Vaste-fase peptidesynthesen: Synthese van oxytocine, vasopressine en menselijk calcitonine met behulp van een machine

V a s t e - f a s e p e p t i d e s y n t h e s e n

Synthese van oxytocine,vasopressine

en menselijk calcitonine

met behulp van een

machine

Rik Hindriks

n

UI o

>- o

u> o

Vaste - fase p e p t i d e s y n t h e s e n

Synthese van o x y t o c i n e , vasopressine

en menselijk c a l c i t o n i n e

met behulp v a n e e n

m a c h i n e

BIBLIOTHEEK TU Delft P 1888 3066 C 603512

INIIj

m mil uil lU linUlNlir mil III^ iiiimiiyi

lil

!!l

liii

iiiiiii

iiiü:

IHlUllMlIlilI

1

-X) o 00 0> 00 O- 00

V a s t e - f a s e p e p t i d e s y n t h e s e n

Synthese van o x y t o c i n e , vasopressine

en menselijk c a l c i t o n i n e

met b e h u l p v a n e e n

m a c h i n e

Proefschrift

ter v e r k r i j g i n g van de graad van doctor i n de technische wetenschappen aan de Technische Hogeschool D e l f t , op gezag van de rector magnificus ir. H.R. van N a u t a Lemke, hoogleraar in de A f d e l i n g der e l e k t r o t e c h n i e k , voor een commissie aangewezen door het c o l l e g e van dekanen, te verdedigen op woensdag 31 januari 1973 te 16.00 uur door

H i n d r i k H i n d r i k s

scheikundig ingenieur

D i t proefschrift is goedgekeurd door de promotor PROF. DR. H.C. BEYERMAN

I N H O U D A f k o r t i n g e n Inleiding en d o e l s t e l l i n g 9 1. DE VASTE-FASE SYNTHESE 11 1 . 1 . I n l e i d i n g 1 1 1.2. Principe 12 1.3. De vaste drager en het invoeren van f u n k t i o n e l e groepen 13

1.4. A a n h e c h t e n van het eerste aminozuur 14 1.5. Keuze van de beschermende groepen 15

1.6. Koppelingsmethoden 16 1.7. Afsplitsingsmethoden 17 1.8. Mechaniseren en automatiseren van de bewerkingen 18

2 . MECHANISEREN V A N DE BEWERKINGEN 19

2 . 1 . I n l e i d i n g 19 2 . 2 . A p p a r a t e n voor de synthese van peptiden 20

2 . 3 . Konstruktie van de eigen machine 24

3. SYNTHESE V A N O X Y T O C I N E EN ENKELE DERIVATEN 34

3. 1. I n l e i d i n g 34 3 . 2 . Synthese volgens de vaste-fase methode 35

3 . 3 . A f s p l i t s i n g van het peptide van het polymeer 37

3 . 4 . Experimenteel gedeelte 41

4 . SYNTHESE V A N LYSINE^-VASOPRESSINE EN ENKELE DERIVATEN 48

4 . 1 . I n l e i d i n g 48 4 . 2 . Synthese volgens de vaste-fase methode 4 9

5. SYNTHESE VAN MENSELIJK CALCITONINE-15AMIDE 57

5. 1. Inleiding 57 5 . 2 . Synthesen volgens de vaste-fase methode 61

5 . 2 . 1 . Fragment 11-32 61 5 . 2 . 2. Beschermende groepen 64 5 . 2 . 3 . Afsplitsing van het polymeer en ammonolyse 66

5 . 2 . 4 . Fragment 1-10 69 5 . 2 . 5 . Synthese van de beschermde calcitonine sekwentle 71

5 . 2 . 6 . Vrij calcItonIne-lSamIde 71 5 . 2 . 7 . Biologische aktlvltelt 72 5.3. Experimenteel gedeelte 73 SAMENVATTING EN KONKLUSIES 86 SUMMARY A N D CONCLUSIONS 89 LITERATUUR 92

A F K O R T I N G E N

In de gebruikte afkortingen zijn zoveel mogelijk de aanbevelingen van de lUPAC-kommissIe voor biochemische nomenclatuur gevolgd.

[J. BIol. Chem., 247 (1972) 977] Boe Bzl DCCI DCCU DCHA D N S DMF DVB Et IE M e MRC Nps O N p ONSu ORD

®

TFA Tos Trt Z Z-TF t-butyloxycarbonyl benzyl N , N'-dIcyclohexylcarbodiimide N , N'-dicyclohexylureum dicyclohexylamine

dansyl (5-dimethylaminonaphtaleen-l -sulfonyl) dimethyl f ormamide

divinylbenzeen ethyl

internationale eenheid methyl

medical research council o-nitrofenylsulfenyl p-nitrofenylester hydroxysuccinimidester optische rotatie dispersie

polymere drager (inkluslef de daaraan gesubstitueerde methyleengroep) trifluorazijnzuur

tosyl trityl

benzyl oxycarbonyl

Het onderzoek, dat in d i t proefschrift wordt beschreven, is uitgevoerd onder auspiciën van de Stichting " S c h e i k u n d i g Onderzoek in N e d e r l a n d " met f i n a n c i ë l e steun van de Nederlandse O r g a n i s a t i e voor Z u i v e r W e t e n -schappelijk O n d e r z o e k . Tekenwerk: J . M . Dijksman Foto's : F. Hommers A. Schriel O f f s e t : d r u k k e r i j Van Os, O SS

I N L E I D I N G E N D O E L S T E L L I N G

De synthese van peptiden met behulp van een vaste drager (1), ook wel v a s t e fase synthese of M e r r i f i e l d s y n t h e s e genoemd, heeft b i j de werkgroep p e p t i d e -onderzoek te D e l f t vanaf het begin in de b e l a n g s t e l l i n g gestaan. Het -onderzoek a a n deze methode door Van Zoest (2) werd spoedig gevolgd door een suksesvolle synthese van o x y t o c i n e (3), waarmee het belang van de w e r k w i j z e werd onder-streept.

U i t dit w e r k werd d u i d e l i j k , dat door het grote aantal handelingen aan de praktische u i t v o e r i n g van de methode bezwaren k l e v e n . De methode leent z i c h echter uitstekend voor mechanisering, omdat a l l e bewerkingen In h e t z e l f d e reaktievat kunnen worden u i t g e v o e r d .

M i j n eerste doel is dan ook geweest een apparaat (synthesizer) te ontwerpen, waarmee de bewerkingen mechanisch kunnen worden u i t g e v o e r d .

Het verdere onderzoek was erop g e r i c h t om met behulp van de synthesizer de nnogelijkheden en de beperkingen van de vaste-fase synthese beter te leren kennen.

Om de machine op z i j n bruikbaarheid te testen, werden achtereenvolgens de p

nonapeptiden o x y t o c i n e en lysine -vasopressine gesynthetiseerd. M e t de gunstige ervaring, d i e hiermee werd opgedaan, r i c h t t e n w i j onze aandacht tenslotte op de synthese van menselijk c a l c i t o n i n e , met 32 aminozuren, teneinde de beperkingen v a n de vaste-fase synthese te onderzoeken.

h o o f d s t u k 1

DE V A S T E - F A S E S Y N T H E S E

1 . 1 . I n l e i d i n g

De vastefase synthese zoals die door M e r r i f i e l d (1) vanaf 1959 werd o n t -w i k k e l d , is gebaseerd op algemeen toegepaste -w e r k -w i j z e n in de peptidechemie. Het invoeren van een onoplosbare vaste drager brengt echter w e z e n l i j k e v e r a n d e -ringen met z i c h mee ten aanzien van de keuze van de beschermende groepen en de praktische u i v o e r i n g van de synthese.

Omdat het peptide aan één z i j d e aan de g e m a k k e l i j k te f i l t r e r e n p o l y m e e r -korrels k o v a l e n t gebonden b l i j f t , biedt deze aanpak een aantal voordelen boven de g e b r u i k e l i j k e methoden:

- A l l e bewerkingen kunnen in h e t z e l f d e r e a k t i e v a t worden u i t g e v o e r d , waardoor deze a a n z i e n l i j k vereenvoudigd en versneld worden.

- De v e r l i e z e n d i e b i j de k o n v e n t i o n e l e w e r k w i j z e ontstaan b i j het isoleren en zuiveren van de tussenprodukten worden vermeden.

- Een v o l l e d i g e omzetting b i j iedere stap kan b e r e i k t worden door de reaktonten In grote overmaat toe te voegen.

- De gehele procedure kan worden gemechaniseerd. - Oplosbaarheidsproblemen z i j n u i t g e s l o t e n .

Daartegenover staan echter een aantal nadelen:

- Z u i v e r i n g en kontrole van de tussenprodukten is n i e t m o g e l i j k .

- Er kunnen sekwenties optreden waarin één of meer aminozuren ontbreken (failure sequences) (4).

- De keten kan tussentijds worden afgebroken (truncated sequence) (4).

- Er kunnen z i c h z i j r e a k t i e s voordoen, zoals: d i a c y l e r i n g ( 5 , 6 ) , i n t e r - k e t e n aminolyse (7), d i o x o p i p e r a z i n e v o r m i n g (811) en afsplitsing van z i j k e t e n b e -schermende groepen, gevolgd door de vorming van sekundaire ketens. - Door het werken met een grote overmaat is er materiaal verlies.

- De grote overmaat aan reaktaüten maakt het n o o d z a k e l i j k a l l e z i j k e t e n s te beschermen. D i t betekent een beperking voor de t a k t i e k en de strategie (12) volgens w e l k e men een peptide kan opbouwen.

In d i t hoofdstuk zal de M e r r i f i e l d - m e t h o d e in het kort worden behandeld. G e d e t a i l l e e r d e gegevens v i n d t men in een d r i e t a l recente o v e r z i c h t s a r t i k e l e n (13-15) en in het laboratoriumhandboek van Stewart en Young (16).

1 . 2 . P r i n c i p e ( 1 , 1 7 - 2 2 )

De grondgedachte van de M e r r i f i e l d - m e t h o d e is schematisch weergegeven in figuur 1 - 1 .

