Viral markers screening and transfusion safety

(1)

Praca poglądowa/Review

Bezpieczeństwo krwi w aspekcie badań wirusologicznych

Viral markers screening and transfusion safety

Piotr Grabarczyk *

ZakładWirusologii,InstytutHematologiiiTransfuzjologii, Kierownik:prof.drhab.n.med.MagdalenaŁętowska, Warszawa,Polska

informacje o artykule

Historiaartykułu:

Otrzymano:31.05.2013 Zaakceptowano:02.07.2013 Dostępneonline:19.07.2013

Słowakluczowe:

HCV

HBV

HIV

okienkodiagnostyczne

zakaźność

dawcykrwi

bezpieczeństwoprzetoczeń

Keywords:

HCV

HBV

HIV

Windowperiod

Infectivity

Blooddonors

Transfusionsafety

abstract

Currentresidual infectionrisk bytransfusionfor hepatitis BandCviruses (HBV,HCV) andfor humanimmunodeﬁciencyvirus (HIV) is thelowestin thehistory.It has been achievedmainly byintroduction ofserologicalmarkersscreening(HBsAg,anti-HCVand anti-HIV) and nucleic acid testing (NAT). These procedures allow identifying donors infectedinchronicandveryearlystagesoftheinfection.

TheincidenceandprevalenceofHBVandHCVinfectionamongblooddonorsinPoland remainstable,howeverinthecaseofHIV,inrecentyears,anincreasingtrendisseen.

The residual risk of infection is associated primarily with diagnostic window. For donationstestedindividually,thisperiodisestimatedtobe11.6,1.5,3.3days forHBV, HCVandHIV,respectively.Inthecaseofscreeninginplasmapoolsofeightdonationsit iscalculatedfor18.2,2.7and5.5days.ParticularlyforHIV,polymorphismatthegenomic levelisanadditionalriskfactor.

Recentobservationsconfirmthat,infectivityduringwindowperiodisveryhigh–even singlevirionscouldtransmitinfection.AtthefinalstageofchronicHBVinfection(OBI) infectivityisstillsignificantbutmuchlower(about1,000copies).

Inrecentyearsithasbeen demonstratedthatincreasedanalyticalsensitivitytrans- latesintoasignificantimprovementoftheclinical sensitivity.Furtherreductionofthe diagnostic window for individual donations testing is possible by increasing the effi- ciencyoftheextractionandamplification(e.g.HBVinUltrioPlusandUltrioElite)orby increasingthevolumeofthetestsample(e.g., HCVandHIVin testsbasedon TMAor PCR).It was demonstratedthat theamplification ofmore thanone regionof the HIV genomecontributetotherecovery/improvementofclinicalsensitivitylostinthecaseof blooddonationsinfectedwithescapemutants.

One wayto reduce the number of infected donors is to improveselection process involving questionnaire and interview before every donation. The process should be updatedbasedontheanalysisofcurrentsourcesofinfection.

*Adresdokorespondencji:ZakładWirusologii,InstytutHematologiiiTransfuzjologii,ul.IGandhi12,02-972Warszawa,Polska.

Tel.:+48223496600wewn.135;fax:+48223496614.

Adresemail:pgrabarczyk@ihit.waw.pl.

ContentslistsavailableatSciVerseScienceDirect

Acta Haematologica Polonica

journal homepage:www.elsevier.com/locate/achaem

http://dx.doi.org/10.1016/j.achaem.2013.07.010

(2)

Wprowadzenie

Wielewirusówzakażającychludziwswoimcyklużyciowym pojawia się we krwi i może stanowić potencjalne źródło zakażenia biorcy krwi i jej składników [1]. W niniejszym opracowaniu, na podstawie aktualnego piśmiennictwa, dokonano oceny ryzyka zakażenia przez transfuzję wiru- sami,któresąbadanerutynowoudawcówkrwi–wirusem zapalenia wątroby typu B (HBV), typu C (HCV) i ludzkim wirusem niedoboru odporności (HIV). Ryzyko zakażenia HCV,HBViHIVjestwypadkowąwieluczynników. Wpracy przeanalizowano aktualną sytuację epidemiologiczną, wpływ czułości analitycznej i klinicznej obecnie stosowa- nych testów przeglądowych na ryzyko zakażenia przez krew.Przedstawiono najnowszedanedotyczące zakaźności przeztransfuzję.OmówionotakżeobecnąrolębadaniaDNA parvowirusaB19(B19V) ijego perspektywywzapewnieniu bezpieczeństwaprzetoczeńkrwi.

Wysokiebezpieczeństwoprzetoczeńkrwiijejskładników zostałoosiągniętem.in.przezwprowadzeniebadańmarke- rów zakażeń wirusowych przed każdą donacją. Tego typu działania w Polsce rozpoczęto napoczątku lat siedemdzie- siątychwraz z sukcesywnymwprowadzaniem badańanty- genuHBsudawcówkrwi[2]. Od 1987rokuwszyscy dawcy badani sąna obecność przeciwciał anty-HIV [3], a od1994 anty-HCV[4].Przełomminionegoipoczątekobecnegostule- cia stał pod znakiem wprowadzania badań przeglądowych metodamibiologiimolekularnej.W1999rozpoczętobadania RNA HCV u dawców osocza przeznaczonego do frakcjono- wania, aod 2002 objęto nimi wszystkich dawców. W 2005 roku wprowadzono obowiązkowe badania RNA HIV i DNA HBVuwszystkichdawców[5].

Przez okres ponad 30 lat doskonalono metodykębadań przeglądowych. Metodyserologiczne imolekularne charak- teryzowałysięcoraz większączułością analityczną, atakże kliniczną, ponieważ identyﬁkują m.in. zakażenia formami polimorﬁcznymi dotychczas niewykrywalnymi (np. mutantami ucieczki HBV). Znaczenie i efektywność tych działań dlabezpieczeństwabiorców pokazujeporównanieczęstości zakażeń wśród osób leczonych krwią lub/i jej składnikami przedipowprowadzeniubadańprzeglądowych[6].

