Index of /rozprawy2/11404

Pełen tekst

(1)AKADEMIA GÓRNICZO-HUTNICZA IM. STANISŁAWA STASZICA W KRAKOWIE. Wydział Fizyki i Informatyki Stosowanej. Rozprawa doktorska. Agnieszka Dróżdż Dyscyplina: Fizyka. Wykorzystanie zaawansowanych metod spektroskopowych do badania wpływu nanocząstek tlenków żelaza na organizmy żywe (The advanced spectroscopic methods in the study of the iron oxide nanoparticles influence on living organisms). Promotor: dr hab. inż. Joanna Chwiej Promotor pomocniczy: dr inż. Katarzyna Matusiak. Kraków, 2018.

(2) -2-.

(3) Oświadczenie autora rozprawy: Oświadczam, świadoma odpowiedzialności karnej za poświadczenie nieprawdy, że niniejsza pracę doktorską wykonałam osobiście i samodzielnie i nie korzystałam ze źródeł innych niż wymienione w pracy.. …………………………………………………… Data, podpis autora. Oświadczenie promotora rozprawy: Niniejsza rozprawa jest gotowa do oceny przez recenzentów.. …………………………………………………… Data, podpis promotora rozprawy. -3-.

(4) -4-.

(5) Pragnę złożyć serdeczne podziękowania: Pani dr hab. inż. Joannie Chwiej za opiekę naukową, poświęcony czas, nieocenioną pomoc oraz cierpliwość i życzliwość podczas realizacji niniejszej pracy. Pani dr inż. Katarzynie Matusiak za ogromną pomoc na etapie badań i w trakcie powstawania niniejszej rozprawy oraz za miłą atmosferę pracy. Pani dr hab. Zuzannie Setkowicz-Janeczko oraz mgr Małgorzacie Ciarach z Zakładu Neuroanatomii Instytutu Zoologii i Badań Biomedycznych UJ w Krakowie za opiekę nad zwierzętami eksperymentalnymi oraz realizację wszystkich procedur prowadzonych z ich użyciem. Pani dr inż. Aldonie Kubali-Kukuś oraz mgr Ilonie Stabrawie z Laboratoriu Metod Rentgenowskich UJK w Kielcach za ogromną i życzliwą pomoc w przeprowadzeniu pomiarów metodą spektroskopii TXRF. Dr Christophowi Snadtowi oraz dr Ferencowi Borondicsowi z linii SMIS Synchrotronu SOLEIL w Saint Aubin (Francja) za pomoc w trakcie pomiarów metodą mikrospektroskopii FTIR. Panu prof. dr hab. Piotrowi Warszyńskiemu oraz mgr Anecie Kędrze z Instytutu Katalizy i Fizykochemii Powierzchni PAN im. Jerzego Habera w Krakowie za uprzejmą pomoc w wykonaniu badań metodą DLS i w pomiarze potencjału zeta. Panu dr Michałowi Sarnie z Wydziału Biochemii, Biofizyki i Biotechnologii UJ w Krakowie za pomoc w przeprowadzeniu pomiarów metodą DLS. Panom dr inż. Danielowi Horákowi oraz dr inż. Michalowi Babičowi z Instytutu Chemii Makromolekularnej Akademii Nauk Republiki Czeskiej w Pradze za wykonanie i udostępnienie do badań nanocząstek tlenku żelaza (III) pokrytych D-mannitolem. Panu dr inż. Przemysławowi Wachniewowi z Katedry Zastosowań Fizyki Jądrowej WFiIS AGH za udostępnienie mineralizatora SpeedWave4. Krakowskiemu Konsorcjum „Materia-Energia-Przyszłosć” za wsparcie w formie stypendium w ramach dotacji KNOW.. im.. Mariana. Smoluchowskiego. Pragnę również gorąco podziękować mojemu mężowi Piotrowi, Rodzicom oraz Bliskim za zrozumienie, wsparcie i motywację.. -5-.

(6) -6-.

(7) Spis treści 1.. Wstęp ........................................................................................................................................ - 9 -. 2.. Cele i zakres pracy ................................................................................................................. - 11 -. 3.. Nanocząstki tlenków żelaza – aktualny stan wiedzy .......................................................... - 12 -. 4.. 5.. 3.1.. Definicja nanomateriałów i nanocząstek.......................................................................... - 12 -. 3.2.. Charakterystyka nanocząstek tlenków żelaza .................................................................. - 12 -. 3.3.. Badania toksyczności nanocząstek w warunkach in vivo a in vitro ................................. - 16 -. 3.4.. Farmakokinetyka i biodystrybucja nanocząstek tlenków żelaza w organizmie żywym .. - 17 -. 3.5.. Metabolizm nanocząstek tlenków żelaza w organizmie żywym ..................................... - 19 -. 3.6.. Potencjalna toksyczność nanocząstek tlenków żelaza ..................................................... - 20 -. 3.7.. Zastosowania nanocząstek tlenków żelaza ...................................................................... - 22 -. Materiał badawczy ................................................................................................................ - 25 4.1.. Specyfikacja stosowanych nanocząstek ........................................................................... - 25 -. 4.2.. Procedury przygotowania roztworów nanocząstek do podania in vivo ........................... - 25 -. 4.3.. Charakterystyka zwierząt eksperymentalnych ................................................................. - 26 -. 4.4.. Wybór narządów .............................................................................................................. - 27 -. 4.5.. Procedury pobierania narządów ....................................................................................... - 27 -. 4.6.. Preparatyka próbek ........................................................................................................... - 28 -. 4.6.1.. Przygotowanie próbek do pomiaru metodą spektroskopii TXRF............................. - 28 -. 4.6.2.. Przygotowanie próbek do pomiaru metodą mikrospektroskopii FTIR .................... - 31 -. Metody badawcze .................................................................................................................. - 32 5.1.. Spektroskopia TXRF ........................................................................................................ - 32 -. 5.1.1.. Podstawy fizyczne metody ....................................................................................... - 32 -. 5.1.2.. Wykorzystanie spektroskopii TXRF w badaniach biomedycznych ......................... - 39 -. 5.1.3.. Aparatura................................................................................................................... - 41 -. 5.1.4.. Warunki pomiarowe.................................................................................................. - 43 -. 5.1.5.. Oznaczanie zawartości pierwiastków w narządach .................................................. - 43 -. 5.1.6.. Walidacja procedur analitycznych ............................................................................ - 47 -. 5.2.. Mikrospektroskopia FTIR ................................................................................................ - 53 -. 5.2.1.. Podstawy fizyczne metody ....................................................................................... - 53 -. 5.2.2.. Wykorzystanie mikrospektroskopii FTIR w badaniach biomedycznych ................. - 67 -. 5.2.3.. Aparatura i warunki pomiarowe ............................................................................... - 69 -. 5.2.4.. Analizowane pasma oraz parametry biochemiczne .................................................. - 70 -. 5.2.5.. Półilościowa analiza zawartości głównych makromolekuł biologicznych ............... - 72 -. 5.3.. Analiza statystyczna uzyskanych wyników ..................................................................... - 74 -7-.

(8) 6.. Wyniki..................................................................................................................................... - 76 6.1.. Zmiany zachodzące w narządach zwierząt poddanych działaniu PEG-IONP ................. - 76 -. 6.1.1.. Zmiany w stężeniach wybranych pierwiastków ....................................................... - 76 -. 6.1.2.. Dyskusja wyników .................................................................................................... - 80 -. 6.2.. Zmiany zachodzące w narządach zwierząt poddanych działaniu M-IONP ..................... - 84 -. 6.2.1.. Zmiany w stężeniach wybranych pierwiastków ....................................................... - 84 -. 6.2.2. Długofalowe zmiany w zawartości i strukturze biomolekuł w wybranych narządach zwierząt po podaniu M-IONP.................................................................................................. - 89 6.2.3.. Dyskusja wyników .................................................................................................... - 97 -. 6.3. Porównanie biodystrybucji i odpowiedzi organizmu na podanie PEG-IONP i M-IONP w warunkach in vivo...................................................................................................................... - 100 7.. Podsumowanie ..................................................................................................................... - 102 -. 8.. Materiały dodatkowe ........................................................................................................... - 105 -. 9.. Spis rysunków ...................................................................................................................... - 114 -. 10. Spis tabel............................................................................................................................... - 117 11. Bibliografia ........................................................................................................................... - 119 12. Dorobek naukowy ................................................................................................................ - 133 12.1. Publikacje ....................................................................................................................... - 133 12.2. Referaty .......................................................................................................................... - 134 12.3. Postery ............................................................................................................................ - 135 12.4. Granty ............................................................................................................................. - 136 12.5. Uczestnictwo w projektach pomiarowych ..................................................................... - 137 -. -8-.