A l s uitgangsprodukt dient een onoplosbaar polymeer waaraan f u n k t i o n e l e groepen X worden gehecht. Het eerste N-beschermde aminozuur wordt v i a een stabiele esterbinding c o v a l e n t aan het polymeer gebonden door reaktie van de v r i j e carboxylgroep met de r e a k t i e v e groep X . N a het selektief afsplitsen van de NH«-beschermende groep kan aan de ontstane v r i j e aminofunktie het tweede Nbeschermde aminozuur worden gebonden. Deze reaktievolgorde wordt v o o r t -gezet tot het gewenste peptide aan de drager is gevormd.

aantiechten deblokkeren n e u t r a l i s e r e n koppelen hierhalen Y-Az,-OH Y - A z , - ( P ) H - A z , - © Y - A z j - A z , - ® Y-Az -OH Y-Az„ A Z j - A z , - ® a f s p l i t s e n

_-©

Y-Az„ A z j - A z , - 2 H-Az„ AZj-Az,-OH

Figuur 1-1 Principe van de M e r r i f i e l d - m e t h o d e .

Az = aminozuur; X = reaktieve groep aan het polymeer (P); Y en Z zijn bescher-mende groepen voor respektievelijk amino- en carboxylfunkties.

In t e g e n s t e l l i n g t o t de reakties die worden toegepast in de klassieke p e p t i d e synthese b e t r e f t het hier dus een heterogene reaktie w a a r b i j de oplosbare r e a k t o n -ten reageren met een onoplosbare p e p t i d e k e t e n . Bijproduk-ten en in overmaat toegevoegde reagentia kunnen dan ook g e m a k k e l i j k worden v e r w i j d e r d door het polymeer g r o n d i g te wassen met geschikte oplosmiddelen. Bij de laatste stap wordt de covalente b i n d i n g tussen het C - t e r m i n a l e aminozuur en het polymeer verbroken. Het polymeer wordt a f g e f i l t r e e r d , waarna u i t het f i l t r a a t het peptide kan worden geïsoleerd en g e z u i v e r d .

De r e a k t i e v o l g o r d e zoals die door M e r r i f i e l d werd gekozen - opbouw van het C t e r m i n a l e naar het N t e r m i n a l e aminozuur betekent dat a l l e e n het N b e beschermde aminozuur, dat aan de keten wordt gebonden, door een k o p p e l i n g s -reogens w o r d t g e a k t i v e e r d . A f h a n k e l i j k van de keuze vati de N-beschermende groep kan de racemisatie d i e h i e r b i j optreedt minimaal z i j n . A n o l o g o met variaties in het N - t e r m i n a l e deel kunnen op deze w i j z e eenvoudig worden gesynthetiseerd.

O n a f h a n k e l i j k van M e r r i f i e l d o n t w i k k e l d e Letsinger (23,24) een methode waarbij het N - t e r m i n a l e aminozuur aan de drager wordt gebonden. K o p p e l i n g met een c o r b o x y l - b e s c h e r m d aminozuur komt t o t stand door de eindstandige carboxylgroep van de peptideketen te a k t i v e r e n . Vanwege de kans op racemisatie en het v e r l i e s aan p e p t i d e m a t e r i a a l , heeft deze methode geen verdere toepassing gevonden*.

1 . 3 . D e v a s t e d r a g e r e n h e t i n v o e r e n v a n f u n k t i o n e l e g r o e p e n

De a f g e l o p e n jaren is veel studie v e r r i c h t naar de juiste keuze van het p o l y -meer en de daaraan te hechten r e a k t i e v e groepen. In het o v e r z i c h t s a r t i k e l van M e r r i f i e l d (13) worden b i j v o o r b e e l d a l 37 mogelijkheden genoemd.

De eisen waaraan deze dragers moeten v o l d o e n , z i j n :

a) De vaste drager moet v o l l e d i g onoplosbaar z i j n in de oplosmiddelen en reagentia d i e b i j de synthese worden g e b r u i k t , zoals gechloreerde k o o l w a t e r -stoffen en organische en minerale zuren.

b) Het materiaal moet mechanisch sterk z i j n , z o d a t tijdens de bewerkingen geen v e r g r u i z i n g optreedt.

c) In het polymeer moeten r e a k t i e v e groepen ingevoerd kunnen worden waaraan het C - t e r m i n a l e aminozuur kan worden gebonden,

N a een u i t g e b r e i d onderzoek koos M e r r i f i e l d voor een copolymeer van styreen en 2 % d i v i n y l b e n z e e n (DVB). Voor de oplossing van bepaalde problemen (21) en b i j de synthese van grote peptiden (26-28) gebruikt men sinds korte t i j d 1 % DVB. D i t levert weliswaar een verlies van mechanische s t a b i l i t e i t maar daartegenover staat een groter zweivermogen en een groter poriënvolume.

CICH2-O-CH3 + ^ > - ^ SnCU CICH2 R Boc-NH-CH-COOH + EtjN R O , ^ ^ .—. Boc-NH-CH-C-OCH,-<Q-<P) EtsN-CH.H^^J^^ Cl©

Figuur 1-2 Het invoeren van f u n k t i o n e l e groepen en het aanhechten van het C - t e r m i n a l e aminozuur.

Funktionele groepen kunnen worden geïntroduceerd door r e a k t i e van het c o -polymeer met c h l o o r m e t h y l m e t h y l e t h e r in a a n w e z i g h e i d van een Friedel-Crafts katalysator (29) (figuur 12). Door een juiste keuze van de r e a k t i e o m s t o n d i g -heden (temperatuur, t i j d , hoeveelheid katalysator, roersnelheid en z w e l m i d d e l ) kan de substitutie beperkt worden tot 1 a 2 m m o l / g polymeer. D i t betekent dat o n geveer 1 0 2 5 % van de oromaatringen is gesubstitueerd. Door het grote z w e i -vermogen van het polymeer v i n d t de reaktie zowel aan het oppervlak als binnen in de polymeerkorrels plaats.

1 . 4 . A a n h e c h t e n v a n h e t e e r s t e a m i n o z u u r

De aangebrachte chloormethyIgroepen reageren g e m a k k e l i j k met het

c a r b o x y l a a t a n i o n van een aminozuur onder vorming van een stabiele c o v a l e n t e esterbinding (figuur 1-2). Daartoe wordt een suspensie van het gechloormethyleerde copolymeer gedurende 24 uur in b i j v o o r b e e l d absolute ethanol b i j kooktemperatuur v e r h i t met het t r i e t h y l o m m o n i u m z o u t van het N-beschermde aminozuur.

Hoewel het polymeer n a u w e l i j k s z w e l t in e t h a n o l , b l i j k t toch u i t o n d e r z o e -kingen (30) met peptiden gemerkt met t r i t i u m dat het aminozuur onder deze kondities uniform over de polymeerkorrels wordt v e r d e e l d . De c h l o o r m e t h y l -groepen die tijdens de verestering niet reageren, kunnen a a n l e i d i n g geven tot verdere v e r t a k k i n g van het polymeer (cross-linking) (31).

A l s een kontrole op eventuele racemisatie is in een aantal g e v a l l e n ( 2 0 , 3 2 ) het veresterde aminozuur met waterstofbromide afgesplitst van het polymeer. Bij v e r g e l i j k e n van de d r a a i i n g van het geïsoleerde produkt met die van het uitgangs-produkt, kon geen racemisatie worden aangetoond.

Tijdens de verestering treedt een z i j r e a k t i e op, w a a r b i j aan de drager q u a t e r -naire ammoniumgroepen ontstaan ( 2 , 3 3 ) , d i e het aminozuur als anion aan het polymeer kunnen binden (figuur 1-2). Hoewel in veel geval len. slechts sporen ionogeen gebonden aminozuur konden worden aangetoond, d i e n t hiermee b i j de b e p a l i n g van het gehalte aan veresterd aminozuur toch rekening te worden g e -houden (3, 34, 35).

1 . 5 . K e u z e v a n d e b e s c h e r m e n d e g r o e p e n

Van de ongeveer 50 bekende amino-beschermende groepen z i j n er slechts enkele d i e voldoen aan de volgende speciale eisen d i e de vaste-fase methode stelt:

- De beschermende groep moet selektief ten o p z i c h t e van de esterbinding aan het polymeer kunnen worden afgesplitst,

- Het beschermde aminozuur moet stabiel z i j n , g e m a k k e l i j k te bereiden en geen a a n l e i d i n g geven tot racemisatie tijdens de k o p p e l i n g .

- De produkten die b i j de afsplitsing van de beschermende groep ontstaan,moeten g e m a k k e l i j k kunnen worden v e r w i j d e r d .

De t b u t y l o x y c a r b o n y l ( B o c ) g r o e p (3638) v o l d o e t uitstekend aan deze v o o r waarden en wordt daarom v r i j w e l algemeen g e b r u i k t . De groep kan worden a f g e -splitst met I N zoutzuur in i j s a z i j n ( 1 8 , 3 9 ) , 4 N zoutzuur in d i o x a a n ( 3 9 , 4 0 ) of met t r i f l u o r a z i j n z u u r In m e t h y l e e n c h l o r i d e in verschillende verhoudingen ( 2 6 , 3 9 , 4 1 ) .

De keuze van de beschermende groepen voor de z i j k e t e n s en voor d e a a m i n o -- f u n k t i e van het N -- t e r m i n a l e aminozuur vormt een onderdeel van de t a k t i e k (12),

w a a r b i j de synthese van het peptide in z i j n geheel moet worden bekeken. In het algemeen g e l d t , dat gedurende de gehele synthese a l l e z i j k e t e n s beschermd moeten b l i j v e n omdat b i j de k o p p e l i n g een grote overmaat van het aminozuur w o r d t g e b r u i k t . De s p e c i f i e k e problemen d i e h i e r b i j optreden komen in het praktische gedeelte nader aan de orde.

1 . 6 . K o p p e l i n g s m e t h o d e n

Evenals b i j de klassieke peptidesynthese wordt N , N ' - d i c y c l o h e x y l c o r b o d i i m i d e (DCCI) (42) het meest g e b r u i k t als aktiveringsreagens. Hoewel in het heterogene m i l i e u een korte r e o k t i e t i j d en een geringe overmaat aminozuur en DCCI vaak voldoende b l i j k t , wordt in het algemeen gedurende 2 uur gereageerd met een 3 è 4 v o u d i g e overmaat aan reaktonten om zeker te z i j n van een v o l l e d i g e o m -z e t t i n g .

