Medycyna Wet. 2006, 62 (11) 1288
Praca oryginalna Original paper
Granulocyty obojêtnoch³onne (PMN) stanowi¹ naj-wa¿niejszy sk³adnik systemu obronnego gruczo³u mle-kowego. Przedostanie siê drobnoustrojów do wnêtrza wymienia powoduje aktywacjê tych komórek. Stan ten jest efektem kontaktu z czynnikami chemotaktyczny-mi, wytwarzanymi zarówno przez organizm gospoda-rza, jak i mikroorganizmy. Skutkiem aktywacji s¹ zmiany w morfologii komórki oraz wzrost ekspresji receptorów. Nawet w zlokalizowanej postaci zapale-nia uwalzapale-niane mediatory tego procesu przedostaj¹ siê do krwiobiegu i dzia³aj¹ ogólnoustrojowo, wp³ywaj¹c na stan czynnociowy granulocytów. Obserwuje siê nap³yw PMN do miejsca objêtego procesem zapalnym ze wszystkich dostêpnych obszarów obwodowego, puli marginalnej i szpiku (4, 13, 15, 18).
Do oceny zmian metabolizmu tlenowego, towarzy-sz¹cych aktywacji granulocytów s³u¿¹ badania pozio-mu chemiluminescencji (CL), która jest zjawiskiem generowania fotonów wiat³a podczas reakcji chemicz-nych. Badanie chemiluminescencji neutrofilów mo¿e
byæ przydatne do diagnostyki stanu zapalnego. CL gra-nulocytów jest podwy¿szona w ostrych i przewlek³ych stanach zapalnych, niezale¿nie od ich etiologii i ro-dzaju u¿ytej sondy. Chemiluminescencjê mo¿na wy-wo³aæ, miêdzy innymi, przez zajêcie receptorów dla zwi¹zków chemotaktycznych za pomoc¹ formylo--metionylo-leucylo-fenyloalaniny (fMLP), receptorów dla fragmentów Fc przeciwcia³ i dope³niacza przy u¿yciu opsonizowanego zymosanu (OZ) oraz drog¹ pozareceptorow¹, bezporednio pobudzaj¹c kinazê bia³kow¹ C, z pominiêciem interakcji ligandreceptor u¿ywaj¹c estru forbolu (PMA). Pomiar CL zale¿nej od luminolu koreluje ze stanem funkcjonalnym gra-nulocytów i dotyczy produktów zwi¹zanych z aktyw-noci¹ peroksydazow¹. Badania prowadzone w pe³nej krwi wykluczaj¹ mo¿liwoæ aktywacji tych komórek podczas izolacji (5, 8, 22).
Celem badañ by³a ocena spontanicznej i stymulo-wanej aktywnoci metabolicznej neutrofilów w pe³-nej krwi krów zdrowych oraz z klinicznym i pod-klinicznym zapaleniem wymienia wraz z wp³ywem leczenia mastitis na stan aktywacji tych komórek.
Aktywnoæ granulocytów krwi krów zdrowych
i z zapaleniem gruczo³u mlekowego*
)
HANNA MARKIEWICZ, EDWARD MALINOWSKI, KRYSTYNA KUMA, SEBASTIAN SMULSKI, MICHA£ KACZMAROWSKI
Zak³ad Fizjopatologii Rozrodu i Gruczo³u Mlekowego Pañstwowego Instytutu Weterynaryjnego Pañstwowego Instytutu Badawczego Oddzia³ w Bydgoszczy, al. Powstañców Wlkp. 10, 85-090 Bydgoszcz
Markiewicz H., Malinowski E., Kuma K., Smulski S., Kaczmarowski M.