Czynniki wpływające na aktualne ryzyko zakażenia HCV, HBV I HIV przez transfuzję w Polsce

Pozostałe ryzykozakażeniawirusamiHCV, HBViHIVprzez transfuzjęzwiązanejestprzedewszystkimztzw.okienkiem diagnostycznym. ,,Okienko diagnostyczne’’ to okres od momentu zakażenia do pojawienia się wykrywalnego wbadaniachprzeglądowychmarkerazakażenia.Wprzypad- ku każdego z rozpatrywanych wirusów, w początkowym okresie, kiedy zakażony organizm nie wytwarza jeszcze przeciwciał,krewcharakteryzujesięnajwiększązakaźnością.

Okienko diagnostyczne dla HCV i HIV jest szacowane odpowiednionaniewięcejniż3i6dni,adlaHBVna17dni.

Długość tego okresu z jednej strony zależy od czułości metody stosowanej do prowadzenia badań przeglądowych,

zdrugiejstronyodtempareplikacjiposzczególnychwirusów.

Dynamika namnażania się wirusa determinuje czas, jaki musiminąć,abystężeniewirionówwekrwiosiągnęłopoziom wykrywalnywbadaniuprzeglądowym.DlawirusaHCV,który podwaja swoją ilość bardzo szybko, wciągu 8–10 godzin, okienko diagnostyczne przy prowadzeniu badań metodami NAT (nucleic acid testing) o najwyższej czułości analitycznej w indywidualnych donacjach(IDT; individual donationtesting) szacowanejestnaniewięcejniż3dni.Potencjałreplikacyjny HIV jest nieznacznie mniejszy(podwojenie liczby wirionów trwa ok. 14h). W przypadku tego wirusa okres, kiedy jego stężeniejestponiżejpoziomudetekcjitestówprzeglądowych, nie przekracza 6 dni. Najdłużej trwające okienko diagnostyczne ma miejsce w przypadku HBV. Stężenie DNA HBV ulegapodwojeniupo2,8dniaidlategowykryciewłaśnietego markerawpojedynczejdonacjijestmożliwedopieropookoło 17dniachodmomentuzakażenia.

Krew w okresie okienka serologicznego (od momentu zakażenia do pojawienia sięmarkerów serologicznych)jest wysoce zakaźna inawet pojedynczewiriony sąwystarcza- jące doprzeniesieniazakażenia.Pojawieniesięprzeciwciał, które towarzyszą przewlekłemu zakażeniu, powoduje zmniejszenie zakaźności krwi 100–1000 razy (dane podsu- mowane w [7]). Nadal bardzo mało wiadomo na temat infekcyjnościkrwi osób znajdującychsięw końcowejfazie przewlekłego zakażenia HBV, które określane jest mianem zakażenia ukrytego (occult hepatitisB infection, OBI). Na tym etapie antygen HBs nie jest wykrywalny, natomiast obec- nemu w organizmie, zazwyczaj wykrywalnemu w osoczu, DNA HBV w większości przypadków towarzyszą przeciw- ciaładoantygenurdzeniowego(anty-HBc)[8].

HBV

Napoczątkulatosiemdziesiątychzapadalnośćnazakażenie HBVw PolscebyłanajwyższawEuropie(45przypadkówna 100000 mieszkańców na rok) [9]. Wykrywalność antygenu HBs (HBsAg) u pierwszorazowych dawców krwi w latach 1995–2004 wynosiła około 0,8%. W analizowanym okresie obserwowano spadek częstości tego markera wśród daw- ców, zarówno pierwszorazowych, jak i wielokrotnych.

W drugiej grupie tendencja malejąca była istotnie silniej zaznaczona i wynosiła 20,7% na rok, (spadek z 0,088%

w roku 1995 do 0,017% w 2004 roku) wobec 5,4% na rok u dawców pierwszorazowych (spadek z 0,79% do 0,67%

w tym samym czasie) [10]. W kolejnych latach częstość wykrywaniaHBsAgwpopulacjidawcówustabilizowałasię– od 2007 roku utrzymuje się na poziomie 0,5%. Wśród dawców wielokrotnych HBsAg identyﬁkowany jest spora- dycznie (0,001–0,0004%) (dr M. Mikulska – dane w trakcie opracowania). W badaniach przeprowadzonych u siedmiu tysięcy losowo wybranych dawców RCKiK Kraków, stwier- dzono, że aż 8% z nichjestnosicielami przeciwciał skiero- wanych do antygenu rdzeniowego HBV (anty-HBc), świad- czącychoprzebytymzakażeniulubekspozycji[11].

ObecneryzykozakażeniaHBVprzezprzetoczeniakrwiijej składników związane jest przede wszystkim z okienkiem diagnostycznym. Od momentu wprowadzenia obowiązku badania DNA HBV w Polsce, metodyka badań technikami

(3)

biologiimolekularnejbyłaudoskonalana.Początkowobadania były prowadzone w pojedynczych donacjach lub pulach utworzonych przez zlanie osocza z 24 donacji. Od stycznia 2007rokuzewzględunawysokązakaźnośćHBVwokienku serologicznymorazczęstewystępowanieOBIudawcówkrwi w Polsce [8, 12] wprowadzono limit czułości analitycznej badańprzeglądowychnapoziomie24IU/ml(prógwykrywal- ności95%–LOD;limitofdetection,).Abywypełnićtozalecenie, w Centrach Krwiodawstwa i Krwiolecznictwa (CKiK), które prowadziły badania w pulach, zmniejszono liczbę donacji wpulido6.Dodatkowo,wtymczasiewprowadzonoczulsze testyopartenametodziereal-timePCR.Wkonsekwencjitych zmiannastąpiłopięciokrotnezwiększenieczułościanalitycz- nej, z 120 IU/ml do 24 IU/ml (95% LOD), a w okresie późniejszym obserwowano blisko 13-krotne zwiększenie częstościidentyﬁkacjizakażeńwokienkuserologicznymoraz prawie7-krotnywzrostczęstościwykrywaniaOBI[13].

