Oznaczanie aktywności enzymów

(1)

Oznaczanie aktywności enzymów

Instrukcja do zajęć laboratoryjnych z przedmiotu

Biotechnologia Enzymatyczna

Prowadzący: mgr inż. Anna Byczek

(2)

CEL ĆWICZENIA

Celem ćwiczenia jest oznaczanie aktywności enzymu z grupy hydrolaz na przykładzie α-amylazy zawartej w ślinie, a następnie zbadanie wpływu różnych czynników, takich jak:

temperatura, obecność aktywatorów, czy pH środowiska na aktywność tej amylazy.

PODSTAWY TEORETYCZNE

Wstęp

Ilość enzymu w układzie można oznaczyć na podstawie pomiaru szybkości katalizowanej przez niego reakcji. Szybkość reakcji nie zawsze jest jednak proporcjonalna do stężenia enzymu i najczęściej mierząc szybkość reakcji enzymatycznej określa się aktywność enzymu w określonych warunkach. Szybkość reakcji enzymatycznej, a więc konsekwentnie i aktywność enzymu jest zależna od wielu czynników zarówno fizycznych, jak i chemicznych.

Oprócz stężenia enzymu i stężenia substratu, na aktywność enzymu mają wpływ takie czynniki jak: temperatura, pH roztworu w którym zachodzi reakcja, działanie aktywatorów lub inhibitorów oraz efektorów allosterycznych.

Szybkość reakcji enzymatycznej wzrasta zwykle wraz ze wzrostem temperatury i dla większości enzymów temperatura optymalna zbliżona jest do 40^oC. Nie jest to jednak reguła i znane są enzymy, dla których optymalna temperatura jest wyższa bądź niższa. Nadmierne podwyższenie temperatury prowadzi do ograniczenia lub zahamowania szybkości reakcji enzymatycznej na skutek denaturacji termicznej białka enzymatycznego. Termostabilość enzymu określa się podając najwyższą temperaturę, w której nie dochodzi do termicznej inaktywacji enzymu.

Równie ważnym czynnikiem jak temperatura jest pH środowiska reakcji. Szybkość reakcji jest maksymalna przy optymalnym pH dla danego enzymu. Rozpiętość optimum pH dla reakcji enzymatycznych jest znaczna i waha się w zakresie od 1 do 9. Małe odchylenia od optymalnej wartości pH dla danego enzymu powodują zwykle nieznaczne zmniejszenie szybkości reakcji, jednak duże odchylenia pH od wartości optymalnej mogą prowadzić nawet do nieodwracalnej denaturacji białka enzymatycznego.

Do innych czynników wpływających na szybkość reakcji enzymatycznych należą aktywatory i inhibitory. Mogą to być związki nisko- lub wielkocząsteczkowe zarówno nieorganiczne, jak i organiczne. Wiele enzymów wrażliwych jest nawet na małe stężenia soli metali ciężkich, które mają katalityczny wpływ na utlenianie grup hydrosulfidowych tlenem atmosferycznym. Inhibitorami mogą być również związki kompleksujące metale będące częścią centrum katalitycznego enzymu lub biorące udział w procesie katalitycznym. Do tej grupy związków zaliczane są cyjanki, azydki, H2S oraz CO. Za aktywowanie dużej grupy enzymów odpowiada z kolei obecność elektrolitów (Cl^-, Br^-, NO₃^-). Do tej grupy enzymów należą amylazy.

W ramach ćwiczenia oznaczana jest aktywność α-amylazy hydrolizującej jedynie wiązania α-1-4-glikozydowe więc jako hydrolizowany substrat zastosowano tzw. „skrobię rozpuszczalną” stanowiącą liniowy polimer zbudowany z jednostek D-glukozy połączonej wiązaniami α-1-4-glikozydowymi. Dodatkową zaletą użycia skrobi rozpuszczalnej jest możliwość przygotowania jej wodnego roztworu (podczas gdy frakcje skrobi zawierające amylopektynę są w wodzie nierozpuszczalne).

Do oznaczenia aktywności α-amylazy posłużono się metodą bazującą na śledzeniu ubytku substratu w czasie i wyznaczaniu tzw. punktu achromowego.