A l s reaktiemedlum z i j n het meest geschikt oplosmiddelen die het z w e l l e n van het polymeer bevorderen en die bovendien een hoge d i e l e k t r i s c h e konstante b e z i t t e n , zoals d i m e t h y l f o r m o m i d e , methyleenchloride en chloroform. In de p r a k -t i j k word-t v r i j w e l u i -t s l u i -t e n d gewerk-t me-t me-thyleenchloride omda-t daarin de vorming van i n a k t i e v e acylureumomleggingsprodukten wordt onderdrukt (19, 20).

Bij het invoeren van Boc-asparagine en m o g e l i j k ook van Boc-glutamine moet van deze w e r k w i j z e worden a f g e w e k e n . Het a k t i v e r e n van deze aminozuren met D C C I geeft n a m e l i j k a a n l e i d i n g tot n i t r i l v o r m i n g door w a t e r o n t t r e k k i n g aan de carbonamidefunktie in de z i j k e t e n ( 4 3 , 4 4 ) . Z i j worden daarom ingevoerd als p-nitrofenylesters (45) in dimethylformomide als oplosmiddel (46),

O p d i t Laboratorium is onderzocht in hoeverre het toevoegen van katalysatoren als 1. 2 . 4 - t r i a z o o l een verbetering kan geven b i j de k o p p e l i n g van a k t l e v e esters in de vastefase synthese (2). O p basis van de gegevens die hierbij werden v e r -kregen werd een synthese van o x y t o c i n e u i t g e v o e r d ( 2 , 3 ) . G e l e t op de opbrengst en de z u i v e r h e i d van het verkregen produkt kan met een zekere v o o r z i c h t i g h e i d worden gekonkludeerd dat toevoegen van een katalysator juist die geringe v e r -hoging van het koppelingsrendement geeft die een i n g e w i k k e l d e z u i v e r i n g van het eindprodukt overbodig maakt. Computerberekeningen (47) bevestigen dat k l e i n e verschillen h i e r b i j van groot belang z i j n .

In een recente p u b l i k a t i e stellen Ragnarsson e . m . (48) dat toevoegen van t r i a z o o l b i j een vaste-fase synthese geen e f f e k t heeft. G e z i e n de interesse die op d i t Laboratorium voor d i t gebied bestaat, is het onderwerp weer in studie genomen.

1 . 7 . A f s p l i t s i n g s m e t h o d e n

a) onder z u r e kondities

Door behandeling met waterstofbromide in t r i f l u o r a z i j n z u u r gedurende korte ( 3 1 , 4 9 ) of langere t i j d (18) wordt de esterbinding tussen peptide en polymeer v e r b r o k e n , t e r w i j l t e g e l i j k e r t i j d een aantal z i j k e t e n beschermende groepen worden v e r w i j d e r d . De o n t l e d i n g van z u u r - l o b i e l e aminozuren en de soms optredende lage opbrengsten vormen echter een n a d e e l . De laatste t i j d wordt daarom meer en meer vloeibaar w a t e r s t o f f l u o r i d e gebruikt ( 5 0 , 5 1 ) . Dank z i j de a f w e z i g h e i d van oxiderende en reducerende eigenschappen is deze stof b i j z o n d e r geschikt als reaktiemedlum. Temeer nu er v o o r ' d l l ë t r i f u n k t l o n e l e aminozuren z i j k e t e n beschermende groepen z i j n o n t w i k k e l d d i e stabiel z i j n t i j d e n s de vaste-fase synthese en die met waterstoffluoride b i j O C gedurende k o r t e t i j d kunnen worden afgesplitst (52).

b) onder b a s i se h e • k o n d i t i es

H e t is bekend dat esters onder bepaalde omstandigheden kunnen worden omge-z e t via een ammonolyse, aminolyse, hydraomge-zinolyse of een omestering tot r e s p e k t i e v e l i j k amiden, gesubstitueerde amiden, hydroziden en esters. Deze reakties worden ook in de vaste-fase synthese toegepast, meestal in methanol of ethanol als oplosmiddel. De ammonolyse ( 2 , 3 , 5 3 - 6 3 ) is d a a r b i j met name v a n belang omdat steeds vaker peptiden in de natuur worden aangetroffen met een C - t e r m i n a l e a m i d e f u n k t i e , zoals b i j v o o r b e e l d : o x y t o c i n e , vasopressine, s e c r e t i n e , c a l c i t o n i n e , thyreotroop releasing hormoon en luteneiserend hor-moon - f o l l i k e l stimulerend horhor-moon / releasing horhor-moon.

V o o r het v e r k r i j g e n van v o l l e d i g b e s c h e r m d e p e p t i d e n , die eventueel g e b r u i k t kunnen worden b i j f r a g m e n t k o p p e l i n g e n , kan het peptide worden afgesplitst door hydrazinolyse ( 3 5 , 4 6 , 6 4 - 6 8 ) of door omestering met een t e r t i a i r e base in a l k o h o l ( 8 , 3 4 , 6 2 , 6 9 - 7 8 ) (figuur 1-3).

De omestering in a a n w e z i g h e i d van een sterke anionen-wisselaar (79,80) Keeft als g e v o l g van de b e w e r k e l i j k e procedure en door de i n s t a b i l i t e i t van de ionenwisselaar geen toepassing gevonden.

B o e - P e p t i d e - ©

NHj/'CHaOH NpH,

i-^n/ ^r\-j\.

NH3 N2H, Boc-Peptide-NHj < Boc-Peptide-OCH, » Boc-Peptide-N2H3

CH3OH

OH

Boc-Peptide-OH

Figuur 1-3 Ammonolyse, hydrazinolyse en omestering van de p e p t i d e - p o l y m e e r b i n d i n g .

In hoofdstuk 3 zal nader worden ingegaan op de omestering met behulp van een t e r t i a i r e base in een a l k o h o l .

1 . 8 . M e c h a n i s e r e n e n a u t o m a t i s e r e n v a n d e b e w e r k i n g e n

Bij het o n t w i k k e l e n van z i j n methode was het u i t e i n d e l i j k e doel van M e r r i f i e l d de handelingen zodanig te k i e z e n dat ze automatisch zouden kunnen worden u i t gevoerd (20). O p d i t moment kan men stellen dat de methode slechts is g e m e c h a -niseerd omdat een k o n t r o l e op de meest essentiële stappen in de synthese, te weten de afsplitsing van de beschermende groepen en de koppel ingsreoktie, en de d a a r b i j behorende t e r u g k o p p e l i n g nog n i e t is gerealiseerd.

Een b e l a n g r i j k probleem b i j de kontrolemethoden (8184) vormt de v a r i a b i l i -t e i -t van de b l a n k o waarden, die a f h a n k e l i j k b l i j k e n -te z i j n van de leng-te van de keten en in het bijzonder van de g e b r u i k t e aminozuren ( 8 5 , 8 6 ) . In feite maakt d i t een automatische r e g e l i n g b i j z o n d e r m o e i l i j k , omdat moet worden gerelateerd aan een b l a n k o w a a r d e , d i e voor Ieder geval opnieuw moet worden bepaald. Daarnaast moet worden gezocht naar a d d i t i o n e l e gegevens, b i j v o o r b e e l d v i a aminozuuranalyses, die een éénduidige i n t e r p r e t a t i e van de b l a n k o waarden m o g e l i j k maken.

In hoeverre de reakties en de t a l l o z e wasprocedures d i e met deze kontrole v e r -bonden z i j n , a a n l e i d i n g kunnen geven tot onverwachte z i j r e a k t i e s moet nog worden onderzocht.

h o o f d s t u k 2

M E C H A N I S E R E N V A N DE B E W E R K I N G E N

2 , 1 . I n l e i d i n g

De strakke opzet van de vastefase synthese met a l l e daarin optredende h e r -halingen maken het werken aan deze procedure tot een geestdodend k a r w e i . De synthese van een nonapeptide vereist b i j v o o r b e e l d a l l e e n voor het wassen van het peptide-polymeer al 522 handelingen. Een en ander geeft g e m a k k e l i j k a a n l e i d i n g tot vergissingen en heeft een negatieve i n v l o e d op de reproduceerbaarheid van de resultaten, zo men al de moed opbrengt om een synthese te herhalen. Daarom

Is gezocht naar een machine die d i t werk kan overnemen. De voordelen van een machine z i j n :

- Grotere nauwkeurigheid in de b e w e r k i n g e n . - Reproduceerbaarheid van de resultaten.

- Winst in manuren, doordat de machine 24 uur per etmaal in werking kan z i j n . - Bescherming b i j het werken met g i f t i g e stoffen of r a d i o a k t i e v e v e r b i n d i n g e n . - Voorkomen van routinewerk.

- Kontrole door registratie van de h a n d e l i n g e n .

De apparaten die tot op d i t moment z i j n gebouwd, hebben gemeen dat ze b e staan uit een elektronische of elektromechanische stuureenheid en u i t een m e -chanisch g e d e e l t e . Hiertoe wordt gerekend: het r e a k t i e v a t , de flessen om de wasvloeistoffen en reagentia in te bewaren en de komponenten die nodig z i j n om de vloeistoffen te verplaatsen.

In d i t hoofdstuk zal ter v e r g e l i j k i n g aandacht worden besteed aan de M e r r i f i e l d - m a c h i n e en aan twee machines die t e g e l i j k e r t i j d met ons ontwerp werden g e p u b l i c e e r d . Vervolgens zal de w e r k i n g worden beschreven van de machine d i e op d i t Laboratorium werd o n t w i k k e l d en gebouwd.