W 2010 roku CKiK, stosujące technologię amplifikacji przez transkrypcję (TMA; transcription mediated amplification) zastąpiły test Procleix Ultrio testem nowej generacji – Procleix Ultrio Plus. Podstawowa różnica między testami dotyczyłazastosowaniawteścienowszejgeneracjinaetapie izolacji stężonego wodorotlenku litu, który zwiększa efek- tywność rozbijania wirionów HBV i uwalniania ssDNA wirusa do dalszej amplifikacji. Badania przeprowadzone w Instytucie Hematologii i Transfuzjologii (IHiT) wykazały, że konsekwencją tej modyfikacji jest zwiększenie średnio 2,4 raza (95% Cl; przedział ufności: 1,4–4,8) czułości analitycznej wykrywania DNA HBV wyrażonej w 95% LOD do poziomu 4,6 IU/ml (95% CI: 3,2–7,2). Analiza wyników badaniapaneli rozcieńczeń osocza zakażonego poszczegól- nymigenotypamiHBV(A-G)pozwoliłastwierdzićzwiększe- nie czułości z 1,3 do7,3 raza w Ultrio Plus w porównaniu ztestem Ultrio.Stosującanalizymatematyczne,napodsta- wiewynikówbadaniarozcieńczeństandarduWHO,oszaco- wano,żepozastąpieniuUltriotestemUltrioPlusnależysię spodziewać ograniczenia długości trwania okienka diagno- stycznegoHBVośrednio3,3dnia(95%CI:0,9–5,7)[14]. Przy założeniu,żestosowanyjestalgorytmpostępowaniaaktual- nie obowiązujący w Polsce [15], ryzykowyrażone w liczbie dniokienkadiagnostycznegodlaUltrioPlus jestszacowane na 11,6 dnia, gdy badania przeglądowe są prowadzone w pojedynczych donacjach, oraz 17,7 dnia, gdy badaniu poddawanejestosoczezlewanewpulęz8donacji[16].

2,4-krotnepodniesienieczułościanalitycznej wykrywania DNA HBV przekłada się na wzrost czułości klinicznej testu Ultrio Plus w porównaniu z testem Ultrio. Zwiększenie efektywnościtestunowejgeneracjizostałoudokumentowane wtrakciebadańprzeprowadzonychwRegionalnychCentrach KrwiodawstwaiKrwiolecznictwa(RCKiK)wŁodzi,Warszawie i Krakowie oraz w Instytucie Hematologii i Transfuzjologii (IHiT).Badaniaprzeglądoweblisko10tysięcydonacji prowadzono równolegletestami UltrioiUltrioPlus. Wtrakcie ich trwaniazidentyﬁkowanodawcęzOBI,wosoczuktóregoDNA HBV zostało wykryte wyłącznie testem nowej generacji.

Dodatkowo testem UltrioPlus wykryto DNA HBV u dawcy, u którego powtarzalnie reaktywny wynik badania HBsAg został potwierdzony w teście neutralizacji, jednak wynik badania testem Ultrio pozostawał ujemny [14]. Zidentyﬁko- wano jeszcze jednego dawcę z HBsAg potwierdzonym

wteścieneutralizacji,uktóregoDNAHBVniezostałowykryte w badaniu przeglądowym w prowadzonym w pojedynczej donacji. W retrospektywnie wykonanych 24 powtórzeniach badania odpowiednio żadne i4 oznaczenia były reaktywne w teście Ultrio i Ultrio Plus. Uzyskane wyniki pokazują, że obecnie nie jest możliwe zastąpienie oznaczania HBsAg testamiwykrywającymiDNAwirusa.

Dostępne panele rozcieńczeń różnych form polimorﬁcz- nychpozwalająnaokreślenieczułościwykrywaniaróżnych genotypów. Obserwowane jest zróżnicowanie czułości wykrywania genotypów zakażających polską populację.

Przykładowo, w badaniach przeprowadzonych w IHiT 95%

LOD(CI)testuUltrioPluswahałosięod24,3(17,1–38)kopii/

mldo46,1(27,5–91)dlaróżnych materiałów referencyjnych genotypuA.Wprzypadkudrugiegonajczęściejzakażającego Polaków genotypuDróżnicebyłyjeszczewiększe–od12,7 (8,1–23)do 48,1 (21,4–194) kopii/ml. Otrzymanewyniki pro- wadządowniosku,żeokienko diagnostycznejestnajpraw- dopodobniej skracane w różnymstopniu nie tylko w przy- padkuróżnychgenotypów,alenawetróżnychformpolimor- ﬁcznychwramachtegosamegogenotypu[14].

Obserwacje Vermeulen i wsp. wskazują, że badania w pojedynczej donacji, choć najbardziej skracają okienko diagnostyczne,nieograniczającałkowicieryzykaprzeniesie- niaHBVwprzypadkuzakażeniadawcynawczesnymetapie.

BadaczezRPAopisaliprzypadekprzeniesieniaHBVzidenty- ﬁkowany w trakcie procedury trace back u 28-letniego mężczyzny. Po 84 dniach od przetoczenia koncentratu krwinek czerwonych (KKCz), w związku z operacją po wypadkumotocyklowym,stwierdzonouniegoobjawyzapa- lenia wątroby typu B. Badania molekularne obejmujące analizę DNA HBV wykazały, że źródłem wirusa był dawca zakażony naetapieokienkadiagnostycznego,jeszczeprzed wytworzeniem przeciwciał anty-HBc i pojawieniem się wykrywalnego antygenu HBs. W badaniu przeglądowym w pojedynczejdonacjiwykonanymmetodąUltrioPlus(95%

LOD 2,1 IU/ml)nie wykryto genomuwirusa. Retrospektyw- nie badanie wykonano w 30 powtórzeniach i uzyskano wynik reaktywny 24 razy, co pozwoliło oszacować liczbę wirionów w przetoczonymKKCZ na32(95%CI: 22–43)[17].

