• Nie Znaleziono Wyników

Zmiany w jądrach komórkowych wywołane szokiem termicznym

N/A
N/A
Protected

Academic year: 2021

Share "Zmiany w jądrach komórkowych wywołane szokiem termicznym"

Copied!
20
0
0

Pełen tekst

(1)

A C T A U N I V E R S 1T A T I S L 0 D Z 1 E N S I S

F O L IA B IO C H IM IC A ET B IO P H Y S IC A 14, 1999

Z ofia M . Kiliańska, A netta Ptasińska

Z M IA N Y W JĄ D R A C H K O M Ó R K O W Y C H W Y W O Ł A N E S Z O K IE M T E R M IC Z N Y M

E kspozycja k o m ó rek n a podw y ższo n ą tem p e ra tu rę (43 -4 8 °C ) p rzy czy n ia się do w zro stu o gólnej m asy b iałek , k tó re w sp ó łiz o lu ją się z ją d ra m i k o m ó rk o w y m i. G łó w n y fizjologiczny efekt szoku cieplnego w ją d ra c h k o m ó rk o w y c h to h a m o w a n ie replikacji i n a p raw y D N A , a także syntezy i d o jrzew an ia R N A . S tw ie rd zo n o , że in d u k o w a n y szokiem w zrost m asy białek p o z o staje w ko relacji ze zm ian am i w u lt- ra s tru k tu rz e i składzie polip ep ty d o w y m szkieletu jąd ro w eg o - m atrik s jąd ro w ej.

W S T Ę P

O rganizm y pro k ario ty czn e i eukariotyczne w odpow iedzi n a w zrost te m p e ra tu ry (5 -1 0 % ) powyżej w artości fizjologicznej syntetyzują b iałk a szoku term icznego (ang. heat shock proteins; hsp) [17, 44, 45, 53, 62, 64], B iałka te stan o w ią p ro d u k t ekspresji genów opisyw anych rów nież sym bolem hsp, k tó re u dało się zidentyfikow ać, sklonow ać oraz scharak tery zo w ać [10, 11, 29, 57, 70], O kazało się, że geny hsp podlegają aktyw acji rów nież przez inne czynniki stresogenne. Ich stale w ydłużająca się lista obejm uje zw iązki chem iczne, czynniki niefizjologiczne, trucizny, in h ib ito ry enzym ów , itd. N ależą d o nich m . in. etano l, analogi am inokw asów , p u ro m ycy na, m etale ciężkie, czynniki chelatujące jo n y dw uw artościow e, arseniany, jo d o a c e ta m id , n ad tlen ek w od o ru , an io n o ro d n ik i p o nadtlenk ow e, in h ib ito ry fosforylacji oksydacyjnej, hydroksyloam ina, salicylan sodu, jon ofory [1, 44]. W k om ó rk ach niestresow anych obecne są białka o podobnej stru k tu rze pierw szorzędow ej, op isy w an e ja k o hsc (ang. heat shock cognate). P o te n cjaln e m ożliw ości sto so w an ia podw yższonej tem p eratu ry - hiperterm ii w m edycynie p ow od uje duże zainteresow anie efektam i, ja k i ten czynnik wywołuje w m etabolizm ie, u ltra stru k tu rz e i w funkcjono w aniu organelli ko m órko w ych.

(2)

W P Ł Y W S Z O K U T E R M IC Z N E G O N A K O M Ó R K I

B iałka kod o w an e przez geny aktyw ow ane szokiem term icznym - hsp stan o w ią zespół ok. 50 polip eptydów [39, 49], P rzyjm ując ja k o k ryterium m asę cząsteczkow ą (m .cz.) w yróżnia się w śród nich trzy rodziny: niskocząs- teczkowe hsp 20-30 (18-30 kD a), średniocząsteczkowe hsp 60-70 (56-78 k D a) i w ysokocząsteczkow e hsp 100 (80-100 kD a). Powyższy podział nie jest idealny, zidentyfikow ano bowiem b iałka hsp nie m ieszczące się w powyższej klasyfikacji [39], F u n k cje w iększości białek in d u k o w an y c h h ip e rte rm ią p oznano dzięki badaniom ich izoform konstytutyw nych - hsc [49]. W p raw id­ łowych k o m ó rk ac h białka hsc70 w ystępują w większości przedziałów k o m ó r­ kow ych, tj. w cytosolu, m ito c h o n d ria c h , ap a ra c ie G olg ieg o, en d o p laz - m atycznym retikulum (ER ). W w yniku zadziałania podwyższonej tem peratu ry b iałk a tej rodziny ulegają translokacji do ją d ra ko m órkow eg o, gdzie ulegają n a g ro m a d z a n iu [28, 56, 67], W cześniejsze p race sugerow ały w y biórczą lokalizację b iałka hsp70 w ją d e rk u [41]. D otyczyły one jed n ak k ró tk o trw ałej ekspozycji ko m ó rek n a hiperterm ię (1-3 godz.). D łuższe d ziałanie szoku term icznego (k o m ó rk i H eL a; 24 godz.), k tó ry jest jednocześnie czynnikiem stabilizującym szkielet jąd ro w y [3, 23, 30], pow oduje n ag ro m a d zan ie hsp70 w m atrik s jądrow ej [31, 36, 58], Przeciw ciała rozpoznające b iałk a hsp70 reagują krzyżow o z polipeptydam i o m.cz. ok. 70 k D a wielu naw et odległych ewolucyjnie organizm ów , co potw ierdza ich daleko posuniętą konserw atyw ność [24], C złonkow ie rodziny hsp 80-100 przew ażają w cytosolu, choć sp o ty k a się je w endoplazm atycznym retikulum [39], M o g ą tw orzyć kom pleksy z tu b u lin ą , w im entyną, a k ty n ą , k a lm o d u lin ą o ra z n iek tó ry m i k in azam i białkow ym i (por. rys. 1). P o n a d to przedstaw io no wyniki w skazujące, że ze w nątrzkom órkow e receptory h o rm o n ó w w chodzą w in terakcje z hsp90, a n astępnie w połączeniu z hsp70 i hsp56 fo rm ują „ tra n s p o rto s o m ” p rze­ noszący recep to r m iędzy cytop lazm ą a jąd rem kom ó rk ow ym [49], W ciąż słabo p o znane niskocząsteczkow e b iałka hsp najszerzej op isan o u dro żdży i roślin [39], U roślin lokalizują się głównie w cytosolu, cho ć o p isan o je rów nież w m ito ch o n d riach , ch lo ro p la sta ch i en doplazm atycznym retik ulum [12, 19, 27], U zw ierząt opisano je w kom pleksach z a k ty n ą [34].

W e l c h i S u h a n [67] n a podstaw ie obszernych analiz w m ik ro sk o p ie elektronow ym fibroblastów szczura, k o n tro ln y ch i p o d d an y c h działaniu tem p eratu ry 42-43°C przez 3 godz., opisali następujące zm iany w yw ołane tym czynnikiem :

- niszczenie i fragm entację a p a ra tu G olgiego, łago dn e n ab rzm iew an ie siateczki E R , n ag ro m ad zan ie w obszarze o k ołojąd ro w y m elem entów b ło ­ niastych,

(3)

R ys. 1. R ozm ieszczenie białek szoku term icznego w k o m ó rce (wg S c h l e s i n g e r a [49]; za z g o d ą A u to ra ). G łó w n e b ia łk a asocjujące z różnym i o rganellam i k o m ó rk o w y m i u jęto w ram k i. N a schem acie zaznaczono: J - ją d r o k o m ó rk o w e ; E R - en d o p lazm aty czn e retik u lu m ; elem enty cytoszkieletu: M f - m ik ro filam en ty ; M l - m ik ro tu b u le; I f - filam enty p o śred n ie; M - m ito ­ c h o n d ria ; CV - opłaszczone pęcherzyki; L - lizosom ; U b - ubik w ity n a; B IP - izo fo rm a hsp70;

białko w iążące łań c u ch ciężki im m u n o g lo b u lin

- n ab rzm iew an ie m ito c h o n d rió w z gęstym u p ak o w an iem grzebieni, czem u tow arzyszy pow iększenie przestrzeni m iędzy grzebieniam i,

- załam anie i d ezorganizacja ciągłości cytoszkieletu, zw iązane głów nie z agregacją filam entów p o śred nich o raz filam entów ak ty no w y ch w ok ół ją d e r kom ó rk o w y ch ,

- pojaw ianie się w ew nątrz ją d e r kom ó rkow ych pałeczko w aty ch tw o rów , reorganizacja sieci w łókien w jąd erk ach .