2 . 2 . A p p a r a t e n v o o r d e s y n t h e s e v a n p e p t i d e n

M a c h i n e volgens M e r r i f i e l d e. m. ( 2 0 , 8 7 - 9 0 )

In d i t apparaat worden de aminozuren en de wasvloeistoffen c. q. reagentia a f z o n d e r l i j k gekozen v i a twee "selector v a l v e s " . Deze kleppen of kranen bestaan in p r i n c i p e uit een vaste t e f l o n s c h i j f met x aansluitingen op de omtrek voor de toevoer van vloeistoffen en In het midden van de schijf een centrale afvoer. T e -gen de eerste schijf wordt met een veer een tweede t e f l o n s c h i j f gedrukt die door een motor steeds 3 6 0 / x graden wordt gedraaid en die middels een uitsparing de verbinding tot stand brengt tussen toevoer en afvoer. De kleppen z i j n m o e i l i j k te maken en bieden een grote kans op mechanische defekten en op v e r o n t r e i n i -ging van de stoffen o n d e r l i n g ,

De vloeistoffen worden vanuit de reservoirs v i a de selector valves naar het r e a k t i e v a t gepompt. H i e r i n worden de polymeerkorrels in intensief kontakt g e -bracht met de vloeistoffen door het r e a k t i e v a t met behulp van een motor en een daaraan verbonden e x c e n t r i e k over 180 graden heen en weer te schudden.

De volgorde van de bewerkingen wordt geregeld door een programmeereenheld d i e bestaat uit een r i j mikroswitches , geplaatst onder een trommel met gaten op de omtrek, waarin pluggen gestoken kunnen worden. Wanneer de trommel draait, worden de pluggen meegenomen. Deze zetten op hun beurt een mikroswitch om, waarna een bepaalde bewerking wordt uitgevoerd gedurende een t i j d die tevoren op een k l o k is ingesteld.

Omdat iedere bewerking a f z o n d e r l i j k wordt gestuurd is deze manier van p r o grammeren b e w e r k e l i j k . Er z i j n meerdere t i j d b e p a l e n d e elementen, die t e g e -l i j k e r t i j d in werking z i j n en die dus v o -l -l e d i g op e-lkaar ingeste-ld moeten worden om ongewenste overlappingen te voorkomen. De f l e x i b i l i t e i t van het systeem, d. w. z. de m o g e l i j k h e i d om tussentijds het programma of een deel daarvan te veranderen of te herhalen, is don ook g e r i n g .

M a c h i n e volgens Brunfeldt e. m. (91-93)

Ten o p z i c h t e van de M e r r i f i e l d m a c h i n e heeft d i t apparaat een tweetal f u n d a -mentele w i j z i g i n g e n :

1. De vloeistoffen worden met behulp van stikstof vanaf het reservoir naar de reaktor getransporteerd door t e f l o n l e i d i n g e n . De hoeveelheid vloeistof wordt afgemeten met f o t o c e l l e n die op verschillende volumina instelbaar z i j n .

2. H e t stuurprogramma wordt overgebracht door middel van een ponsband (Teletype p r i n t e r ) .

In de reaktor worden de polymeerkorrels in de v l o e i s t o f f e n geroerd met een propellerroerder. Om te voorkomen dat d a a r b i j deeltjes aan de wand gehecht b l i j v e n , worden de wasvloeistoffen en reogensoplossingen door een t e f l o n m e m -braanpornp onder in de reaktor aangezogen en boven weer i n g e v o e r d , zodat de wand v a n de reaktor voortdurend wordt afgespoeld. Recent ( 1 1 , 8 3 , 94) is het apparaat u i t g e b r e i d met een k o n t r o l e m o g e l i j k h e i d , w a a r b i j v r i j e omlnogroepen na de koppel ingsreoktie worden bepaald door potentiometrische t i t r a t i e met p e r -c h l o o r z u u r .

Deze machine wordt in l i c e n t i e gebouwd door Schworz BIoResearch, I n e , O r a n g e b u r g , N e w Y o r k ,

M a c h i n e volgens Loffet e . m , (95)

L o f f e t en Close o n t w i k k e l d e n een apparaat w a a r b i j vooral de eenvoud van het mechanisch gedeelte o p v a l t ; het elektromechanisch gedeelte is nagenoeg g e l i j k aan d a t van de M e r r i f i e l d - m a c h i n e ,

De oplosmiddelen en reagentia worden door stikstofdruk v a n u i t z e l f v u l l e n d e doseerflessen v i a g l a z e n l e i d i n g e n naar een stilstaande reaktor geperst. Een stikstofstroom die onder in de reaktor door het g l o s f i l t e r wordt gevoerd, zorgt er voor dat de polymeerkorrels in de v l o e i s t o f in beweging b l i j v e n . Door het d o o r l e i d e n van stikstof verdampt het oplosmiddel waardoor de k o n c e n t r a t i e v e r -loging ten gevolge van de koppel ingsreoktie wordt tegengegaan. T e g e l i j k e r t i j d daalt de temperatuur in de reaktor in enkele minuten tot ongeveer O C.

V a n u i t het oogpunt van konstruktie biedt een stilstaande reaktor veel v o o r -d e l e n . Er z i j n echter ook n a -d e l e n , waarop in -de volgen-de paragraaf na-der zal worden ingegaan.

Het v a l t buiten het bestek van d i t hoofdstuk een b e s c h r i j v i n g te geven van a l l e , geheel of g e d e e l t e l i j k , gemechaniseerde apparatuur voor de synthese volgens het p r i n c i p e van M e r r i f i e l d . De betreffende literatuur (96-101) z i j hier v o l l e d i g h e i d s h a l v e v e r m e l d .

Het mechanische gedeelte: eerste ontwerp

Het mechanische gedeelte: laatste ontwerp

2 . 3 . K o n s t r u k t i e v a n d e e i g e n m a c h i n e ( 1 0 2 )

Het mechanische gedeelte

Bij de konstruktie van het mechanische gedeelte van de machine diende het ontwerp van Loffet en Close (2. 2 . ) ons tot v o o r b e e l d . In de loop der jaren hebben w i j echter op grond van de p r a k t i j k een groot aantal veranderingen aangebracht, waardoor het geheel eenvoudiger, meer bedrijfszeker en minder kwetsbaar is g e -worden. M e n v i n d t d i t goed geïllustreerd in de foto's van het eerste en het laatste ontwerp, die ter v e r g e l i j k i n g naast e l k a a r z i j n geplaatst.

Figuur 2 - 1 Schema van het mechanische gedeelte

Figuur 2 - 1 geeft een schematische weergave van het mechanische g e d e e l t e . U i t een c y l i n d e r komt stikstof binnen met een druk van 0 . 3 a t o . Deze wordt v i a een f i j n r e g e l v e n t i e l (F^), w e r k t tevens als smoorklep, toegevoerd aan een zestal magneetkleppen. De uitgangen van deze kleppen z i j n verbonden met de flessen, w a a r i n z i c h de wasvloeistoffen en reagentia b e v i n d e n . Wanneer op een signaal v a n u i t de stuureenheid de k l e p wordt geopend, perst de stikstof de vloeistof uit het meetvaatje (M) v i a een t e f l o n l e i d i n g naar de reaktor (R), Onder i n v l o e d van de druk zal de v l o e i s t o f ook v a n u i t het meetvaatje worden teruggevoerd naar de voorraadfles. Door de v l o e i s t o f b e w e g i n g w o r d t het glazen k o g e l t j e in het t o e -voerkanaal omhooggevoerd, waardoor d i t kanaal wordt afgesloten. N a d a t de k l e p

gesloten is, l e k t de overdruk v i a de v e i l l g h e i d s o p e n i n g (V) weg waarna het meet-vaatje v a n u i t de doseerfles automatisch wordt g e v u l d .

Eén o f t a k k l n g (I) van de s t i k s t o f l e l d i n g komt via een f i j n r e g e l v e n t i e l (F^) u i t onder de r e a k t o r . O m d a t de opening naar het opvangvat van de afval vloeistoffen (O) is afgesloten door een k w i k s l o t zal het gas door het g l o s f i l t e r worden geperst. De f i j n e gasbelletjes, d i e d a a r b i j ontstaan, houden de polymeerdeeltjes gesuspen-deerd in de v l o e i s t o f .

Tijdens de koppel ingsreaktie, waarbij methyleenchloride oU oplosmiddel wordt gebruikt veroorzaakt het doorleiden van stikstof een snelle daling van de temperatuur. Ten gevolge van de verdamping ontstaat na korte tijd een dikke slurry, vanwaoruit vaak polymeer-korrels tegen de wond van de reaktor worden geslingerd. Het is daarom noodzakelijk de wand regelmatig met enkele milliliters methyleenchloride af te spoelen.

Meer moeilijkheden werden tijdens de koppeling ondervonden door het uitkristalliseren van dicyclohexylureum in het glosfilter waardoor verstoppingen optreden. In verband hiermee is het wenselijk dut een nieuwe reaktor wordt gekonstrueerd.

Een t w e e d e a f t a k k i n g (II) d i e n t voor de f i l t r a t i e . N o het openen van de f i l t r o -t i e k l e p w o r d -t de paddes-toelvormige -t e f l o n a f s l u i -t e r als g e v o l g van de s-tuwdruk o p g e t i l d , waardoor de bovenuitgang van de reaktor wordt afgesloten. De vloeistof In de r e a k t o r wordt nu in enkele sekonden door het g l o s f i l t e r en het k w i k s l o t in het o p v a n g v a t geperst.

De programmeerbare stuureenheid

Om het apparaat als hulpmiddel b i j de research optimaal te doen funktioneren hebben w i j b i j het ontwerpen van de stuureenheid de volgende k r i t e r l a aangelegd:

1. Het programmeren moet snel en eenvoudig u i t te voeren z i j n . 2. Tijdens de w e r k i n g moet het programma g e w i j z i g d kunnen worden.