Activity of neutrophils in the blood of healthy and mastitic cows Summary
The purpose of the study was to evaluate the metabolic activity of neutrophils in pure blood healthy and mastitic cows. Examinations were performed on 10 cows with clinical mastitis, 10 with subclinical mastitis and 10 healthy cows. The blood samples were collected from the coccygeal vessels and milk veins on the first day of clinical mastitis treatment with an intramammary product containing amoxicillin, clavulanic acid and pred-nisolone (or observation of the other cows) and on 3rd and 7th days. The blood was examined in the following
ways: without in vitro stimulation and in vitro stimulation using fMLP, OZ, PMA. The reactive oxygen species (ROS) production was assessed by means of luminol-enhanced chemiluminescence (CL) using a kinetic method for 40 minutes at 38°C, measuring CL at 5 minute intervals (BioOrbit 1251 Luminometer). The area under the curve (integrate) was calculated. Significant differences in CL levels between peripheral blood and blood flowing from the udder were not found, irregardless of the use of stimulators or udder health status. The spontaneous and induced CL level, mainly through means of the receptor, was significantly higher in the blood of mastitic cows in comparison to healthy cows. PMNs from chronic mastitic cows were characterized by weakness of oxygen metabolism and a crucial increase of a stimulated respiratory burst through activation of the protein kinase C way (PMA). A significant decrease of OZ stimulated and non significant decrease of PMA stimulated CL was determined on the 3rd and 7th days after intramammary clinical mastitis treatment;
however, the spontaneous CL remained on the same level. Keywords: mastitis, PMN activity
*) Badania zrealizowano w ramach projektu badawczego nr 2 P06K 048 26 finansowanego przez KBN.
Medycyna Wet. 2006, 62 (11) 1289 Materia³ i metody
Badania przeprowadzono na 10 krowach zdrowych, 10 z podklinicznym i 10 z klinicznym zapaleniem wymienia. Leczenie zwierz¹t wykazuj¹cych kliniczn¹ postaæ mastitis polega³o na 3-krotnej aplikacji dowymieniowej preparatu zawieraj¹cego amoksycylinê z kwasem klawulanowym i prednizolon w odstêpach 12 godz. Wszystkie krowy by³y w podobnej fazie laktacji (miêdzy 15. a 70. dniem po wy-cieleniu). Krew pobrano do probówek heparynizowanych (system Vacutainer) w dniu rozpoczêcia leczenia (lub ob-serwacji w przypadku krów zdrowych i z zapaleniem pod-klinicznym) oraz w 72. i 168. godzinie, licz¹c od tego mo-mentu. Wskaniki hematologiczne oznaczono przy u¿yciu analizatora Sysmex F800, a liczbê komórek somatycznych przy u¿yciu Fossomatic 90. W krwi pe³nej z ¿y³y mlecznej i naczyñ ogona okrelono wielkoæ CL, wed³ug nastêpuj¹-cego schematu: bez stymulacji; stymulacja fMLP; stymulacja OZ; stymulacja PMA. Oznaczenia wykona-no metod¹ kinetyczn¹ w temp. 38°C, rejestruj¹c wskaza-nia luminometru przez 40 min. w odstêpach 5-minutowych. Pomiarów chemiluminescencji zale¿nej od luminolu z wy-korzystaniem pola powierzchni pod krzyw¹ w okrelonym przedziale czasu (integrate), wyra¿aj¹cego ca³kowit¹ iloæ wiat³a wyemitowan¹ przez komórki, dokonano przy po-mocy luminometru BioOrbit 1251.
Stosowano nastêpuj¹ce odczynniki: luminol (Sigma) w postaci substancji, któr¹ rozpuszczono w 0,4% roztwo-rze NaOH do stê¿enia 28 µmol/l; zymosan (Sigma) 100 mg zymosanu zawieszono w mieszaninie 10 ml PBS i 10 ml osocza pochodz¹cego od 5 zdrowych krów, miesza-ninê inkubowano w 38°C przez 30 min., po odwirowaniu osad zawieszono w 10 ml PBS, a po trzykrotnym p³ukaniu osad zawieszono w PBS, aby koñcowe stê¿enie wynosi³o 0,3 mg/ml; PMA (Sigma) w iloci 5 mg rozpuszczono w 5 ml 96% etanolu, a nastêpnie w PBS do stê¿enia 200 ng/ml; fMLP (Sigma) w iloci 5 mg rozpuszczono w 4,56 ml DMSO, z roztworu macierzystego przygotowano odczyn-nik roboczy w PBS o stê¿eniu 2 × 106 M.