(3)

Budowa skrobi

Skrobia jest homopolimerem polisacharydowym zbudowanym z cząsteczek D-glukozy, które są połączone wiązaniami α-glikozydowymi. Nie stanowi ona jednak jednorodnego związku lecz jest mieszaniną różnych strukturalnie polimerów:

• amylozy oraz

• amylopektyny.

Zwykło się przyjmować, że amyloza tworzy proste, długie łańcuchy o masie cząsteczkowej od 4 do 15 kDa. Reszty glukozylowe są przyłączane w niej wyłącznie wiązaniami αααα-1,4-glikozydowymi.

Schemat 1. Budowa amylozy

W rzeczywistości jest to mieszanina liniowych i bardzo słabo rozgałęzionych łańcuchów glukanowych. Łańcuchy amylozy występują w formie lewoskrętnej helisy (każdy zwój takiej helisy zawiera 6 reszt D-glukozy), stabilizowanej wiązaniami wodorowymi, wewnątrz której może ulegać wiązaniu jod dając w efekcie skrobi charakterystyczne ciemnoniebieskie zabarwienie.

Amylopektyna jest tworem rozgałęzionym, w którym łańcuch centralny tworzą cząsteczki D-glukozy połączone wiązaniem α-1,4-glikozydowym, od którego odchodzą liczne odgałęzienia tworzone przez wiązania α-1,6-glikozydowe. Dla przykładu, w skrobi ziemniaczanej wiązania α-1,6-glikozydowe stanowią około 4% wszystkich wiązań glikozydowych obecnych w polimerze. Długość łańcuchów bocznych jest zróżnicowana i średnio wynosi od 13 do 45 reszt glukozowych (mogą jednak występować znacznie dłuższe łańcuchy boczne). Wśród łańcuchów bocznych wyróżnia się tzw. łańcuchy typu A (nie posiadające dalszych odgałęzień) oraz łańcuchy typu B (z co najmniej jednym bocznym odgałęzieniem). Masa cząsteczkowa amylopektyny jest znacznie większa niż amylozy i przekracza 500 kDa, a sięga nawet do 100000 kDa.

Schemat 2. Budowa amylopektyny koniec „nieredukujący”

wiązanie α-1,4-glikozydowe

wiązanie α-1,6-glikozydowe koniec „redukujący”

(4)

Skrobia występuje w ziemniakach, ziarnie zbóż i w owocach, pestkach, bulwach oraz kłączach wielu innych roślin. Stosunek amylozy i amylopektyny jest zasadniczą cechą poszczególnych gatunków skrobi.

Enzymy amylolityczne

Enzymy stosowane do hydrolizy skrobi są zaliczane do podklasy hydrolaz (EC 3.2.).

Typowymi enzymami trawiennymi, występującymi w ślinie i wydzielinie trzustki kręgowców są amylazy, które katalizują rozkład skrobi i glikogenu. Są one również obecne w roślinach, zwłaszcza w zarodkach ziarna zbóż, gdzie w procesie kiełkowania następuje ich gwałtowna synteza, mająca na celu szybkie uruchomienie energetycznego materiału zapasowego.

Podział amylaz

Znane są różne rodzaje amylaz, a podzielić je można w różny sposób.

Z punktu widzenia możliwości hydrolizy różnych wiązań glikozydowych można je podzielić na:

• atakujące wiązania α-1,4-glikozydowe (α-amylazy, β-amylazy),

• atakujące wiązania α-1,6-glikozydowe (izoamylazy i pullulanazy) oraz

• hydrolizujące wiązania α-1,4-glikozydowe i α-1,6-glikozydowe (glukoamylazy i niektóre pullulanazy).

Biorąc pod uwagę miejsce cięcia wiązania glikozydowego w cząsteczce skrobi można je podzielić na:

• endoamylazy (α-amylazy, amylazy znoszące rozgałęzienia) oraz

• egzoamylazy (glukoamylazy i β-amylazy).

Z punktu widzenia zachodzących procesów możemy je podzielić na enzymy:

• upłynniające (α-amylazy, izoamylazy, pululanazy) i

• scukrzające (β-amylazy, glukoamylazy i niektóre α-amylazy).

Amylazy można tez podzielić z punktu widzenia źródeł ich pochodzenia, a także z punktu widzenia konfiguracji centrum anomerycznego uwalnianych produktów hydrolizy.

