Kostyra E.: Bioaktywne peptydy uwalniane z białek żywności. W: Żywność prozdrowotna, Wyd. Uniwersytetu Przyrodniczego w Poznaniu, 2014; 235-249.
11. Minkiewicz P., Dziuba J., Darewicz M., Iwaniak A., Dziuba M., Nałęcz D.: Food peptidomics. Food Technol. Biotechnol., 2008; 46: 1-10. – 12. Comerford K.B., Pasin G.: Emerging evidence for
Nr 4
258 D. Mogut, I. Szerszunowicz
the importance of dietary protein source on glucoregulatory markers and type 2 diabetes: Different effects of dairy, meat, fi sh, egg, and plant protein foods. Nutrients, 2016; 8(8): 446. – 13. Bjornshave
A., Hermansen K.: Effects of Dairy Protein and Fat on the Metabolic Syndrome and Type 2 Diabetes.
Rev. Diabet Stud., 2014; 11(2): 153-166. – 14. Uenishi H., Kabuki T., Seto Y., Serizawa A., Nakajima
H.: Isolation and identifi cation of casein-derived dipeptidyl-peptidase 4 (DPP-4)-inhibitory peptide
LPQNIPPL from gouda-type cheese and its effect on plasma glucose in rats. Int. Dairy J., 2012; 22(1): 24-30. – 15. López-Expósito I., Amigo L., Recio I.: A mini-review on health and nutritional aspects of cheese with a focus on bioactive peptides. Dairy Sci. Technol., 2012; 92(5): 419-438. – 16. Minkiewicz P.,
Dziuba J., Iwaniak A., Dziuba M., Darewicz M.: ‘BIOPEP database and other programs for processing
bioactive peptide sequences’. J. AOAC Int, 2008; 91(4): 965-980. – 17. Iwaniak A.: Analiza zależności między strukturą peptydów pochodzących z białek żywności a ich aktywnością inhibitorową wobec enzymu konwertującego angiotensynę. Ocena przydatności metod in silico w badaniach nad białkowymi prekursorami bioaktywnych peptydów. Wyd. UWM, Olsztyn, 2011.
Michał Stanisław Majewski, Filip Żebrowski
WPŁYW WYBRANYCH AMINOKWASÓW SZLAKU PRZEMIAN TRYPTOFANU NA UKŁAD NACZYNIOWY
Katedra Farmakologii i Toksykologii Wydziału Lekarskiego Uniwersytetu Warmińsko-Mazurskiego w Olsztynie
Kierownik: prof. dr hab. med. A. Rynkiewicz
Oceniono wpływ wybranych aminokwasów szlaku kinureninowego (L-trypto-fan, L-kinurenina, 3-hydroksy-L-kinurenina) na funkcje motoryczne izolowanych odcinków tętnicy piersiowej szczura. Aktywna naczyniowo okazała się jedynie L-kinurenina w stężeniach powyżej 10–5 M. Inkubacja pierścieni naczyń aorty
w obecności L-kinureniny (10–5 M, 60 min) miała zdecydowany wpływ na funkcje
motoryczne naczyń, co przejawiało się obniżoną odpowiedzią na rozkurczowe działanie acetylocholiny. Wskazuje to na udział innych związków, jakie mogą powstawać w naczyniach krwionośnych pod wpływem L-kinureniny w czasie trwania inkubacji.
Słowa kluczowe: 3-hydroksy-L-kinurenina, L-kinurenina, L-tryptofan. Key words: 3-hydroxy-L-kynurenine, L-kynurenine, L-tryptophan.
L-Tryptofan należy do aminokwasów egzogennych niezbędnych do syntezy białek. W organizmie człowieka ulega trzem przemianom: (I) dekarboksylacji z utworzeniem tryptaminy, (II) hydroksylacji do 5-hydroksytryptofanu i dalszym przekształceniem do serotoniny oraz (III) rozerwania pierścienia indolowego, co prowadzi do powstania aminokwasów L-kinureniny i 3-hydroksy-L-kinureniny oraz produktu końcowego – niacyny. Z puli tryptofanu aż 94% jest metabolizowane na drodze szlaku kinureninowego w wątrobie (1).