Objêtoci i kolejnoæ dodawanych odczynników przed-stawiono w tab. 1.
Otrzymane wartoci skorygowano wed³ug wzoru: CLzmierzona × Hb (%)
CLobliczona = WBC (tys./µl) × PMN (%) × 1,5
Przy doborze stymulatorów kierowano siê mechanizma-mi, przez które dany zwi¹zek powoduje uruchomienie re-akcji wybuchu oddechowego.
Ca³kowity stan antyoksydacyjny osocza oceniano meto-d¹ kolorymetryczn¹ opart¹ na redukcji powstawania
katio-norodnika ABTS°+. Badanie przeprowadzono u¿ywaj¹c odczynników firmy Randox.
Wyniki oceniano przy u¿yciu testu t-Studenta dla prób zale¿nych oraz za pomoc¹ analizy wariancji ANOVA w klasyfikacji pojedynczej przy poziomie istotnoci p < 0,05.
Wyniki i omówienie
rednia liczba komórek somatycznych wynosi³a w grupie krów zdrowych 82 000 ± 70 000/ml, w grupie z zapaleniami podklinicznymi 1 323 000 ± 1 141 000/ ml, a w grupie z zapaleniami klinicznymi 5 437 000 ± 2 855 000/ml (u 3 krów z tej grupy nie oznaczono liczby komórek somatycznych ze wzglêdu na ropny charakter wydzieliny).
Ka¿da krowa cechowa³a siê indywidualnym pozio-mem aktywnoci PMN, co wskazuje na du¿¹ zmien-noæ osobnicz¹. Wielkoæ wybuchu tlenowego neu-trofilów determinowana jest tak¿e wiekiem i faz¹ laktacji (2, 10, 12). Nie wykazano istotnych ró¿nic miêdzy CL krwi obwodowej a CL krwi odp³ywaj¹cej z wymienia, niezale¿nie od u¿ytego stymulatora i sta-nu zdrowotnego gruczo³u mlekowego (tab. 2), dlate-go dalszych analiz dokonywano na wartociach CL krwi odp³ywaj¹cej z wymienia. Zapalenie kliniczne spowodowa³o znamienny wzrost CL spontanicznej w porównaniu do krów zdrowych. Wp³ynê³o równie¿ na istotny wzrost CL stymulowanej zarówno drog¹ re-ceptorow¹, jak i pozareceptorow¹ w porównaniu z gru-p¹ kontroln¹ i z grugru-p¹ z zapaleniem podklinicznym. CL stymulowana fMLP pozostawa³a na poziomie CL spontanicznej we wszystkich grupach krów. Neutrofi-le krów zdrowych odpowiada³y z podobnym natê¿e-niem na aktywacjê zarówno drog¹ receptorow¹, jak i pozareceptorow¹, w przeciwieñstwie do krów z za-paleniem podklinicznym, u których stymulacja PMA
Tab. 1. Objêtoci (µl) i kolejnoæ dodawanych odczynników y n y ³ P i k i n n y z c d o i z e B ij c a l u m y t s ) S B ( OZ fMLP PMA S B P 200 100 100 100 l o n i m u L 100 100 100 100 a n ³ e p w e r K 150 150 150 150 r o t a l u m y t S 100 100 100
Tab. 2. Aktywnoæ PMN w krwi odp³ywaj¹cej z wymienia i krwi obwodowej krów zdrowych i krów z zapaleniem wy-mienia (x ± SD; n = 10)
Objanienie: a, b ró¿nice istotne dla p < 0,05 u ³ o z c u r g n a t S o g e w o k e l m Stymulator ¯y³amleczna Naczyniaogona y w o r d Z S B 1481a±204 1471±197 P L M f 1491a±189 1478±159 Z O 1269a±427 1125±258 A M P 1129a±523 1432±703 e i n e l a p a Z e n z c i n il k d o p S B 11885±337 1854±316 P L M f 11895±300 1927±307 Z O 1159a±458 1136±359 A M P 11725±436 1593±456 e i n e l a p a Z e n z c i n il k S B 1097b±772 1900±734 P L M f 1251b±863 1010±869 Z O 02279b±1130 1876±834 A M P 1745b±948 1926±875
