Wyklad 4-6 – wstęp Ewa Bartnik ebartnik@igib.uw.edu.pl Instytut Genetyki i Biotechnologii UW i IBB PAN

(1)

Wykład jest współfinansowany przez Unię Europejską w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego

Wyklad 4-6 – wstęp

Ewa Bartnik ebartnik@igib.uw.edu.pl Instytut Genetyki i Biotechnologii UW i IBB PAN

(2)

Test Genetyczny?

Analiza ludzkiego DNA, RNA, chromosomów, białek lub metabolitów w celu wykrycia zaburzeń

związanych z chorobą dziedziczną Chodzi o to by ją wcześnie wykryć

(3)

1. Testy biochemiczne – oznaczenie enzymów lub metabolitów 2. Testy cytogenetyczne – nie tylko liczba chromosomów, także

drobne zmiany

3. Testy DNA/RNA – czy są obecne mutacje To obejmuje:

10/30/071,464 testów genetycznych (www.genetests.org) Obecnie 2039 plus 265

(4)

Badania cytogenetyczna

Coraz mniejsze rzeczy można wykrywać

•Delecje

•Inwersje

•Translokacje

Zmiana liczby chromosomów

•Zespół Downa

(5)

1. Predykcyjne 2. Diagnostyczne 3. Nosicielstwo 4. Prenatalne

5. Preimplantacyjne

6. Skrining noworodków

Typy testów

(6)

Testy Genetyczne

?

Diagnostyczne

Przedobjawowe

Prenatalne

= choroba Huntingtona

(7)

•Czasem tylko wiedza, jeśli choroby nie można leczyć; czasem

dopasowane leczenie, choć czasem dość archaiczne (hemochromatoza)

•Wykrycie mutacji u osoby może mieć konsekwencje dla całej rodziny

Diagnostyczne

Służy potwierdzeniu diagnozy u osoby z objawami choroby

(8)

Choroby dla których istnieje terapia/nie

istnieje terapia:

diagnoza zawsze ma sens u chorego

• Choroba Huntingtona

• Rak piersi

(9)

Parę problemów:

• nieletni – HD, rak piersi, rak tarczycy

• może wpływać na wiele rzeczy

• może być bardzo trudne do zniesienia (psycholog itp.)

Testy predykcyjne

Osoby bez objawów, ale obciążający wywiad rodzinny

Dwa typy

Przedobjawowe – rozwój choroby jest pewny jeśli jest obecna mutacja (HD)

Predyspozycji – rozwój choroby jest możliwy (różne prawdopodobieństwa) (rak piersi, TP53, HNPCC)

(10)

Prenatalne

Kobiety powyżej pewnego wieku (na ogół 35 lat); osoby z rodzin z obciążonym wywiadem; czasem po badaniu przesiewowym (genetyczne USG, testy potrójne

itp.)

Płyn owodniowy lub kosmki

(11)

Trudne i drogie; w Polsce podobno jeden ośrodek

Preimplantacyjne

• 1-2 blastomery, podobne wskazania

(12)

Od kilku do kilkudziesięciu chorób

Badania przesiewowe noworodków

Wczesne wykrywanie potencjalnych problemów

•Kropla krwi z pięty niemowlaka

•Rodzice informowani tylko przy wyniku dodatnim

•Dodatni wynik nie przesądza, że dziecko chore; wymagane dalsze testy

(13)

Podatność genetyczna

• Pewne badania dają tylko

ryzyko względne – jeśli się dowiesz że masz 2 x większe

ryzyko cukrzycy to co zrobisz?

• Zmiana diety?

• Ćwiczenia/ruch?

• Nic?

(14)

Czułość i specyficzność

• Czułość (sensitivity) – jaka część

chorych wychodzi jako chorzy w teście

• Specyficzność– jaka część zdrowych wychodzi jako zdrowi w teście

• Jeśli jedno i drugie 99% powinno być

bosko. Ale jak jest naprawdę – zależy

od CZĘSTOŚCI CHOROBY

(15)

Naprawdę ważne są wartości predykcyjne

• Pozytywna wartość predykcyjna –

prawdopodobieństwo, że ktoś jest chory jeśli test jest dodatni

• Negatywna wartość predykcyjna -

prawdopodobieństwo, że ktoś jest

zdrowy jeśli test jest ujemny

(16)

TEST na AIDS – US częstość 1%, czułość i spec. Po 99%; badamy

10000

Wynik + Wynik - Liczba osób Naprawdę

chory 99 1 100

Naprawdę

zdrowy 99 9801 9900

Razem 198 pred

99/198 9802 10000

(17)

TEST na costam – US częstość 11%, czułość i spec. Po 99%;

badamy 10000

Wynik + Wynik - Liczba osób Naprawdę

chory 1100 11 1111

Naprawdę

zdrowy 89 8800 8889

Razem 1189 Pred

1100/1189

9802 10000

(18)

(19)

THE CLASSIC 2x2 TABLE THE CLASSIC 2x2 TABLE

TEST +

TEST -

(20)