(9) 1. Wstęp W ostatnich dekadach obserwuje się ogromny postęp w technologii produkcji i rozwoju nanomateriałów, które znajdują zastosowanie w coraz to nowych dziedzinach życia i nauki. Wśród nanomateriałów, bardzo obiecujące dla zastosowań biomedycznych są nanocząstki (ang. nanoparticles, NP), które najczęściej definiuje się jako obiekty o średnicy mieszczącej się w zakresie 1 – 100 nm [1]. NP mogą posiadać unikalne właściwości fizyczne, chemiczne, strukturalne oraz magnetyczne. Największy potencjał do zrewolucjonizowania klinicznych metod diagnostycznych i terapeutycznych przypisuje się nanocząstkom magnetycznym (ang. magnetic nanoparticles, MNP), które mogą być stosowane jako kontrasty w obrazowaniu magnetyczno-rezonansowym (ang. Magnetic Resonance Imaging, MRI) czy też nośniki leku umożliwiające jednoczesne monitorowanie jego dystrybucji w terapii celowanej. Ponadto, pobudzone zewnętrznym polem magnetycznym MNP mogą indukować lokalną hipertermię, która selektywnie niszczy komórki nowotworowe [2]–[5]. Ze względu na rozmiary porównywalne ze strukturami komórkowymi, NP mogą z łatwością pokonywać naturalne bariery biologiczne chroniące organizm i w konsekwencji powodować niepożądane skutki zdrowotne [6], [7]. Co więcej, biorąc pod uwagę złożoność układów in vivo, oddziaływanie nanocząstek z komponentami, takimi jak komórki lub białka, może prowadzić do unikalnych biodystrybucji, klirensu, odpowiedzi immunologicznej i metabolizmu tych nanoobiektów. Stąd coraz większą wagę przykłada się do oceny potencjalnego ryzyka związanego z ekspozycją organizmów żywych na działanie NP [8]. Pomimo licznych badań dotyczących nanotoksyczności, aspekty związane z szeroko pojętym bezpieczeństwem nanotechnologii pozostają daleko w tyle w porównaniu z tempem rozwoju tej dziedziny nauki. Wciąż istnieje nisza w obszarze badań dotyczących związku między fizycznymi i chemicznymi własnościami nanocząstek, a biologiczną odpowiedzią na ich podanie [6], [8], [9]. Z kolei, z punktu widzenia ulepszenia funkcjonalności nanocząstek, niezwykle istotne jest również określenie biodystrybucji i farmakokinetyki NP po ich podaniu do organizmu [10]. Obecnie większość badań, dotyczących niepożądanych skutków działania nanocząstek, prowadzona jest na hodowlach komórkowych. W literaturze naukowej można znaleźć wiele opracowań na temat toksyczności NP w warunkach in vitro, jednak wciąż istnieje duże zapotrzebowanie na badania dotyczące zachowania i działań ubocznych nanocząstek w warunkach in vivo [8], [11]. Znaczenie takich badań jest ogromne, przede wszystkim ze względu na często wykazywany brak spójności pomiędzy wynikami uzyskanymi w eksperymentach przeprowadzanych na liniach komórkowych, a skutkami obserwowanymi po podaniu nanocząstek do organizmu [8], [12]. Istotnym elementem badań in vivo są testy wykonywane na zwierzętach, które dają możliwość oceny wpływu NP na cały organizm [8], [11], [13]. Ze względu na przewidywaną biokompatybilność, biodegradowalność oraz łatwość syntezy, najintensywniej badanymi MNP są obecnie nanocząstki tlenków żelaza (ang. iron oxide nanoparticles, IONP) [14], [15]. Jak dotąd badania dotyczące toksyczności IONP były prowadzone dla dawek porównywalnych lub dużo większych niż klinicznie stosowane u ludzi [2], [14], [16]–[18]. Wciąż brakuje opracowań dotyczących oddziaływania na organizm niższych, niż obecnie stosowane, dawek IONP, które mogą chociażby imitować przypadkowe narażenie na nanocząstki. Co więcej, prowadzone dotąd badania ograniczały się głównie do analizy zmian histopatologicznych, -9-.

(10) funkcjonalnych czy mutacji genetycznych w narządach narażonych na działanie NP [10], [16], [17]. Niezbędne wydaje się zatem uzupełnienie wiedzy na temat zmian zachodzących na poziomie molekularnym w tkankach organizmów poddanych działaniu IONP. Takie możliwości stwarzają, niestosowane jak dotąd w badaniach dotyczących nanotoksyczności, metody spektroskopii fluorescencji rentgenowskiej całkowitego odbicia (ang. total reflection X-ray fluorescence, TXRF) oraz mikrospektroskopii w podczerwieni z transformatą Fouriera (ang. Fourier transform infrared spectroscopy, FTIR), które dostarczają informacji na temat zmian pierwiastkowych i biochemicznych w badanych próbkach.. - 10 -.

(11) 2. Cele i zakres pracy Niniejsza praca miała na celu weryfikację możliwości wykorzystania nowoczesnych metod spektroskopowych, jakimi są spektroskopia TXRF i mikrospektroskopia FTIR, do oceny wpływu nanocząstek tlenków żelaza na organizmy żywe. Wymienione wcześniej aspekty dotyczące właściwości i potencjalnych zastosowań nanocząstek stanowiły motywację do podjęcia badań nad zmianami pierwiastkowymi i biochemicznymi zachodzącymi w wybranych narządach zwierząt poddanych działaniu IONP w warunkach in vivo.. 1. 2.. 3. 4.. 1. 2. 3.. 4. 5.. Za główne cele niniejszej pracy doktorskiej przyjęto: ocenę zmian pierwiastkowych zachodzących w wybranych narządach zwierząt poddanych działaniu wybranych IONP w różnych okresach czasowych od ich podania; ocenę biodystrybucji i potencjalnych działań niepożądanych wybranych IONP podanych w warunkach in vivo na podstawie uzyskanych wyników oraz w oparciu o istniejącą wiedzę na temat zachowania nanocząstek w organizmie i procesów towarzyszących ich akumulacji w tkankach; porównanie biodystrybucji i odpowiedzi biologicznej na podanie badanych rodzajów IONP w warunkach in vivo; analizę długofalowych zmian w zawartości i strukturze głównych makromolekuł biologicznych w wątrobie i nerkach po podaniu IONP. Zakres niniejszej pracy doktorskiej obejmuje: podsumowanie aktualnego stanu wiedzy na temat właściwości, biodystrybucji, farmakokinetyki i metabolizmu dożylnie podanych IONP; badania prowadzone na zwierzętach poddanych działaniu wybranych IONP w warunkach in vivo; wykorzystanie dwóch rodzajów nanocząstek tlenków żelaza: nanocząstek magnetytowych pokrytych glikolem polietylenowym oraz nanocząstek maghemitowych pokrytych D-mannitolem; badania prowadzone z zastosowanie niskich dawek badanych IONP; wykorzystanie nowoczesnych metod spektroskopowych (spektroskopii TXRF oraz mikrospektroskopii FTIR), dostarczających informacji o składzie pierwiastkowym i biomolekularnym tkanek.. - 11 -.

(12) 3. Nanocząstki tlenków żelaza – aktualny stan wiedzy Nanocząstki tlenków żelaza cieszą się obecnie szczególnym zainteresowaniem w zastosowaniach biomedycznych, co wynika m.in. z niskich kosztów ich produkcji, łatwości syntezy czy też własności superparamagnetycznych [15]. W procesie produkcji IONP możliwie jest wprowadzanie modyfikacji powierzchni tj. pokrycie organiczną otoczką czy dołączenie powierzchniowych ligandów, co wpływa na ich biokompatybilność, stabilność w roztworze i poszerza liczbę możliwych zastosowań [19]. Mimo ciągłych postępów w dziedzinie nanotechnologii, dotyczących przede wszystkim syntezy i funkcjonalizacji nanoobiektów, wdrożenie nanocząstek tlenków żelaza do praktyki biomedycznej nie może odbyć się bez uprzedniego zbadania ich potencjalnego toksycznego wpływu na organizmy żywe.. 3.1. Definicja nanomateriałów i nanocząstek Zgodnie z zaleceniem Komisji Europejskiej termin „nanomateriały” powinien być używany w odniesieniu do każdego naturalnie lub przypadkowo wytworzonego materiału, w którym co najmniej 50% cząstek, znajdujących się w stanie niezwiązanym, zaglomerowanym lub zagregowanym, posiada przynajmniej jeden z przestrzennych wymiarów mieszczący się w zakresie 1-100 nm [1]. Szczególnym przypadkiem nanomateriałów są nanocząstki, które najczęściej definiuje się jako obiekty o symetrii sferycznej, których średnica nie przekracza 100 nm [20], [21]. Należy zaznaczyć, że przytoczone definicje nie uwzględniają metody pomiaru rozmiarów nanoobiektów, podczas gdy wyniki takich pomiarów mogą znacząco różnić się w zależności od wybranej techniki. Średnica geometryczna nanocząstek, określona zwykle przy użyciu elektronowej mikroskopii transmisyjnej (ang. transmission electron microscopy, TEM), może być nawet o 50% mniejsza od średnicy hydrodynamicznej wyznaczonej z wykorzystaniem metody dynamicznego rozpraszania światła (ang. dynamic light scattering, DLS) i uwzględniającej cząsteczki nośnika związane do powierzchni nanoobiektu [22]. Z punktu widzenia badań nad zachowaniem NP w układach biologicznych, w których zwykle mamy do czynienia z nanocząstkami zawieszonymi w płynnym medium, można założyć, że średnica hydrodynamiczna lepiej odzwierciedla „funkcjonalne” wymiary obiektów oraz pozwala trafniej przewidzieć ich zachowanie zarówno w warunkach in vitro jak i in vivo [23].. 3.2. Charakterystyka nanocząstek tlenków żelaza Do nanocząstek tlenków żelaza najczęściej wymienianych w kontekście zastosowań biomedycznych, należą magnetyt (Fe3O4) oraz maghemit (γ-Fe2O3). Magnetyt, czyli tlenek żelaza (II,III), zawiera trzy atomy żelaza, z których dwa występują w formie Fe3+, a jeden atom w formie Fe2+ [24]. Tlenek ten absorbuje promieniowanie elektromagnetyczne w zakresie promieniowania ultrafioletowego, widzialnego oraz w podczerwieni, stąd posiada kolor czarny [25], [26]. W środowisku wodnym bądź też w obecności tlenu i w wysokiej temperaturze magnetyt utlenia się do tlenku żelaza (III), czyli maghemitu [24]–[26]. Maghemit natomiast posiada dwa atomy żelaza w formie Fe3+ i wykazuje bardzo słabą absorpcję promieniowania widzialnego powyżej 700 nm, dlatego barwa preparatów γ-Fe2O3 najczęściej przybiera odcień czerwonobrunatny [24], [25]. - 12 -.