Medycyna Wet. 2006, 62 (11) 1290
wywo³a³a istotnie wy¿sz¹ CL ni¿ opsonizowany zy-mosan. W grupie krów z zapaleniem klinicznym sil-niejszym stymulatorem by³ OZ ni¿ PMA. Granulocy-ty krów z zapaleniem podklinicznym cechowa³y siê s³ab¹ reakcj¹ na stymulatory, przy jednoczesnej nad-produkcji reaktywnych form tlenu (wartoæ ilorazu integrate bez stymulacji do wartoci integrate ze stymulatorem 0,76). U krów zdrowych iloraz ten wy-nosi 0,38, wobec 0,48 u krów z zapaleniem klinicz-nym. Uzyskane wyniki potwierdzaj¹, ¿e zapalenie gru-czo³u mlekowego nie jest jedynie procesem miejsco-wym, ograniczonym do danej æwiartki, ale oddzia³y-wuje równie¿ na ca³y organizm, co wp³ywa na funkcjê kr¹¿¹cych granulocytów.
Podanie dowymieniowe antybiotyku spowodowa³o obni¿enie CL stymulowanej OZ w 3. i 7. dniu od roz-poczêcia leczenia. Uzyskane ró¿nice by³y na granicy istotnoci (p = 0,057). Obserwowano równie¿ spadek CL po stymulacji PMA. Chemiluminescencja sponta-niczna i indukowana fMLP pozostawa³a na podobnym poziomie w kolejnych dniach po leczeniu (tab. 3).
Z danych pimiennictwa wynika, ¿e PMN byd³a cechuj¹ siê brakiem receptorów dla fMLP. Formylo-metionylowe peptydy, których syntetycznym analo-giem jest fMLP, nie wywo³uj¹ chemotaksji neutrofi-lów bydlêcych (19, 20). Uzyskane wyniki potwierdzaj¹, ¿e fMLP nie stymuluje wybuchu tlenowego granulo-cytów. Niektóre badania pokazuj¹ jednak, ¿e recepto-ry dla fMLP na neutrofilach tego gatunku mog¹ byæ utajone, a mechanizmy ich ekspresji s¹ nieznane. Wy-kazano bowiem wzrost CL stymulowanej fMLP w wysokim stê¿eniu (2 × 104 M)przez PMN krów.
Wybuch tlenowy wzrasta³, kiedy pomiar poprzedzony by³ preinkubacj¹ z mieloperoksydaz¹ (3).
Inwazja bakterii do gruczo³u mlekowego wp³ywa na aktywacjê komórek ródb³onka i wydzielanie cyto-kin (IL-1, IL-8, TNF-a) przez komórki epitelialne (1). Uwalnianie cytokin prozapalnych przez te komórki jest spolaryzowane w kierunku przypodstawnobocznym, co sprzyja nie tylko nap³ywowi PMN do gruczo³u mle-kowego, ale tak¿e aktywacji neutrofilów w krwi ob-wodowej (17). Skutkiem aktywacji jest, miêdzy inny-mi, wzrost ekspresji receptorów dla czynników che-motaktycznych. U krów z chronicznym zapaleniem wymienia wywo³anym przez Staph. aureus nie stwier-dzono zmian w ekspresji receptorów b³onowych neu-trofilów krwi obwodowej, jak równie¿ zmian w sub-populacji limfocytów (16). Wykazano jednak, ¿e 83% krów z t¹ postaci¹ mastitis cechuje siê obecnoci¹ spe-cyficznych przeciwcia³ klasy IgG, podczas gdy u 17% zwierz¹t ich nie wykryto (7). Stan zapalny wymienia indukowany podaniem LPS powoduje obni¿enie CL neutrofilów (11).