Z m iany u ltra stru k tu ry i fu n kcjonow ania k o m ó rek streso w anych p o d w y ż­ szoną te m p e ra tu rą m o g ą przebiegać dw om a to ram i, tj.:

1) przez ograniczenie rozpuszczalności wielu białek (głównie jąd ro w y ch ) i ich agregacji m . in. na elementach szkieletu jądrow ego [24, 55, 66]. W ytrącone i zagregow ane białka o zmienionej konform acji tra c ą częściowo lub całkowicie sw oją aktyw ność biologiczną. Z kolei funkcje szkieletu jąd ro w eg o , zw anego również m atriks lub m acierzą jądrow ą, którem u przypisuje się pierw szoplanow ą rolę w m etabolizm ie jądrow ym oraz w utrzym aniu arch itek tu ry ją d ra k o m ó r­ kow ego [4-6, 13, 14, 22, 32] ulegają zakłóceniu w skutek agregacji n a jego pow ierzchni białek indukow anych szokiem term icznym [20, 62, 64];

(4)

2) przez zmniejszenie biosyntezy białek praw idłow ych, a indukcję ekspresji genów szoku term icznego, który ch p ro d u k ty białkow e m ają zdolność p rzy ­ w racania właściwej konform acji uszkodzonych podw yższoną te m p e ra tu rą polipeptydom [48, 49],

A k tu aln ie uznaje się, że główne działanie hsp wiąże się z pełnieniem przez nie funkcji tzw. „m olekularnych przyzw oitek” (ang. m olecular cha­ perones) [2, 40, 49], W odgryw aniu tej roli w ykorzystują one zdolność tw orzenia kom pleksów zarów no z białkam i w ystępującym i w k o m ó rk ac h w w arunkach Fizjologicznych, jak i pojaw iających się po zadziałaniu stre­ su. P olipeptyd będący w takim kom pleksie jest ch ro n io n y przed zm ianą k o nform acji, a także n ieodw racalną d en atu racją. D ysocjacja utw orzonego kom pleksu zachodzi bądź przez przyłączenie A T P , b ądź po d wpływem nieznanego białka. E ksperym enty in vitro, w k tó ry ch zd e n atu ro w a n e b iał­ k a re n atu ro w a n o w obecności białek hsp o raz liczne dośw iadczenia gene­ tyczne z w ykorzystaniem drożdży i b akterii, potw ierdziły koncepcję fu n k ­ cjo n o w an ia hsp ja k o „m olekularny ch przyzw oitek” [40, 49]. C ząsteczki hsp fu n k cjo n u ją ja k o enzym y, k tó re uczestniczą w szlakach m etab o licz­ nych ak ty w o w an y ch pod w y ższo n ą te m p e ra tu rą [39], W p rz y p a d k u e n ­ zym ów cyklu glikolitycznego k o m ó rek stresow anych h ip erterm ią d ochodzi d o w zro stu ich aktyw no ści, dzięki czem u m o g ą one k o rz y sta ć z bez­ tlenow ego pozyskiw ania A TP. D oniesiono rów nież o zw iększonej ak ty w ­ ności enzym ów zw iązan y ch z A T P -z a le ż n ą u b ik w ity n a c ją b iałek [26]. U m ożliw ia to usuw anie zdenatu ro w an y ch białek z k o m ó rek stresow anych tem p eratu rą. O pisano przykłady niektó ry ch enzym ów w k o m ó rk ac h po hiperterm ii, k tó ry ch aktyw ność jest regulow ana tym czynnikiem stresogen- nym , m . in. enzym ów zaan g aż o w an y c h w zw ijanie łań cu c h ó w p o lip ep - tydow ych, np. izom eraza cis/trans pepty dy lo prolilo w a [6, 9], czy ich fos- forylację [21].

S tosunkow o m ało wrażliwe na łagodny stres term iczny, pom im o pew nych zm ian w u ltrastru k tu rz e, są m ik ro tu b u le , siateczka śró d p lazm aty czn a, a p a ra t G olgiego i pęcherzyki wydzielnicze [49, 67]. R ów nież d rogi p rzenoszenia sygnału są niezbyt w rażliw e n a hiperterm ię, co p o tw ierdzon o b ad ając cykl inozy to lo trifo sfo ran o w y o ra z efekt różnych stężeń jo n ó w C a 2+ i A T P, a także różne w artości p H [49], P odw yższona te m p e ra tu ra o kazuje silny wpływ n a stru k tu rę , replikację i tran sk ryp cję D N A , stopień u p ak o w an ia ch ro m aty n y , m odyFikację h istonów , sk ładanie i dojrzew anie p re k u rso ró w m R N A i rR N A , tw orzenie rybosom ów [20].

N iniejszy a rty k u ł dotyczy zm ian w u ltra stru k tu rz e i składzie polipep- tydow ym jąder, a głównie ich stru k tu r szkieletowych w ko m ó rk ach poddanych hip erterm ii, k tó re o k az u ją wpływ n a m etabolizm ko m órkow y.

(5)

W P Ł Y W S Z O K U T E R M IC Z N E G O N A JĄ D R A K O M Ó R K O W E

Z licznych b ad a ń w ynika, żc ekspozycja k om ó rek ssaków na stres term iczny przyczynia się d o zw iększonej asocjacji białek z frak cją ją d e r k o m órkow ych, na co w skazuje wyższy stosunek b ia łk o /D N A [24, 4 6-4 8, 60]. P o ra z pierw szy zjaw isko to o d n o to w a n o we frak cji ch ro m a ty n y wydzielonej z ko m ó rek ja jn ik a ch o m ik a chińskiego (C H O ; ang. chinese ham ster ovary) [54] oraz kom órek ra k a szyjki m acicy - H eL a [46], poddanych działan iu szoku term icznego, w której obserw o w an o zw iększony poziom białek niehistonow ych.

W a r t e r s i wsp. [66] donieśli, że ilość białek ek strah o w an y ch zb ufo ro - w anym 2 M roztw orem N aC l z ją d e r k o m ó rek C H O ek spo no w anych n a hiperterm ię (45°C, 30 m in) obn iżała się o połow ę, n a to m ia st zaw arto ść białek zw iązanych z D N A i z m atrik s ją d ro w ą w zrosła od po w iedn io 2,2 i 3,4 razy (tab. 1).

T a b e l a 1 P o ró w n an ie w ew nątrzjądrow ej zaw arto ści białek w k o m ó rk a c h C H O k o n tro ln y c h

i p o d d a n y ch hiperterm ii [66]

R o d zaj b iałek jąd ro w y ch K o m ó rk i k o n tro ln e K o m ó rk i p o d d a w an e szokow i

B iałka rozpuszczalne 0,794 ± 0,024 0,399 ± 0 ,0 5 0

B iałka zw iązane z D N A 0,076 ± 0 ,0 2 0 0,166 ± 0 ,0 4 8

B iałk a m atrik s jąd ro w ej 0,129 ± 0 ,0 2 0 0,434 ± 0,049

K o m ó rk i zn ak o w an o m ieszaniną 3H -am inokw asów . J ą d ra o trzy m an e z k o m ó rek k o n tro ln y ch lu b p o d d a n y ch h ip erterm ii (45°C, 30 m in) e k strah o w a n o z b u fo ro w an y m 2 M ro z tw o re m N aC l (b ia łk a ro z p u szc z aln e). D N A u su w an o z p o z o stało śc i ją d ro w e j p rzez traw ie n ie D N a z ą I i p o n o w n ą e k strak c ję z b u fo ro w a n y m 2 M ro z tw o re m N a C l (b ia łk a z w iązan e z D N A ). P o zo stało ść ją d ro w ą tra k to w a n o ja k o m atrik s jąd ro w ą. W yniki p rz ed sta w io n o ja k o sto su n ek rad io ak ty w n o ści poszczególnych frakcji d o całkow itej rad io ak ty w n o ści ją d e r k o m ó rk o w y ch .

W zrost w artości stosunku b iałk o /D N A zależy od w ysokości tem p eratu ry , czasu ekspozycji na jej działanie i w ynika ze zw iększenia m asy białek w ją d ra c h ko m órkow ych. B ezpośrednio po zad ziałan iu podw yższonej te m ­ p e ra tu ry w różnych przedziałach czasu, tj. 43°C/15 m in; 44°C /15 m in; 45°C /7,5 m in; 45°C /10 m in i 45°C /15 m in z a o b serw o w an o w ją d ra c h k o m ó rek C H O w zrost m asy białek odpow iednio 1,37; 1,64; 1,58; 2,02 i 2,30 razy w p o ró w n a n iu z w artościam i kontrolny m i [20].

B iałka pojaw iające się w ją d ra c h kom ó rek H e L a in d u k o w an y ch szokiem term icznym zostały nazw ane dodatkow ym i i opisane sym bolem H IE N P (ang. heat induced excess nuclear proteins) [24], W a r t e r s i B r i z g y s [64]

(6)

oszacow ali, że aż ok. 70% białek obecnych w ją d ra c h k o m ó rk ow ych po hiperterm ii ulega asocjacji z m atrik s jąd ro w ą. Pojaw ienie się białek 11IEN P wydaje się być spow odow ane adsorpcją o raz agregacją p op rzed nio ro zp u sz­ czalnych polipeptydów n a elem entach bardziej nierozpuszczalnych - D N A i białkach stru k tu r szkieletow ych o raz przem ieszczaniem białek z cytoplazm y d o ją d e r kom órkow ych (ok. 30% ). P odjęto p ró b ę ch arak tery sty k i n a d rod ze elek tro fo rez y dw uw ym iarow ej w żelu p o liakrylam ido w y m białek frakcji ją d ro w y c h w ydzielonych z k o m ó re k k o n tro ln y ch i p o d d a n y c h szokow i term icznem u. Stw ierdzono, że istotnym i ilościowo składnikam i H IE N P są członkow ie rodziny hsp70. T a ro d z in a białek reprezentuje składniki p o ­ chodzenia cytoplazm atycznego; obecność w jądrze spow odow ana jest m igracją jej członków z cytoplazm y. O prócz hsp w skład H IE N P w chodzą polipeptydy

0 m .cz. 130, 95, 75, 58, 53, 46, 37, 28 i 26 kD a.