Przedstawiona obserwacja potwierdza wcześniejsze sza- cunki wskazujące na niezwykle wysoką zakaźność HBV wokienkuserologicznym.

BadanieDNAHBVpozwaladodatkowowykrywać1) tzw.

mutanty ucieczki – szczepy, w których zmiany nukleoty- dowe powodująsubstytucjeaminokwasowesprawiające,że zakażenieniejestrozpoznawanewtrakciebadaniaprzeglą- dowego HBsAg oraz 2) zakażenie na końcowym etapie przewlekłegozakażenia HBV,tzw.OBI,charakteryzującesię bardzo niskim poziomem DNA HBV (<100 IU/ml).Niewiele wiadomo na temat zakaźności donacji od dawców z OBI.

Badania JapońskiegoCzerwonegoKrzyżaopartenaanalizie wynikówprocedurylookback,wszczynanejwwynikubadań przeglądowychHBVNAT,wpulachosoczaz50donacjioraz anty-HBc wykazały nieznaczną zakaźność OBI przez trans- fuzję(3%)[18].Uważasię,żezakaźność donacjioddawców z OBI ma miejsce przede wszystkim, gdy wykrywane są jedynie przeciwciała anty-HBc, choć opisano jeden przypadek przeniesienia od dawcy z anty-HBs [19]. Niedawno opublikowana praca opisująca analizę wyników procedur

(4)

look back i trace back prowadzonych w pięciu Europejskich ośrodkach,w tym w Polsce, wskazujena znacznie wyższą zakaźność OBI. W pracy podjęto próbę oceny zakaźności przede wszystkim na podstawie analizy wykrywalności anty-HBc, jako markera przebytego zakażenia HBV. U 45 spośród105pardawca–biorca(42,9%)stwierdzonoprzeciw- ciała o tej właśnie swoistości. Po uwzględnieniu średniej częstości anty-HBc w populacji współczynnik przeniesienia/transmisji został skorygowany do 28%.Częstość anty- HBcwynosiła aż 63,6% (28/44)u nieszczepionychbiorców, którzyotrzymalitransfuzjeodanty-HBsujemnychdawców zOBI.Zaledwie15,4% zgrupyanalizowanychbiorcówbyło dodatnichzarównowanty-HBcjakianty-HBs,copotwier- dza, że obecność anty-HBsistotnie obniża zakaźnośćOBI.

Otrzymane wyniki wskazują, że zakaźność donacji anty- HBs-ujemnych zależy od objętości przetoczonego osocza i wynosi 85–100% dla osocza świeżomrożonego – FFP (zawierającego około 200ml osocza), 51% dla koncentratu płytkowego – KKP (50ml osocza) i 24% dla koncentratu krwinekczerwonych– KKCZ(20mlosocza). 50% minimal- nejdawkizakaźnej(ID50)oszacowanona1049(95%CI:117– 3441)kopii[20].

HCV

Zaraz po rozpoczęciu badania markerów serologicznych zakażenia HCV u dawców częstość wykrywania anty-HCV wynosiła1,4%. Wśród dawców pierwszorazowychw latach 1996–2003obserwowanospadekczęstościwykrywaniaprze- ciwciał anty-HCV o 4% rocznie (95% CI: 2–6%). W tym samymokresiewśróddawcówwielokrotnychspadekwykry- walnościbyłwyraźniejszy iwynosiłrocznieaż21%(95%CI:

17–24%). Wśród dawców pierwszorazowych najwyższe roz- powszechnienie obserwowano w województwach: śląskim (1,0%), małopolskim (1,0%), świętokrzyskim (1,0%), łódzkim (1,0%),lubelskim(1,0%)ikujawsko-pomorskim(1,0%).Wśród dawców wielokrotnych, w łódzkim (0,4%) oraz podlaskim (0,3%) i dolnośląskim (0,3%) [21]. Ostatnio przeprowadzona analiza danych z lat 2004–2012 wykazała, że mimołącznie mniejszej częstości u dawców pierwszorazowych (0,8%) częstość wynikówpowtarzalniereaktywnychwskali całego kraju wzrosła z 0,72% do 0,87%. Nieznaczny trend wzros- towyobserwowanotakżeudawcówwielokrotnych(średnio 0,19%, wzrost z 0,11% w 2004 do 0,23% w 2011). Należy jednak podkreślić, że procent zakażeń potwierdzonych utrzymujesięnastałympoziomie(udawcówpierwszorazo- wych0,36% w 2008i 0,31%w 2011oraz odpowiednio 0,01– 0,02%uwielokrotnych).

Po przebadaniu blisko 12 milionów donacji zakażenie HCV na wczesnym etapie, w tzw. okienku serologicznym (WP) zidentyﬁkowano u 120 dawców. Zarówno liczba, jak i częstość tego typu zakażeń w porównaniu z innymi krajami prowadzącymi badania RNAHCV jest bardzoduża [22]. Ponieważ zakaźność krwi przed wytworzeniem prze- ciwciałjest bardzo wysoka, należy przypuszczać, że wpro- wadzeniebadań przeglądowychRNA HCV w naszymkraju mogło zapobiec nawet 360 nowym przypadkom zakażeń (przyzałożeniu,żezjednejdonacjiprzygotowywanesątrzy składnikikrwi).Rocznieidentyﬁkujesięodjednejdo20osób

z HCVWP.Obserwowanajest tendencjamalejącaczęstości tegotypuzakażeń.

Dotychczas, w procedurze trace back, zidentyﬁkowano jedenprzypadekprzeniesieniazakażeniaHCVprzezkoncen- trat krwinek czerwonych (KKCz) mimo badania RNA HCV wpuliosoczaz24donacji.Jesttojedynyudokumentowany przypadek przeniesienia zakażenia HCV przez transfuzje wPolsce(częstośćokoło1:12mlndonacji)odwprowadzenia obowiązkowychbadańNAT[23].