(13) Nanocząstki tlenków żelaza, zarówno magnetytowe jak i maghemitowe, przejawiają pewne właściwości typowe dla wszystkich NP. Miniaturyzacja materiałów makroskopowych do cząstek o średnicy rzędu 10-9 m wiąże się ze znacznym zwiększeniem wartości stosunku pola powierzchni do objętości (ang. surface area to volume ratio, SVR). Wzrost wartości SVR przekłada się na obserwowaną dla nanocząstek dominację efektów powierzchniowych nad ogólnym zachowaniem materiału, a w szczególności na podniesienie reaktywności chemicznej nanocząstek w porównaniu do ich odpowiedników makroskopowych [8], [27], [28]. Badania dotyczące potencjalnych zastosowań IONP najczęściej skupiają się na tzw. superparamagnetycznych nanocząstkach tlenków żelaza (ang. superparamagnetic iron oxide nanoparticles, SPION) [29]–[32]. Superparamagnetyzm to rodzaj magnetyzmu występujący w nanocząstkach zbudowanych z materiałów ferromagnetycznych lub ferrimagnetycznych, których średnica mieści się w zakresie od kilku do kilkudziesięciu nanometrów [15], [33]. Nanocząstki typu SPION są strukturami jednodomenowymi, co w prostym przybliżeniu oznacza, że całkowity moment magnetyczny cząstki (krystalitu) może być traktowany jako jeden moment magnetyczny, będący sumą momentów magnetycznych pochodzących od poszczególnych atomów tworzących NP [20], [33]– [35]. W przypadku pojedynczych krystalitów orientacja magnetyzacji może łatwo ulec zmianie pod wpływem energii termicznej, co w praktyce prowadzi do ciągłej fluktuacji kierunków momentów magnetycznych SPION [33]. W konsekwencji takie nanocząstki zachowują się jak paramagnetyki tzn. nie posiadają remanencji (namagnesowania występującego po usunięciu zewnętrznego pola magnetycznego), a ich koercja (wielkość zewnętrznego pola magnetycznego jakie należy przyłożyć, aby usunąć pozostałą magnetyzację) jest równa zeru [15], [20], [25], [33], [35]. Jednak w odróżnieniu od paramagnetyków, nanocząstki superparamagnetyczne posiadają znacznie większą podatność magnetyczną [33], [34]. Krytyczny rozmiar średnicy NP, warunkujący pojawienie się właściwości superparamagnetycznych, zależy od rodzaju materiału rdzenia, a w szczególności od jego składu chemicznego, struktury krystalicznej i morfologii [20], [35]. W przypadku tlenków żelaza Fe3O4 oraz γ-Fe2O3 superparamagnetyzm występuje, kiedy wielkość średnicy rdzenia nanocząstki jest mniejsza niż 20 nm [25]. Na rysunku Rys. 1 przedstawiono zależność wielkości pola koercji cząstki od jej średnicy oraz poglądowe porównanie zachowania cząstki ferromagnetycznej oraz superparamagnetycznej w zależności od obecności zewnętrznego pola magnetycznego [35]. Należy podkreślić, że właściwości superparamagnetyczne nanocząstek są szczególnie pożądane z punktu widzenia zastosowań biomedycznych, gdyż zerowa remanencja nanoobiektów typu SPION sprawia, że nie aglomerują one w roztworach na skutek przyciągania magnetycznego [36], [37].. - 13 -.

(14) Rys. 1 (a) Zależność pola koercji cząstki od jej średnicy; d s – granica superparamagnetyczna, dc – granica przejścia między strukturą wielodomenową i jednodomenową. (b) Cząstka ferromagnetyczna i superparamagnetyczna w zewnętrznym polu magnetycznym. Czerwona strzałka wskazuje kierunek zewnętrznego pola magnetycznego, natomiast czarne strzałki symbolizują kierunki momentów magnetycznych w cząstkach. Na podstawie [35].. Podstawowym wymaganiem stawianym nanocząstkom typu SPION, przeznaczonym do aplikacji biomedycznych, jest ich biokompatybilność [16], [38]–[40]. Pojęcie biokompatybilności oznacza nie tylko brak toksyczności, immunogenności czy kancerogenności, ale również zdolność do zachowania funkcjonalności po wprowadzeniu do systemu biologicznego [38], [41], [42]. Można ją osiągnąć przez zastosowanie odpowiednich otoczek polimerowych wykonanych z materiałów biodegradowalnych, które pozwalają zmienić właściwości powierzchni rdzenia [38], [42]. Pokrycie NP otoczką zapobiega ich aglomeracji w roztworach wodnych i w krwioobiegu, zwiększając tym samym ich stabilność. Zapewnia ono również hydrofilowość powierzchni oraz umożliwia funkcjonalizację, poprzez dołączenie do niej różnych ligandów tj. np. leki, izotopy promieniotwórcze, wirusy [38], [42]–[44]. Jednym z najpopularniejszych polimerów stosowanych do syntezy otoczek jest glikol polietylenowy (ang. polyethylene glycol, PEG) [34], [38], [42], [44]–[48]. PEG powstaje w wyniku katalizowanej zasadowo polimeryzacji tlenku etylenu z udziałem wody, monoetylenoglikolu lub glikolu dietylenowego [38]. Wzory strukturalny i cząsteczkowy powstającego w ten sposób produktu przedstawiono na rysunku Rys. 2 [49].. Rys. 2 Wzory strukturalny (a) oraz cząsteczkowy (b) glikolu polietylenowego. Litera „n” oznacza liczbę jednostek tlenku etylenu, która mieści się w zakresie 4-120. Na podstawie [49].. Glikol polietylenowy jest polimerem rozpuszczalnym w wodzie, toluenie, chloroformie a także w innych polarnych i niepolarnych rozpuszczalnikach [50], [51]. Ponadto, PEG zapewnia hydrofilowość pokrytych nim struktur, poprawiając w ten sposób ich rozpuszczalność [51]. Istotną, z punktu widzenia interakcji ze środowiskiem biologicznym, właściwością tego polimeru jest rozpuszczalność w błonach komórkowych [50]. Stan skupienia PEG w temperaturze pokojowej zależy od jego masy cząsteczkowej, a twardość polimeru w stanie stałym rośnie wraz z jego masą molową [52]. - 14 -.

(15) Unieruchomienie PEG na powierzchni nanocząstki odbywa się przez jego wiązanie kowalencyjne lub fizyczną adsorpcję, jednak ze względu na większą trwałość pokrycia preferuje się pierwsze rozwiązanie [50], [51], [53]. Duża ruchliwość glikolu polietylenowego na powierzchni nanocząstki prowadzi do wykluczenia sterycznego, zapobiegając w ten sposób agregacji NP w roztworze i zwiększając ich stabilność koloidalną [42], [50], [51]. Nanocząstki tlenku żelaza pokryte PEG wykazują stabilność koloidalną przez jeden do czterech miesięcy [54], [55]. Co więcej, PEG zapobiega opsonizacji pokrytych nim nanoobiektów, polegającej na dołączeniu do ich powierzchni immunoglobulin lub białek dopełniacza umożliwiających rozpoznanie nanocząstek jako ciał obcych przez układ immunologiczny [21], [50], [51], [56]. W efekcie opsonizacji hydrofobowe nanocząstki bez otoczki są szybko wychwytywane przez makrofagi systemu fagocytarnego znajdującego się m.in. w wątrobie i śledzionie [50]. Glikol polietylenowy chroni NP przed wychwytem w systemie siateczkowo-śródbłonkowym i w ten sposób wydłuża czas ich cyrkulacji w krwioobiegu, co stanowi zaletę istotną z punktu widzenia zastosowań biomedycznych [42], [51]. Dodatkowo, PEG redukuje przyleganie płytek krwi do nanocząstek, formowanie skrzepów, zmniejsza aktywność hemolityczną oraz ogranicza aktywację neutrofili, co również wpływa na osłabienie odpowiedzi immunologicznej [42], [57]. Mimo, iż PEG jest powszechnie stosowanym materiałem zapewniającym biokompatybilność nanocząstek w zastosowaniach biomedycznych, polimer ten może wywołać reakcję nadwrażliwości immunologicznej poprzez aktywację układu dopełniacza [56], [58]. Ponadto ze względu na powszechne występowanie substancji pokrytych PEG w lekach, kosmetykach i przetworzonych produktach żywnościowych zaobserwowano w ostatnim czasie wzrost częstości występowania przeciwciał PEG u zdrowych ludzi [59]. Częste dożylne podawanie nanocząstek pokrytych PEG może stymulować układ odpornościowy do wytwarzania specyficznych przeciwciał PEG IgM, co znacznie skraca okres półtrwania takich nanoobiektów w organizmie [53]. Kolejnym związkiem chemicznym, który wykazuje duży potencjał jako pokrycie nanocząstek, jest D-mannitol. Substancja ta to polihydroksylowy alkohol cukrowy, łatwo rozpuszczalny w wodzie, acetonie oraz innych alkoholach takich jak metanol, izopropanol, czy butanol [60]. Wzory strukturalny oraz cząsteczkowy D-mannitolu przedstawiono na rysunku Rys. 3 [61].. Rys. 3 Wzory strukturalny (a) oraz cząsteczkowy (b) D-mannitolu. Na podstawie [61].. D-mannitol jest biologicznie obojętny co oznacza, że w organizmie nie ulega metabolizmowi. Jedynie niewielki odsetek (2-3%) tego alkoholu znajdujący się w krwioobiegu podlega w wątrobie przemianie metabolicznej do glikogenu i dwutlenku węgla [62]–[64]. Ok 77-97% dożylnie podanego D-mannitolu zostaje wydalone z moczem po 24 godzinach od wstrzyknięcia [64]. Roztwory wodne D-mannitolu stosuje się w medycynie klinicznej do zmniejszenia ciśnienia wewnątrzczaszkowego - 15 -.