Z a p o m o cą różnicow ej kalorym etrii skaningow ej (D SC ; ang. differential scanning calorim etry) w ykazano, że białka jąd ro w e, k tó rych d e n a tu ra c ja następuje w przedziale tem p eratu ry 42-60°C , ulegają ekstrakcji p odczas w ydzielania z ko m ó rek kon tro ln y ch [8]. O kazało się, że większość term o- labilnych polipeptydów pozostaje w tej stru kturze, gdy ko m ó rk i ulegają stresow i. Przypuszcza się, że zm niejszenie rozpuszczalności białek podczas hiperterm ii jest wynikiem ich denaturacji. K onsekw encją w zrostu oddziaływ ań m iędzycząsteczkow ych w ta k zm ienionych polipepty dach jest ich agregacja 1 tw o rzenie nierozpuszczalnych kom p lek sów . B iałka H IE N P w w yniku asocjacji z m atrik s ją d ro w ą ograniczają ruchy superskręconej cząsteczki D N A . Ich obecność ham uje syntezę D N A oraz m echanizm n apraw y jego uszkodzeń pow stałych w w yniku d ziałania prom ienio w ania jon izującego czy UV. P olipeptydy te ograniczają proces transk ry pcji, a tak że w ydarzen ia p o transkryp cyjne i w yw ołują zm iany w lokalizacji polim eraz D N A .

C h a ra k te ry sty k a i d alsza id en ty fik acja białek, k tó ry c h ilość rośnie podczas szoku term icznego, jest niezbędna do zrozum ienia złożonych m e­ chanizm ów odpow iedzi kom órkow ej n a ten typ stresu o raz procesu śmierci k o m ó rek nim indukow anej. D o polipeptydów , k tó re zm ieniają sw oją ro z ­ puszczalno ść p o d w pływ em hip erterm ii n ależą m .in. p o lim erazy D N A i R N A , b iałka kom pleksu replikacyjnego, h n R N P i p ro d u k t genu c-m yc [24, 25],

M e ta b o liz m w ją d r a c h k o m ó r k o w y c h p o d d a n y c h d z ia ła n iu p o d w y ż s z o n e j te m p e r a tu r y

M atrik s ją d ro w a stanow i fizyczną po d p o rę utrzy m u jącą D N A w postaci up akow an ej; s tru k tu ra ta zaw iera zespół enzym ów niezbędnych d o jego

(7)

replikacji, napraw y i ekspresji [13]. W puli D N A jąd ro w eg o m o żn a w yróżnić dwie frakcje: 1) główną, stanowiącą około 75% ekstrahow anego z izolowanych ją d e r za p o m o cą zbuforow anego 0,2 m M ro ztw o ru M g C l2 o raz 2) zasoc- jo w a n ą ze szkieletem jądrow ym , stanow iącą 25% całości jądrow ego D N A . T ę o statn ią m o żn a dalej rozdzielić na frakcję rozpuszczalną w zbuforow anym 2 M roztw orze N aCl oraz resztkową, reprezentującą ok. 1% całości jądrow ego D N A , ściśle zw iązaną ze stru k tu rą opisyw aną ja k o m atrik s ją d ro w a 111 [6],

Szok term iczny wpływa n a biosyntezę D N A - m . in. n a tw orzenie now ych rep lik o n ó w , przyłączanie nukleo ty d ó w d o ro sn ąceg o łań cu c h a D N A , jego dojrzew anie, a także w iązanie m aszynerii replikacji D N A (ang. clusterosome) d o chrom osom u [65]. Z aobserw ow ano różnice we wrażliwości poszczególnych etapów replikacji n a hiperterm ię. E ta p elongacji łańcu cha D N A w ydaje się być opo rn y na podw yższoną tem p eratu rę (43,5°C) i nie d o ch o d z i d o jeg o h am o w a n ia n aw et przy in k u b acji w czasie 60 m in. Z aobserw ow ano, że w iązanie histonów do pow stającego D N A zachodzi szybciej w tem p eratu rze 42°C niż 37°C. K ażd y z tych etap ó w w ydaje się być zw iązany z m atrik s ją d ro w ą i okazuje odm ien ną w rażliw ość n a h ip erter­ mię. Podw yższona te m p e ra tu ra najsilniej ham uje w iązanie „c lu stero so m ó w ” d o chro m o so m u i dojrzew anie now o syntetyzow anego łań cu c h a w o statecz­ n ą po stać D N A . Z aham ow anie w iązania „clustero som ó w ” do D N A jest czynnikiem w arunkującym tw orzenie now ych repliko nó w i ograniczającym sem ikonserw atyw ną replikację. Podczas ekspozycji na tem p eratu rę 43°C (lub w yższą) aktyw ność dojrzew ania zm niejsza się przynajm niej o 50% lub jest zaham o w ana. N a to m iast w czasie inkubacji w tem p eratu rze 45°C d o jrze­ w anie D N A w ogóle nie zachodzi, a ilość w yznakow anego D N A zw iąza­ nego z m atrik s ją d ro w ą w zrasta. Powyższe w arunki hiperterm ii b lok ują dojrzew anie D N A przy aktyw nej elongacji jego łańcu ch a, co w skazuje n a oddzielenie aktyw ności tych dw óch etapów . N a p o d k re śle n ie zasługuje obserw acja, że przeniesienie k om órek inkubow anych uprzed nio w podw yż­ szonej tem p eratu rze (45°C, 30 m in) do tem p eratu ry 37°C d o p ro w a d za do przyw rócenia dojrzew ania pow stającego łańcucha D N A , je d n a k w ydajność tego procesu jest znacznie niższa. Z achodzi o n 35-45 razy wolniej niż w k o n tro li [65],

W poszukiw aniu wyjaśnienia m olekularnych podstaw ham ow ania replikacji D N A wywołanej hiperterm ią podjęto analizę aktywności enzym ów związanych z tym procesem , tj. polim erazy D N A a i fi oraz to po izom erazy II, białek w ykazujących zdolność do asocjacji ze szkieletem jąd ro w y m [66]. Szok term iczny zm niejsza aktyw ność w ym ienionych enzym ów w kom órce, przy czym p olim eraza D N A fi o k azała się bardziej n ań w rażliw a niż a.

A ktyw ność polim erazy D N A a. i fi w ją d ra c h k o m ó rek C H O , k tó re p o d d a n o hiperterm ii (45,5°C; 0 -30 m in), po ich w ydzieleniu, pozostaje w logarytm icznej zależności od czasu działania czyn n ik a stresogennego

(8)

i o k azała się niższa niż w p rzyp ad k u w artości uzyskiw anych d la tych enzym ów w całych k o m ó rk ach indukow anych szokiem w analogicznym czasie. Stopień u tra ty aktyw ności tych enzym ów , niższy w p rzy p ad k u całych kom órek , w ynika zapewne z faktu słabej zdolności usuw ania przez ekstrakcję polim eraz z ją d e r indukow anych term icznie, w których dochodzi do ogólnego wzrostu białek, w tym enzymatycznych. Zbliżoną tendencję opisano w przypad­ ku topoizom erazy, aczkolw iek enzym ten o kazał się bardziej term o stab iln y . O szacow ano, że inaktyw acja (w tem p. 45,5°C ) w 50% aktyw ności D N A polim erazy a. i [i w ym agała odpow iednio 10 i 15 m in., podczas gdy czas p o trze b n y d o analogicznego sp ad k u aktyw ności to p o izo m era zy w ynosił 30 m in [66].

M i l l s i M e y n [33] w skazali, że hiperterm ia wespół z p ro m ien io w a­ niem jo n izu jący m przyczynia się d o podw yższenia p o zio m u u szko dzeń D N A , przy czym nadw rażliw ość w ynika z zaburzeń n apraw y D N A . A u ­ torzy ci zaobserw ow ali korelację m iędzy w zrostem ilości b iałk a a z a h a ­ m ow aniem napraw y D N A w k o m ó rk ac h C H O p od dan ych d ziałan iu p o d ­ w yższonej te m p e ra tu ry . W y k o rz y stu ją c ten sam m o d el d o św ia d c z a ln y

k o m ó rk i C H O - w lab o ra to riu m W a r t e r s a [63] p o djęto p o szu k iw a­ n ia zw iązku m iędzy przyrostem m asy białek a zaburzeniam i w procesie n apraw y pojedynczych pęknięć D N A w k o m ó rk ac h p o d d an y ch hiperter- m ii [43, 44 i 45°C]. Przy ocenie zdolności napraw czych k o m ó rek wy­

b ra n o ja k o p a ra m e tr czas pó łtrw an ia uszkodzeń in dukow anych o k re ślo n ą d aw k ą (10 G y) p rom ieniow ania X. W yniki przeprow adzo ny ch eksp ery­ m en tó w w ykazały, że pod wpływem podw yższonej te m p e ra tu ry m aleje z d o ln o ść n a p ra w y p ojed y n czy ch pęk n ięć D N A o sz a c o w a n a w zro stem o k resu p ó łtrw a n ia uszkodzeń. H a m o w an ie n ap raw y D N A p o zo staw ało w ścisłej korelacji z przyrostem ilości białek w spółizolow anych z m atrik s ją d ro w ą , przy czym w ym agany był progow y, około d w u k ro tn y w zrost do z a p o czątk o w an ia ham ow ania. T a k ą korelację potw ierdziła p o n a d to zbliżo­ n a k in e ty k a p o w ro tu d o w arto ści k o n tro ln y c h zdolności n ap raw czy ch i m asy białek jądrow ych. O szacow ana zależność m iędzy w zrostem m asy białek m atrik s jądrow ej a ham ow aniem nap raw y D N A sugeruje, że obec­ ność d o d atk o w y c h białek w tej istotnej struk tu rze, stanow iącej ru sz to w a­ nie d la zo rg an izo w a n ia D N A w d om en y stru k tu ra ln e i fu n k c jo n a ln e, o d p o w iad a za upośledzenie n apraw y D N A , wyw ołane szokiem term icz­ nym . Ja k d o tą d ro z p atru je się dwie możliwości w yjaśniające w pływ w zro ­ stu ilości białek nukleoszkieletu n a zaburzenia napraw y D N A [63]: 1) b ia ­ łk a H IE N P m o g ą o g ran iczać akty w n o ść enzym ów re p eracy jn y ch przez u trudnienie dostępności uszkodzeń b ądź przez agregację tych enzym ów n a elem entach szkieletu jądrow ego; 2) zw iększona ilość białek (np. histonów ) zw iązanych z m atrik s ją d ro w ą m oże zm ieniać k o n fo rm ację D N A i s tru k ­ tu rę chro m atyny.