Wspomniane wcześniej polskie badania porównujące testyprzeglądowekolejnejgeneracjiwykorzystującetechno- logię TMA wykazały, żeczułośćUltrio i Ultrio Plus jest na porównywalnym poziomie (95% LOD [CI] odpowiednio 9,0 [5,5–17,3] oraz 9,3 [5,81–17,3]). Zatem długość trwania okienkadiagnostycznegoprzyzastosowaniutychtestówjest taka samai zostałaoszacowana na1,41 dnia, gdybadania przeglądowe prowadzone są w pojedynczych donacjach, i 2,62dnia, gdy donacjebadanesąw minipulach utworzo- nychz8donacji(MP8)[16].

Wobec wciąż wysokiej częstości nowych zakażeń HCV, widocznej zwłaszcza wśród dawców wielokrotnych i obja- wiającej się utrzymywaniem się znaczącej liczby zakażeń seroujemnych (w tzw. okienku serologicznym) ważne jest doskonalenieprocesukwaliﬁkacjidawców. Przeprowadzono analizę ankiet epidemiologicznych, które są wypełniane przez dawców zakażonych HCV w ostatnim czasie w celu oceny czynników ryzyka. Ankieta zawierała pytania doty- czące charakterystykidawców, ichzachowań oraz ostatnio odbytych podróży. Odpowiedzi udzielone przez dawców zakażonych HCV(grupa I)porównanozinformacjamiuzys- kanymi od dawców niezakażonych dopasowanych pod względem płci i wieku (kontrola ujemna – grupa II).

Wokresie2000–2011 zgromadzonoankietyod42wielokrot- nych dawców krwi zakażonych HCV, dawców zakażonych HCVwokienkuoraz126dawcówgrupykontrolnej.Zidenty- ﬁkowano następujące prawdopodobne czynniki związane z zakażeniem HCV (p<0,05) (OR, 95% CI): ekspozycja na cudząkrew(główniewtrakciebójekiwypadków;25,3;5,57– 115,23), tatuaż (19,55; 2,30–166,45), przyjmowanie narkoty- ków (9,76; 3,19–29,89), dwóch i więcej partnerów seksual- nych w ciągu 6 miesięcy przed donacją (11,72; 2,51–54,70) iwspólnekorzystaniezgolarek/szczoteczekdozębów(6,42;

1,67–24,64). Wynikitego typuanaliz mogą byćwykorzysty- wane do modyﬁkowania kwestionariusza stosowanego do odraczania dawców należących do grup ryzyka zakażenia HCV i aktualizacji materiałów informacyjnych dla dawców i tym samym mogą wpływać na podniesienie bezpieczeń- stwatransfuzjikrwi[24].

HIV

Częstość potwierdzonych zakażeń seropozytywnych wirusem HIV wśród dawców krwi w Polsce w ostatnich latach rośnie. Zjawisko to jest związane przede wszystkim ze zwiększoną liczbą zakażonych dawców wielokrotnych.

W latach 2005–2007 częstość zakażeń wirusem wynosiła 0,98:100000donacji,podczasgdywokresiekolejnychtrzech lat wzrosła do2,04:100000.BadanieRNAHIVbyłowprowa- dzanesukcesywnieod2003wtychCKiK,którezdecydowały

(5)

sięrozpocząć badaniaRNAHCV metodą TMA.Oprócz tego markeratestytewykrywałykwasynukleinoweHIV.W2005 badaniami RNA HIV objęto obowiązkowo wszystkich daw- cówkrwiwPolsce.ZakażenieHIVwokienkuserologicznym dokońcaroku2012zidentyﬁkowanou12dawców(częstość ok. 1:600000 donacji) ([25, 26] oraz dr M. Mikulska – informacjaustna).

Ryzyko przeniesienia HIV przez transfuzje związane z okienkiem diagnostycznym wydaje się być obecnie nie- wielkie.Wyrażonew liczbie dni okienko diagnostyczne dla UltrioPluswynosi3,09,gdybadaniaprzeglądowesąprowa- dzone w pojedynczych donacjach, oraz 5,43, gdy badaniu poddawanejestosoczezlewanewpulez8donacji[16].

PrzeprowadzonokalkulacjęryzykazakażeniaHIV, wyko- rzystując dane epidemiologiczne z różnych części świata.

WanaliziedlaEuropyCentralnejuwzględnionodaneepide- miologiczne pochodzące m.in. z RCKiK w Warszawie. Przy prowadzeniu badań anty-HIVoraz RNA HIV w pojedynczej donacjiryzykoprzeniesieniainfekcjiprzeztransfuzjęszaco- wanejestśredniona0,15:1000000donacji(przy założeniu, że50%minimalnejdawki zakaźnej[ID50]w trakcieokienka serologicznego wynosi 3,16 wirionów dla KKCz). Wynik szacunkowych wyliczeń oznacza, że należy się spodziewać nie więcej niż jednego przypadku przeniesienia HIV przez transfuzję na blisko 7 lat, przy założeniu, że co roku pobierany jest ok. 1 milion donacji. W przypadku gdyby badania prowadzono w puli po 8 donacji, wskaźnik ten rośnie do poziomu 0,28 (jeden przypadek zakażenia przez transfuzjęna3,5roku)[27].

Innymistotnymźródłemryzykazakażeniawirusem HIV jestjegopolimorﬁzm.Niejestznanadokładnieskalawystę- powania mutantów, w trakciebadaniaktórychuzyskiwane są wyniki fałszywie ujemne. W Niemczech opisano przy- padki zakażenia mutantami HIV, którenie zostały wykryte w badaniu przeglądowym NAT [28–30]. O ileu zachodnich sąsiadów Polski mutanty ucieczki dotyczyły najpowszech- niejszego obecnie naświecie podtypuB, todonacje fałszy- wienegatywne w badaniumetodami biologii molekularnej opisane we Włoszech dotyczyły form zrekombinowanych [31]. Wszystkie te obserwacje są istotnym argumentem przeciwrezygnacjiz badańserologicznychw krajach,gdzie prowadzi się badania przeglądowe kwasów nukleinowych HIV. Wykazano, że skuteczną metodą ograniczenia ryzyka wynikówfałszywieujemnychwNATjeststosowanietestów ampliﬁkujących jednocześnie przynajmniej dwa regiony genomuHIV[29–32].