Spośród licznych znanych amylaz głównymi są: α-amylaza zaliczana do endoamylaz oraz β-amylaza i glukoamylaza zaliczane do grupy egzoamylaz. Wszystkie katalizują hydrolizę wiązań 1-4-α-glikozydowych.

Zgodnie z nazwą „endoamylazy”, αααα-amylaza atakuje wiązania znajdujące się wewnątrz łańcucha (prowadząc do upłynniania skrobi i powstawania oligosacharydów), natomiast ββββ-amylaza i glukoamylaza, jako egzoamylazy, rozrywają odpowiednio co drugie (β-amylaza) lub kolejne (glukoamylaza) wiązania glikozydowe, poczynając od nieredukującego końca łańcucha.

Skrobia obok stosunkowo prostej do zhydrolizowania frakcji amylozy zawiera również frakcję amylopektyny złożoną z łańcuchów rozgałęzionych. Ponieważ wiązania α-1-6-glikozydowe, występujące przy rozgałęzieniach w amylopektynie, stanowią barierę dla działania ββββ-amylazy, rozkład tej frakcji skrobi jest inny: boczne łańcuchy są rozkładane przez β-amylazę do maltozy, podobnie jak prosty łańcuch amylozy, po czym reakcja zatrzymuje się w odległości trzech jednostek glukozy od miejsca rozgałęzienia (wiązania α-1,6-glikozydowego). Powstaje więc nierozłożona, wielkocząsteczkowa dekstryna graniczna, która stanowi około 40-45% masy amylopektyny i wykazuje znaczną lepkość w roztworze i fioletową barwę kompleksu z jodem.

(5)

Tak powstała dekstryna graniczna ulega rozkładowi dopiero przy łącznym działaniu obu enzymów, gdyż α-amylaza jest w stanie „przeskakiwać” przez wiązania α-1,6-glikozydowe (bez ich hydrolizy), tworząc nowe, proste łańcuchy, które mogą już być dalej rozkładane przez β-amylazę. W wyniku łącznego działania α- i β-amylaz skrobia ulega hydrolizie do maltozy i izomaltozy oraz niewielkiej ilości wolnej glukozy.

Najlepiej radzi sobie z amylopektyną (i glikogenem) glukoamylaza występująca w grzybach oraz u zwierząt. Rozkłada ona zarówno wiązania α-1,4-, jak i α-1,6-glikozydowe (o ile te ostatnie znajdują się przy nieredukujacej jednostce glukozy) i dlatego przy jej udziale amylopektyna i glikogen ulegają rozkładowi do glukozy.

Zarówno sok jelitowy, jak i ziarna zbóż zawierają również α-1,4-glukozydazę i α-1,6-glukozydazę (izomaltazę). Enzymy te rozkładają wytworzone w wyniku działania β-amylazy disacharydy do cząsteczek glukozy, która jest końcowym produktem rozkładu enzymatycznego skrobi.

Nazwa EC Typ hydrolizowanych wiązań

α-amylazy EC 3.2.1.1 α-1,4-glikozydowe

β-amylazy EC 3.2.1.2 α-1,4-glikozydowe

glukoamylazy EC 3.2.1.3 α-1,4- i α-1,6-glikozydowe

pululanazy EC 3.2.1.41 α-1,6-glikozydowe

izoamylazy EC 3.2.1.68 α-1,6-glikozydowe

Tabela 1. Wiązania hydrolizowane przez amylazy Metody oznaczania aktywności enzymów amylolitycznych

Szybkość reakcji enzymatycznej można oznaczać:

• poprzez określenie szybkości ubytku substratu bądź też

• poprzez określenie ilości powstałych produktów w jednostce czasu.

W przypadku enzymów z grupy amylaz mogą być zastosowane obydwa sposoby oznaczania aktywności enzymatycznej.

Produktami hydrolizy skrobi wobec α-amylazy są kolejno:

• amylodekstryny zawierające powyżej 30 reszt D-glukozy połączonej wiązaniami glikozydowymi

• erytrodekstryny zawierające 8-12 reszt D-glukozy połączonej wiązaniami glikozydowymi oraz

• achrodekstryny zawierające poniżej 6 reszt D-glukozy połączonej wiązaniami glikozydowymi,

• a także maltoteraoza, maltotrioza oraz maltoza.