(9)

N a uwagę zasługują bad an ia zm ierzające do w yjaśnienia w pływ u hiper- term ii na proces transkrypcji. W dośw iadczeniach F i s c h e r a i wsp. [15] w ykorzystano ja k o m odel zap ło d n io n e ja ja Drosophila melanogaster. B ad a­ cze ci w ykazali, że dwie duże p odjednostki polim erazy R N A 11 o m .cz. 215 i 140 k D a w k o m ó rk ac h k o n tro ln y ch są zw iązane z „ro zp u szczaln ą fra k c ją ” ją d ro w ą , nato m iast w k o m ó rk ac h eksponow anych na podw yższoną tem ­

p e ra tu rę (37°C, 15 m in) większość cząsteczek b iałka enzym atycznego asoc- ju je z m atrik s jąd ro w ą. W dalszych eksperym entach p o djęto analizę ak ty w ­

ności polim erazow ej enzym u. W tym celu w yko rzy stan o m eto d ę tran sk ry p cji in vilro (z32P -U T P ) w obecności (lub bez) in h ib ito ra polim erazy R N A II - a-am anity ny. O kazało się, że w raz z czasem ekspozycji k o m ó rek n a podw yższoną tem p eratu rę sp ad a aktyw ność p olim erazow a, a po 2 godz. in k u b acji w te m p e ra tu rz e 37°C proces tran sk ry p cji ulega b lo k o w an iu . A so cjacja p o lim erazy R N A II z m a trik s ją d ro w ą nie w ydaje się być przy p ad k o w a, gdyż zidentyfikow ano w niej obecność dużych po djedn ostek (215 i 140 k D a), co w skazuje na zw iązanie z tą s tru k tu rą h oloenzym u, a nie zdenatu ro w an y ch podjednostek. In terak cja polim erazy R N A II ze sk ła d ­ nikam i szkieletu jądro w eg o praw d o p o d o b n ie zwiększa „ o c h ro n ę ” enzym u przed wpływem hiperterm ii. A ktu aln ie uw aża się, że ten ty p stresu przy­ czynia się do „p rzestaw ienia” transkrypcji. W iększość typow ych szlaków transk ry p cji zatrzym uje się, zaś w łączają się nowe, np. transk ryp cji ulegają geny hsp.

O statn io przedstaw iono dow ody w skazujące, że pierw otny tra n sk ry p t m R N A wiąże się z m atrik s jąd ro w ą, a kom pleksy ryb on u k leo p ro tein o w e b u d u ją jej sieć w ew nętrzną [71], Wiele b ad a ń wskazuje, że w ieloenzym atyczne kom pleksy p row adzące biosyntezę p re -rR N A o raz zespół zdarzeń to w arzy ­ szących jego dojrzew aniu (ang. processing) są bezpośrednio zasocjow ane z elem entam i m atrik s jądro w ej. Stąd wysoce p ra w d o p o d o b n e w ydają się sugestie, że szok term iczny przyczynia się d o w zrostu zaw arto ści białek jąd ro w y ch , k tó re m o g ą wiązać się z m aszynerią enzym atyczną i ham ow ać

dojrzew anie R N A [59],

C o s s i W a c h s b e r g e r [58] przedstaw ili wyniki b a d a ń n ad lokalizacją białek C ko m pleksu h n R N P zaangażow anych w proces dojrzew ania pre- -m R N A i w iążących h n R N P do m atrik s jądrow ej. B iałka C d ołączają się d o polipirym idynow ego 3’ ko ń ca intron ów , u do stęp n iając w ten sposób sekw encje p ierw o tn eg o tra n s k ry p tu w k o n fo rm a cji um ożliw iającej jeg o składanie (ang. splicing), co wskazuje n a pełnienie przez nie funkcji m o lek u lar­ nej opiekunki [16], Z a p o m o cą m o n o k lo n aln y ch przeciw ciał (4F4), skoniu- gow anych ze złotem (tzw. technik a im m unozłocenia), zlok alizow an o białka C w m atrik s jądrow ej kom órek C H O stresow anych i kon trolnych. P ozytyw ną reakcję im m unozłocenia obserw ow ano głównie w sieci w łókien m atrik s jąd ro w ej i resztkow ym ją d e rk u , zaró w n o w p re p a ra ta c h p o ch o d zący ch

(10)

z kom ó rek poddaw anych szokowi term icznem u, ja k i k o n tro ln y ch . P o n a d to w m a te ria le jąd ro w y m p o h ip erte rm ii w ykazano w zrost intensyw ności lluorescencji przeciwciał skierow anych przeciw białkom C. N a tej podstaw ie p rzy p u szcza się, że p odw y ższona te m p e ra tu ra w pływ a n a w zrost i/lub stabilizację w iązania białek C kom pleksu h n R N P w ją d e rk u i w łóknach m a trik s jądro w ej. N agro m adzen ie białek C w m iejscach syntezy rR N A m oże ham ow ać proces dojrzew ania p re -rR N A oraz jego tra n s p o rt [58],

H ip e rte rm ia h am u je sk ład an ie p re -m R N A i w ten sp o só b b lo k u je m atry cę w syntezie niepraw idłow ych białek, k tó re m ogłyby być szkodliw e d la k o m ó rk i [16]. Szok term iczny (podw yższona tem p. przez 1-2 godz.) p ro w ad zi in vitro d o inaktyw acji sk ład an ia p rc -m R N A w e k s tra k ta c h jąd ro w y ch ko m ó rek H eL a. W takich w aru n k ach stru k tu ra cząstek ró ż ­

nych U -sn R N P , k tó re są składnikam i spliceosom ów , ulega zm ianom . N a p o d staw ie b a d a ń im m u nologicznych stw ierd zo n o , że cząstki U -s n R N P , k tó re uczestniczą w dojrzew aniu p re-m R N A tw o rzą w n uk leoplazm ie sia­ teczkę po łączo n ą z w łóknam i m atrik s jądrow ej [50]. W w yniku d ziałania podw yższonej tem p eratu ry układ sieci tw orzonej przez cząstki U -sn R N P ulega ro z p ro szen iu . O sta tn io o p u b lik o w an e wyniki b a d a ń u jaw niły, że szok (45°C, 10 m in) prow adzi d o znacznej inaktyw acji sk ład an ia in vitro p re -m R N A fi globiny o raz podstaw ow ego czynnika transkry pcy jneg o S pl i praw ie całkow icie blokuje dojrzew anie p re-m R N A Sp4. W y kazano , że blokow anie sk ład an ia prekursorow ej cząstki m R N A w e k stra k ta c h k o m ó ­ rek p o d d an y ch działaniu podw yższonej tem p eratu ry (45°C, 10 m in) jest w ynikiem oddysocjow ania białek M z kom pleksu h n R N P i silnego zw ią­ zan ia z m atrik s jąd ro w ą. B iałka te m o gą pełnić funkcję „m oleku larnej o p iek u n k i” , wiążąc się do h o m orybopo lim eró w poli(G ) i poli(A ), w ten sposób zm ieniać konform ację pre-m R N A . Proces ten jest o dw racaln y po 6 godzinach inkubacji w tem p eratu rze 37°C. P rzypuszcza się, że o m aw ia­ ne an ty g en y m o g ą stan ow ić w łączniki i/lu b w yłączniki sk ła d a n ia pre- -m R N A [16].

L e e i w sp. [25] w ykazali, że hiperterm ia pow oduje uw alnianie now osyn- tetyzow anych białek z polisom ów i ich nagrom adzenie w jądrze kom órkow ym . A naliza elektroforetyczn a i au to rad io g raficzn a białek k o m ó rek C H O zn a­ kow anych przez 2 m in. [35S]-m etioniną, a następnie p o d d an y ch działaniu podw yższonej tem p eratu ry (45,5°C, 10 m in), d ostarczyła w yników św iad­ czących, że w ją d ra c h k o m ó rek ta k trak to w a n y ch znajduje się ok. 10 razy więcej ra d io a k ty w n y c h p o lip ep ty d ó w n iż w k o n tro ln y c h . H y d ro fo b o w e regio ny n o w o sy n tety zo w an y ch b iałek są ek sp o n o w a n e n a p o w ierzch ni. P o lipeptydy te ch a rak tery zu ją się szerokim zakresem m as cząsteczkow ych, znaczn ą ich część stan o w ią składniki niskocząsteczkow e, zb u d o w an e z ok. 10-100 reszt am inokw asow ych (m.cz. 1-14 k D a). N a g ro m ad zo n e b iałka zw iązane z m a trik s ją d ro w ą m o g ą oddziaływ ać n a proces replikacji D N A ,

(11)

jeg o napraw ę i transkrypcję. N a podkreślenie zasługują obserw acje, że in hibitory translacji (cykloheksym id, purom ycyna czy histydynol) ograniczają biosyntezę potencjalnie cytotoksycznych białek i stanow ią czynnik ochraniający przed podw yższoną te m p e ra tu rą [51, 52].