(16) w urazach głowy czy zwiększenia wydalania moczu przy zatruciach oraz skąpomoczu [65], [66]. W dziedzinie nanotechnologii D-mannitol znalazł jak dotąd zastosowanie w syntezie mikrosfer służących jako nośniki nanocząstek chitozanowych, zapewniający ich homogeniczny rozkład w całej objętości mikrocząstki [67]–[70]. Mikrosfery tego typu, dzięki swoim aerodynamicznym właściwościom, wykazują powinowactwo do układu oddechowego oraz są biokompatybilne z liniami komórkowymi nabłonka oskrzelowego i nabłonka pęcherzyków płucnych. Wysoka rozpuszczalność D-mannitolu zapewnia uwolnienie nanocząstek ze zbudowanych z niego kapsułek niezwłocznie po ich dotarciu do płuc [67], [70]. Dzięki swojej niskiej toksyczności i degradowalności, po wniknięciu do organizmu, mikrosfery D-mannitolowe stanowią obiecujący nośnik dla systemu dostarczania leków w terapiach chorób układu oddechowego [67]–[71].. 3.3. Badania toksyczności nanocząstek w warunkach in vivo a in vitro Większość badań dotyczących toksyczności nanocząstek jest prowadzona w warunkach in vitro [10], [72], [73]. Jest to podyktowane przede wszystkim mniejszymi kosztami prowadzenia hodowli komórkowych, niskim stopniem skomplikowania takiego systemu, a także krótkim czasem trwania eksperymentu oraz niewielkimi wymaganiami związanymi z kwestią etyki badań [10], [72]. Badania in vitro umożliwiają ocenę parametrów życiowych komórek poddanych działaniu NP w tym ich aktywności metabolicznej i żywotności. Ich zaletą jest także możliwość kontrolowania i odtwarzania warunków eksperymentalnych, co istotnie zwiększa powtarzalność otrzymywanych wyników [74]. Eksperymenty prowadzone na hodowlach komórkowych nie uwzględniają niestety komunikacji pomiędzy komórkami, między komórkami a środowiskiem zewnętrznym, procesów hormonalnych czy udziału makrofagów, które występują w warunkach in vivo [6], [73]. Stąd też zestawienie wyników uzyskanych dla różnych linii komórkowych poddanych działaniu NP in vitro może dać zupełnie inny obraz zachowania niż prezentowany przez komórki tych samych tkanek in situ [12], [73]. Nie mniej jednak badania in vitro dostarczają mechanistycznych informacji na temat toksyczności nanocząstek, w szczególności ich genotoksyczności, cytotoksyczności, możliwości indukcji stresu oksydacyjnego czy rozwoju procesów zapalnych, stanowiących cenne uzupełnienie wiedzy w dziedzinie nanotoksyczności [6]. Układy in vivo cechują się wysokim stopniem skomplikowania, a w związku z tym oddziaływanie nanoobiektów z różnymi strukturami biologicznymi, jak komórki czy białka, może skutkować unikatowymi dla różnych typów nanocząstek biodystrybucją, metabolizmem, odpowiedzią immunologiczną czy sposobem usuwania [6], [72], [73]. Dlatego też testy prowadzone z wykorzystaniem modeli zwierzęcych, pozwalają znacznie trafniej ocenić związek pomiędzy fizykochemicznymi właściwościami NP, a wywołaną przez nie odpowiedzią w układach biologicznych [6], [73]. Metody badania toksyczności nanocząstek w warunkach in vivo opierają się przede wszystkim na ocenie ich biodystrybucji, farmakokinetyki i dróg usuwania z organizmu, a także określeniu parametrów hematologicznych i chemicznych krwi oraz zmian histopatologicznych u zwierząt poddanych działaniu NP [72]. Co ważne, poznanie zależności pomiędzy właściwościami nanocząstek, a wywołaną przez nie w warunkach in vivo reakcją może pozwolić na stworzenie prognostycznego modelu oceny ich toksyczności [73].. - 16 -.

(17) 3.4. Farmakokinetyka i biodystrybucja nanocząstek tlenków żelaza w organizmie żywym Farmakokinetyka oraz biodystrybucja nanocząstek stanowią ważne parametry, których znajomość umożliwia zarówno zminimalizowanie toksyczności stosowanych nanoobiektów, będącej skutkiem ich niepożądanej dystrybucji lub zachowania w organizmie, jak i zwiększenie oczekiwanej funkcjonalności IONP w wybranym narządzie lub obszarze organizmu [75]. Pod pojęciem farmakokinetyki nanocząstek rozumie się szybkość ich rozpoznawania i usuwania przez układ odpornościowy, a także metabolizowania i wydalania z organizmu. Natomiast biodystrybucja to parametr określający ilość i sposób rozmieszczenia IONP w różnych narządach i tkankach w trakcie lub po ich zastosowaniu in vivo [10]. Obydwa te parametry są ściśle związane z fizykochemicznymi właściwościami wśród których można wymienić średnicę hydrodynamiczną, rodzaj zastosowanego pokrycia, czy ładunek powierzchniowy nanocząstek [10], [50], [76]. Najczęściej stosowanym sposobem podawania IONP, szczególnie w przypadku ich aplikacji jako magnetycznych środków kontrastowych, jest iniekcja dożylna (ang. intravenous, i.v.) [10]. Istotnym parametrem z punktu widzenia farmakokinetyki i biodystrybucji zaaplikowanych dożylnie nanocząstek jest czas ich półtrwania w krwioobiegu, czyli czas po jakim stężenie podanych IONP we krwi spadnie do połowy swojej wartości początkowej na skutek ich eliminacji z organizmu [10], [77]. Dla IONP czas ten wynosi zwykle od kilku minut do kilkudziesięciu godzin, przy czym im większa średnica hydrodynamiczna nanocząstek tym krócej pozostają one w krwioobiegu ze względu na efektywniejszy wychwyt w wątrobie [10], [76], [78], [79]. Czas półtrwania w krwioobiegu wydłużają dodatkowo modyfikacje powierzchni nanocząstek, w szczególności stosowanie pokryć zapobiegających opsonizacji IONP [10], [38]. Wartości tego parametru silnie zależą także od stosowanych dawek IONP i rosną wraz ze wzrostem zaaplikowanej dawki [10]. Dożylnie podane nanocząstki są selektywnie wychwytywane przez wątrobę i śledzionę, które stanowią główną ścieżkę usuwania IONP z organizmu. Obydwa te organy uczestniczą w formowaniu układu fagocytarnego (ang. mononuclear phagocytic system, MPS), nazywanego również systemem siateczkowo-śródbłonkowym (ang. reticuloendothelial system, RES) [10], [80]. Na MPS składają się krążące we krwi monocyty oraz makrofagi zlokalizowane w różnych narządach, takich jak wątroba, śledziona, węzły chłonne, szpik kostny, płuca i mózg [81], [82]. Wśród wyspecjalizowanych makrofagów znajdują się m.in. obecne w naczyniach zatokowych wątroby komórki Kupffera, komórki mikrogleju występujące w mózgu, a także makrofagi zasiedlające wtórne narządy limfatyczne, do których zaliczyć można śledzionę, a konkretnie strefy miazgi czerwonej oraz marginalną tego narządu [82], [83]. Obecne w wymienionych tkankach makrofagi, poprzez fagocytozę lub angażowanie dodatkowych makrofagów z krwioobiegu, oczyszczają organizm z patogenów, uszkodzonych i starych komórek a także z ciał obcych, w tym IONP [82], [84]. W przypadku podania wysokich dawek IONP makrofagi wątroby i śledziony wyłapują jedynie część nanocząstek znajdujących się w krwioobiegu, pozostałe natomiast mogą gromadzić się w innych zawierających makrofagi tkankach, takich jak tkanka płucna lub tłuszczowa [85]. Wychwyt w wątrobie i śledzionie jest poprzedzony opsonizacją nanocząstek, czyli doczepieniem do ich powierzchni białek znajdujących się w osoczu krwi, które umożliwiają ich rozpoznanie oraz fagocytozę przez makrofagi układu MPS [86], [87]. Podstawowymi czynnikami warunkującymi biodystrybucję i farmakokinetykę nanocząstek są ich rozmiar oraz rodzaj zastosowanej otoczki. IONP o średnicy hydrodynamicznej powyżej 100 nm są - 17 -.

(18) najefektywniej wychwytywane przez komórki Kupffera, przy czym dominującym mechanizmem ich eliminacji jest fagocytoza [37], [88]. W przypadku IONP zaprojektowanych tak, aby dłużej pozostawały w krwioobiegu (jest to związane z ograniczeniem ich wychwytu przez komórki Kupffera), zwiększenie wychwytu obserwuje się w śledzionie [89]. Można to wyjaśnić, wynikającym z przyłączania protein obecnych w osoczu lub agregacji, zwiększeniem średnicy hydrodynamicznej takich IONP do wartości przekraczających 200 nm. Nanocząstki otoczone zapobiegającym opsonizacji pokryciem np. PEG, mogą natomiast przedostać się przez pory (100-200 nm) zatokowych naczyń krwionośnych wątroby do przestrzeni okołozatokowej (tzw. przestrzeni Dissego) oraz ulec akumulacji w hepatocytach [10]. Podobnie, IONP o średnicy hydrodynamicznej poniżej 100 nm wykazują tendencję do akumulacji w hepatocytach, jednak te mogą być także wychwytywane przez makrofagi na drodze endocytozy receptorowej [10], [90]. Internalizacja nanocząstek o średnicy hydrodynamicznej mniejszej niż 20 nm w wątrobie i śledzionie następuje na drodze pinocytozy przez makrofagi obecne w tych narządach [10], [58], [90]. Istotną rolę w usuwaniu NP o średnicy hydrodynamicznej poniżej 15 nm odgrywa z kolei filtracja nerkowa [91]–[93]. Nanocząstki takie mogą akumulować się w naczyniach włosowatych oraz tętniczkach doprowadzających i odprowadzających krew z kory nadnerczy, lecz najprawdopodobniej nie ulegają wychwytowi w kłębuszkach nerkowych [10], [94]–[96]. Odpowiednio pokryte IONP, mogą również pokonać barierę krew-mózg (ang. blood-brain barier, BBB) i przedostać się do centralnego układu nerwowego [97]. W odróżnieniu od pozostałych narządów i tkanek, komórki śródbłonka naczyń krwionośnych znajdujących się w mózgu są ze sobą ściśle połączone dzięki występowaniu na ich powierzchni astrocytów. Zapewnia to minimalną przepuszczalność BBB dla toksyn, molekuł hydrofobowych oraz patogenów, a transport substancji niezbędnych do funkcjonowania tkanki nerwowej odbywa się na drodze dyfuzji poprzez dwuwarstwę lipidową otaczającą komórki śródbłonka [80]–[82]. Bariera ta może zostać pokonana przez pokryte kopolimerem zbudowanym z chitozanu i PEG IONP o średnicy hydrodynamicznej do 30 nm. Wynika to m.in. z charakterystycznej dla PEG wysokiej rozpuszczalności w tłuszczach, która zwiększa przepuszczalność śródbłonka naczyń krwionośnych dla IONP, oraz z małego rozmiaru hydrodynamicznego zastosowanych nanocząstek [97]. Istotną właściwością IONP, która również wpływa na ich oddziaływanie z białkami i błonami organizmu oraz farmakokinetykę, jest ładunek powierzchniowy. Rutynowo, do określenia wielkości ładunku powierzchniowego, stosuje się parametr zwany potencjałem zeta (wyrażany w jednostkach miliwolt, mV), który jest wyznaczany na drodze pomiaru ruchliwości elektroforetycznej IONP, czyli szybkości ich przemieszczania się w polu elektrycznym [10], [92], [98]. Nanocząstki o obojętnym ładunku powierzchniowym są znacznie wolniej wychwytywane przez narządy układu fagocytarnego, a co za tym idzie dłużej pozostają w krwioobiegu [44], [92], [99]. Przykładowo, czas półtrwania we krwi IONP pokrytych dekstranem o średnicy hydrodynamicznej 35 nm i obojętnym ładunku powierzchniowym (Ferrumoxtram-10) był równy od 24 do 36 godzin, podczas gdy w przypadku podobnych nanocząstek o ujemnym ładunku wynosił między 10 a 14 godzin [37], [100]. Z kolei dodatnio naładowane nanocząstki są usuwane z krwioobiegu szybciej niż te o negatywnym ładunku powierzchniowym, ponieważ znacznie efektywniej adsorbują białka obecne w osoczu, a co za tym idzie są wydajniej wychwytywane przez makrofagi oraz błony innych komórek [92], [101], [102]. Sposób i tempo usuwania IONP z krwioobiegu jest niezwykle skomplikowanym procesem, który zależy od kombinacji wielu parametrów. Stąd, niezwykle istotna jest dokładna znajomość - 18 -.