Początkowe produkty degradacji skrobi tworzą z jodem barwne kompleksy, jednak achrodekstryny już tych kompleksów barwnych nie tworzą. Oznaczanie aktywności enzymów amylolitycznych poprzez mierzenie ubytku substratu w czasie bazuje na zmniejszeniu się zabarwienia hydrolizatu po dodaniu jego porcji do roztworu jodu (aż do uzyskania tzw.

punktu achromowego, w którym roztwór jodu nie zmienia zabarwienia po dodaniu próbki hydrolizatu). Do takich metod należy miedzy innymi metoda Heinkela pozwalająca na podanie aktywności α-amylazy w jednostkach Wohlgemutha. Inną metodą pozwalającą na oznaczenie w ten sposób aktywności α-amylazy jest metoda Sandstedta, Kneena i Blisha.

(6)

Aktywność amylaz możemy również określić na podstawie przyrostu redukcyjności roztworu. Powstające w wyniku reakcji cukry redukujące możemy oznaczać na różne sposoby np.:

• z wykorzystaniem metody polegającej na pomiarze stopnia osłabienia intensywności zabarwienia alkalicznego roztworu heksascyjanożelazianu(III) potasu. W metodzie tej cukry redukujące reagują z alkalicznym roztworem heksascyjanożelazianu(III) potasu (którego roztwór ma barwę intensywnie żółtą) przekształcając go w bezbarwny heksascyjanożelazian(II) potasu

• z wykorzystaniem metody Bernfelda, która polega na utlenianiu kwasem 3,5-dinitrosalicylowym grup redukujących uwolnionych podczas hydrolizy skrobi w obecności amylaz. W środowisku zasadowym grupa nitrowa soli sodowej kwasu 3,5-dinitrosalicylowego (DNS) w pozycji 3 zostaje zredukowana do grupy aminowej, a powstałe pochodne aminowe mają barwę pomarańczową, silnie absorbują światło przy długości fali 530 nm. Intensywność barwy będącą pochodną ilości powstających produktów oznacza się fotometrycznie

• z wykorzystaniem metody Somogyi i Nelsona wykorzystującej, podobnie jak w poprzednio opisanych metodach, właściwości redukujące sacharydów, które w środowisku zasadowym redukują jony miedzi(II) do jonów miedzi(I) w obecności winianu sodowo-potasowego (odczynnik Somogyi) z wytworzeniem tlenku miedzi CuO w postaci ceglastego osadu. Po dodaniu kwasu arsenomolibdenowego (odczynnik Nelsona) do utworzonego tlenku miedzi zachodzi redukcja tego kwasu do odpowiedniego barwnika o kolorze błękitnym, intensywność otrzymanej barwy można mierzyć w zakresie długości fali od 500-620 nm i jest ona proporcjonalna do ilości utworzonych cukrów redukujących w czasie działania enzymów amylolitycznych.

Szybkość reakcji mierzona ilością przereagowanego związku w jednostce czasu w przeliczeniu na określoną ilość materiału badanego jest miarą aktywności enzymu.

Aktywność ta jest wyrażana w jednostkach umownych i często różniących się w zależności od ustaleń autorów opracowujących daną metodę analityczną.

Porównywanie wyników aktywności uzyskiwanych różnymi metodami może być mylące i dlatego Komisja Enzymowa Międzynarodowej Unii Biochemicznej wprowadziła pojęcie bezwzględnej międzynarodowej jednostki standardowej (U).

Jednostką (U) każdego enzymu jest ta jego ilość, która katalizuje przemianę 1 µmola substratu (lub 1 µmola odpowiednich grup chemicznych) w ciągu 1 minuty, w temperaturze 30^oC i w optymalnych warunkach pH i temperatury dla danego enzymu.