Przyw rócenie poziom u praw idłow ej syntezy D N A , R N A i białek, z a h a ­ m ow anej przez hiperterm ię, w ym aga rozbicia kom pleksów przez n ią in ­ dukow anych [20]. Zmniejszenie zawartości białek jądrow ych w czasie inkubacji w te m p e ra tu rz e 37°C p o cz ątk o w o przebiega b ard zo szybko, n a to m ia st w m iarę zbliżania się d o w artości kon trolnej znacznie słabnie. W y kazano liniow ą zależność m iędzy procesem zm niejszania po zio m u białek d o w artości 125% k o n tro li a odzyskaniem pełnej spraw ności ko m ó rek w syntezie R N A i białek. W ydaje się, że o p isan a zależność dla replikacji D N A m a c h a ra k te r w prost p ro p o rcjo n aln y , co potw ierdzon o w szerokim zakresie oddziały w an ia n a kom ó rk i szoku term icznego (w czasie od 30 m in d o 60 godz.) p o w o ­ dującego jej blok. Z godnie z wcześniejszymi obserw acjam i przedstaw ionym i przez badaczy [61, 68] replikacja D N A jest bardziej w rażliw a n a hiperterm ię niż synteza R N A i białek. W zrost poziom u białek jądrow ych nagrom adzonych w różnych substrukturach ją d ra kom órkow ego m oże być przyczyną odm iennej wrażliw ości syntezy D N A i R N A na szok term iczny. P o n a d to pojaw ienie się d o d atk o w y c h białek jądro w y ch wpływa n a stopień skręcenia D N A . W ydaje się, że podczas transkrypcji D N A ch arak tery zu je niższy poziom relaksacji niż podczas replikacji, co m oże tłum aczyć o d m ien n a w rażliw ość om aw ianych procesów n a stres term iczny.

P ozostaje otw artym pytanie, czy istnieje związek m iędzy czasem w ym a­ ganym d o w znow ienia pełnej syntezy D N A , R N A i b iałk a a okresem , w k tó ry m dochodzi do odzyskania praw idłow ej stru k tu ry m atrik s jąd ro w ej zm ienionej hiperterm ią? N a uwagę zasługują wyniki o statn io prezentow anych eksperym entów [59], w któ ry ch stw ierdzono, że w 20 godz. po zastoso w aniu szoku (45°C, 20 m in) poziom syntezy R N A stanow i tylko 8% w artości obserw ow anej w k ontroli. O kazało się, że w tych w a ru n k ach u ltra s tru k tu ra m a trik s jądrow ej aż w 90% przy p o m in a analogiczną s tru k tu rę k o m ó rek niestresow anych. N a tej podstaw ie m o żn a w nioskow ać, że przyw rócenie praw idłow ej p o staci szkieletu jąd ro w eg o n astęp u je p rzed w znow ieniem pełnej syntezy R N A . Jednak nie m ożna wykluczyć, że transkrypq'a określonych p o d k las R N A (pre-rR N A , p re -rR N A , czy sn R N A ) jest n ieo dzo w na do pow rotu prawidłowej struktury m atriks jądrow ej, zmienionej przez hiperterm ię. Integ raln o ść szkieletu jądro w eg o jest uzależniona od obecności R N A , co po tw ierd zają wyniki licznych b ad a ń [3, 18, por. 23],

Z m iany w m etabolizm ie jądrow ym indukow ane podw yższoną tem p eratu rą zn a jd u ją odzw ierciedlenie w składzie chem icznym i o b ra zac h u ltra s tru k tu ry m a trik s jądrow ej [55, 58].

(12)

Zmiany w ultrastrukturzc i składzie chemicznym

matriks jądrowej wywołane hipertermią

M atrik s stanow i szkielet ją d e r kom órko w y ch, któ ry p ozostaje w tej stru k tu rze p o ich ekstrakcji solam i, deterg entam i o raz traw ieniu nukleazam i [4-6, p o r. 22, 23], T a definicja m a c h a ra k te r operacyjny i jest sto so w an a dla resztkow ej, pozachrom atynow ej in fra stru k tu ry ją d ra k o m ó rek inter- fazow ych. W jej skład w chodzą: 1) resztk o w a o to c z k a ją d ro w a (ang. residual envelope) n az y w an a rów nież w arstw ą p eryferyczną, z b u d o w a n a z blaszki i porów otoczki jądrow ej; 2) resztkow e jąd erk o (a), zw ane rów nież m atrik s jąd erk o w ą; 3) sieć w łóknisto-ziarnisla (ang. internal m a trix) łącząca powyższe elem enty stru k tu raln e (rys. ,2a).

U ltra s tru k tu ra i skład chemiczny m atrik s jądrow ej w znacznym stop niu zależą od sposobu jej w ydzielenia, tj. 1) kolejności ekstrakcji ją d e r k o m ó r­ kow ych; 2) spo so b u u sunięcia h isto n ó w (N aC l, LIS, siarczan a m o n u , polianiony: siarczan d ek stran u -h ep ary n a); 3) stoso w ania deterg entó w wym y­ w ających lipidy (dezoksycholan sodu, N on id et N P .-40, T rito n X-100, Tw een 40, sap o n in a); 4) enzym ów n u k leolityczny ch (D N a z a I, m ik ro k o k a ln a nukleaza, R N a z a A , restrykazy) o ra z 5) obecności jo n ó w dw uw artościow ych [5, 6, por. 23, 37, 38], D o istotnych różnic w składzie chemicznym p reparató w m atrik s jądrow ej przyczyniają się: elim inacja w sposobie ich izolow ania, traw ie n ia R N a z ą , blok o w an ie g ru p tiolow ych, um ożliw ienie p o w sta n ia w ew nątrzcząsteczkow ych połączeń białek poprzez m o stk i disiarczkow e o raz stabilizacja term iczna [por. 23, 32],

R óżnice w ultrastruk turze m atriks jądrow ej kom órek p od dan ych działaniu podw yższonej tem p eratu ry ja k o pierw si o dnotow ali W a r t e r s i wsp. [62]. A n aliza p re p a ra tó w m atrik s ją d e r k om ó rek H e L a k o n tro ln y ch i p o d d an y ch hip erterm ii, zarów no w klasycznym m ik rosko pie elektronow ym ja k i sk a n in ­ gowym , ujaw niła znaczne różnice głów nie dotyczące sieci w łóknisto-ziarnistej oraz w arstw y peryferycznej.

B ad an ia m atrik s kom ó rek erytroleukem icznych m yszy (ang. m ouse eryt- hroleukem ia cells-, M E L ), w ydzielonej z ją d e r stab ilizo w an y ch in vitro w tem p eratu rze 37°C, oraz k o m ó rek p o d d aw an y ch szokow i term icznem u in vivo (43°C, 15 m in) sugerują, że n a tu ra stabilizacji in vitro jest od m ien n a od tej wywołanej stresem in vivo [31].

W a c h s b e r g e r i C o s s [58, 59] w bad an iach u ltrastru k tu ry m atrik s jądrow ej w ykorzystali hodow le synchronicznych k o m ó rek C H O , zatrzym ane w fazie G j (co pozw oliło wyelim inować zm iany wynikające z różnic w fazach cyklu kom órkow ego). W p re p ara ta ch nukleoszkieletu k o m ó rek C H O , p rzy ­ gotow anych tech n ik ą zatap ian ia bez żywicy (ang. resinless section), po usunięciu rozpuszczalnych w detergencie T riton X-100 elem entów cytoszkieletu,

(13)

R ys. 2. U ltra s tru k tu ra m atrik s jąd ro w ej k o m ó rek C H O w fazie G , ; a - k o n tro la ; b - p o działan iu szoku term icznego (45“C, 30 m in w g W a c h s b e r g e r a i C o s s a [59]; z a zg o d ą A u to ró w . N a fo to g rafiac h zaznaczono: resztkow e ją d e rk a (nu), blaszkę ją d ro w ą (1), w łó k n a

(14)

blon cytoplazm atycznych i jądrow ych, wyróżnia się blaszkę jąd ro w ą, natom iast w nętrze w ypełniają cienkie, m iejscam i zespolone w łók na m atrik s jądrow ej tw o rz ące stru k tu ry p rz y p o m in a ją ce „p la ste r m io d u ” (ang. honeycom b). Z kolei c h ro m a ty n a w ystępuje w postaci elektro now o gęstych nitek p o w ią­ zanych z w łóknam i m atrik s i blaszką jąd ro w ą.