(19) własności stosowanych IONP, dzięki której w pewnym stopniu można przewidzieć ich zachowanie w organizmie.. 3.5. Metabolizm nanocząstek tlenków żelaza w organizmie żywym W organizmie zdrowego człowieka około 65% żelaza występuje w postaci związanej z hemoglobiną, 4% w mioglobinie, 0,1% w transferrynie i około 15-30% w magazynowanej w wątrobie ferrytynie [103]. Cząsteczka ferrytyny, o średnicy hydrodynamicznej mierzącej około 13 nm, składa się z białkowej pokrywy otaczającej krystalit (nanocząstkę) tlenku żelaza o średnicy około 8 nm, zajmujący centrum objętości całej struktury [104]. Uważa się, że mechanizmy degradacji nanocząstek w organizmie są bardzo zbliżone to tych związanych z ferrytyną [10]. W przypadku ferrytyny w pierwszej kolejności otoczka zostaje rozpuszczona przez proteazy zawarte w lizosomach, po czym następuje roztworzenie rdzenia nanocząstki w kwaśnym środowisku lizosomów [10], [104]. Podobnie, podane dożylnie IONP, wychwycone przez system fagocytarny wątroby czy śledziony, ulegają rozpuszczeniu w lizosomach obecnych w komórkach makrofagów [105], [106]. Tempo metabolizowania IONP w śledzionie jest znacznie wolniejsze niż w wątrobie, ze względu na mniejszą zawartość białek magazynujących żelazo [10]. Poziom żelaza, którego nadmiar powstaje w organach po rozłożeniu IONP, podlega regulacji poprzez naturalne, wrodzone mechanizmy oczyszczania organizmu [10]. Najważniejszymi kompleksami białkowymi, zaangażowanymi w transport i przechowywanie żelaza w organizmie, są transferryna oraz ferrytyna [103], [107]. Uwolnione z IONP jony żelaza łączą się z prekursorowym białkiem apoferrytyną, obecną w cytoplazmie makrofagów, tworząc ferrytynę [15], [103]. Następnie jony żelaza mogą ulec odłączeniu od ferrytyny i związaniu z apotransferryną, co prowadzi do powstania transferryny. Transferryna przedostaje się do krwioobiegu, skąd może transportować żelazo do różnych tkanek takich jak szpik kostny czy mięśnie [103]. W szpiku kostnym jony żelaza przenoszone są i wiązane do cząsteczki hemoglobiny zawartej w krwinkach czerwonych, natomiast w mięśniach zostają dołączone do jej tkankowego odpowiednika – mioglobiny, która odpowiada za transport tlenu do tkanki mięśniowej u kręgowców [80], [82], [103]. Cząsteczki transferryny, po przedostaniu się do szpiku kostnego, ulegają silnemu związaniu z receptorami obecnymi na błonach komórkowych erytroblastów, po czym zostają przez nie zinternalizowane na drodze endocytozy [103]. Następnie, jony żelaza zostają uwolnione do mitochondriów erytroblastów, gdzie uczestniczą w formowaniu cząsteczek hemoglobiny. Hemoglobina zgromadzona w czerwonych krwinkach jest głównym białkiem odpowiadającym za transport tlenu w organizmie [10], [15], [103]. Krwinki czerwone żyją około 100-130 dni, a pod koniec swojego życia są wyłapywane i rozkładane przez makrofagi systemu fagocytarnego śledziony, co prowadzi do uwolnienia transportowanych przez nie jonów żelaza [81], [82], [103]. Część uwolnionych jonów Fe jest przyłączana do ferrytyny, a następnie do transferryny, która może przetransportować je do szpiku kostnego, gdzie ponownie zostają wykorzystane do tworzenia hemoglobiny, lub do wątroby, gdzie zostaną zmagazynowane w postaci ferrytyny [108]. Ten ciągły cykl powoduje długotrwałe zatrzymanie jonów żelaza w organizmie, czemu dodatkowo sprzyja wolne tempo ich usuwania [10], [109]. Część hemoglobiny pozostałej po degradacji erytrocytów jest przekształcana przez makrofagi do bilirubiny (produktu rozkładu hemu), która zostaje następnie wydalona z organizmu z moczem lub żółcią [103]. Jeżeli ilość znajdującego się w organizmie żelaza jest większa niż dostępna ilość cząsteczek ferrytyny, w wątrobie tworzą się nierozpuszczalne agregaty - 19 -.

(20) białkowe zwane hemosyderyną, które przechowują nadmiarowe żelazo [10]. Badania z wykorzystaniem IONP znakowanych 56Fe, wykazały że około 17-22% żelaza, podanego dożylnie szczurom w postaci nanocząstek, wydalane jest z organizmu z kałem, a jedynie 1% z moczem. Pozostała część żelaza krąży w organizmie jeszcze przez 84 dni od podania IONP, uczestnicząc w cyklu metabolicznym Fe [110]. Powstałe w wyniku degradacji IONP jony żelaza mogą zostać włączone do hemoglobiny zarówno w postaci Fe2+ jak i Fe3+, jednak tylko żelazo na drugim stopniu utlenienia jest zdolne do transportu cząsteczek tlenu pomiędzy płucami i innymi tkankami [80], [111]. Przyłączenie jonów Fe3+ do hemoglobiny powoduje powstanie nieaktywnej formy hemoglobiny tzw. methemoglobiny, która, ze względu na wyższy stopień utlenienia obecnego w niej żelaza, nie jest zdolna do przyłączania tlenu. Enzymy redukujące methemoglobinę mogą aktywować Fe, przekształcając jony Fe3+ w białku do formy Fe2+ [10], [80]. Istotną rolę w metabolizmie żelaza odgrywa wytwarzana w wątrobie ceruloplazmina – enzym znajdujący się w osoczu i należący do grupy ferroksydaz, który w swojej budowie posiada atomy miedzi [112]. Szacuje się, że prawie 95% miedzi zawartej w surowicy krwi występuje w postaci związanej z ceruloplazminą [113]. Enzym ten katalizuje reakcję utleniania jonów żelaza Fe2+ do Fe3+, dzięki czemu mogą one zostać przyłączone do apotransferryny, która w ten sposób ulega aktywacji do transferryny [112], [114]. Szlak metaboliczny IONP może wyglądać nieco inaczej w zależności od tego, czy materiałem budulcowym ich rdzeni jest Fe3O4 czy Fe2O3. Z tego względu przed zastosowaniem w medycynie niezbędne jest przeprowadzenie dokładnych badań dotyczących biodystrybucji oraz farmakokinetyki różnych typów IONP [10], [16].. 3.6. Potencjalna toksyczność nanocząstek tlenków żelaza Nanocząstki tlenków żelaza posiadają wiele cech, które choć są niezwykle atrakcyjne z technologicznego i aplikacyjnego punktu widzenia, czynią je potencjalnie toksycznymi w warunkach in vivo [115]. Wyniki dotychczas przeprowadzonych badań sugerują, że reakcja organizmu na dożylne podanie IONP zależy przede wszystkim od ich rozmiaru, zastosowanego pokrycia oraz drogi ekspozycji, które mają równocześnie decydujący wpływ na biodystrybucję i farmakokinetykę IONP [10]. Wyróżnia się dwa, powiązane ze sobą, mechanizmy odpowiedzialne za występowanie skutków ubocznych takiej ekspozycji tj. przeciążenie żelazem oraz produkcję wolnych rodników [31]. W zastosowaniach biomedycznych dawki żelaza podawanego dożylnie w postaci IONP stanowią między 1,25% a 5% żelaza występującego w organizmie [31]. Jednak od nanocząstek magnetycznych oczekuje się przede wszystkim, aby sterowane zewnętrznym polem magnetycznym gromadziły się w ściśle określonym miejscu w organizmie. Prowadzi to do wzrostu stężenia IONP w danej tkance lub organie, co umożliwia maksymalizację korzyści terapeutycznych lub diagnostycznych. Z drugiej strony, akumulacja IONP w docelowym obszarze organizmu może prowadzić do przeciążenia żelazem, wynikającego z nagromadzenia wolnych jonów Fe będących produktem metabolizmu tych nanocząstek. W konsekwencji może dojść do zaburzenia homeostazy żelaza, co skutkuje nieprawidłowościami w odpowiedzi komórkowej, wystąpieniem stresu oksydacyjnego, uszkodzeniem materiału genetycznego, białek, peroksydacją lipidów, a w dalszej kolejności zaburzeniami metabolicznymi i procesami zapalnymi [31]. Procesy te wymieniane są - 20 -.