Dopiero kiedy odkryto, że podanie niektórych metabolitów L-kinureniny do mó-zgu szczurów powodowało drgawki i zmiany w zachowaniu zwierząt, wzrosło zain-teresowanie znaczeniem metabolitów tryptofanu w różnych procesach chorobowych (2, 3, 4, 5). W badaniach in vivo udowodniono, że zarówno tryptofan, jak i pierwszy metabolit tryptofanu L-kinurenina podane obwodowo, obniżają ciśnienie tętnicze krwi u szczurów oraz działają depresyjnie na mięsień sercowy i mięśnie gładkie. W badaniach prowadzonych na izolowanych pierścieniach aorty piersiowej szczura, L-kinurenina, w stężeniach znacznie przekraczających fi zjologiczne powodowała rozkurcz naczyń aorty (6).
Komórki śródbłonka naczyniowego syntetyzują związki, takie jak: tlenek azo-tu, prostacyklinę PGI2, tlenek węgla, nadtlenek wodoru oraz kwas
epoksyeikoza-Nr 4
260 M. S. Majewski, F. Żebrowski
trienowy, o znanym już działaniu rozszerzającym naczynia. Z kolei do substancji o działaniu kurczącym naczynia, powstających również w komórkach śródbłonka zaliczamy tromboksan A2, prostaglandynę H2 oraz endotelinę typu 1. Związki te,
działają miejscowo i odgrywają istotną rolę w utrzymaniu prawidłowego napięcia naczyń i kontroli ciśnienia tętniczego (7).
Celem pracy było określenie wpływu wybranych aminokwasów szlaku przemian tryptofanu: L-tryptofanu, L-kinureniny oraz 3-hydroksy-L-kinureniny jako poten-cjalnych związków aktywnych naczyniowo, w badaniach reaktywności izolowanych pierścieni tętnicy piersiowej szczura.
MATERIAŁ I METODY
Wszystkie czynności związane z wykonywaniem doświadczeń na zwierzętach zostały przeprowadzone w sposób respektujący normy prawne obowiązujące na terenie Rzeczypospolitej Polskiej za zgodą lokalnej komisji etycznej do spraw do-świadczeń na zwierzętach (NR 06/2014) oraz zgodnie z dyrektywami Unii Euro-pejskiej (2010/63/EU).
Szczury rasy Wistar (masa 250–300 g) w liczbie 8 sztuk, przebywały przez co najmniej 14 dni (minimum aklimatyzacyjne) w warunkach zapewniających im do-brostan: standaryzowany cykl światło/ciemność 12h/12h (07:00–19:00 h), z nie-ograniczonym dostępem do wody i karmy (standardowa karma dla gryzoni) i stałej temp (23±2°C).
Po eutanazji (CO2) i dyslokacji kręgów, aorta piersiowa została ostrożnie
wy-izolowana, oczyszczona z tkanki łącznej, a następnie przygotowano 8 pierścieni naczyń o dł. 3–4 mm. Tak otrzymane fragmenty naczyń aorty, umieszczano na specjalnych haczykach ze stali nierdzewnej, przewieszone przez światło naczynia w komorach inkubacyjnych, zawierających 5 cm3 buforu Krebsa-Henseleita (KH).
Jeden koniec był przytwierdzony do ściany komory, natomiast drugi był podłączony do przetwornika (F30, TAM-A typ 705/1, HugoSachs Elektronik, Germany) w celu pomiaru skurczów izometrycznych.
Każdorazowo przed doświadczeniem naczynia poddawano 60 min stabilizacji, w 5 cm3 komorach tkankowych, w zmodyfi kowanym buforze KH, w celu pokonania
stresu mechanicznego i osiągnięcia, ustalonego wcześniej napięcia spoczynkowe-go. Roztwór przez cały czas trwania doświadczenia był napowietrzany mieszaniną karbogenu o składzie 95% O2 i 5% CO2 oraz utrzymywany w temp. 37°C, co
zapewniało pH na poziomie ok. 7,4. Bufor KH był zmieniany średnio co 15 min i zastępowany świeżym buforem, w celu wyeliminowania powstających ewentu-alnie metabolitów, które mogłyby mieć wpływ na pracę analizowanych pierścieni naczyń aorty.
Doświadczenie było przeprowadzone w obecności sprawnego śródbłonka. Śród-błonek uznano za nienaruszony, gdy rozszerzenie pierścienia aorty po podaniu ace-tylocholiny (ACh, 10–5 M) wynosiło powyżej 70%.