Funkcje opsonizuj¹ce u byd³a spe³niaj¹ g³ównie przeciwcia³a klasy IgM i IgG2. Wiêkszoæ obecnych w krwi PMN wi¹¿e IgM, co wskazuje, ¿e te w³anie przeciwcia³a s¹ istotne dla fagocytozy. Rozpoznanie immunologiczne bakterii nastêpuje przez region Fab,
a wi¹zanie z PMN przez Fc. Zdolnoæ PMN do ruchu i fagocytozy jest, miêdzy innymi, uwarunkowana obec-noci¹ receptorów b³onowych, które pozwalaj¹ na wi¹-zanie immunoglobulin i wykrywanie chemoatraktan-tów (14).
W przeprowadzonych badaniach wykazano wzmo-¿on¹ aktywnoæ metaboliczn¹ neutrofilów, ocenian¹ testem CL, u krów z klinicznym zapaleniem wymie-nia. Mo¿e to wskazywaæ na skuteczne dzia³anie uk³a-du immunologicznego. Wielkoæ CL jest zwi¹zana z bakteriobójcz¹ zdolnoci¹ granulocytów obojêtno-ch³onnych. W grupie krów z podklinicznym zapale-niem nie wykazano istotnego wzrostu CL po stymula-cji PMA i OZ. S³absza odpowied na aktywacjê za-równo drog¹ receptorow¹, jak i pozareceptorow¹ mo¿e byæ wynikiem d³ugotrwa³ej stymulacji wywo³anej przez mediatory zapalenia i prowadz¹cej do funkcjo-nalnego wyczerpywania siê komórek. W podobnych badaniach, w których jako wynik pomiaru przyjêto maksymaln¹ wartoæ CL (szczyt), uzyskano odmien-ne wyniki. Najbardziej podatodmien-ne na stymulacjê OZ by³y granulocyty krów wykazuj¹cych mastitis subclinica, a CL spontaniczna u krów z objawami klinicznymi by³a ni¿sza ni¿ u zdrowych (9).
Granulocyty obojêtnoch³onne mog¹ znajdowaæ siê w ró¿nych stanach funkcjonalnych. Neutrofile zwie-rz¹t zdrowych wykazuj¹ tzw. spoczynkow¹ aktywnoæ CL. W ostrych i przewlek³ych stanach zapalnych PMN mog¹ byæ w stanie aktywacji, preaktywacji lub czerpania. U krów z podklinicznym zapaleniem wy-mienia odpowied na stymulatory by³a s³aba, co wska-zuje na obni¿enie siê metabolizmu tlenowego neutro-filów. Mo¿e byæ to spowodowane wyczerpywaniem siê rezerw energetycznych tych komórek, na skutek chronicznego przebiegu zapalenia podklinicznego. Obni¿enie CL zwi¹zane te¿ jest ze zmniejszeniem licz-by Fc receptorów na skutek z³uszczania lub internali-zacji. O przejciu zapalenia w stan przewlek³y lub te¿ o wygaszeniu tego procesu decyduje iloæ
nap³ywaj¹-Tab. 3. Aktywnoæ granulocytów obojêtnoch³onnych krwi krów przed i po leczeniu mastitis
Tab. 4. Wp³yw stanu zdrowotnego gruczo³u mlekowego na ca³kowity stan antyoksydacyjny osocza (TAS mmol/l)
Objanienie: * p < 0,05 r o t a l u m y t S 0.dizeñ 3.dizeñ 7.dizeñ S B 1097±772 1152±883 1301±816 P L M f 1251±863 1182±798 1368±824 Z O 2279±1130 1535±985 1577±927 A M P 1745±948 1302±765 1370±821 i w r k j a z d o R Stangruczo³umlekowego y w o r d z zap.podkilniczne zap.kilniczne a n z c e l m a ³ y ¯ 0,312±0,166 0,199±0,116 0,243±0,178 a n o g o a i n y z c a N 0,311±0,150 0,210±0,100 0,261*±0,184
Medycyna Wet. 2006, 62 (11) 1291 cych leukocytów z kr¹¿enia i czas ich prze¿ycia oraz
szybkoæ usuwania tych komórek przez makrofagi (21).