(7)

PRZEBIEG ĆWICZENIA

Zadanie 1. Oznaczanie aktywności α-amylazy zawartej w ślinie

Odczynniki:

• roztwór śliny

• 0.5% roztwór skrobi: naważkę 0.5g skrobi rozpuszczalnej w kolbce miarowej na 100 ml rozpuścić w 80 ml wody ogrzewając do wrzenia, uzyskany roztwór ochłodzić pod bieżącą wodą i jeśli po ochłodzeniu pozostanie klarowny to uzupełnić wodą do 100 ml

• bufor fosforanowy pH 6.6

• 1% roztwór NaCl

• odczynnik Lugola (roztwór I2 w KI): 2g KI rozpuścić w 5 ml wody i w tym roztworze rozpuścić 1g jodu, po czym uzupełnić wodą do 100 ml. Podczas ćwiczenia używany jest roztwór macierzysty rozcieńczony 100-krotnie

• 1M HCl

Szkło i inne materiały oraz potrzebny sprzęt laboratoryjny:

• cylinder miarowy o poj. 25 ml z korkiem

• lejek szklany

• statyw z 11 probówkami

• pipety szklane (po dwie pipety o poj. 1 ml, 2 ml oraz 5 ml)

• gruszka do pipet

• łaźnia wodna ze statywem na probówki ustawiona na 37^oC

• statyw metalowy wraz z łącznikiem i łapą trójkątną

Wykonanie ćwiczenia

1. W cylindrze miarowym z korkiem (1) zebrać 2 ml śliny i rozcieńczyć ją wodą do objętości 20 ml, całość wymieszać w celu ujednolicenia stężenia w całej objętości i odstawić do łaźni wodnej o temperaturze 37^oC.

2. Do zwykłej probówki (2) odmierzyć: 5 ml 0.5% roztworu skrobi, 2 ml 1% roztworu NaCl, 2 ml buforu fosforanowego, całość zamieszać i umieścić w łaźni wodnej o temperaturze 37^oC na co najmniej 5 minut.

3. Przygotować statyw z 10 probówkami zawierającymi po 0.5 ml odczynnika Lugola i 0.5 ml 1M HCl.

4. Po co najmniej 5 minutach inkubowania cylindra (1) oraz probówki (2) w temperaturze 37^oC, do probówki (2) dodać pipetą 1 ml roztworu śliny, zamieszać w celu ujednolicenia stężenia enzymu w całej objętości i zanotować czas rozpoczęcia kontaktu enzymu z substratem skrobiowym (wszystko odbywa się w łaźni wodnej o temperaturze 37^oC). W krótkich odstępach czasu (od 0.5 min. do 1 min.) do probówek zawierających płyn Lugola (umieszczonych w statywie na stole), wprowadzać pipetą 2-3 krople próbki hydrolizatu z probówki (2). Obserwować przebieg reakcji barwnej z jodem. Pobór próbek hydrolizatu kontynuować tylko do momentu, w którym nie obserwuje się już zmiany barwy roztworu jodu. Zanotować

(8)

czas, po którym pobrana próbka nie zmienia barwy roztworu jodu, co znaczy że osiągnięto punkt achromowy.

5. Wypełnić poniższą tabelkę wstawiając do odpowiednich rubryk czas oraz znak „+”

lub „–” mówiący odpowiednio o zmianie barwy lub braku zmiany barwy w momencie zadozowania hydrolizatu do roztworu płynu Lugola.

Czas od rozpoczęcia reakcji enzymatycznej

0.5 min.

1 min.

1.5 min

2 min

3 min.

4 min.

5 min.

6 min.

7 min

8 min.

Zmiana barwy płynu Lugola

6. Podać aktywność amylazy w ślinie w jednostkach/ml.

W tym ćwiczeniu za jednostkę aktywności amylazy przyjmujemy taką ilość enzymu, która hydrolizuje 25 mg skrobi w czasie 10 minut w temperaturze 37 C, w pH 6.6 w obecności jonów chlorkowych do produktów nie dających barwy z jodem.

Przykład obliczenia:

Jeśli do oznaczenie pobrano 1 ml dziesięciokrotnie rozcieńczonej śliny, a punkt achromowy osiągnięto po 5 minutach to aktywność amylazy wynosi: 10/5 x 10 = 20 jednostek/ml.