3. Het g e b r u i k van (extra) hulpmiddelen moet zoveel m o g e l i j k worden vermeden.

Een v o o r b e e l d van een v o l l e d i g e cyclus is geschetst in figuur 2 - 2 . Zoals uit deze f i g u u r d u i d e l i j k w o r d t , is de cyclus onderverdeeld in d r i e ë n , te weten: toevoegen, agiteren en f i l t r e r e n . A g i t e r e n w i l hier zeggen: het gesuspendeerd houden v a n het polymeer in een vloeistof door opstijgende stikstofbelletjes. De t o e v o e g - en f i l t r a t i e t i j d e n z i j n weliswaar instelbaar, moor daarna g e f i x e e r d voor a l l e stappen, zodat ze automatisch uitgevoerd kunnen worden. De volgorde w a a r in de r e a g e n t i a en de wasvloeistoffen worden toegevoegd, tezamen met de b i j b e

o» .automatisch ^ stap 1 2 , 3 , 4

5,6,7

8,9,10 11 12, 13, 14 15 16, 17, 18 19,20,21 22, 23, 24 25 toevoegtijd 5" 5" 5" 5" 5" 5" startpuls carrousel = toevoegtijd 5" 5" 5" 5" einde cyclus HC|/HOAc-H O A c - , EtOH— C H j C I j E t g / C H ^ C I j C H j C I j - Boe-aminozuur-C H j Boe-aminozuur-C l j - ^ EtOH—^ H O A c - » — keuze (1 uit 6) -«.-«.automatisch-». •agitatietijd 30' 3' 3' 3' 10' 3' 1 0 ' - ^ D C C I — a g i t a t i e t i j d 2 hr 3' 3' 3' filtratietijd 15" 15" 15" 15" 15" 15" 15" 15" 15" 15" Figuur 2-2

horende a g i t a t i e t i j d e n , moet dus worden g e k o z e n . Deze keuze wordt vastgelegd door voor ledere stap (één stap = toevoegen + agiteren + f i l t r e r e n ) één plug in de matrix te steken,

U i t ekonomische overwegingen en om de w i l l e van de eenvoud w e r d voor de a g i t a t i e t i j d van de wasvloeistoffen één k l o k g e b r u i k t , • Handbediening • HCl/HOAc • HOAc , EtOH , DMF , Et3N/CH2Cl2 n CH2CI2 DCCI Q Boc-Aminozuur o Einde cyclus 0 0 0 0 0 0 0 0 0 * 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 • Filtratie t • tocvo«g*n Oiogiltrtn fifiUrcrtn

rwfj

nil/1/1/

rWff

•".. '1 l/IT TTïïTpiT

1 L _ ^ ^

^ ,

• ^ t

1,

1,

•Rjt

^&È:

(^^

^ M ^

JL- start

'^ iï^V

ir

Figuur 2 - 3 Schema van het elektronische gedeelte

Voor het programmeren wordt gebruik gemaakt van een x - y m a t r i x (plugbord), opgebouwd u i t een stelsel van elkaar kruisende geleiders, d i e met behulp van Insteekpennen of pluggen In de gewenste volgorde met elkaar doorverbonden kunnen worden (figuur 2 - 3 ) . O p de x-as staat het totaal aantal stappen (35), dat kan worden u i t g e v o e r d . De oplosmiddelen en de reagentia z i j n op de y - a s aangegeven,

De matrix w o r d t gestuurd door een s c h i j f (S) met een u i t h o l l i n g op de omtrek. In het v l a k rond de s c h i j f z i j n 3 5 ( + l ) mikroswitches aangebracht, e l k behorend b i j één stap van de m a t r i x . Achtereenvolgens wordt nu een e l e k t r i s c h e v e r b i n d i n g

tot stand gebracht met de x o s van de matrix wanneer de roller van de b i j b e h o -rende mikroswitch in de uitsparing v a l t .

Tijdens de f i l t r a t i e wordt een puls naar de motor (M) toegevoerd, waardoor de schijf z i c h verplaatst tot de volgende stop met de m a t r i x Is verbonden. N o a f l o o p van de f i l t r a t i e wordt deze stap gestart. V a n u i t de matrix wordt dan een relais (R) gevoed, dot op z i j n beurt de t o e v o e g k l e p en de k l o k voor de a g i t a t i e -t i j d bedien-t.

De gong van zaken b i j de koppel ingsreaktie (figuur 2 2 , stap 15) w i j k t g e -d e e l t e l i j k af van a l l e an-dere stappen om-dat Boc-omlnozuur en DCCI na elkaar worden toegevoegd zonder dot tussentijds wordt g e f i l t r e e r d . In d i t geval wordt de puls, d i e anders d i e n t voor het openen van de t o e v o e g k l e p , gebruikt voor starten van de pomp, waarmee Boc-aminozuuroplossing wordt aangevoerd. In het eerste ontwerp werd met een slongenpomp Bocaminozuuroplossing en D C C I --oplosslng aangezogen uit b u i z e n , die op een draaiende s c h i j f (carrousel) waren geplaatst. Door aantasting van het slangenmateriaal werden in een tweede o n t -werp deze oplossingen naar het r e a k t i e v a t verplaatst door stikstofdruk.

De eerste klok geeft de t i j d aan w a a r i n het Boc-ominozuur in het polymeer kan d i f f u n d e r e n . Juist voor het verstrijken van deze t i j d schakelt k o n t a k t 2 van de klok om, waardoor de tweede k l o k - voor de r e o k t i e t i j d - wordt gestart. De eerste k l o k schakelt u i t en de beide kontakten keren weer terug in de ruststand.

In feite bevat ledere klok vier kontakten waarvan er twee worden ingeschakeld bij het starten van de klok en twee vlak voordat de ingestelde tijd Is afgelopen.

A l s een a a n v u l l i n g op het schema in figuur 2 - 3 is in figuur 2 - 4 de situatie voor een w i l l e k e u r i g e stop weergegeven tijdens de b e w e r k i n g d i e b i j ieder o n d e r -deel is aangegeven.

In deze figuur 2 - 4 is te z i e n dot na het indrukken van de startknop, b i j de eerste bewerking (toevoegen) via de kontakten van de f i l t r o t i e k l o k het relais (R) wordt aangetrokken, t e r w i j l ook de t o e v o e g k l o k wordt ingeschakeld. De k o n -takten van het relais en de k l o k worden a a n g e t r o k k e n , zodat de toevoegklep wordt geopend. Wanneer de t o e v o e g t i j d is verstreken, v a l l e n de kontakten terug en wordt de k l e p gesloten. Gedurende een korte t i j d zou nu v i a kontakt 2 van de toevoegklok de f i l t r o t i e k l o k gestart kunnen worden. De schakeling is echter z o d a n i g dat d i t n i e t kon gebeuren. V i a k o n t a k t 1 van de t o e v o e g k l o k wordt v e r volgens de k l o k voor de a g i t a t i e t i j d gestart. Omdat het k o n t a k t wordt a a n g e

M a t r i x en cyclyskeuzeschokelaar ( v o o r z i j d e )

M a t r i x ( a c h t e r z i j d e ) en schijf met mikroswitches

t r o k k e n , wordt een deel van het c i r k u i t stroomloos, zodat v i a k o n t a k t 2 van de t o e v o e g k l o k de f i l t r o t i e k l o k n i e t kon worden gestart,

Figuur 2 - 4 Schema's van de schakelingen tijdens de d r i e bewerkingen

N o afloop van de a g i t a t i e t i j d v a l t het k o n t a k t terug en wordt dus de f i l t r a t i e -k l o -k gestart. Bij het aantre-k-ken van -k o n t a -k t 2 wordt het relais stroomloos en v o l t af; de f i l t r a t i e k l e p wordt geopend. T e g e l i j k e r t i j d gaat k o n t a k t 1 om, zodat de t o e v o e g k l o k n i e t meer wordt gestart. V i a het d o c h t e r k o n t a k t komt een v e r b i n d i n g tot stand met de pulsvormer, d i e een puls naar de motor voert.

De stap die wordt u i t g e v o e r d , wordt op de x - en y - a s gemarkeerd door lampjes zodat In één oogopslag d u i d e l i j k Is hoever het programma gevorderd is. N a d a t het

_.Jg*JHl

De cycluskeuzeschakelaar

hele programma is a f g e w e r k t , loopt de s c h i j f door naar de beginstand en passeert d a a r b i j de 36ste m i k r o s w i t c h , die n i e t naar de matrix is gevoerd. Deze geeft een puls naar een t e l l e r , d i e aangeeft hoeveel malen het programma is herhaald.

Het aantal c y c l i wordt tevoren ingesteld met de cycluskeuzeschakelaar (zie f o t o ) . Deze is opgebouwd u i t een relais waarvan het anker v o o r z i e n is van een polkonstruktle. A o n het einde van de cyclus wordt het relais bekrachtigd en drukt de pol tegen een w i e l met 36 tanden, waardoor het w i e l en de daaraan verbonden schijf met uitsparing over 10 graden wordt v e r d r a a i d . M e t de b e -dieningsknop wordt een tweede schijf, waarop een mikroswitch is gemonteerd, in de gewenste stand gebracht. Wanneer het voorgeschreven aantal c y c l i is v o l b r a c h t , v a l t de mikroswitch in de uitsparing, waarna het hoofdrelois a f v a l t .

De schakeling is z o d a n i g , dat het programma en de ingestelde t i j d e n naar wens kunnen worden veranderd t e r w i j l de machine in w e r k i n g is. Wordt het g e programmeerde systeem n i e t g e b r u i k t , dan is handbediening met behulp van d r u k -knoppen m o g e l i j k .

A a n v u l l e n d e informatie over de apparatuur kan worden verkregen op de a f d e l i n g der Scheikundige t e c h n o l o g i e van de Technische Hogeschool te D e l f t , b i j de volgende personen:

algemeen ontwerp : G . W , H . A . Mansveld G . W . H . A , Mansveld e l e k t r o n i k a glasinstrumentmaken fijnmechanische t e c h n i e k A . G . van den H e u v e l , P . J . M o l e n k a m p B, E . J . C . H a r t w i g , S . A . J i l l e s e n 33

h o o f d s t u k 3

S Y N T H E S E V A N O X Y T O C I N E E N E N K E L E D E R I V A T E N

3 , 1 . I n l e i d i n g

De b e l a n g s t e l l i n g voor het peptidehormoon o x y t o c i n e (figuur 3-1) dateert al u i t 1906 toen Dole ontdekte dot een ruw e x t r o k t von de hypofyseochterkwob een samentrekking van de uterus In het k o n i j n teweegbracht (103). In tegenstelling tot wat op grond hiervan werd aangenomen, wordt o x y t o c i n e tezamen met vasopressine ( z i e hoofdstuk 4) geproduceerd in bepaalde neuronen van de h y p o t h a l a -mus, Beide hormonen worden van daaruit v i a zenuwvezels getransporteerd naar de bloedvaten binnen de a c h t e r k w a b van de hypofyse. De scheiding van o x y -t o c i n e en vasopressine g e l u k -t e in 1928 Kamm en medewerkers (104).