U sunięcie z ją d e r k o m ó rek C H O ch ro m a ty n y p o p rz ez tra k to w a n ie D N a z ą I i siarczanem am o n u zm ienia o b raz w łókien m atrik s jąd row ej; stają się cieńsze i luźniej pow iązane (rys. 2a). Silnie u tk a n a w ew nętrzna s tru k tu ra nukleoszkieletu po takim działaniu jest m niej u p ak o w an a i w ykazuje słabiej za ryso w aną sieć. W dalszych dośw iadczeniach cytow ani b adacze [59] a n a ­ lizowali p aram etry m orfologiczne m a trik s jądrow ej przez p om iar liczby tzw. zespoleń w łókien (ang. anastomosing fib ers) p rzypadających n a jed n o stk ę pow ierzchni szkieletu jądro w eg o i po m iar długości w łókien m iędzy p u n k tam i zespoleń w ew nątrz tej stru k tu ry jądrow ej. D la opisyw anych p re p a ra tó w nuk leo szk ieletu k o m ó re k C H O śre d n ia liczba w łókien ze sp o lo n y ch n a pow ierzchni 1,62 /im 2 w ynosiła 41,9 + 7,4, n ato m iast średnia długość m iędzy p u n k tam i zespolenia - 0,133 ± 0,01 //m. W stru k tu rze m a trik s jądrow ej ob serw ow ano resztkow e ją d e rk a w postaci elek tron ow o gęstych ciał, od k tó ry ch rozpościerały się w łókna m atrik s jąd ro w ej d och od zące d o blaszki. W ew nątrz jąd erek opisan o regiony o odm iennej gęstości elektronow ej.

N a to m ia st w m a trik s w ydzielonej z ją d e r k o m ó rek p o d d an y ch szokow i (43°C, 60 m in) o d n o to w an o szereg zm ian (rys. 2b). N ukleoszkielet p ozostaje otoczo n y blaszką, a jego w łókna tw o rz ą sieć o wyższym sto p n iu zespolenia w p o ró w n a n iu z p re p a ra ta m i k o n tro ln y m i [59], A n a liza p o ró w n a w c z a długości w łókien ujaw niła, że w p re p a ra ta c h m atrik s jądro w ej p o d d an y ch działaniu hiperterm ii ulegają one średnio dw ukrotnem u skróceniu. Jednocześnie zaob serw ow ano 2,5-krotny w zrost gęstości sieci w łókien tej stru k tu ry . D o b a d a ń w łączono tech n ik ę d en sy to m etrii k o m p u tero w e j, k tó ra w y k azała w zrost gęstości elektro now ej w s tru k tu ra c h szkieletow ych izo lo w an ych z ją d e r p o d d a w a n y c h d ziałan iu podw yższonej te m p e ra tu ry . O trz y m a n e rezu ltaty w skazują, że gęstość nukleoszkieletu zależy zaró w n o od czasu trw a n ia stresu term icznego, ja k i w ysokości tem p eratu ry stosow anej podczas eksperym entów [58],

H ip erte rm ia pow oduje rów nież zm iany w u ltra stru k tu rz e ją d e re k [58, 59], C echuje je więcej w olnych przestrzeni niż analogiczne stru k tu ry w p re ­ p a ra ta c h nie pod d aw an y ch stresow i term icznem u, a p o n a d to zdolność do agregacji z otaczającym je m ateriałem peryferycznym . O becnie uw aża się, że szok term iczny p row adzi do u tra ty lub przem ieszczenia m a te ria łu ze sk ład n ik a w łóknistego ją d e re k i n agrom ad zen ie w składn ik u ziarnistym . Te zm iany m orfologiczne m o g ą być rezultatem b lo k o w an ia lub spow oln ien ia syntezy p re -rR N A i/lub dojrzew ania pow stałego tran sk ry p tu spow odow anego zw iększeniem zaw arto ści białek C k o m p lek su h n R N P w ją d e rk u i we

(15)

w łóknach m atrik s jądrow ej [58], P odw yższona ilość białek m o że także w pływ ać n a u tratę zdolności jąd crek d o ich dezintegracji po działaniu podw yższonej tem p eratu ry w obecności czynników m itotycznych.

U ltra stru k tu ra ln e zm iany w ją d ra c h kom órk ow y ch ind u k o w an e przez hiperterm ię, u p odstaw któ ry ch leży zw iększony poziom białek zw iązanych z m atrik s ją d ro w ą , w pływ ają n a procesy jąd ro w e i m o g ą p row adzić do p o w stan ia defektów . Z kolei, jeśli pow stałe uszkodzenia nie ulegną n a ­ praw ie, wówczas stają się cytotoksyczne i najczęściej pro w ad zą d o śmierci k o m ó rk i. O k azało się, że zm iany w u ltrastru k tu rz e szkieletu jądro w eg o k o m ó re k C H O są odw racalne, jeżeli k om ó rk i w określonych w a ru n k ach stresu w ykazują w skaźnik przeżyw alności o dpow iadający w artości 0,3 (lub wyższej) [59], W skaźnik ten określa liczbę k om órek, z pierw otnie w p ro w a­ dzonych do p odłoża 5000/cm 2, k tó re po szoku term icznym w czasie in­ kub acji (37°C, 10-12 dni) tw o rzą kolonię złożoną z co najm niej 50 k o m ó ­ rek. U ltra stru k tu rę nukleoszkieletu kom ó rek po działaniu podw yższonej tem p eratu ry (45°C, 20 m in), a następnie inkubo w an ych (37°C, 30 m in), cechuje silniejsze u tk an ie sieci jego w łókien o raz wyższa gęstość elek tro n o w a ciałek jąd row ych. W k o m ó rk ac h tak trak to w an y ch liczba p u n k tó w ze­ spolenia w łókien m atrik s jądrow ej n a określonej pow ierzchni stanow i 170% w artości charakterystycznej d la k o m ó rek k o n tro ln y ch , n a to m ia st długość w łókien - zaledwie 30% tej obserw ow anej w k o m ó rk ac h niestresow anych. O kazało się, że w 20 godz. po działaniu stresu o b ra z m a trik s jąd ro w ej w m ik ro sk o p ie elek tro n o w y m p rz y p o m in a w znacznym sto p n iu (9 0% ) u ltra stru k tu rę k o n tro ln ą . D ługość w łókien i liczba p u n k tó w zespolenia tych w łókien o d p o w iad a w artościom charakterystycznym dla k o m ó rek n iestreso­ w anych. W skaźnik przeżyw alności k om órek w opisyw anych w a ru n k ach stresu w ynosił ok o ło 0,3 + 0,03.

W a c h s b e r g e r i C o s s [59] ocenili, że p o osiągnięciu przez ko m ó rk i w skaźnika przeżyw alności poniżej 0,01 zm iany w u ltra stru k tu rz e m atrik s jąd ro w ej okazały się nieodw racalne. W szkielecie jąd ro w y m wydzielonym z k om órek inkubow anych (37°C, 30 m in) i pod d an y ch szokow i term icznem u (45°C, 30 m in) liczba p u n k tó w zespolenia w łókien w zrosła o 182 + 15% , a długość w łókien zespolonych uległa skróceniu o 65 + 4 % w p o ró w n an iu z k o n tro lą. U ltra stru k tu ra m atrik s jądrow ej po 24 godz. od d ziałania cz ynnik a stresu (45°C, 30 m in) znacznie zm ieniła się w p o ró w n a n iu do analogicznej stru k tu ry kom ó rek niestresow anych. W trak to w a n y ch w pow yż­ szych w a ru n k a c h k o m ó rk a c h sieć w łókien szkieletu ją d ro w e g o cechuje niejednolite rozm ieszczenie oraz form ow anie agregatów , n a to m ia st ciałka ją d ro w e podlegają fragm entacji i w ykazują wyższą gęstość elektro no w ą. O pisane w arun ki hiperterm ii h am u ją proces n apraw y uszkodzeń w u ltra ­ stru k tu rz e szkieletu jądrow ego. O kazało się, że zm iany w u ltra stru k tu rz e

(16)

m atrik s jądrow ej, obserw ow ane w 20 godz. po inkubacji (45°C, 30 m in) p o jaw iają się wcześniej i m o żn a je zid en ty fik o w ać ju ż w 2 godz. po działaniu stresu.

T a b e l a 2

Z m ian y ilościow e w śród białek jader i m alrik s jąd ro w ej k o m ó rek H e L a p o d d a n y ch hip erterm ii (45°C, 30 m in) [55]

G ru p a

B iałka h sp lub pasm a białkow e

m .cz. [kDa]

W zględny w zrost zaw artości

białek p o d wpływem hiperterm ii M e to d a detekcji ją d ro ko m ó rk o w e m atrik s ją d ro w a A 146 1,5 2,5 C B “ 120 1,4 2,2 CB 108 1,4 3,1 CB 97 1,7 2,6 CB 90 1,6 4,6 CB 76 1,4 3,0 CB 47 1,5 2,2 CB B 30 1,3 1,7 CB hsp-70 3,5 4,5 hsp-70; IBb hip-27 3,7 2,9 hsp-27; IB 90 1,8 1,7 a n ty M J; IB 72 1,3 1,3 a n ty M J; IB C 28 1,0 1,8 CB 26 1,0 1,7 CB T o p o I 0,9 10,1 to p o I; IB T o p o I 0,8 8,2 to p o II; IB 57 1,0 1,3 a n ty M J; IB D 43 1,1 1,0 CB 38 1,1 1,1 CB 34 1,1 1,2 CB 22 1,0 1,2 CB 20 0,9 0,8 CB 17 0,9 1,0 CB 15 0,8 0,9 CB 47 1,0 1,0 a n ty M J; IB

W zględna zaw arto ść indyw idualnych p asm białkow ych u zy sk an a tec h n ik ą skaningow ej d en sy to m etrii laserow ej p o rozdziale b iałek ją d ro w y ch i m atrik s ją d ro w ej w żelu p o liak - rylam id o w y m zaw ierającym SD S i w ybarw ieniu błękitem brylan to w y m C o o m assie (CB) lub im m u n o d etek cji an ty g en ó w tec h n ik ą W estern b io t (IB) w obecności przeciw ciał skierow anych p rzeciw ko h sp - 27, h sp - 70, to p o izo m erazie I i II (to p o I i to p o II) lub białkom m atrik s jąd ro w ej (an ty M J). G ęsto ść o p ty czn ą każd eg o p o lip ep ty d u frakcji jąd ro w ej czy m atrik s jąd ro w ej, w ydzielonych z k o m ó re k H e L a p o d d a n y ch h ip erterm ii, p o ró w n a n o z analo g iczn y m pasm em k o m ó rek k o n tro ln y c h , w k tó ry ch zaw arto ść p rzy jęto ja k o 1,0.