Zadanie 2. Wpływ jonów chlorkowych na aktywność α-amylazy zawartej w ślinie

Odczynniki:

• roztwór śliny

• 0.5% roztwór skrobi

• woda destylowana

• odczynnik Lugola (roztwór I2 w KI)

• 1M HCl

• statyw z 11 probówkami

• pipety szklane (po dwie pipety o poj. 1 ml, 2 ml oraz 5 ml)

• gruszka do pipet

• łaźnia wodna ze statywem na probówki ustawiona na 37^oC

• mała zlewka

1. W oznaczeniu tym skorzystać z roztworu śliny przygotowanego w zadaniu 1 w cylindrze miarowym z korkiem (1) i umieszczonego w łaźni wodnej o temperaturze 37^oC.

(9)

2. Do zwykłej probówki (2) odmierzyć: 5 ml 0.5% roztworu skrobi, 2 ml wody destylowanej, 2 ml buforu fosforanowego, całość zamieszać i umieścić w łaźni wodnej o temperaturze 37^oC na co najmniej 5 minut.

3. Przygotować statyw z 10 probówkami zawierającymi po 0.5 ml odczynnika Lugola i 0.5 ml 1M HCl.

4. Po co najmniej 5 minutach inkubowania cylindra (1) oraz probówki (2) w temperaturze 37^oC, do probówki (2) dodać pipetą 1 ml roztworu śliny, zamieszać w celu ujednolicenia stężenia enzymu w całej objętości i zanotować czas rozpoczęcia kontaktu enzymu z substratem skrobiowym (wszystko odbywa się w łaźni wodnej o temperaturze 37^oC). W krótkich odstępach czasu (od 1 min. do 2 min.) do probówek zawierających płyn Lugola (umieszczonych w statywie na stole), wprowadzać pipetą 2-3 krople próbki hydrolizatu z probówki (2). Obserwować przebieg reakcji barwnej z jodem. Pobór próbek hydrolizatu kontynuować tylko do momentu, w którym nie obserwuje się już zmiany barwy roztworu jodu. Zanotować czas, po którym pobrana próbka nie zmienia barwy roztworu jodu, co znaczy że osiągnięto punkt achromowy.

5. Wypełnić poniższą tabelkę wstawiając do odpowiednich rubryk czas oraz znak „+”

Czas od rozpoczęcia reakcji enzymatycznej

1 min.

2 min

3 min

4 min.

5 min.

7 min.

9 min.

11 min

13 min.

15 min.

Zadanie 3. Wpływ temperatury na aktywność α-amylazy zawartej w ślinie

Odczynniki:

• roztwór śliny

• 1M HCl

• 3 statywy z 11 probówkami każdy

• pipety szklane (po dwie pipety o poj. 1 ml i 2 ml oraz 4 pipety o poj. 5 ml)

• gruszki do pipet

• łaźnia wodna ustawiona na 80^oC

• 2 statywy metalowe wraz z 2 łącznikami i 2 łapami trójkątnymi

• zlewka lub inne naczynie z lodem, w którym przygotowana zostanie łaźnia lodowa

(10)

2. Do trzech probówek (2) odmierzyć po 5 ml 0.5% roztworu skrobi, 2 ml buforu i 2 ml 1% roztworu NaCl. Każdą probówkę (2) umieścić w innej łaźni (0^oC i 80^oC) oraz w zlewce na blacie (temperatura pokojowa).

3. Przygotować 3 statywy z 10 probówkami zawierającymi po 0.5 ml odczynnika Lugola i 0.5 ml 1M HCl każdy.

4. Po co najmniej 5 minutach inkubowania probówki (2) w odpowiedniej temperaturze, do każdej probówki (2) dodać pipetą 1 ml roztworu śliny, zamieszać roztwór pipetą w celu ujednolicenia stężenia enzymu w całej objętości i zanotować czas rozpoczęcia kontaktu enzymu z substratem skrobiowym (wszystko odbywa się w danej łaźni o określonej temperaturze). W krótkich odstępach czasu (od 0.5 min. do 5 min.) do probówek zawierających płyn Lugola (umieszczonych w statywie na stole), wprowadzać pipetą 2-3 krople próbki hydrolizatu z probówki (2) (postępować w ten sposób z reakcją prowadzoną we wszystkich trzech temperaturach). Obserwować przebieg reakcji barwnej z jodem. Pobór próbek hydrolizatu kontynuować tylko do momentu, w którym nie obserwuje się już zmiany barwy roztworu jodu. Zanotować czas, po którym pobrana próbka nie zmienia barwy roztworu jodu, co znaczy że osiągnięto punkt achromowy.