Oceniaj¹c ca³kowity stan antyoksydacyjny osocza, za który odpowiadaj¹ moleku³y niskocz¹steczkowe (6), nie stwierdzono istotnych ró¿nic miêdzy grupami zwie-rz¹t (tab. 4). Krowy zdrowe cechowa³y siê jednak wy¿szym rednim poziomem TAS, podczas gdy naj-ni¿sze wartoci obserwowano u krów z zapaleniem podklinicznym. Obni¿ona wartoæ pojemnoci anty-oksydacyjnej u krów z zapaleniem podklinicznym mo¿e wskazywaæ, ¿e jest to równoczenie zapalenie przewlek³e, a niskie wartoci TAS mog¹ byæ skutkiem d³ugotrwa³ego utrzymywania siê podwy¿szonego stê-¿enia reaktywnych form tlenu (RFT). W grupie krów z zapaleniem klinicznym odnotowano istotn¹ ró¿nicê miêdzy TAS krwi odp³ywaj¹cej z wymienia, a krwi¹ obwodow¹. Zwiêkszone wytwarzanie RFT w gruczo-le mgruczo-lekowym, wywo³ane gwa³townym nap³ywem PMN u tych zwierz¹t, mo¿e przyczyniaæ siê do obni-¿enia TAS w krwi odp³ywaj¹cej z wymienia. Nie stwierdzono wp³ywu dowymieniowej aplikacji prepa-ratu antybiotykowego na zmianê poziom TAS w ko-lejnych dniach badañ.
Z przeprowadzonych badañ wynika, ¿e w krwi krów z kliniczn¹ postaci¹ mastitis ma miejsce nasilona che-miluminescencja spontaniczna i indukowana g³ównie drog¹ receptorow¹, po³¹czona z istotnym zmniejsze-niem potencja³u antyoksydacyjnego. U krów z pod-kliniczn¹ postaci¹ mastitis widoczne jest os³abienie metabolizmu tlenowego neutrofilów, a g³ówn¹ drog¹ stymulacji jest droga pozareceptorowa.
Pimiennictwo
1.Alluwaimi A.: The cytokines of bovine mammary gland: prospects for diag-nosis and therapy. Res. Vet. Sci. 2004, 77, 211-222.
2.Burvenich C., Merris V., Mehrzad J., Diez-Fraile A., Duchateau L.: Severity of E. coli mastitis is mainly determined by cow factors. Vet. Res. 2003, 34, 521-564.
3.Cooray R.: Formylmethionyl leucyl phenylalanine induced chemilumi-nescence responses in bovine polymorphonuclear leukocytes. Comp. Immun. Microbiol. Infect. Dis. 1996, 19, 1-8.
4.Hampton M., Kettle J., Winterbourn C.: Inside the neutrophil phagosome: oxidants, myeloperoxidase, and bacterial killing. Blood 1998, 92, 3007-3017. 5.Jurczak W., Skotnicki A., Zgliczyñski M., Kwasnowska E.:
Chemilumines-cencja granulocytów. Przegl¹d Lek. 1993, 50, 53-58.
6.Kleczkowski M., Kluciñski W., Sikora J., Zdanowicz M., Dziekan P.: Role of the antioxidants in the protection against oxidative stress in cattle nonen-zymatic mechanisms (Part 2). Pol. J. Vet. Sci. 2003, 6, 301-308.