(21) również jako główne mechanizmy zaangażowane w kancerogenezę, stąd lokalne przekroczenie fizjologicznego poziomu żelaza w tkance może potencjalnie skutkować rozwojem nowotworu [116]– [119]. Jony Fe, uwolnione na skutek działania enzymów lizosomowych, mogą przedostać się do jądra komórkowego lub mitochondriów. Szczególnie toksyczny potencjał wykazują jony Fe2+, które w obecności nadtlenku wodoru, wchodzą w reakcję Fentona prowadzącą do powstania silnie reaktywnych rodników hydroksylowych oraz jonów Fe3+ [31]. Wolne rodniki hydroksylowe mogą uszkadzać makromolekuły biologiczne, w tym powodować pęknięcia łańcucha DNA, zmiany w drugorzędowej strukturze białek i peroksydację lipidów [120], [121]. Co więcej, wywołane przez akumulację IONP lub przeciążenie żelazem, uszkodzenie struktury mitochondriów może prowadzić do anomalii w funkcjonowaniu tych organelli w tym produkcji rodników ponadtlenkowych i zaburzeń fosforylacji oksydacyjnej, a w konsekwencji do cytotoksyczności oraz śmierci komórki [31]. Obecnie ocena skutków ubocznych działania nanocząstek opiera się głównie na pomiarze zmian biochemicznych oraz parametrów morfologicznych i hematologicznych krwi, ekspresji genów w wątrobie, obserwacji zmian ogólnych i histologicznych w budowie organów, a także monitorowaniu zmian mas narządów następujących po podaniu IONP [76], [122], [123]. Ocena patologicznych zmian w wątrobie może zostać wykonana pośrednio, poprzez pomiar aktywności enzymów wątrobowych tj. aminotransferazy alaninowej (ALT), aminotransferazy asparaginianowej (AST) oraz fosfatazy alkalicznej (ASP) w osoczu krwi [17], [122]. Poziom stresu oksydacyjnego wywołanego przez IONP można określić poprzez oznaczenie stopnia peroksydacji lipidów, które pośród molekuł biologicznych wykazują największą podatność na uszkodzenia wywołane działaniem wolnych rodników [17], [124]. Biologicznymi markerami stresu tlenowego w narządach są przede wszystkim produkty peroksydacji kwasu linolowego oraz cholesterolu, lipidów o najwyższej abundancji in vivo [124], [125]. Badania nad toksycznością IONP pokrytych kopolimerem glikolu polietylenowego i tlenku propylenu o średnicy hydrodynamicznej między 186 a 206 nm prowadzone na szczurach przez Jain i wsp. [17] wykazały jedynie niewielkie przejściowe zmiany w aktywności głównych enzymów wątrobowych pomiędzy 6 a 24 godziną od podania nanocząstek. Poziom biomarkerów stresu oksydacyjnego w wybranych narządach był jedynie nieznacznie podniesiony i wrócił do normy po około 3 dniach od podania IONP. Analiza histologiczna wątroby, nerek i śledziony pobranych w 1 i 7 dniu nie wykazała żadnych nieprawidłowości. Analizę aktywności ALT, AST i ALP, zmian histopatologicznych oraz zmian ekspresji genów w wątrobie myszy po dożylnej ekspozycji na pokryte amfifilowymi polimerami zawierającymi grupy karboksylowe IONP o średnicach hydrodynamicznych 14 nm, 25 nm, 34 nm oraz 43 nm przeprowadzili Yang i wsp. [76]. Dawka IONP, którą podano zwierzętom wynosiła 20 mg na 1 kg masy ciała. Narządy pobrano od zwierząt w 1 i 7 dniu od podania nanocząstek. Nie stwierdzono żadnych istotnych zmian aktywności enzymów wątrobowych we krwi ani nieprawidłowości w testach histopatologicznych, które mogłyby sugerować toksyczne działanie IONP. Uzyskane wyniki wykazały jednak, że mniejsze nanocząstki (14 nm i 25 nm) znacznie skuteczniej wpływają na poziom ekspresji wrażliwych genów związanych ze stresem oksydacyjnym, transportem żelaza, procesami metabolicznymi oraz apoptozą. Skutki uboczne dożylnego podania pokrytych kopolimerem kwasu oleinowego i PEG IONP o średnicach 5 nm, 15 nm i 30 nm u myszy badali Gu i wsp. [122]. Podana zwierzętom dawka Fe w postaci IONP wynosiła 5 mg na 1 kg masy ciała. Przeprowadzone testy hematologiczne wykazały nieznacznie podwyższoną zawartość neutrofili po 24 godzinach od iniekcji nanocząstek, która jednak - 21 -.

(22) wróciła do normalnego poziomu w trakcie następnych 30 dni. Te krótkotrwałe zmiany przypisano odpowiedzi układu odpornościowego zwierząt na obecność IONP. Po 30 dniach od podania nanocząstek zaobserwowano również podniesiony poziom enzymów wątrobowych AST i ALT, co mogło być wywołane przeniesieniem cząsteczek kwasu oleinowego wchodzącego w skład otoczki IONP ze znajdujących się w wątrobie komórek Kupffera do hepatocytów. Jak widać wyniki otrzymane przez Gu i wsp. [122] różnią się od opisanych przez Jain i wsp. [17], co może wynikać zarówno z zastosowania innego modelu zwierzęcego (odpowiednio myszy i szczury) jak i odmiennego sposobu preparatyki IONP [122]. Feng i wsp. [126], [127] badali odpowiedź metaboliczną wywołaną u szczurów dożylnym podaniem nanocząstek typu USPIO (ang. ultrasmall superparamagnetic particles of iron oxides) bez pokrycia oraz otoczonych dekstranem. Zwierzęta otrzymały pojedynczą dawkę nanocząstek w postaci roztworu USPIO w soli fizjologicznej o stężeniu Fe 25 mmol na litr, co odpowiada około 5,6 mg Fe na 1 kg masy ciała. Autorzy, dzięki zastosowaniu wysokorozdzielczej spektroskopii magnetycznego rezonansu jądrowego oraz wielowymiarowej analizy statystycznej otrzymanych wyników, dokonali oceny zmian metabolicznych wywołanych podaniem USPIO w nerkach, wątrobie, śledzionie i sercu. Otrzymane wyniki sugerują, że nanocząsteki, poprzez zaburzenie czynności nerek, wątroby i serca, wpływają na szlaki metaboliczne lipidów, glukozy oraz aminokwasów, przy czym efekty te zależą od własności chemicznych oraz rozmiarów nanocząstek.. 3.7. Zastosowania nanocząstek tlenków żelaza Postęp w dziedzinie modyfikacji i funkcjonalizacji nanoobiektów, w tym również nanocząstek tlenków żelaza, przyczynił się do zwiększenia ich potencjału diagnostycznego i terapeutycznego [33], [34], [128], [129]. Własności magnetyczne IONP, umożliwiające manipulowanie nimi z wykorzystaniem zewnętrznego pola magnetycznego, otworzyły w dziedzinie nanotechnologii nowy wymiar. Wśród najbardziej popularnych zastosowań tych szczególnych nanoobiektów wymienia się magnetyczną hipertermię w terapii nowotworów, terapię celowaną z zastosowaniem leków na bazie SPION a także obrazowanie magnetyczno-rezonansowe wykorzystaniem nanocząstek tlenków żelaza w charakterze kontrastów magnetycznych [15], [25], [32]–[34], [130]. Hipertermia magnetyczna Terapia z zastosowaniem zjawiska magnetycznej hipertermii, tzw. termoterapia (ang. magnetic fluid hyperthermia, MFH), jest obiecującą metodą leczenia nowotworów [35], [131]. Badania kliniczne dotyczące MFH są prowadzone w połączeniu z innymi formami terapii przeciwnowotworowej, jako uzupełnienie tradycyjnej chemioterapii i radioterapii [131]. Termoterapia opiera się na zastosowaniu nanocząstek magnetycznych (głównie IONP) zawieszonych w biokompatybilnym płynie do podniesienia lokalnej temperatury ciała [35], [132]. Komórki nowotworowe wykazują dużo większą wrażliwość na temperatury przekraczające wartości fizjologiczne (powyżej 37°C) niż komórki zdrowe. Stąd, podnosząc lokalnie temperaturę ciała do 41-45°C można selektywnie niszczyć zmienione nowotworowo tkanki, oszczędzając jednocześnie ich otoczenie [133]. Miejscowy wzrost temperatury można wywołać dzięki zastosowaniu zmiennego pola magnetycznego [134]. Przyłożenie zewnętrznego pola magnetycznego powoduje ustawienie się momentów magnetycznych IONP zgodnie z kierunkiem wektora indukcji magnetycznej. Natomiast - 22 -.

(23) pod wpływem zmiennego pola magnetycznego o dużej częstotliwości rzędu 105 Hz następują szybkie fluktuacje orientacji momentów magnetycznych nanocząstek [131]. Takie zmiany kierunków momentów magnetycznych IONP powodują fizyczne drgania nanocząstek, które poprzez zjawisko tarcia wywołują wzrost temperatury otoczenia (tzw. relaksacja Browna) [133]. Lokalny zasięg zjawiska hipertermii jest możliwy do uzyskania dzięki np. wszczepieniu w centralny obszar nowotworu elektrod generujących fale elektromagnetyczne o częstotliwości radiowej, co prowadzi do precyzyjnego niszczenia patologicznie zmienionych tkanek [131], [132]. Takie, ograniczone do niewielkiego obszaru ciała, leczenie pozwala na zredukowanie skutków ubocznych terapii nowotworów w porównaniu z konwencjonalnymi metodami leczenia [131]. Kontrasty magnetyczne Obecnie do zastosowań klinicznych dopuszczony jest jeden kontrast magnetyczny na bazie SPION – ferucarbotran (Resovist®) [135]. Do niedawna jako kontrast stosowano również ferumoxides (Feridex®), który jednak został wycofany z rynku leków ze względu na brak użytkowników klinicznych [135], [136]. Obydwa leki są przeznaczone do obrazowania magnetyczno-rezonansowego wątroby, dzięki zjawisku ich wychwytu przez system fagocytarny znajdujący się w zdrowym narządzie. SPION powodują redukcję czasu relaksacji podłużnej (T2) momentów magnetycznych protonów znajdujących się w tkankach [131], [137], [138]. Większość tkanek zmienionych nowotworowo, takich jak guzy pierwotne, przerzuty, gruczolaki, cysty charakteryzuje się słabszym powinowactwem do kontrastów SPION, dlatego możliwe jest ich obrazowanie dzięki dużej intensywności (jasności) sygnału na tle zdrowej tkanki widocznej jako ciemny obszar [137]. Charakterystyka wymienionych kontrastów na bazie SPION znajduje się w tabeli Tab. 1. Tab. 1 Charakterystyka kontrastów na bazie SPION, dopuszczonych do zastosowań klinicznych. Na podstawie [138], [139]. Czas Średnica Średnica Nazwa Dawka Otoczka półtrwania we hydrodynamiczna rdzenia krwi Ferumoxides 0,56 mg Fe/1 kg 120 – 180 nm 5 nm Dekstran 1 – 2 godziny (Feridex®) masy ciała Ferucarbotran 0,49 mg Fe/1 kg 65 nm 4 nm Karboksydekstran 2,4 – 3,6 godzin ® (Resovist ) masy ciała. Niestety zastosowanie kontrastów tego typu może prowadzić do wystąpienia efektów niepożądanych. W badaniach klinicznych leku Feridex® skutki uboczne wystąpiły u ponad 10% spośród 800 pacjentów, którym podano kontrast, przy czym najczęściej raportowane były bóle pleców (3-4% pacjentów). Tego typu dolegliwości pojawiały się zwykle po zbyt szybkim podaniu leku lub też u pacjentów ze stwierdzonymi dysfunkcjami wątroby. Wśród pozostałych niepożądanych efektów wymienić można także ból klatki piersiowej oraz niedociśnienie. W testach klinicznych leku Resovist®, kontrast ten podano ponad 1200 pacjentom, z których 9% zgłosiło wystąpienie efektów ubocznych, przy czym bóle pleców odczuwane były przez mniej niż 0,5% osób biorących udział w badaniach. Pozostałe raportowane skutki uboczne to parestezje, bóle głowy, nudności, lęk, wymioty i ból w miejscu wstrzyknięcia [139].. - 23 -.