UsJ" C2H,

T I

NH, Q CH2 Q CH — C H , I II ; I II : I l.o,.„c,n. CH; — CH — C - ^ N H —CH—C-f-NH —CH I ' ' I c Ty'0»ln« C ^ O S o n NH I ^ U Asporogin* ^ « 1 CH; — CH — N H - r C — C H — N H - r C — C H —(CH2)2 — CONH2 I ' ^ H , ' GUlomln. C = 0 I - I - o "^ONH; o CH; — N I , II . I ^ H — C - J - N H — C H —C-J-NH — CH,—CONH2 CH2 C H , ' I ' GtycmomidC PrcUn, C H , l . u c i n , C H ( C H 3 ) 2 H-Cys-Tyr-lle-GlN-AsN-Cys-Pro-Leu-GlyNH; Figuur 3-1 O x y t o c i n e 34

In 1932 raakte V . du Vigneoud betrokken b i j het onderzoek, omdat h i j door z i j n werk op het gebied van insuline geïnteresseerd was in e i w i t t e n , die zwavel bevatten. A l s resultaat van een uitgebreid onderzoekprogramma publiceerde h i j in 1953 de struktuuropheldering en de synthese van o x y t o c i n e (105, 106). Sinds-dien z i j n een groot aantal synthesen beschreven. Hiervoor werd gebruik gemaakt van klassieke w e r k w i j z e n (107) e n , meer recent, ook van de vastefase m e t h o -diek ( 2 , 3 , 5 5 - 5 7 , 7 8 ) .

De synthese, die in d i t hoofdstuk wordt beschreven, werd ondernomen om de machine op hoor bruikbaarheid te testen. W i j kozen d a a r b i j voor een synthese van o x y t o c i n e omdat een keten van negen aminozuren ons een geschikte orde van grootte leek. Daarbij komt, dat kon worden gesteund op gegevens, die op d i t Laboratorium werden verkregen b i j een klassieke synthese (108) en b i j een vaste-fase synthese (3) van d i t peptide. Tenslotte vormde het f e i t dot het synthetische materiaal nauwkeurig biologisch getest kon worden een b e l a n g r i j k e o v e r -weging b i j de k e u z e ,

3 . 2 , S y n t h e s e v o l g e n s d e v a s t e - f a s e m e t h o d e

C o p o l y s t y r e e n - 2 % - 1 . 4 - d i v i n y l b e n z e e n werd gechloormethyleerd en veresterd met B o c g l y c i n e (109). Het g l y c i n e g e h a l t e van het B o c G l y p o l y m e e r werd b e -paald: (a) door aminozuuranalyse na v e r w i j d e r e n van het ionogeen gebonden B o c g l y c i n e door wassen met a z i j n z u u r (3, 34, 35) en (b) door een aantal c h l o r i d e -t i -t r a -t i e s (volgens Volhard) in he-t f i l -t r a a -t van de neu-tralisa-ties-tap na afspli-tsen van de Boe-groep met I N zoutzuur in i j s a z i j n ,

Uitgaande van B o c - G l y - p o l y m e e r werd na acht c y c l i (figuur 3-2) het v o l l e d i g beschermde o x y t o c i n e d e r l v a a t , N b e n z y l o x y c a r b o n y l S b e n z y l c y s t e l n y l O b e n z y Ityrosylisol e u c y l g l u t a m l n y l a s p a r o g l n y l S b e n z y Icy s t e l n y l p r o l y l -- l e u c y l -- g l y c i n e -- p o l y m e e r , verkregen,

Voor de opbouw van de keten werden v o o r n a m e l i j k k r i s t a l l i j n e B o c o m l n o z u u r -- p -- n i t r o f e n y l e s t e r s gebruikt met 1. 2 . 4 -- t r i a z o o l als katalysator (3). Proline werd ingevoerd als N-hydroxysuccinnimidester tezamen met t r i a z o o l . Isoleucine werd gekoppeld met D C C I .

De beschermende groepen werden zodanig gekozen, dat deze na a f l o o p van de synthese in dezelfde bewerking konden worden afgesplitst. De SH-funktles van de beide cysteines werden beschermd met een benzylgroep (110). Deze groep is

Boc-Gly-CH2-C^H4(p)-® 1. I N HCl/HOAc 2. Et^N/DMF , 3. Boc-Leu-ONp, triazool, DMF Boc-Leu-Gly-CH2-C^H^(p)-(p) herhaal stop 1-3

3. met Boc-Pro-ONSu, resp. Boc-Cys(Bzl)-ONp, Boc-AsN-ONp en B o c - G I N - O N p

Boc-GIN-AsN-Cys(Bzl)-Pro-Leu-Gly-CH2-C^H4(p)-® 4. I N HCl/HOAc

5. EtgN/DMF

, 6. Boc-lle-OH, DCCI, CH2CI2 Boc-lle-GIN-AsN-Cys(Bzl)-Pro-Leu-Gly-CH2-C^H4(p)-®

herhaal stap 1-3

, 3. met Boc-Tyr(Bzl)-ONp, resp. Z-Cys(Bzl)-ONp Z-Cys(Bzl)-Tyr(Bzl)-lle-GIN-AsN-Cys(Bzl)-Pro-Leu-Gly-CH2-C^H4(p)-(J) 7. NH3/CH3OH ' ^ N - Z - S , S'-dibenzyl-O-benzyloxytocine 8. N-Me-pIperldlne/CH^OH * - N - Z - S , S'-dibenzyl-O-benzyloxytoeinezuurmethylester 9. HBr/TFA fc- S, S'-dibenzyloxytocinezuur, HBr

Figuur 3-2 Schema van de nonapeptide-synthese

tijdens de synthese volkomen stabiel en kan a l l e e n onder drastische omstandig-heden met natrium in v l o e i b a r e ammoniak (111) of door langdurige behandeling met vloeibaar waterstof f l u o r i d e (50) worden v e r w i j d e r d . Ondanks de n a d e l e n , d i e verbonden z i j n aan een r e a k t i e met natrium in ammoniak, zoals een g e d e e l -t e l i j k e o n -t z w a v e l i n g en een spli-tsing van p e p -t i d e - b i n d i n g e n , word-t deze me-thode b i j de synthetische b e r e i d i n g van o x y t o c i n e algemeen toegepast. De fenolische hydroxylgroep van tyrosine is beschermd als een benzylether (112) en de a - N H . ^ groep van cysteine met een b e n z y l o x y c a r b o n y l (Z) groep (113).

Om te voorkomen dot b i j de afsplitsing van de glutomine-Boc groep met I N zoutzuur in i j s a z i j n de vorming van pyroglutaminezuur optreedt, werd afgesplitst met 100% t r i f l u o r a z i j n z u u r (60), U i t een onderzoek op d i t Laboratorium (114) is gebleken, dot met name i j s a z i j n de vorming van pyroglutamlnezuurderivoten bevordert,

3 . 3 , A f s p l i t s i n g v a n h e t p e p t i d e v a n h e t p o l y m e e r

A f s p l i t s i n g met ammoniak in methanol

De d i r e k t e omzetting van de " 4 - m e t h y l b e n z y l e s t e r " - b i n d i n g tussen peptide en polymeer tot p e p t i d e - a m i d e is onder andere uitgevoerd met v l o e i b a r e ammoniak ( 2 , 3 , 6 3 ) , met een mengsel van v l o e i b a r e ammoniak en dimethylformomide (61) en met een verzadigde oplossing van ammoniak in ethanol ( 5 9 , 6 2 , 6 3 ) , De beste resultaten z i j n echter verkregen met een b i j O C verzadigde oplossing van ammoniak In methanol ( 3 , 4 6 , 5 4 - 5 7 , 6 0 , 115).

Het produkt, dat door m i j werd verkregen na behandeling met ammoniak In methanol, werd onderzocht met behulp van dunnelaagchromotogrofle en bleek zonder verdere z u i v e r i n g i d e n t i e k aan een eerder gesynthetiseerd amide (3).

Belangrijke informatie over de z u i v e r h e i d van het beschermde peptide v e r schaft ook de biologische a k t l v l t e l t van o x y t o c i n e . Daartoe werd het ruwe p r o -dukt gedebenzyleerd met natrium in v l o e i b a r e ammoniak*. O x i d a t i e v e r i n g s l u l t i n g van het o x y t o c e i n e met zuurstof leverde o x y t o c i n e , waarvan de biologische a k t l v l t e l t werd bepaald volgens de " a v i o n vasodepressor"-test (116, 117). De daarbij gemeten waarde van 250 lE/mg beschermd peptide bleek a a n z i e n l i j k hoger dan de in de l i t e r a t u u r opgegeven waarden (ca. 150 lE/mg) b i j analoge syntheses ( 5 5 - 5 7 ) , Een extreem gezuiverd preparaat heeft in deze test een biologische a k t l v l t e l t van 450 l E / m g ,

* Uitgevoerd bij Organon N . V. te Oss

A f s p l i t s i n g met waterstofbromide in t r i f l u o r a z i j n z u u r

O m een verdere v e r g e l i j k i n g m o g e l i j k te maken,werd het peptide afgesplitst van het polymeer met waterstof bromide in t r i f l u o r a z i j n z u u r (109) tot het S, S ' -- d i b e n z y l o x y t o c i n e z u u r hydrobromide. Eenzelfde produkt werd verkregen na behandeling met waterstofbromide in t r i f l u o r a z i j n z u u r van z u i v e r N b e n z y l o x y c a r b o n y I S , S ' d i b e n z y l o x y t o c i n e z u u r (3). D i t laatste peptide werd door K l o s t e r -meyer gesynthetiseerd op klassieke w i j z e v i a fragmentkoppeling (118). De beide hydrobromides vertoonden eenzelfde gedrag b i j dunnelaagchromotogrofle in diverse loopmiddelen.