Inną grupą osób zakażonych, u których mogą wystąpić trudnościdiagnostycznewtrakciebadańprzeglądowych,są tzw.ellitecontrollers.Wkrajachzwysokączęstościązakażeń HIVstanowiąoniok. 2–4% zakażonych dawców. Należą do nich osoby, u których RNA HIV nie jest wykrywalne wosoczumetodamioczułości50–70kopiiRNA/ml,mimoże przez przynajmniej dwa lata byli powtarzalnie reaktywni wbadaniuanty-HIV,awynikiprzeglądowychbadańserolo- gicznych potwierdzano w teście Western blot. Wiadomo o nich, że nigdy nie podawano im leków antyretrowiruso- wych. W większości tych przypadków RNA wirusa wykrywalne jest w komórkach krwi, podobnie jak prowirusowe DNA. W przypadku takiego przebiegu zakażenia cząsteczki wirusowe są zdolne doreplikacji, ale zakaźność krwi i jej

składnikówniejestznana[7,27].Dotychczasniezidentyﬁ- kowano anijednegotakiego przypadku wśród zakażonych dawców krwi w Polsce [33]. Istnienie takiego przebiegu zakażenia nadal jest jest dodatkowym argumentem prze- mawiającymzautrzymaniem badańprzeglądowychmeto- dami serologicznymi w krajach, gdzie badane jest RNAHIV.

Parvowirus B19 (B19V)

Obecniebadanie B19Vudawcówjestograniczonedoozna- czania DNA B19V metodami ilościowymi u osób, których osocze jest przeznaczone do produkcji immunoglobuliny anty-Dianty-HBs,orazdawcówkrwinekwykorzystywanych do immunizacji. W wyniku badań przeglądowychczasowo odsuwanisądawcy,uktórychstężeniewirusamożespowo- dować przekroczenie poziomu 10⁴ IU/mlw puliprodukcyj- nej,zazwyczajtworzonejprzezzlanieosocza pochodzącego z ponad 100 donacji. Istotną trudnością, którą można napotkaćwtrakciebadańB19V,jestwystępowaniewyników fałszywieujemnychlubzaniżonychwprzypadkuzakażenia niektórymi formamipolimorﬁcznymi(genotyp2i3).Jestto konsekwencja uwzględniania, jeszczedoniedawna,w trakcie projektowania testów jedynie sekwencji genomu naj- powszechniejszegogenotypu1[34,35].

Wiadomo także, że B19V osiąga wyjątkowo wysoką wiremię, zwłaszcza we wczesnej fazie zakażenia, jeszcze przed pojawieniemsięswoistych przeciwciał. Takawysoka wiremia, przekraczającagórnyzakresliniowościtestu prze- glądowego może być przyczyną wyników fałszywie ujemnych [36,37].Obecniew Polsce,dobadańdawcówdopusz- czanesąwyłącznietesty,któreniezaniżająilościDNAB19V wszystkich obecnie znanych genotypów oraz prawidłowo określają wiremie przekraczające górny zakres liniowości [38].

Perspektywy dalszego ograniczenia ryzyka zakażenia przez krew

Obecniestosowanemetodydetekcjiwirusówprzyczyniłysię douzyskanianajwyższegow historiibezpieczeństwatrans- fuzji.Dalszezmniejszenieryzykamożezostaćosiągniętem.

in. przez zwiększenie czułości testów. Tylko w niektórych testach możliwa jest poprawa czułości przez zwiększenie efektywności ampliﬁkacji/ekstrakcji kwasów nukleinowych (np. HBV w teście TMA). Jednak w przypadku pozostałych markerów możliwa jest poprawa czułości wyłącznie przez dalszezwiększanieobjętościbadanejpróbki.

Ważnym problemem jest wykrywanie wszystkich znanych form polimorﬁcznych. Dlatego podstawowym narzę- dziem dooceny czułościanalitycznej powinny być już nie tylko pojedyncze próbki zakażone jedną formą polimor- ﬁczną, jakjestw przypadkuwiększościdotychczas dostęp- nych standardówmiędzynarodowych WHO,ale stosowanie materiału referencyjnego nabazie jak najszerszego panelu genotypów[39–41].

Poprawa czułościklinicznejtestówNATmożebyćosiąg- nięta przez poprawę wykrywalności form polimorﬁcznych,

(6)

m.in. przez zastosowanie ampliﬁkacji więcej niż jednego regionugenomuwirusa.

Istotnym zagadnieniem jest ustalenie zakaźności B19V przez pojedyncze donacje. Obserwacje Satakei wsp. poka- zują,żekrewoddawcyzakażonegoB19Vzawierającanawet 10³ IU/ml iswoiste przeciwciałamoże przenieść zakażenie na chorego z osłabioną odpornością [42]. Znajomość kon- kretnejwartościID50,umożliwiłabyustalenieryzykazakaże- niauosób zobniżonąodpornościąichorychimmunokom- petentnych,wzależnościodstosowanychskładnikówkrwi.

Wiadomościtesąszczególnieistotnedlapodjęciaracjonal- nejdecyzjioprzetaczaniuchorymzgrupwysokiegoryzyka powikłańzakażeńB19V,składnikówkrwibadanychmetodą ilościową w kierunku DNA B19V. Problem ten dotyczy w szczególności chorych po przeszczepach i zakażonych wirusem HIV. Coraz częściej zasadność używania składni- ków krwi badanych w kierunku B19V jest podnoszona wodniesieniudotransfuzjidopłodowych[43].