(17)

W połow ie lat osiem dziesiątych W a r t e r s i wsp. [62] p od dali szerokiej analizie elektroforetycznej białka m atriks jądrow ej kon troln ych i stresow anych podw yższoną tem p eratu rą (45°C, 30 m in) kom órek H eLa. Białka tej struktu ry kom ó rek k o n tro ln y ch cechow ała obecność głównych składników o m .cz. 45, 47, 55, 57, 59 i 65 kD a. Z kolei szok term iczny przyczyniał się do istotnego w zrostu zaw artości polipeptydów tej stru k tu ry o m .cz. 28,5, 38,5, 60, 66, 81, 88 i 100 k D a , a w ocenie densytom etrycznej w yrażał się w artościam i odpow iednio 1,5, 1,9, 1,5, 1,3, 1,7, 2,2 i 1,7 razy wyższymi d la ko m órek stresow anych w poró w n an iu z kontrolnym i.

Z m iany w składzie polipeptydow ym kilku składników m atrik s jądrow ej k o m ó rek poddaw anych hiperterm ii (H eL a, B M K , C H O ) o d n o to w a n o w li­ te ra tu rz e przed m io tu w ielokrotnie [24, 35-38, 42, 43, 64, 69],

N a podkreślenie zasługują o statn io o pub lik ow ane wyniki eksperym en­ tów zespołu R o t i - R o t i [55] dotyczące porów naw czej analizy białek jąd ro w y ch i tych zasocjow anych z m atrik s ją d ro w ą k o m ó rek H e L a eks­ p o now anych na podw yższoną tem p eratu rę (45°C) w czasie (0-75 m in). W to k u b ad a ń oszacow ano ilościowe zm iany składnikó w tych s tru k tu r poprzez skaningow ą densytom etrię laserow ą białek w ybarw ionych błękitem brylantow ym C oom assie (po rozdziale m eto d ą S D S -P A G E ) o ra z detekcję antygenó w (techn iką W estern biot) w obecności przeciwciał skierow anych przeciw ko polipeptydom m atrik s jądrow ej (anty M J) bąd ź kom ercyjnie d o stęp n y ch przeciw ciał (a n ty -to p o I, an ty -to p o II, an ty -h sp2 7 i anty- -hsp70). W nikliw a ocena ilościowa elektroferogram ów an alizow anych b ia ­ łek d o p ro w ad ziła do ich podziału n a cztery grupy. W grupie opisyw anej ja k o A znalazły się składniki, k tórych w zrost obserw ow ano p o działaniu podw yższonej tem p eratu ry , zarów no w niefrakcjo no w anych ją d ra c h , ja k i m atrik s jądrow ej, choć w tej ostatniej znacznie wyższy (por. tab. 2). D o g rupy B zakw alifikow ano polipeptydy, w k tóry ch zm iany ilościow e były porów nyw alne w ją d ra c h i m atrik s jądrow ej. O bjęto w tej grupie m . in. hsp27 i hsp70 o raz białka o m .cz. 72 i 90 k D a , ro zp o zn aw an e przez przeciw ciała anty M J. Z kolei d o grupy C zaszeregow ano b iałka, któ ry ch ilość w niefrakcjonow anych ją d ra c h była zbliżona d o tej w ją d ra c h k o m ó ­ rek k o n tro ln y ch (niestresow anych), zaś znacząco w zrastała w ich szkiele­ cie. Z askoczeniem jest p o n ad 10- i 8-krotny w zrost enzym ów zw iązanych z to p o lo g ią i m etabolizm em D N A , tj'. topoizom erazy I i II. W śród czło n­ ków grupy D znalazły się polipeptydy, których ilość zaró w n o w ją d ra c h ja k i m atrik s jądrow ej praktycznie nie zm ienia się po d wpływem szoku term icznego.

Z przedstaw ionych danych w ynika, że większość białek w zbogacających ją d r a k o m ó rk o w e oraz ich stru k tu ry szkieletow e w sk utek agregacji b ądź zm niejszenia ich rozpuszczalności zakłóca zaró w n o skład chem iczny, u ltra- stru k tu rę , ja k i podstaw ow e procesy, tj. replikację, procesy nap raw y D N A ,

(18)

m etabolizm R N A . Te zakłócenia są m . in. przyczyną indukow anej term icznie cytotoksyczności [7, 24, 25, 31, 51, 52, 62, 66],

W nikliw e analizy w ykazały log ary tm iczn ą zależność m iędzy w yw ołanym h iperterm ią (45°C) w zrostem ilości białek w m atrik s jąd ro w ej a śm iercią k o m ó rek H e L a [62]. O kazało się, że w zrost o 15% zaw artości białek zasocjow anych ze szkieletem jąd row ym nie przyczynia się d o śm ierci tych k o m ó rek , ale ich 35% w zrost zw iększa jej p ra w d o p o d o b ień stw o d o oko ło 63% .

L IT E R A T U R A

[1] A n a n t h a n J., G o l d b e r g A. L., V o e l i m y R. (1986), Science, 232, 522-524. [2] B e c k e r J., C r a i g E. A. (1994), E u r. J. B iochem ., 219, 11-23.

[3] B e l g r a d e r P., S i e g e l A. J., B e r e z n e y R . (1991), J. Cell Sei., 98, 281-291. [4] B e r e z n e y R. , C o f f e y D . S. (1974), B iochem . B iophys. R es. C o m m u n ., 60, 1410-1417. [5] B e r e z n e y R . (1991), J. Cell. B iochem ., 47, 109-123.

[6] B e r e z n e y R. , M o r t i l l a r o M. J., M a H. , W e i X. , S a m a r a b a n d u J. (1995), I n t. R ev. C ytol., 162A, 1-65.

[7] B o r e l l i M. J., S t a f f o r d D. M. , R a u s c h C. M. , L e p o c k J. R. , L e e Y. J., C o r r y P. M. (1992), R a d ia t. R es., 131, 204-213.

[8] B o r e l l i M. J., L e p o c k J. R. , F r e y H. E., L e e Y. J., C o r r y P. M. (1996), J. Cell. P hysiol., 167, 369-379.

[9] C a l l e b a u t I., R e n o i r J.-M ., L e b a u M. C., M a s s o l N. , B u r n y u A. , B a u - l i e u E .-M ., M o r m o n J.-P. (1992), P roc. N atl. A cad . Sei. U .S .A ., 89, 6270-6274. [10] C r a i g E. A. , M c C a r t h y B. J. (1980), N ucleic A cids R es., 8, 4441-4457.

[11] C r a i g E. A. , G a m b i l l B. D. , N e l s o n R. J. (1993), M ic ro b io l. R ev., 57, 402-414. [12] C h e n Q. , O s l e r y o u n g K. , V i e r l i n g E. (1994), J. Biol. C hem ., 269, 13216-13223. [13] D a v i e J. R . (1995), In t. Rev. C ytol., 162A, 191-248.

[14] D e J o n g L., G r a n d e M. A. , M a t t e r n K. A. , S c h u l W. , v a n D r i e l R. (1996), C rit. R ev. E u k ary o tic G ene E xpression, 6, 215-246.

[15] F i s c h e r P. A. , L i n L., M c C o n n e l l M. , G r e e n l e a f A. , J a e - M o o n L. , S m i t h D . E. (1989), J. Biol. C hem ., 264, 3464-3469.

[16] G a t t o n i R. , M a h e D. , M ä h l P. , F i s c h e r N. , M a t t e i M. G. , S t v e n i n J., F u c h s J. P. (1996), N ucleic A cids R es., 24, 2535-2542.

[17] G r o s s C. A. , S t r a u s s D. B., E r i c k s o n J. U. , Y u r a T. (1990), [w:] S /ress Protein

in Biology and M edicine, red. R . M o r i m o t o , A. T i s s i e r e s , C. G e o r g o p o u l o s ,

C old S pring H a rb o r Press, N ew Y o rk , 167-189.

[18] H e D ., N i c k e r s o n J. A., P e n m a n S. (1990), J. Cell Sei., 110, 569-580. [19] H e l m K. W. , S c h m e i t s J., V i e r l i n g E. (1995), P lan t Physiol., 107, 287-288. [20] H i g a s h i k u b o R. , R o t i R o t i J. L. (1993), R a d ia t. R es., 134, 193-201. [21] K e y s e S. M. , E m s l i e E. A. (1992), N a tu re, 359, 644-647. [22] K i l i a n s k a Z. (1989), P o st. Biol. K o m ., 16, 61-86. [23] K i l i a n s k a Z. (1994), P o st. Biol. K o m ., 21, 27-42. [24] L a s z l o A. , W r i g h t W. , R o t i R o t i J. L. (1992), J. Cell. Physiol., 151, 519-532. [25] L e e Y. J., B o r r e l l i M. J., C o r r y P. M . (1991), B iochem . B iophys. R es. C o m m u n .,

(19)

[26] L e e I). H ., S h e r m a n M . Y , G o l d b e r g A . L. (1996), M ol. Cell. B iol., 16, 4773-4781. [27] L e n n e C. (1995), B iochem . J , 311, 805-813.