(24) Terapia celowana Precyzyjne dostarczanie leków do chorobowo zmienionych tkanek i narządów jest głównym problemem, jaki stoi na drodze redukcji skutków ubocznych terapii obecnie stosowanych w leczeniu nowotworów. Aby uzyskać terapeutyczne stężenie leku w miejscu docelowym, konieczne jest podanie go w dużej ilości [132]. Należy jednak pamiętać, że jedynie część dawki terapeutyku dotrze do chorej tkanki, natomiast jego nadmiar może wywołać skutki niepożądane w zdrowych, nie będących celem leczenia narządach [134]. Zadaniem terapii celowanej jest ukierunkowane, selektywne dostarczanie leków jedynie do chorobowo zmienionych obszarów organizmu [129], [132]. Fizykochemiczne właściwości SPION oraz możliwość ich funkcjonalizowania, czynią je idealnymi kandydatami na ukierunkowane nośniki leków. Tego typu terapeutyki, dzięki dołączonym do ich powierzchni specyficznym białkom (ligandom), akumulują się jedynie w komórkach posiadających odpowiednie receptory, zdolne do ich rozpoznania. Uwolnienie leku może być symulowane bodźcami wewnętrznymi, takimi jak obecność specyficznych enzymów, czy zmiana pH w miejscu docelowym lub zewnętrznymi np. za pomocą światła, ultradźwięków, pola magnetycznego [132]. Terapia celowana daje możliwość zmniejszenia dawki leku koniecznej do osiągnięcia efektu terapeutycznego w chorej tkance, a tym samym ograniczenia jego działań niepożądanych w pozostałych częściach organizmu. Co więcej, osiągnięcie dużego stężenia terapeutyku w ściśle określonym obszarze, może przyczynić się do podniesienia jego skuteczności [36], [131], [132]. Projektowanie leków na bazie SPION wymaga jednak uwzględnienia wielu czynników takich jak fizykochemiczne właściwości stosowanych nanocząstek, siła wiązania między nanocząstką a transportowanym lekiem, stężenie terapeutyku, droga i tempo podawania, masa ciała, objętość krwi, czas cyrkulacji w krwioobiegu itd. Stąd, przeniesienie terapii celowanej z zastosowaniem leków na bazie SPION z modeli zwierzęcych do klinicznych testów na ludziach stanowi trudne wyzwanie [36].. - 24 -.

(25) 4. Materiał badawczy 4.1. Specyfikacja stosowanych nanocząstek Nanocząstki tlenku żelaza pokryte glikolem polietylenowym Zawieszone w wodzie magnetyczne nanocząstki tlenku żelaza pokryte glikolem polietylenowym (PEG-IONP), wyprodukowane zostały przez Sigma-Aldrich (numer katalogowy produktu 747408). Stężenie wyjściowe roztworu wynosiło 1 mg Fe/ml, z kolei średnica nanocząstek określona przy użyciu metody TEM 30 nm. Materiał rdzenia nanocząstek stanowił tlenek żelaza (II,III). Przed rozpoczęciem eksperymentu, nanocząstki przechowywano w lodówce w zalecanej przez producenta temperaturze 2-8°C. Nanocząstki tlenku żelaza pokryte D-mannitolem Magnetyczne nanocząstki tlenku żelaza pokryte D-mannitolem (M-IONP) wyprodukowane zostały w Instytucie Chemii Makromolekularnej Akademii Nauk Republiki Czeskiej w Pradze. Medium, w którym zawieszone zostały M-IONP stanowił roztwór D-mannitolu o stężeniu 153,6 mg/ml. Stężenie wyjściowe roztworu nanocząstek w mannitolu wynosiło 4,4 mg Fe/ml, a średnica hydrodynamiczna M-IONP oszacowana przy użyciu metody DLS – 100 nm. Rdzeń nanocząstki wykonany został z tlenku żelaza (III), a jego średnica wynosiła 10 nm. Roztwór przechowywano w lodówce w temperaturze 2-8°C.. 4.2. Procedury przygotowania roztworów nanocząstek do podania in vivo Aby uzyskać pożądane niskie stężenia nanocząstek, roztwory wyjściowe musiały zostać odpowiednio rozcieńczone. Sposoby przygotowania roztworów do podania in vivo dla obydwu rodzajów nanocząstek różniły się, co było uwarunkowane właściwościami roztworów wyjściowych tj. obecnością aglomeratów i zastosowanym nośnikiem. Przygotowanie roztworu PEG-IONP 10 ml wyjściowego roztworu nanocząstek o stężeniu 1 mg Fe/ml rozcieńczono przez dodatnie 40 ml wodnego roztworu D-mannitolu o stężeniu 150 mg/ml (Baxter). Otrzymaną mieszaninę odwirowywano z prędkością 5000 obr/min przez 10 minut w celu usunięcia aglomeratów, które wykryto przy pomocy metody DLS. Następnie roztwór znad osadu zlano do oddzielnego pojemnika i pobrano próbki w celu powtórnego określenia średnicy hydrodynamicznej oraz oceny stabilności nanocząstek w roztworze. Pomiary DLS wykonano przy użyciu analizatora wielkości cząstek i potencjału zeta Zetasizer Nano ZS (Malvern) w Instytucie Katalizy i Fizykochemii Powierzchni Polskiej Akademii Nauk im. Jerzego Habera w Krakowie. Badania wykonane zostały wraz z prof. dr hab. Piotrem Warszyńskim oraz mgr Anetą Kędrą. Wyznaczona średnica hydrodynamiczna PEG-IONP w roztworze wynosiła 35 nm. Pomiar potencjału zeta, którego wartość dla badanego układu równa była -98 mV, wykazał że nanocząstki w badanym roztworze cechują się dużą stabilnością. Dawkę PEG-IONP w tak przygotowanym roztworze określono poprzez pomiar stężenia Fe przy użyciu metody spektroskopii fluorescencji rentgenowskiej całkowitego odbicia (ang. total X-ray - 25 -.

(26) fluorescence, TXRF). Pomiary przeprowadzono w akredytowanym Laboratorium Metod Rentgenowskich Uniwersytetu Jana Kochanowskiego w Kielcach przy użyciu spektrometru S2 PICOFOX firmy Bruker. Badania wykonane zostały wraz z dr inż. Aldoną Kubalą-Kukuś oraz mgr Iloną Stabrawą. Stężenie Fe w roztworze końcowym wynosiło 8,14 (0,86) µg Fe/ml. Przygotowanie roztworu M-IONP Objętość 0,5 ml roztworu wyjściowego M-IONP o stężeniu 4,4 mg Fe/ml rozcieńczono przez dodanie 49,5 ml wody dejonizowanej uzyskując w ten sposób roztwór docelowy o stężeniu 44 µg Fe/ml. Aby wykluczyć obecność aglomeratów w roztworze, zmierzono średnicę hydrodynamiczną zawieszonych w nim cząstek przy użyciu metody DLS. Pomiary przeprowadzono za pomocą analizatora wielkości cząstek Zetasizer Nano S (Malvern) na Wydziale Biochemii, Biofizyki i Biotechnologii Uniwersytetu Jagiellońskiego. Badania wykonane zostały wraz z dr Michałem Sarną. Otrzymane wyniki wykazały, że średnica hydrodynamiczna nanocząstek w roztworze wynosiła 100 nm.. 4.3. Charakterystyka zwierząt eksperymentalnych Do badań prowadzonych w ramach niniejszej pracy wykorzystano szczury szczepu Wistar płci męskiej, które pochodziły z hodowli Zakładu Neuroanatomii Instytutu Zoologii i Badań Biomedycznych Uniwersytetu Jagiellońskiego. Za opiekę nad zwierzętami oraz wszystkie procedury prowadzone z użyciem zwierząt eksperymentalnych odpowiadały, posiadające odpowiednie uprawnienia, dr hab. Zuzanna Setkowicz-Janeczko oraz mgr Małgorzata Ciarach. Procedury stosowane na zwierzętach były zgodne z międzynarodowymi wytycznymi i zostały zatwierdzone przez Lokalną Komisję Etyczną w Krakowie (numer zgody 121/2015). Zwierzęta hodowano w temperaturze 20 ± 2°C przy zachowaniu 12-godzinnych cykli dobowych – jasnego i ciemnego. Woda oraz stały pokarm Labofeed dostępne były dla zwierząt w nieograniczonej ilości. Zwierzęta poddane działaniu PEG-IONP Badaniom poddano 24 osobniki, które w 60 dniu życia zostały podzielone na cztery równoliczne grupy. Trzem z nich tj. grupom P-2H, P-24H oraz P-7D podano dożylnie przez żyłę ogonową 1 ml roztworu PEG-IONP o stężeniu 8,14 µg Fe/ml. Czwarta grupa tzw. grupa kontrolna (P-N), otrzymała 1 ml soli fizjologicznej, aby wyeliminować wpływ zwiększenia objętości płynów obecnych w łożysku naczyniowym zwierząt na otrzymane wyniki. Zwierzęta poddane działaniu M-IONP Badaniom poddano 34 osobniki, które w 60 dniu życia zostały podzielone na 4 grupy. Trzem grupom, oznaczonym jako M-2H, M-24H oraz M-7D podano dożylnie przez żyłę ogonową 1 ml roztworu M-IONP o stężeniu 44 µg Fe/ml. Czwarta grupa tzw. grupa kontrolna (M-N), otrzymała dożylnie 1 ml soli fizjologicznej. Grupy M-2H oraz M-24H liczyły po 6 osobników natomiast grupy M-7D oraz M-N liczyły po 11 osobników. Liczebności poszczególnych grup eksperymentalnych oraz przeznaczenie narządów pobranych od zwierząt zostały dla przejrzystości podane w tabeli Tab. 2. - 26 -.