Analizymatematycznepozwalająocenićryzyko zakażeń dla badań przesiewowych charakteryzujących się różną czułością.Wynikitegotypuobliczeńwskazują,żeprowadze- niebadańpopulacjiowiększejczęstościzakażeńuzasadnia zastosowaniepodwyższonejczułościtestów(np.przezbada- nie w pojedynczych donacjach). Ten sam poziom ryzyka może występować w przypadku badania o mniejszej czu- łości (np. badanie w pulach) na terenie z lepszą sytuacją epidemiologiczną (zwłaszcza tam, gdzie rzadziejwystępują przypadkizakażeńudawcówwielokrotnych,wskazującena mniejszą zapadalność na danym tereniei mniejszeryzyko ,,świeżego’’zakażeniaudawcówkrwi).

Analiza źródeł zakażenia, w szczególności u dawców wielokrotnych oraz zakażonych w okienku serologicznym stwarza szansę na uzyskanie danych pozwalających na aktualizację materiałów informacyjnych dla dawców oraz kwestionariuszy wykorzystywanych w trakcie procedury kwaliﬁkacji.

Konﬂikt interesu/Conﬂict of interest

Niewystępuje.

Finansowanie/Financial support

Niewystępuje.

Etyka/Ethics

Treści przedstawione w artykule są zgodne z zasadami DeklaracjiHelsińskiej,dyrektywamiEUorazujednoliconymi wymaganiamidlaczasopismbiomedycznych.

pi smiennictwo/references

[1] BrojerE,red.Czynnikizakaźneprzenoszoneprzezkrew.

OINPHARMA:Warszawa;2008.

[2] PoszwińskiP,BragielI,KacperskaE.DetectionofHBantigen inbloodpreparations.ActaHaematolPol1974;5:133–136.

[3] MoraczewskaZ,SeyfriedowaH,KacperskaE,etal.HIV-1 infectioninblooddonorsandbloodrecipients.Przegl Epidemiol1990;44:149–154.

[4] Głoskowska-MoraczewskaZ,KacperskaE,SeyfriedH.

Evaluationofscreeningandcomplementarytestsforanti- HCVantibodies.ActaHaematolPol1993;24:273–280.

[5] BrojerE.Implementationofdonorscreeningforinfectious agentstransmittedbybloodbynucleicacidtechnologyin Poland.VoxSang2005;89:267–268.

[6] Głoskowska-MoraczewskaZ,BrojerE,MedyńskaJ, GrabarczykP.AnalizaczęstościiźródełzakażeniaHCVu chorychhematologicznych.ActaHaematolPol1997;28:

283–288.

[7] KleinmanSH,LelieN,BuschMP.Infectivityofhuman immunodeﬁciencyvirus-1,hepatitisCvirus,andhepatitisB virusandriskoftransmissionbytransfusion.Transfusion 2009;49:2454–2489.

[8] BrojerE,GrabarczykP,LiszewskiG,etal.Characterization ofHBVDNApositive/HBsAgnegativeblooddonors identiﬁedinthePolishNATscreeningprogram.Hepatology 2006;44:1666–1674.

[9] MagdzikWW.HepatitisepidemiologyinPoland,Central andEasternEuropeandthenewlyindependentstates.

Vaccine2000;18:S13–S16.

[10] GrabarczykP,SeyfriedH,BrojerE,etal.HBsAgdetectionin blooddonorsinPoland,1995–2004.JTransfMed2009;1:

20–25.

[11] KuśmierczykJ,ZatorskaJ,RasJ,etal.Prevalenceof anti-HBcanibodiesinblooddonorsintheSouthregionof Poland.VoxSang2006;9:56.

[12] CandottiD,GrabarczykP,GhiazzaP,etal.Epidemiology andmolecularcharacterizationofocculthepatitisB infection(OBI)inEuropeanasymptomaticblooddonors.

JHepatol2008;49:537–547.

[13] GrabarczykP,KopaczA,LiszewskiG,etal.PolishBlood TransfusionServiceViralStudyGroupEffectivenessof variousminipoolNATsystemsforHBVdetectioninblood donors.Transfusion2009;49:1494–1495.

[14] GrabarczykP,vanDrimmelenH,KopaczA,etal.Headto headcomparisonoftwotranscriptionmediated

ampliﬁcationassayversionsfordetectionofhepatitisB virus,hepatitisCvirusandhumanimmunodeﬁciencyvirus type1inblooddonors.Transfusion2013Apr17.

doi:10.1111/trf.12190.[Epubaheadofprint].

[15] ŁętowskaM,red.Medycznezasadypobieraniakrwi, oddzielaniajejskładnikówiwydawaniaobowiązujące wjednostkachorganizacyjnychpublicznejsłużbykrwi.

Warszawa:InstytutHematologiiiTransfuzjologii;2011.

[16] WeustenJ,VermeulenM,vanDrimmelenH,LelieN.

Reﬁnementofaviraltransmissionriskmodelforblood donationsinseroconversionwindowphasescreenedby nucleicacidtestingindifferentpoolsizesandrepeattest algorithms.Transfusion2011;51:203–215.

[17] VermeulenM,DickensC,LelieN,etal.HepatitisBvirus transmissionbybloodtransfusionduring4yearsof individual-donationnucleicacidtestinginSouthAfrica:

estimatedandobservedwindowperiodrisk.Transfusion 2012;52:880–892.

[18] SatakeM,TairaR,YugiH,etal.Infectivityofblood componentswithlowhepatitisBvirusDNAlevels identiﬁedinalookbackprogram.Transfusion 2007;47:1197–1205.

[19] Levicnik-StezinarS,Rahne-PotokarU,CandottiD,etal.HBs positiveocculthepatitisBviruscarrierbloodinfectiousin twotransfusionrecipients.JHepatol2008;48:1022–1025.

[20] AllainJP,MihaljevicI,Gonzalez-FraileMI,etal.Infectivity ofbloodproductsfromdonorswithocculthepatitisBvirus

(7)

infection.Transfusion2013Jan30.doi:10.1111/trf.12096.