W pierwszej części doświadczenia, badano ewentualny rozkurczowy wpływ wybranych aminokwasów szlaku przemian kinureniny. W tym celu, izolowane
fragmenty aorty były najpierw poddawane działaniu agonisty receptora alfa adre-nergicznego, noradrenaliny (NA, 10–7 M) oraz chlorku potasu (KCl, 30 mM –
zablo-kowanie hyperpolaryzacji) w celu wywołania skurczu analizowanych fragmentów aorty. Następnie wzrastające stężenia kumulacyjne (10–8–10–4 M) badanych
amino-kwasów były bezpośrednio podawane do komór inkubacyjnych, w celu wywołania rozkurczu pierścieni aorty.
W drugiej części doświadczenia, część izolowanych pierścieni aorty była inku-bowana przez 60 min w najmniejszym stężeniu badanego związku, jakie wywarło działanie rozkurczowe na izolowane pierścienie aorty (stężenie określone w pierw-szej części doświadczenia). Pierścienie aorty nie poddane inkubacji z udziałem badanych związków stanowiły grupę kontrolną. Następnie analizowano zmiany w funkcjonowaniu naczyń pod wpływem KCl (30 mM), NA (10–7 M) i
wzrastają-cych stężeń kumulacyjnych acetylocholiny (ACh, 10–10–10–5 M).
Wyniki wyrażono w postaci średnich arytmetycznych i średnich standardowych błędów pomiarów (±S.E.M.), z co najmniej 6 niezależnych powtórzeń. Analiza statystyczna danych była dokonana za pomocą programu GraphPad Prism wersja 7,0. Do analizy statystycznej uzyskanych wyników zastosowano test t dla prób niezależnych i ANOVA (analiza wariancji), uzupełniony testem post-hoc (test Sidak).
WYNIKI I ICH OMÓWIENIE
Badania prowadzone wcześniej wskazują, iż w warunkach in vivo po podaniu tryptofanu, dochodzi do rozszerzenia naczyń krwionośnych za pośrednictwem ak-tywacji szlaków cyklazy adenylanowej i wzrostu cAMP oraz cyklazy guanylanowej w obecności sprawnego śródbłonka (8, 9, 10). Opisane działanie jest wynikiem powstania kinureniny w obecności enzymu przekształcającego tryptofan.
Wyniki naszych badań wskazują, że L-kinurenina (10–5 M) podana bezpośrednio
do komór inkubacyjnych, rozszerzyła izolowane pierścienie aorty poddane wcze-śniejszemu działaniu noradrenaliny, jak również działaniu chlorku potasu (ryc. 1). Minimalne stężenie L-kinureniny, przy którym doszło do rozszerzenia izolowa-nych pierścieni aorty na poziomie powyżej 20% wynosiło 10–4 M i było ok. 100
razy wyższe od fi zjologicznego, natomiast korespondowało ze stężeniem, osią-gniętym in vivo w naczyniach mózgowych zakażonych myszy (sepsa wywołana wstrzyknięciem lipopolisacharydu 7,5 mg/kg i.p.) czy ex vivo w tętnicach wieńco-wych poddanych wcześniejszemu działaniu IFN-γ (5, 10). Stężenie, które wywołało działanie na naczynia, było znacznie niższe od opisanego przez Lapin i Umanskaia (11), wynoszącego 10–2 M (200 μg w 0,1 mL), natomiast korespondowało z
opi-sanym w badaniach prowadzonych przez Wang i współpr. (10) oraz Sakakibara i współpr. (6), którzy zanotowali je na poziomie powyżej 10–4 M.
L-Kinurenina wywołała również rozszerzenie pierścieni aorty poddanych wcze-śniejszemu działaniu chlorku potasu, na poziomie zbliżonym do działania zaobser-wowanego w przypadku noradrenaliny.
Przeprowadzone badania wskazują również na brak bezpośredniego wpływu L-tryptofanu i 3-hydroksy-L-kinureniny na izolowane naczynia krwionośne.
Nr 4
262 M. S. Majewski, F. Żebrowski
Ryc. 1. Efekt działania wzrastających stężeń L-tryptofanu, L-kinureniny i 3-hydroksy-L-kinureniny (10–8–10–4 M) na obkurczone pierścienie aorty piersiowej szczura. Wyniki (średnia±S.E.M., n=8) wyrażono
jako procent wywołanego rozkurczu naczyń krwionośnych po wcześniejszym podaniu noradrenaliny (NA, 10–7 M) i chlorku potasu (KCl, 30 mM), *p≤0,05 (dwuczynnikowa ANOVA/Sidak).