(27) Tab. 2 Liczebność grup eksperymentalnych oraz przeznaczenie pobranych narządów. Grupa Przeznaczenie Liczba zwierząt Badane narządy P-N TXRF 6 P-2H TXRF 6 P-24H TXRF 6 P-7D TXRF 6 Wątroba, śledziona, nerki, serce, mózg, osocze M-N TXRF 6 M-2H TXRF 6 M-24H TXRF 6 M-7D TXRF 6 M-N FTIR 5 Wątroba (wybrany płat), nerka (prawa) M-7D FTIR 5. 4.4. Wybór narządów W badaniach przeprowadzonych w ramach niniejszej pracy skupiono się na ocenie biodystrybucji nanocząstek podanych in vivo oraz towarzyszących temu skutków ubocznych. W celu oceny zmian pierwiastkowych od każdego ze zwierząt eksperymentalnych pobrano wątrobę, nerki, śledzionę, serce, mózg oraz krew. Oceny zmian biochemicznych dokonano z kolei dla wybranego płata wątroby oraz prawej nerki. Zgodnie z istniejącymi doniesieniami literaturowymi, nanocząstki podane dożylnie mogą akumulować się w wymienionych organach oraz indukować w nich procesy prowadzące do zmian histopatologicznych oraz funkcjonalnych [10], [11], [14]. Niezależnie od powyższego wybór narządów podyktowany był głównie pełnioną przez nie w organizmie funkcją. Wątroba i śledziona są narządami uczestniczącymi w kształtowaniu odpowiedzi immunologicznej organizmu poprzez uczestnictwo w formowaniu układu fagocytarnego odpowiedzialnego za m.in. oczyszczanie krwi z nanocząstek [10]. Nerki, jako element kluczowy dla oczyszczania ciała, stanowią pożądaną drogę usuwania nanoobiektów z krwioobiegu [10], [140]. Dożylne podanie nanocząstek może również prowadzić do zmian patologicznych w sercu, będącym centralnym organem układu krążenia, gdyż praca tego narządu wiąże się z dużymi przepływami krwi, a tym samym zwiększoną ekspozycją na IONP [11], [140]. Badanie mózgu miało na celu weryfikację szczelności oraz odporności bariery krew-mózg na działanie nanocząstek tlenków żelaza podanych w warunkach in vivo. Osocze (serum) otrzymane z pobranej krwi posłużyło natomiast do określenia zmian w metabolizmie żelaza, które można powiązać z odpowiedzią organizmu na ogólnoustrojowe działanie zastosowanych nanocząstek [141].. 4.5. Procedury pobierania narządów Procedury pobierania narządów zarówno w grupach poddanych działaniu PEG-IONP jak i M-IONP przebiegały w taki sam sposób. Po 2 godzinach, 24 godzinach oraz 7 dniach od podania roztworu nanocząstek, osobniki z grup odpowiednio P-2H i M-2H, P-24H i M-24H oraz P-7D i M-7D zostały zważone, a następnie poddane perfuzji 0,9% roztworem soli fizjologicznej o wysokiej czystości analitycznej w celu usunięcia krwi z organizmu. U zwierząt z grup P-N i M-N ważenie oraz perfuzja przeprowadzone zostały po 3 dniach od rozpoczęcia eksperymentu. - 27 -.

(28) Przed perfuzją od każdego osobnika pobrano 1 ml krwi. Próbki krwi umieszczano w probówkach typu eppendorf, odpowiednio opisano, a następnie odwirowywano z prędkością 6000 obr/min przez 5 minut, w celu oddzielenia osocza od elementów morfotycznych krwi. Osocze znad skrzepu pobierano i przechowywano w ultrazamrażarce w temperaturze -80°C do czasu przeprowadzenia preparatyki. Po usunięciu krwi od każdego zwierzęcia pobrano wątrobę, nerki, śledzionę, serce oraz mózg, które zostały kolejno zważone, zamrożone w ciekłym azocie (77 K) i szczelnie zapakowane w sterylne woreczki firmy Whirl-Pack®. Każdy woreczek został opisany kodem umożliwiającym identyfikację narządu, osobnika oraz grupy, z której pochodził. Narządy przechowywano w ultrazamrażarce w temperaturze -80°C do czasu przeprowadzenia ich preparatyki oraz pomiarów z wykorzystaniem spektroskopii TXRF oraz mikrospektroskopii FTIR. Wartości median mas narządów oraz zwierząt zamieszczono w tabelach Tab. 3 i Tab. 4 Tab. 3 Wartości median mas zwierząt oraz narządów dla grupy kontrolnej oraz grup poddanych działaniu PEG-IONP. Mediana (rozstęp*) [g] Grupa Całkowita Wątroba Nerki Śledziona Serca Mózg P-N. 313 (49). 11,8 (2,5). 2,47 (0,39). 0,60 (0,15). 1,04 (0,11). 1,796 (0,043). P-2H. 332 (30). 12,68 (0,94). 2,42 (0,14). 0,62 (0,16). 1,01 (0,12). 1,76 (0,21). P-24H. 286 (15). 12,97 (0,74). 2,28 (0,17). 0,75 (0,14). 0,936 (0,069). 1,856 (0,054). P-7D. 325 (43). 13,1 (1,9). 2,41 (0,14). 0,70 (0,13). 1,033 (0,078). 1,852 (0,072). * Niepewność pomiaru masy została obliczona jako rozstęp międzykwartylowy (różnica wartości kwartyli trzeciego i pierwszego).. Tab. 4 Wartości median mas zwierząt oraz narządów dla grupy kontrolnej oraz grup poddanych działaniu M-IONP. Grupa. Mediana (rozstęp*) [g] Całkowita. Wątroba. Nerki. Śledziona. Serce. Mózg. M-N. 296 (20). 12,7 (1,1). 2,34 (0,32). 0,613 (0,056). 0,924 (0,028). 1,77 (0,14). M-2H. 277 (15). 9,22 (0,94). 2,10 (0,18). 0,597 (0,084). 0,896 (0,051). 1,802 (0,040). M-24H. 264 (20). 11,57 (0,50). 1,97 (0,14). 0,687 (0,050). 0,883 (0,079). 1,789 (0,039). M-7D. 307 (22). 12,96 (0,73). 2,47 (0,22). 0,687 (0,078). 0,921 (0,067). 1,90 (0,17). * Niepewność pomiaru masy została obliczona jako rozstęp międzykwartylowy (różnica wartości kwartyli trzeciego i pierwszego).. 4.6. Preparatyka próbek 4.6.1. Przygotowanie próbek do pomiaru metodą spektroskopii TXRF W celu przygotowania pobranych narządów do przeprowadzenia analizy składu pierwiastkowego z zastosowaniem metody spektroskopii TXRF, wszystkie próbki (za wyjątkiem osocza) poddano mineralizacji w kwasie azotowym. Proces dekompozycji organów przeprowadzono przy użyciu zamkniętego mineralizatora mikrofalowego SpeedWave 4® [142]. Przed mineralizacją, każdy organ powtórnie ważono, w celu ostatecznego ustalenia masy poddanej preparatyce. Zważoną próbkę umieszczano w naczyniu teflonowym DAP100, do którego dodawano kwasu azotowego (V) o wysokiej czystości analitycznej i stężeniu 65% (100441/Suprapur®, Merck Group) w średniej ilości 2,53 (0,54) ml na1 gram masy organu. Temperatura, ciśnienie oraz czas mineralizacji próbek zostały - 28 -.

(29) wybrane zgodnie z rekomendacją producenta urządzenia oraz były stale monitorowane w trakcie procesu roztwarzania [142]. Po zakończeniu mineralizacji i ochłodzeniu naczyń teflonowych, zawartość każdego z nich przelewano do probówki opisanej odpowiednim kodem. Tak przygotowane próbki przechowywano w lodówce. Między kolejnymi mineralizacjami naczynia teflonowe poddawano procesowi czyszczenia w warunkach dobranych zgodnie z zaleceniami producenta urządzenia [142]. Najważniejsze informacje dotyczące warunków przebiegu procesów mineralizacji oraz czyszczenia naczyń teflonowych zamieszczono w Tab. 5. Tab. 5 Warunki mineralizacji narządów oraz czyszczenia naczyń teflonowych. Parametr. Temperatura maks. [C°]. Ciśnienie maks. [Ba]. Czas [min]. Liczba naczyń teflonowych (DAP100). Ilość kwasu azotowego (V). Mineralizacja próbek. 190. 40. ~36. 6. średnio 2,53 ml/g m.o.. Czyszczenie naczyń teflonowych. 200. 40. ~30. 6. 6 ml. Przed wykonaniem pomiaru składu pierwiastkowego, do 1 ml próbki dodawano 0,3 ml standardu wewnętrznego (ang. internal standard, IS) w postaci roztworu Ga o stężeniu 10 µg/g. W przypadku osocza krwi z każdej próbki pobierano 200 µl i dodawano do niej 50 µl roztworu Ga o stężeniu 10 µg/g. Wybór Ga był podyktowany brakiem obecności tego pierwiastka w badanych narządach, co daje gwarancję, że zarejestrowana w widmie emisyjnym linia Ga pochodzi jedynie od dodanego standardu wewnętrznego. Po standaryzacji każda próbka została poddana homogenizacji przy użyciu automatycznej wytrząsarki laboratoryjnej. Następnie, z tak przygotowanego roztworu, pobierano 2 μl próbki, które umieszczano na nośniku wykonanym ze szkła kwarcowego (Bruker) i poddawano suszeniu w temperaturze 40°C. Wymiary nośnika oraz miejsce nakrapiania próbki przedstawiono na rysunku Rys. 4 [143].. Rys. 4 Schemat nośnika ze szkła kwarcowego. Żółtym kolorem oznaczono miejsce nakrapiania próbki. Na podstawie [143]. - 29 -.