[Epubaheadofprint].

[21] SeyfriedH,BrojerE,GrabarczykP,etal.Analizaczęstości markerówzakażeniawirusemzapaleniawątrobytypuC (HCV)upolskichdawcówkrwiwlatach1994–2003.Przegl Epidemiol2005;59:807–814.

[22] RothWK,BuschMP,SchullerA,etal.Internationalsurvey onNATtestingofblooddonations:expanding

implementationandyieldfrom1999to2009.VoxSang 2012;102:82–90.

[23] GrabarczykP,GronowskaA,BrojerE,etal.Sequence analysisconformationoftransfusion-transmittedhepatitis Cbyredcellswhichtestednegativebymini-poolHCVNAT.

Transfusion2007;47:1102–1104.

[24] GrabarczykP,CzerwińskiM,RosińskaM,etal.Riskfactors forinfectionamongrecentlyHCVinfectedblooddonorsin Poland.23rdRegionalCongressoftheISBT,Amsterdam, TheNetherlands,fromJune2-5,2013.VoxSang2013;

105:336.

[25] MikulskaM,SułkowskaE,GrabarczykP,etal.Częstość zakażeńwirusemHIVwpopulacjikrwiodawcówwPolsce wlatach1988–2007.JTransfMed2008;1:20–27.

[26] SulkowskaE,MikulskaM,GrabarczykP,etal.Analiza molekularnychiserologicznychmarkerówzakażeniaHIV upolskichkrwiodawców.JTransfMed2013;6:1–5.

[27] BruhnR,LelieN,CusterB,etal.PrevalenceofHIVRNAand antibodyinfirst,lapsedandrepeatblooddonationsacross fiveinternationalregionsandrelativeefficacyofalternative screeningscenarios.Transfusion2013.inpress.

[28] SchmidtM,KornK,NueblingCM,etal.Firsttransmissionof humanimmunodeﬁciencyvirusType1byacellularblood productaftermandatorynucleicacidscreeningin Germany.Transfusion2009;49:1836–1844.

[29] ChudyM,Weber-SchehlM,PichlL,etal.Bloodscreening nucleicacidampliﬁcationtestsforhuman

immunodeﬁciencyvirusType1mayrequiretwodifferent ampliﬁcationtargets.Transfusion2012;52:431–439.

[30] MüllerB,NüblingM,KressJ,etal.Howsafeissafe:New HIV-1variantsmissedbynucleicacidtesting.Transfusion 2013.inpress.

[31] FoglieniB,CandottiD,GuarnoriI,etal.Aclusterofhuman immunodeﬁciencyvirusType1recombinantformescaping detectionbycommercialgenomicampliﬁcationassays.

Transfusion2011;51:719–730.

[32] SchmidtM,HourfarMK,SeifriedE.HIV-1realtimedetection intwoconservedregionsincreasesbloodsafety.VoxSang 2008;95:308.

[33] SulkowskaE,MikulskaM,GrabarczykP,etal.Molecularand serologicalmarkersofHIVinfectioninPolishblooddonors –detectionof‘‘windowperiod’’andHIVRNAseropositive individualsbutlackofHIVelitecontrollers.31st

InternationalCongressoftheISBTinjointcooperationwith the43rdCongressoftheDGTI,Berlin,Germany,June26–1 July,2010.VoxSang2010;99:PP-0570.

[34] BaylisSA,FryerJF,GrabarczykP.Effectsofprobebinding mutationsinanassaydesignedtodetectparvovirusB19:

Implicationsforthequantitationofdifferentvirus genotypes.JVirolMethods2007;139:97–99.

[35] BaylisSA,BuchheitKH.Aproﬁciencytestingstudy toevaluatelaboratoryperformanceforthedetection ofdifferentgenotypesofparvovirusB19.VoxSang 2009;97:13–20.

[36] GrabarczykP,KalińskaA,SulkowskaE,BrojerE.False negativeresultsinhighviremiaparvovirusB19-samples testedwithreal-timePCR.PolJMicrobiol2010;59:129–132.

[37] KoppelmanMH,CuijpersHT,WessbergS,etal.Multicenter evaluationofacommercialmultiplexpolymerasechain reactiontestforscreeningplasmadonationsforparvovirus B19DNAandhepatitisAvirusRNA.Transfusion2012;52:

1498–1508.

[38] GrabarczykP,KopaczA,LiszewskiG,etal.Evaluationofthe Rochecobas^®TaqscreenDPXtestforparvovirusB19DNA genotypesdetectioninblooddonors.23rdRegional CongressoftheISBT,Amsterdam,TheNetherlands,from June2–5,2013.VoxSang2013;105:PP-308.

[39] ChudyM,HanschmannKM,KressJ,etal.FirstWHO InternationalReferencePanelcontaininghepatitisBvirus genotypesA-GforassaysoftheviralDNA.JClinVirol 2012;55:303–309.

[40] ManakM,SinaS,AnekellaB,etal.PilotStudiesfor DevelopmentofanHIVSubtypePanelforSurveillanceof GlobalDiversity.AIDSResHumRetrovir2012;28:594–606.

[41] BaylisSAML,PadleyDJ,HeathAB,YuMW,Group.tCS.

CollaborativestudytoestablishaWorldHealth

OrganizationInternationalgenotypepanelforparvovirus B19DNAnucleicacidampliﬁcationtechnology(NAT)-based assays.VoxSang2012;102:204–211.

[42] SatakeM,HoshiY,TairaR,etal.Symptomaticparvovirus B19infectioncausedbybloodcomponenttransfusion.

Transfusion2011;51:1887–1895.

[43] QuigleyJ,DoyleB,BurkeE,etal.Nonimmunehydropsdue toparvovirusB19inpregnancy:acasereport.23rdRegional CongressoftheISBT,Amsterdam,TheNetherlands, June2-5,2013.VoxSang2013;105:P-553.