7.Leitner G., Yadlin B., Glickman A., Chaffer M., Saran A.: Systemic and local immune response of cows to intramammary infection with Staphylococcus aureus. Res. Vet. Science 2000, 69, 181-184.
8.Lewkowicz P., Lauk-Pucha³a B., Banasik M., Górañska N., Tchórzewski H.: Próba standaryzacji pomiaru chemiluminescencji krwi pe³nej jako metody oceny funkcji ludzkich granulocytów w badaniach in vitro. Diagn. Lab. 1999, 35, 497-510.
9.Malinowski E., Kuma K., Sobolewska S., K³ossowska A.: Aktywnoæ meta-boliczna komórek fagocytuj¹cych mleka i krwi krów zdrowych i z zapale-niem wymienia. Medycyna Wet. 1998, 54, 321-324.
10.Mehrzad J., Duchateau L., Pyöröla S., Burvenich C.: Blood and milk neutrophil chemiluminescence and viability in primiparous and pluriparous dairy cows during late pregnancy, around parturition and early lactation. J. Dairy Sci. 2002, 85, 3268-3276.
11.Mehrzad J., Dosogne H., Meyer E., Burvenich C.: Local and systemic effects of endotoxin mastitis on the chemiluminescence of milk and blood neutrophils in dairy cows. Vet. Res. 2001, 32, 131-144.
12.Mehrzad J., Dosogne H., Meyer E., Eman R., Burvenich C.: Respiratory burst activity of blood and milk neutrophils in dairy cows during different stages of lactation. J. Dairy Res. 2001, 68, 399-415.
13.Paape M., Bannerman D., Zhao X., Lee J. W.: The bovine neutrophil: Struc-ture and function in blood and milk. Vet. Res. 2003, 34, 597-627. 14.Paape M., Mehrzad J., Zhao X., Detilleux J., Burvenich Ch.: Defense of
the bovine mammary Gland by polymorphonuclear neutrophil leukocytes. J. Mammary Gland Biol. Neoplasia 2002, 7, 109-119.
15.Prin-Mathieu C., Le Roux Y., Faure G. C., Laurent F., Béné M. C., Mous-saoui F.: Enzymatic activities of bovine peripheral blood leukocytes and milk polymorphonuclear neutrophils during intramammary inflammation caused by lipopolysaccharide. Clinical and Diagnostic Lab. Immunol. 2002, 9, 812--817.
16.Riollet C., Rainard P., Poutrel B.: Cell subpopulations and cytokine expres-sion in cow milk in response to chronic Staphylococcus aureus infection. J. Dairy Sci. 2001, 84, 1077-1084.
17.Rambeaud M., Almeida R., Pighetti G., Oliver S.: Dynamics of leukocytes and cytokines during experimentally induced Streptococcus uberis mastitis. Vet. Immunol. Immunopath. 2003, 96, 193-205.
18.Sordillo L., Streicher K.: Mammary gland immunity and mastitis susceptibi-lity. J. Mammary Gland Biol. Neoplasia 2002, 7, 135-145.
19.Swain S., Nelson L., Hanson A., Siemsen D., Quinn M.: Host defense func-tion in neutrophils from the American bison. Comp. Biochem. Physiol. Mol. Integr. Physiol. 2000, 127, 237-247.
20.Targowski S., Niemia³towski M.: Appearance of Fc receptors on polymor-phonuclear leukocytem after migration and their role in phagocytosis. Infect. Immun. 1986, 52, 798-802.
21.Tchórzewski H.: Zapalenie. Patofizjologia i klinika. Medpress, Warszawa 1998, s. 99.
22.Wiktorowicz K., Cofta J., Mackiewicz S.: Zastosowanie chemiluminescencji do oceny aktywnoci komórek fagocytuj¹cych. Post. Nauk Med. 1993, 6, 184-187.
Adres autora: dr Hanna Markiewicz, ul. Toruñska 52D/51, 86-050 Solec Kujawski