[28] L e w i s M. J , P e l h a m H. R. B. (1985), E M BO J „ 4, 3137-3143.

[29] L i v a k K. T , F r e u n d R , S c h w e b e r M , W c n s i n k P. C , M e s e l s o n M. (1978), P roc. N atl. A cad . Sei. U .S .A ., 75, 5613-5617.

[30] M a r t e l 1 i A. M , G il m o u r R . S , F a l c i e r i E , M a n z o I i F. A , C o c c o L. (1990), E xptl. Cell R e s , 190, 227-232. [31] M a r t e l l i A. M , F a l c i e r i E , G o b b i P , M a n z o l i L , G i l m o u r R. S , C o c - c o L. (1991), E xptl. Cell R e s , 196, 216-225. [32] M a r t e l l i A. M , C o c c o L , R i c d e r e r B. M , N e r i L. M. (1996), H istol. H is to p a th o l, 11, 1035-1048. [33] M i l l s M. D „ M e y n R. E. (1983), R a d ia l. R e s , 95, 327-338. [34] M i r o n T , V a n c o m p e r n o 11 e K. , V a n d e k e r c k h o v e J , W i l c h e k M. , G e i ­ g e r B. (1991), J. Cell B io l, 114, 255-261. [35] N e r i L. M , S a n t i S , M a r u g g R. A , R i e d e r e r B. M , C a p i t a n i S , C a t a l - d i A „ M a r t e l l i A. M. (1994), E xptl. Cell. R e s , 213, 275-285. [36] N e r i L. M , R i e d e r e r B. M , M a r u g g R. A , C a p i t a n i S , M a r t e l l i A . M. (1995), E xptl. Cell. R e s , 221, 301-310. [37] N e r i L. M , R i e d e r e r B. M , M a r u g g R. A , C a p i t a n i S , M a r t e l l i A . M. (1997a), J. H istochem . & C y to c h e m , 45, 295-305.

[38] N e r i L. M , R i e d e r e r B. M , M a r u g g R. A , C a p i t a n i S , M a r t e l l i A . M. (1997b), J. H istochem . & C y to c h e m , 45, 1317-1328.

[39] N o v e r L , S c h a r f K .-D . (1997), Cell. M ol. Life S e i, 53, 80-103. [40] P a u l i D , A r r i g o A . - P , T i s s i e r e s A. (1992), E x p erien tia, 48, 623-629. [41] P e l h a m H . R. B. (1984), E M B O J , 3, 3095-3100.

[42] P o u c h e l e t M , S t - P i e r r e E , B i r b o r - H a r d y V , S i m a r d R. (1983), E xptl. Cell R e s , 149, 451-459.

[43] R e i t e r T , P e n m a n S. (1983), P roc. N atl. A cad . Sei. U .S .A ., 80, 4737-4741. [44] R i t o s s a F. (1962), E x p erien tia, 18, 571-573.

[45] R i t o s s a F. (1964), E xptl. Cell R e s , 35, 602-607.

[46] R o t i R o t i J. L „ W i n w a r d R. T. (1978), R a d ia l. R e s , 74, 159-169.

[47] R o t i R o l i J. L , L a s z l o A . (1988), [w:] Thermal Effects o f Cells and Tissues, eds. M . U r a n o , E. D o u p l e , VSP, T h e N eth erlan d s, 13-56.

[48] R o t i R o t i J. L„ T ü r k e i N . (1994), R a d ia l. R e s , 138, 286-290. [49] S c h l e s i n g e r M. J. (1994), Ped iatr. R es., 36, 1-6.

[50] S p e c t o r D . L. (1990), Proc. N a tl. A cad. Sei. U .S .A ., 87, 147-151.

[51] S t e g e G. J. J , L i G. C , L i L , K a m p i n g a H. H , K o n i n g s A . W . T . (1994), In t. J. H y p erth erm ia, 10, 659-674.

[52] S t e g e G. J. J , K a m p i n g a H. H , K o n i n g s A . W . T . (1995), In t. J. R a d ia t. B io l, 67, 203-209. [53] T i s s i e r e s A , M i t c h e l l H , T r a c y U. M. (1974), J. M o l. B io l, 84, 389-398. [54] T o m a s o v i c S. P , T u r n e r G. N , D e w e y W . C. (1978), R a d ia t. R e s , 73, 535-552. [55] V a n d e r W a l l R , T h a m p y G , W r i g h t W. D , R o t i R o t i J. L. (1996), R a d ia t. R e s , 145, 746-753. [56] V e l a z q u e z J. M , L i n d q u i s t S. (1984), Cell, 36, 655-662. [57] V o e l l m y R , G o l d s c h m i d I - C l e r m o n t M , S o u t h g a t e R , T i s s i e r e s A , L e v i s R , G e h r i n g W . (1981), Cell, 23, 261-270. [58] W a c h s b e r g e r P. R , C o s s R. A. (1993), J. Cell. P h y s io l, 155, 615-624. [59] W a c h s b e r g e r P. R , C o s s R. A. (1994), J. Cell. P h y s io l, 160, 97-106. [60] W ä r t e r s R. L , R o t i R o t i J. L. (1982), R a d ia t. R e s , 92, 4 5 8-462.

(20)

[61] W ä r t e r s R. L., S t o n e O . L. (1983), R a d ia t. R es., 96, 646 -652.

[62] W ä r t e r s R. L., B r i z g y s L. H. , S h a r m a R. , R o l i R o l i J. L. (1986), In t. J. R a d ia l. B iol., SO, 253-268.

[63] W ä r t e r s R. L., B r i z g y s L. H. , L y o n s B. W. (1987), Int. J. R a d ia t. BioL, 52, 299-313. [64] W ä r t e r s R. L., B r i z g y s L. H . (1988a), C an cer R es., 48, 3932-3938.

[65] W ä r t e r s R. L. (1988), R a d ia t. R es., 115, 258-272. [66] W ä r t e r s R. L., C h u G. L., W o n g R. S. L., L y o n s B. W. , D e w e y W . C . (1993), J. Cell. Physiol., 154, 402-409. [67] W e l c h W. J., S u h a n J. P. (1985), J. Cell. Biol., 101, 1198-1211. [68] W o n g R. L., D e w e y W. C. (1982), R ad iat. Res., 92, 370-395. [69] W r i g h t W. D. , H i g a s h i k u b o R. , R o t i R o t i J. L. (1989), C y to m e try , 10, 303-311.

[70] W u C. (1995), A n n u . Rev. Cell D ev. B iol., 11, 441-469.

[71] X i n g Y. , J o h n s o n C. V., M o e n P. 'I'., M c N e i l J. A. , L a w r e n c e J. B. (1995), J. Cell Biol., 131, 1635-1647.

W płynęło d o R edakcji F o lia biochim ica et biophysica 24.04.1998

Z o ß a M . Kiliańska, A netta Ptasińska

C H A N G E S IN C E L L N U C L E I IN D U C E D BY H E A T S H O C K

E x p o su re o f cells to h y p erth erm ic te m p e ra tu res (43° to 48°C ) resu lts in a n in crease o f th e to ta l p ro te in m ass w hich coisolates w ith the nuclei. P ro m in en t p h ysiological effect o f h eat- -shock o n n u c le a r stru c tu re is in h ib itio n o f D N A rep licatio n and re p air, an d also R N A sy n th esis an d p ro cessin g . H e a t-sh o c k -in d u c e d p ro te in m ass in crease h as been sh o w n to c o rre la te w ith u ltra s tru c tu ra l ch an g es an d p o ly p ep tid e c o m p o s itio n o f n u c le a r skeleto n - n u c le ar m atrix .

K a te d ra C ytobiochem ii U niw ersytet Ł ódzki

Cytaty

Powiązane dokumenty

Dobowe wydalanie białka z moczem u starzejących się szczurów Stężenie kreatyniny w surowicy. Dobowe

Our study involved the first-ever evaluation of the performance of anther culture and wheat × maize hybridization techniques in producing haploids or doubled haploids

chromosomami, kiedy zaczyna się odtwarzać jądro, teleofazowe zostaje wznowiona synteza rRna, dzięki czemu jąderka staja się dobrze widoczne. W czasie interfazy typowe jąderko jest

Z dziejów sokolnickiej królew szczyzny... polem iczny;

P iasek p ustyń afrykańskich silnie bardzo rozgrzewa się od prom ieni słońca i szybko ciepła swego udziela powietrzu, kiedy tym czasem lody i śniegi północy

 Inclusive DIS measurements Inclusive DIS measurements   Strange Strange Content negatively polarized with respect Content negatively polarized with respect.. to

Tekst stanowi przedmiot badania kilku dziedzin, a mianowicie stylistyki, retoryki, poetyki, gramatyki tekstu (je˛zykoznawstwa tekstowego), naste˛pnie – lingwistyki tekstu, zwanej

19 kontrolowanych badaniach wykaza- ła, że wysokie stężenie białka ostrej fazy (CRP, C-reactive protein) w surowicy chorych z nadciśnieniem tętniczym nie tylko jest