5. Wypełnić poniższe tabelki wstawiając do odpowiednich rubryk czas oraz znak „+”

lub „–” mówiący odpowiednio o zmianie barwy lub braku zmiany barwy w momencie zadozowania hydrolizatu do roztworu płynu Lugola

Temperatura 0^oC Czas od rozpoczęcia reakcji

enzymatycznej

1 min.

2 min

3 min

4 min.

5 min.

7 min.

9 min.

11 min

13 min.

15*

min.

* Jeśli po 15 minutach od rozpoczęcia reakcji hydrolizy skrobi prowadzonej w 0^oC nie uda się osiągnąć punktu achromowego, należy przygotować kolejnych 9 probówek z płynem Lugola i r-rem HCl i kontynuować pobieranie hydrolizatu w odstępach co 5 minut aż do uzyskania punktu achromowego.

Temperatura pokojowej Czas od rozpoczęcia reakcji

enzymatycznej

0.5 min.

1 min

1.5 min

2 min.

3 min.

4 min.

5 min.

7 min

9 min.

11 min.

(11)

Temperatura 80^oC Czas od rozpoczęcia reakcji

enzymatycznej

1 min.

5 min

10 min.

15 min.

20 min.

25 min.

30 min

40 min.

50 min.

60 min.

Zadanie 4. Wpływ dodatku silnych kwasów i zasad na aktywność α-amylazy zawartej w ślinie

Odczynniki:

• roztwór śliny

• woda destylowana

• 1M HCl

• 1M NaOH

• 3 statywy z 12 probówkami każdy

• pipety szklane (cztery pipety o poj. 1 ml, dwie pipety o poj. 2 ml oraz 5 pipet o poj. 5 ml)

• gruszki do pipet

• łaźnia wodna ustawiona na 37^oC

• mała zlewka

2. Do trzech probówek (2) odmierzyć po 2 ml 0.5% roztworu skrobi skrobi, 1 ml 1% roztworu NaCl, 1 ml buforu fosforanowego Probówki pozostawić w temperaturze pokojowej w trzech różnych statywach na stole.

3. Do trzech następnych probówek (3) odmierzyć po 1 ml roztworu śliny z cylindra (1).

Do pierwszej z nich dodać 1 ml wody, do drugiej 1 ml 1M HCl, do trzeciej 1 ml 1M NaOH, zamieszać i umieścić wszystkie trzy probówki w łaźni wodnej o temperaturze 37^oC na 15 minut.

4. Przygotować 3 statywy z 10 probówkami zawierającymi po 0.5 ml odczynnika Lugola i 0.5 ml 1M HCl każdy.

(12)

5. Po 15 minutach inkubacji enzymu z kwasem, ługiem lub wodą, zawartość probówek (3) zobojętnić wobec papierka wskaźnikowego (odpowiednio zasadą sodową lub kwasem solnym) i uzupełnić roztwór buforem fosforanowym do objętości 5 ml.

6. Następnie dodawać do probówek z substratem (2) roztwory enzymu z probówek (3) w następujący sposób: do pierwszej probówki dodać 1 ml śliny traktowanej wodą, do drugiej probówki dodać 1 ml śliny traktowanej kwasem, a do trzeciej probówki dodać 1 ml śliny traktowanej zasadą. Zawartość probówek wymieszać pipetą w całej objętości w celu ujednolicenia stężenia enzymu i zanotować czas rozpoczęcia kontaktu enzymu z substratem skrobiowym (reakcje prowadzone w temperaturze pokojowej, która należy sprawdzić i zanotować). W krótkich odstępach czasu (od 1 min. do 5 min.) do probówek zawierających płyn Lugola (umieszczonych w statywie na stole), wprowadzać pipetą 2-3 krople próbki hydrolizatu z probówki (2) (postępować w ten sposób z reakcją prowadzoną we wszystkich trzech probówkach).

Obserwować przebieg reakcji barwnej z jodem. Pobór próbek hydrolizatu kontynuować tylko do momentu, w którym nie obserwuje się już zmiany barwy roztworu jodu. Zanotować czas, po którym pobrana próbka nie zmienia barwy roztworu jodu, co znaczy że osiągnięto punkt achromowy.