A f s p l i t s i n g met een t e r t i a i r e base in methanol

In eerste instantie werd het beschermde nonapeptide van het polymeer a f g e splitst met een verzadigde oplossing van ammoniak in e t h a n o l , zoals door M e i e n -hofer werd gebruikt voor de synthese van vasopressine (59). Het produkt, dot d a a r b i j werd geïsoleerd had echter een veel te laag stikstofgehalte, zodat w i j vermoedden, dot naast het verwachte omlde een a a n z i e n l i j k e hoeveelheid N -- b e n z y l o x y c a r b o n y l -- S , S ' -- d i b e n z y l -- O -- b e n z y l -- o x y t o c I n e z u u r e t h y l e s t e r was gevormd. D i t vermoeden werd bevestigd toen b i j behandeling van Z P r o L e u G l y --polymeer met ammoniak in ethanol gedurende vier uur de ethylester naast het amide kon worden aangetoond (69).

W i j trokken daaruit de konklusie (70), dat er in f e i t e sprake is van twee met elkaar konkurrerende reakties: enerzijds een d i r e k t e ammonolyse, aminolyse of hydrazinolyse (figuur 3 3 , route 1) en anderzijds een base gekatalyseerde o m -estering, gevolgd door een ammonolyse, aminolyse of hydrazinolyse (figuur 3 - 3 , route 2). 6 -0 I: l-C-( ..Ó-CH, •^'3 O o o II I: ^ I I II , e ^ R-C-0- P) + CH,OH + HNR,R, = i = ^ R - C - 0 - ( F = ^ ^ R-C-0-v£) = ^ R - C - 0 C H , 1 . + O - ® HNRiR, H-N-R, O-CH3 Ri H - N - R , I® H r o u t e 2 HNR,R, R-C-0-Cft R i - N ^ H O R R - C - N ^ R, Figuur 3-3 R - C - 0 - C H 3 R, 38

O p grond van het veronderstelde reaktiemechonisme zou een t e r t i a i r amine a l l e e n de m o g e l i j k h e i d geven tot een omestering v i a algemene base k a t a -lyse, hetgeen inderdaad het geval b l e e k .

W i j hebben de methode met sukses toegepast in de volgende g e v a l l e n :

1. Bij de analyse met behulp van dunneloogchromatografie en goschromatografie. De vastefase synthese kan worden gekontroleerd door omzetting van p e p t i d e --polymeermonsters met t r i e t h y l a m i n e i n methanol in de peptidemethylester, gevolgd door dunnelaogchromotografie en eventueel goschromatografie. 2. Bij de k w a n t i t a t i e v e aminozuuranalyse.

In de p r a k t i j k b l i j k t , dot b i j zure hydrolyse van monsters peptide aan p o l y meer,aminozuren, zoals G l u en Phe, voor een deel aan het polymeer g e a d -sorbeerd worden. Om d i t te voorkomen, wordt het peptide eerst afgesplitst van het polymeer als methylester en vervolgens gehydrolyseerd.

3. Bij de massaspektrometrie.

V e e l peptidemethylesters z i j n vaak zonder permethyleren nog voldoende v l u c h t i g voor een sekwentie-onalyse met massaspektrometrie. Hierdoor is een extra k o n t r o l e m o g e l i j k h e i d verkregen op het juiste verloop van de synthese.

4. Bij de o m z e t t i n g tot amiden v i a de methylesters.

De d i r e k t e ammonolyse met ammoniak in methanol verloopt langzaam, w a n -neer het af te splitsen peptide via een sterisch gehinderd aminozuur als valine of p r o l i n e aan het polymeer is gebonden. In een lage opbrengst o n t -staan dan mengsels van peptidemethylesters en amiden ( 3 4 , 7 1 ) . O m te komen tot een é é n d u i d i g produkt wordt het peptide eerst afgesplitst als methylester, eventueel b i j verhoogde temperatuur. Vervolgens wordt de ester met ammoniak omgezet in het amide met g l y c e r o l of d i e t h y l e e n g l y c o l ais katalysator (1 19). 5. Bij de peptidesynthese.

Ondanks de snelle v o o r u i t g a n g , die de vaste-fase synthese heeft doorgemaakt, is de methode nog steeds n i e t i d e a a l . Voor de synthese van grote p e p t i d e n , r e s p e k t i e v e l i j k e i w i t t e n , zal men naar m i j n mening moeten uitgaan van g e -schikte fragmenten, in de grootte van 10-15 aminozuren, d i e b i j v o o r b e e l d met behulp van de vaste-fase methode kunnen worden gesynthetiseerd. Deze

brokstukken kunnen door omestering van het polymeer worden afgesplitst. Na een tussentijdse z u i v e r i n g kon het deelpeptide geschikt gemaakt worden voor een koppeling door omzetting van de C t e r m i n a l e methylester in een h y d r o -zide of een corbonzuur.

Zoals mag worden verwacht, worden u:>-benzylesters in osparaginezuur en glutominezuur ook omgeësterd. De t-butylesters z i j n echter s t a b i e l .

De produkten, d i e na de afsplitsing werden verkregen, kunnen op v e r s c h i l lende manieren worden g e z u i v e r d . In de p r a k t i j k v o l d o e t precipiteren u i t d i -methylformomide of i j s a z i j n , G e l c h r o m a t o g r o f l e over Sephodex LH-20 geeft meestal minder v e r l i e z e n en heeft als bijkomend voordeel dot b i j (kontinue) registratie van het e f f l u e n t van de kolom de vorm van het geschreven signaal een a a n w i j z i n g kan geven over de z u i v e r h e i d van het produkt,

3 . 4 . E x p e r i m e n t e e l g e d e e l t e

A l g e m e e n

De smeltpunten werden bepaald met AnschUtzthermometers en z i j n niet gekorrlgeerd. De monsters werden in een glascapillair verwarmd in een koperen blok.

De optische rotaties werden gemeten met een fotoelektrische polarlmeter, Perkin-Elmer model P-141.

De elementanalyses werden uitgevoerd door de heer M . van Leeuwen op d i t Laboratorium. A l l e monsters werden tevoren in vckuum bij + 40 C gedroogd tot konstont gewicht.

De aminozuuranalyses werden uitgevoerd door dr. C . H . Monfoort, S . O . N . , Laboratorium voor physiologische chemie. Rijksuniversiteit Utrecht, en door de analytische afdeling van de N . V. Organon te Oss, beide met een Technicon aminozuuranalysator en door de heer H . A . B i l l i e t , Laboratorium voor analytische chemie. Technische Hogeschool Delft, met een z e l f g e -bouwde aminozuuranalysator. Bij Organon werd norleucine als interne standaard gebruikt. De monsters werden gehydrolyseerd in een mengsel van gekoncentreerd zoutzuur en ijsazijn ( 1 : 1 ) of in 6 N zoutzuur in vakuum b i j 1 10 C, gedurende 20 uur.

Dunnelaagchromatografie werd uitgevoerd op glazen platen met kieselgel OF 254 (Merck). De stoffen werden opgebracht in hoeveelheden van ongeveer 40 mikrogram. De vlekken werden zichtbaar gemaakt op diverse manieren: (a) belichten met u l t r a v i o l e t l i c h t ; (b) bespuiten met 0 . 1 % ninhydrine sproeireagens, gevolgd door enige t i j d verhitten b i j 100 C; (c) met d e R e i n d e l --Hoppe reaktie (121): chloreren met chloorgas en bespuiten met een mengsel van o - t o l i d i n e en kal iumjodide; (d) met de Pauly-reaktie (122): bespuiten met een oplossing van gediozoteerd sulfonilzuur.

Loopmiddelen voor de dunnelaagchromatografie*

1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9.

n-buta nol-azijnzuur-WO ter dioxoan-woter t-omy 1 al kohol-Isopropanol-water n - a m y l a l k o h o l - p y r i d i n e - w a t e r e t h y l a c e t a a t - p y r i d i n e - w a t e r n-amylalkohol-mlerezuur-water n - b u t a n o l - p y r i d i n e - a z i j n z u u r - w a t e r chlorofprm-methanol benzeen-ethanol 4;1:1 3:1 51:21:28 5:3:2 20:10:11 7:2:1 16:3:1:4 4:1 4:1

De verhoudingen z i j n aangegeven in volumedelen

Tabel 3-1 Literatuurpreparaten Verbinding B o c - N ^ B o c - G l y Boc-Leu. j H j O B o c - L e u - O N p Boc-Pro Boc-Pro-ONSu Boc-Cys(Bzl) B o c - C y s ( B z l ) - O N p Boc-AsN Boc-AsN-Onp Boe-GIN Boc-GIN-ONp Boc-lle Boc-Tyr(Bzl) Boc-Tyr(B2l)-ONp Z-Cys(Bzl)-ONp Smeltpunt In OC Kpt,2 32

-94-95 86-90 78-81 83-85 83-84 94-95 134-136 135-136 135-136 134-135 63-65 87-89 95-96 95-96 174-176 179-180 161-162 157-158 116-119 117-118 154-155 153-154 66-68 61-63 108-110 112-114 137-139 138-140 93-94 92-93 [-1D

--24.7 -44 -48 -61.4 -55.3 -54.0 -45.8 -37.5 -38.0 - 6.8 -44 -38 -16 -16.8 -35 -35.0 + 2.6 + 3.8 - 2.0 - 2.6 -43 -41.9 W578 -30.0 -31.0 -68.5 -64.5 -45.3 -48.5 - 8.5 - 8.0 + 2.5 + 5.5 + 4.0 Opbrengst in % 92 95 90 77 97 86 86 65 96 91 74 74 98 82 81 80 72 69

-40

-56 63 59 96 85 98 76 75 70 90 85 Auteur Corpino (1 24) Schnabel (123) Schnabel (123) Vogler e . m . (125) Schnabel (123) Anderson e. m. (38) Schnabel (123) Beyerman e. m. (3) Schnabel (123) Beyerman e. m. (3) Beyerman e. m. (3) Beyerman e. m. (3) Schnabel (123) Schnabel (123) Beyerman e. m. (3) Bodanszky e . m . (126)

De optische rotaties werden gemeten bij 20-25 C In dezelfde oplosmiddelen en b i j nagenoeg dezelfde koncentrotles als in de literatuur aangegeven.