Fig. 1. The effect of increasing concentrations of L-tryptophan, L-kynurenine and 3-hydroxy-L-kynurenine (10–8–10–4 M) on precontracted aortic rings. Results (mean±S.E.M., n=8) are expressed as a percentage
of inhibition of the contraction induced by noradrenaline (NA, 10–7 M) and potassium chloride (KCl, 30
mM), *p≤0.05 (two-way ANOVA/Sidak).
W drugiej części doświadczenia, inkubacja w obecności L-kynureniny (10–5 M,
60 min) nie wpłynęła w sposób statystycznie istotny na siłę skurczu pierścieni na-czyn aorty wywołaną poprzez podanie noradrenaliny (10–7 M) czy chlorku potasu
(30 mM), p>0,05. Siła skurczu wywołanego przez noradrenalinę wyniosła: kontrola negatywna, L-kyn (-) 114±5,17% natomiast w obecności L-kinureniny, L-kyn (+) 125,2±5,12%, względem KCl (30 mM) przyjętego jako 100% (ryc. 2). W dalszej części doświadczenia, inkubacja w obecności L-kinureniny (10–5 M, 60 min),
ob-niżyła w sposób statystycznie znamienny rozkurcz wywołany działaniem acetylo-choliny (10–10–10–5 M) (ryc. 3). Wartość siły rozkurczu po podaniu ACh była na
poziomie 73,89±1,46% w grupie kontrolnej, nie poddanej działaniu L-kinureniny, L-kyn (-) i 34,78±3,52% w obecności L-kinureniny, L-kyn (+) p<0,001.
Powyższe dane wskazują, że w wyniku ekspozycji na działanie L-kinureniny, pierścienie aorty wyprodukowały i uwolniły związek, który mógł być antagonistą receptorów cholinergicznych i który może pochodzić z komórek śródbłonka. Związ-kiem tym wydaję się być kwas kinureninowy, który jest metabolitem kinureniny,
Ryc. 2. Zależność stężenie-odpowiedź po podaniu noradrenaliny. Pierścienie aorty były inkubowane w obecności L-kinureniny, L-kyn (+) (10–5 M, 60 min) lub bez, L-kyn (-) jako grupa kontrolna. Następnie,
w obu przypadkach działanie noradrenaliny było analizowane. Wyniki (średnia±S.E.M., n=8) przedsta-wiono w odniesieniu do skurczu indukowanego chlorkiem potasu (KCl, 30 mM), wyrażone jako 100%, p>0,05 (test t dla prób niezależnych).
Fig. 2. The concentration-response effect to noradrenaline. Aortic rings were incubated with L-kynu-renine, L-kyn (+) (10–5 M, 60 min) or without, L-kyn (-) as a control. Next, in both cases the response
to noradrenaline (10–7 M) was analyzed. Results (mean±S.E.M., n=8) are expressed as a percentage of
contraction induced by potassium chloride (KCl, 30 mM), expressed as reference value of 100%, p>0.05 (unpaired t test).
Ryc. 3. Skumulowane krzywe stężenie-odpowiedź powstałe w wyniku podania acetylocholiny. Izolo-wane pierścienie aorty były inkuboIzolo-wane w obecności L-kinureniny, L-kyn (+) (10–5 M, 60 min) lub bez,
L-kyn (-) jako grupa kontrolna. Następnie, w obu przypadkach działanie acetylocholiny (10–10–10–5 M)
było analizowane. Wyniki (średnia±S.E.M., n=8) wyrażono jako procent wywołanego rozkurczu naczyń krwionośnych po wcześniejszym podaniu noradrenaliny (10–7M), *p≤0,05 (dwuczynnikowa
ANOVA/Sidak).
Fig. 3. The cumulative concentration-response curves to acetylcholine. Aortic rings were incubated with L-kynurenine, L-kyn (+) (10–5 M, 60 min) or without, L-kyn (-) as a control. Next, in both cases
the response to acetylcholine (10–10–10–5 M) was analyzed. Results (mean±S.E.M., n=8) are expressed
as a percentage of relaxation after being precontracted with noradrenaline (10–7 M), *p≤0.05 (two-way
![[2014/Nr 1] Pełna wersja czasopisma/The entire magazine](data:image/gif;base64,R0lGODlhAQABAIAAAP///wAAACH5BAEAAAAALAAAAAABAAEAAAICRAEAOw==)