7. Wypełnić poniższe tabelki wstawiając do odpowiednich rubryk czas oraz znak „+”

Enzym traktowany wodą Czas od rozpoczęcia reakcji

enzymatycznej

1 min.

2 min

3 min

4 min.

5 min.

7 min.

9 min.

11 min

13 min.

15*

min.

* Jeśli po 15 minutach od rozpoczęcia reakcji hydrolizy skrobi prowadzonej w wodzie nie uda się osiągnąć punktu achromowego, należy przygotować kolejnych 9 probówek z płynem Lugola i r-rem HCl i kontynuować pobieranie hydrolizatu w odstępach co 5 minut aż do uzyskania punktu achromowego.

Enzym traktowany ługiem Czas od rozpoczęcia reakcji

enzymatycznej

1 min.

5 min

10 min.

15 min.

20 min.

25 min.

30 min

40 min.

50 min.

60 min.

Enzym traktowany kwasem Czas od rozpoczęcia reakcji

enzymatycznej

1 min.

5 min

10 min.

15 min.

20 min.

25 min.

30 min

40 min.

50 min.

60 min.

(13)

PRZYGOTOWANIE DO ZAJĘĆ

1. Przeczytaj uważnie instrukcję i dokładnie przeanalizuj czynności oraz techniki laboratoryjne opisane w części eksperymentalnej.

2. Zapoznaj się z zagrożeniami związanymi z stosowanymi odczynnikami oraz poszczególnymi czynnościami wykonywanymi na zajęciach (karty charakterystyk).

3. Zwróć uwagę czy znasz następujące pojęcia: enzym, aktywatory i inhibitory enzymów, pH, denaturacja białek, homopolimer, wiązanie α-glikozydowe, amylazy, cukry redukujące.

4. Zastanów się czy wiesz:

a) jak jest zbudowana skrobia (różnice w budowie amylozy i amylopektyny), b) do jakiej klasy enzymatycznej należą amylazy i jakie reakcje katalizują,

c) jaki jest podział amylaz ze względu na mechanizm hydrolizy łańcuchów skrobi i jaka jest pomiędzy nimi różnica w działaniu,

d) w jaki sposób możemy oznaczać postęp reakcji hydrolizy skrobi w obecności amylaz i oznaczyć aktywność tych enzymów,

e) w jaki sposób tworzy się barwny kompleks skrobi z jodem f) co rozumiemy pod pojęciem jednostki aktywności amylazy.

OPRACOWANIE WYNIKÓW

W celu opracowania sprawozdania należy:

a) Na początku zamieścić dokładny opis przeprowadzonych oznaczeń z uwzględnieniem obserwacji poczynionych w trakcie dokonywania każdego oznaczenia (w sprawozdaniu nie zamieszczamy wstępu teoretycznego)

b) Zestawić tabele z wynikami uzyskanymi w poszczególnych punktach wykonywanego ćwiczenia (czas uzyskania punktu chromowego w zależności od warunków prowadzonej reakcji)

c) Tam, gdzie to możliwe, wyliczyć aktywność α-amylazy

d) Na podstawie uzyskanych wyników podsumować wpływ poszczególnych czynników na aktywność badanego enzymu

e) Sprawozdanie zakończyć wnioskami wyciągniętymi na podstawie uzyskanych wyników.

W całym sprawozdaniu należy zwracać uwagę aby opis dotyczył faktycznego !!!

przebiegu ćwiczenia i nie był „kalką” instrukcji.

LITERATURA

• T. Kędryna, M. Gałka-Walczak, B. Ostrowska, Wybrane Zagadnienia z Biochemii Ogólnej z Ćwiczeniami, Wyd. Uniwersytetu Jagiellońskiego, Kraków (2001).

• L. Kłyszejko-Stefanowicz, Ćwiczenia z Biochemii, Wyd. Naukowe PWN, Warszawa, (2003).

• J-L. Reymond, Enzyme Assays, Weinheim: Wiley-VCH (2006)

• J. M. Berg, J.L. Tymoczko, L. Stryer, Biochemia, PWN, Warszawa (2005).

• J. Kączkowski, Podstawy biochemii, WNT, Warszawa, (1993).