U i t g a n g s m a t e r i a l e n e n h u l p s t o f f e n

De aminozuren werden voornamelijk betrokken von de firma's Fluko A . G . en Ajinomoto Co. en na kontrole op fysische konstonten zonder zuivering gebruikt. p - N I t r o f e n o l werd gezuiverd door tweemaal omkristalliseren uit verdund zoutzuur. Oplosmiddelen werden gebruikt In een pro analyse k w a l i t e i t of voor gebruik gedestilleerd. Methyleenchloride en dioxaan werden g e z u i verd door f i l t r a t i e over een kolom van basisch aluminiumoxide. Gekristalliseerd N , N ' d i c y c l o -hexylcarbodiimide von de firma Fluka A . G . werd zonder verdere zuivering gebruikt.

Boe-aminozuren werden bereid volgens Schnabel (123) met een pH-stot (Methrom Dosimot). Andere derivaten werden gesynthetiseerd volgens literatuurvoorschriften. A l l e verbindingen werden onderzocht op zuiverheid door het meten van het smeltpunt en de draaiing en door k o n trole met behulp van dunnelaagchromatografie in meerdere loopmiddelen. Een lijst van de l i t e -ratuurpreparaten is gegeven in tabel 3 - 1 .

S y n t h e s e v a n h e t n o n a p e p t i d e a a n h e t p o l y m e e r Chloormethyleren van de drager

Copolystyreen-2% divinylbenzeen (200-400 mesh, Dow Chemical Company, lotnr. 6431-48) werd grondig gewassen, achtereenvolgens met I N N a O H , water, I N H C I , water, d i m e t h y l f o r -momide en methanol. Het copolymeer werd bij 100 C en 2 mm Hg gedroogd tot konstont g e w i c h t .

Het polymeer werd gechloormethyleerd met chloormethylether en tintetrachloride als k a t a l y -sator (10 ml S n C I . op 100 g polymeer) (109). Chloorgehalte van het chloormethylpolymeer: 6 . 2 1 % of 1.75 meq C l / g polymeer. Stap 1 2,3,4 5,6,7 8,9,10 11 12,13,14 15 16,17,18 19,20,21 22, 23, 24 Reagensc. q. wasvloeistof 25 ml I N HCl/HOAc 30 ml HOAc 30 ml EtOH 30 ml DMF 30 ml 10% EtgN/DMF 30 ml DMF tijdsduu 30 3 3 3 15 3 10 ml DMF, Boc-aminozuur-ester, triazool 30 ml DMF 30 ml EtOH 30 ml HOAc 3 3 3

Bij de koppeling van Boc-lle werd DMF in stap 12-14 en 16-18 vervangen door C H ^ C L , verder werd b i j stap 15 eerst 10 min geroerd met B o c - l l e in 10 ml C H . j C I , waarna een oplossing van DCCI in 3 ml C H ^ C L werd t o e -gevoegd.

Figuur 3 - 4 Reaktiecyclus voor de verlenging van het peptide met één aminozuur

N - t - b u t y l o x y c a r b o n y l - g l y c i n e - p o l y m e e r , Boc-Gly-CE)

Gechloormethyleerd polymeer (50 g, 87.5 meq Cl) werd gesuspendeerd in 150 ml absolute ethanol en gedurende 48 uur onder refluxen geroerd met 15.3 g (87.5 meq) Boc-Gly en 7 . 9 5 g (79 meq) triethylamine. Het veresterde polymeer werd afgefiltreerd, gewassen met steeds drie porties ethylocetoot, ethanol, water en methanol en in vakuum gedroogd.

Een afgewogen hoeveelheid veresterd polymeer werd 30 min geschud met I N HCI in ijsazijn om ionisch gebonden B o c - G l y te verwijderen. Het polymeer werd a f g e f i l t r e e r d en gewassen met i j s a z i j n . In het f i l t r a a t kon d u i d e l i j k glycine worden aangetoond. Het glycine-polymeer werd met een mengsel van 6 N HCI en ijsazijn (1 : 1) in een geëvokueerde g l a z e n buis, gedurende 48 uur b i j 110 C verhit. In het hydrolysaot werd het gehalte veresterd g l y c i n e bepaald met behulp van een aminozuuranalysator.

Gevonden: 0.66 mmol G l y / g B o c - G l y - p o l y m e e r .

Het gehalte aan veresterd g l y c i n e werd daarnaast vele molen bepaald door titratie van de c h l o -r i d e - i o n e n in het f i l t -r a a t na neut-ralisatie met t-riethylamine (figuu-r 3 - 2 , stap 2 -resp. 5 ) . Deze bepaling is reproduceerbaar binnen 1 % en leverde een gehalte van gemiddeld 0.63 mmol G l y / g B o c - G l y - p o l y m e e r .

Z - C y s ( B z l ) - T y r ( B z l ) - l l e - G I N - A s N - C y 5 ( B z l ) - P r o - L e u - G l y - © N - b e n z y l o x y c a r b o n y l - S , S ' - d i b e n z y l - O - b e n z y l o x y toe ine-poly meer

De synthese werd door de machine uitgevoerd volgens de schemo's in figuur 3-2 en figuur 3 - 4 met de hieronder aangegeven r e a k t i e t i j d e n .

Uitgangsstof: 2.00 g B o c - G l y - ® 0.63 mM B o c - G l y - O H / g B o c - G l y - ® 8. 7. 6. 5. 4 . 3. 2. 1. B o c - L e u - O N p triazool Boc-Pro-ONSu triazool B o c - C y s ( B z l ) - O N p triazool , B o c - A s N - O N p triazool B o c - G I N - O N p triazool B o c - l l e triazool B o c - T y r ( B z l ) - O N p triazool Z - C y s ( B z l ) - O N p triazool 4eq. 5 4 5 4 5 5 5 4 4 5 5 4 5 4 5 16 hr. 9 15 64 20 21 55 20 Gewichtsvermeerdering: 1211 mg ^l°/o) 44

Z - C y s ( B z l ) - T y r ( B z l ) - l l e - G I N - A s N - C y s ( B z l ) - P r o - L e u - G l y - N H 2 N - b e n z y l o x y c a r b o n y l - S , S ' - d i b e n z y l - O - b e n z y l o x y t o c i n e a. Afsplitsing met ammoniak in ethanol

Het peptide-polymeer (1476 mg) werd gedurende 17 uur geroerd b i j kamertemperatuur in 50 ml 9 N ammoniak in ethanol. Het polymeer werd a f g e f i l t r e e r d en gewassen met ethanol. De olie (84 mg), die werd verkregen na indompen van het f i l t r a a t , werd tweemaal opgelost in DMF en neergeslagen met ether (7 mg, smpt. 243-245 C). Het polymeer werd tweemaal gedurende een uur geëxtraheerd met DMF. No indampen in vakuum werd hieruit verkregen resp. 357 mg w i t t e stof en 4 mg o l i e .

Totale opbrengst 364 mg (45%); smeltpunt 2 3 8 - 2 4 0 ° , [a]'^ - 43 (C = 1 in DMF). Gevonden : C 60. 3 ; H 6. 6 ; N 10. 9 ; S 4. 8 Berekend voor C 7 2 H 9 2 N , 2 0 1 4 ^ 2 ^ 4 1 3 . 6 ) : C 6 1 . 1 7 ; H 6 . 5 6 ; N 11.89; S 4 . 5 4 (1)

" C - , ^ H 9 j N , , 0 ^ g S 2 (1442.6) : C 6 1 . 6 ; H 6 . 6 4 ; N 10.7 ; S 4 . 4 5 (2). (1): omide

(2): ethylester

Het ongezuiverde produkt werd op dunneloag vergeleken met omide (sub b), met de e t h y l -ester, verkregen na behandeling van het peptide-polymeer met triethylamine in ethanol, en met een omide afkomstig van Organon, waarin tyrosine onbeschermd bleef. Hierbij bleek, dat de stof bestond uit een mengsel von omide en ethylester, t e r w i j l geen N b e n z y l o x y c a r b o n y l S , S ' --dibenzyloxytocine kon worden aangetoond. Het afgefiltreerde polymeer werd nog eens gedurende 17 uur behangedurendeld met 9 N ammoniak in methanol (zie ook b), waarbij 169 mg stof werd v e r k r e -gen met smeltpunt 2 4 2 - 2 4 3 ° , [a] p° - 45 (C = 1 in DMF).

b. Afsplitsing met ammoniak in methanol

Het nonopeptide-polymeer ( 464 mg) werd gesuspendeerd in 40 ml methanol. De suspensie werd bij O C verzadigd met ammoniak, gedestilleerd over natrium, en vier uur geroerd bij k a -mertemperatuur. Het polymeer werd afgefiltreerd en gewassen met methanol. De verzamel<Je filtraten werden in vakuum ingedampt. De verkregen o l i e (54 mg) werd tweemaal neergeslagen uit DMF met ether (12 mg, smelttrajekt 225-230 C ) . Het polymeer werd tweemaal, gedurende een uur, geroerd met 25 ml DMF. Uit de f i l t r a t e n werd na indampen in vakuum respektievelijk

153 mg en 7 mg w i t amorfe stof verkregen. De voste stof (172 mg) werd opgelost in DMF en v r i j w e l k w o n t i t a t i e f weer neergeslagen met ethylacetaot.

Opbrengst 162 mg (63%); smeltpunt 2 3 6 - 2 3 7 ° (onder ontleding), [a]'f^ - 46 (C = 1. 9 in DMF), R f ^ = 0 . 5 1 .

Gevonden : C 60. 6 ; H 6. 7 ; N 11. 6 Berekend voor C 7 2 H 9 2 N , 2 0 , ^ 5 2 ( 1 4 1 3 . 6 ) : C 6 1 . 17; H 6 . 5 6 ; N 11.89.

Lit. (3) smpt. 2 3 7 - 2 4 2 ° opbrengst 7 0 % ; l i t . (57) smpt. 2 4 6 - 2 4 8 ° , [a.]'^ - 50. 5 (C = 1 in DMF), opbrengst 59%; l i t . (56) smpt. 2 3 4 - 2 3 8 ° , [a] - 45 (C = 2 in DMF),