TEST +

TEST -

Sensitivity

(21)

TEST +

TEST -

Specificity

(22)

TEST +

TEST -

Positive Predictive Value

(23)

TEST +

TEST -

Negative Predictive Value

(24)

TEST +

TEST -

Putting it all together

Positive Predictive Positive Predictive Value

Value Sen

sitiv ity

Sen

sitiv

ity ficitySpeciSpecificity

Negative Predictive Value Negative Predictive Value

(25)

DNA Sequencing Cost vs Throughput Timeline

Modified from UBS 2007

1974-1977 1986 1999 2002

ABI-SOLiD ABI-SOLiD FLX - 454

1G - Illumina

Heliscope

Comp. Genom

PacBio Sanger (dideoxy)

Maxim-Gilbert(chemical)

2005-2008 2010

Automated Fluorescent sequencer (dideoxy)

Sequencing by Ligation (SBL) Sequencing by Synthesis (SBS) Pyrosequencing (SBS)

•$10M genome x-prize

•100 human genomes in <=10 days

•99.99999% accurate with 98% coverage

•$10K/genome

25

(26)

Przykład bardzo dobry

• Fenyloketonuria

• Niemowlęta na całym świecie

• Wczesne wykrycie i dieta chronią przed

niepełnosprawnością umysłową

(27)



Dziedziczne neuropatie ruchowo czuciowe



Deformacja stóp



Zanik mięśni strzałkowych



„Chód brodzący”



Osłabienie odruchów

skokowych

(28)

(29)

cd

• Whole-genome sequencing for optimized patient management.

• Bainbridge MN, Wiszniewski W, Murdock DR, Friedman J, Gonzaga-

Jauregui C, Newsham I, Reid JG, Fink JK, Morgan MB, Gingras MC, Muzny DM, Hoang LD, Yousaf S, Lupski JR, Gibbs RA. Sci Transl Med. 2011 Jun 15;3(87):8

• 14 letnie blizniaki – DRD – L-dopa ale druga mutacja i terapia 5-hydroksytryptofanem – poprawa b duża

(30)

Biobanki

• Zbiory DNA itd. itp. i danych

• Trzy problemy –

• Świadoma zgoda

• Poufność danych

• Nieoczekiwane wyniki

(31)

Biobanki

• Wyniki

niezaplanowane/nieoczekiwane/wtórne

• Incidental findings/secondary findings

(32)

Biobanki

• Świadoma zgoda – ale co jeśli badania

trwają 20 lat? Albo pojutrze ktoś wymyśli

nowy test?

(33)

Biobanki

• Poufność danych

• 23andMe

• Sprzedaż firmom

• Nastolatek znalazł ojca który wcale tego nie planował bo był anonimowym dawcą

spermy

(34)

Zbieranie próbek i danych

• Kto ma dostęp?

• Gymrek et al. – 10% zidentyfikowano

• Niszczyć, trzymać, zabezpieczać?

(35)

Problemy etyczne i prawne

• Świadoma zgoda przy biobankach

• Prywatność

– Stopień anonymizacji

– Ograniczanie nieuprawnionego ujawniania – Obawa że podstawa do dyskryminacji

• Problemy dla grup /rodzin

– Informacja związana z rasą

(36)

Przykład dość kiepski

• Havasupai z Arizony

• Próbki zebrane do badań nad cukrzycą użyto do badania chorób psychicznych i

„inbreeding”

• Pochodzenie

• $700000

(37)

Incidental findings

• Jedno rozwiązanie dla wyników

nieoczekiwanych – tiered consent czyli różne poziomy zgody

• Tylko to czego dotyczy badanie

• Wszystko co może mieć znaczenie dla zdrowia

• Także podejrzane ale niedoprecyzowane

• Wszystko?

(38)

Incidental findings

• Czy biobanki muszą informować o tych

wynikach?

(39)

57 genów

• American College of Medical Genetics and Genomics

• 57 – Alzheimer, BRCA1, inne nowotwory, nawet nieletnim

• Lepsze pomysły – parę opcji przy teście

(40)

Testy DTC – direct to Testy DTC – direct to

consumer consumer



Większość genów daje niewielkie ryzyko

◦Bada się kilka – a wpływ może mieć wiele

(41)

Direct to Consumer Direct to Consumer

Marketing Marketing



Testy na prawdziwe choroby



Nutraceutyki; kremy

(42)

Direct to Consumer Direct to Consumer

Marketing Marketing



Genealogia

(43)

Problemy z DTC Problemy z DTC

 Genetyka jest trudna

 Dla ogromnej większości chorób nie znamy genów – a dokładniej nie wszystkie (cukrzyca)

 Nie należy badać nieletnich

chyba że to coś wnosi (nie badać nieuleczalnych chorób/chorób

które ujawnią się dużo później u dorosłych)

 Geny otyłości i dieta

(44)

Organizmy GMO nadal mają Organizmy GMO nadal mają

dziesiątki tysięcy swoich dziesiątki tysięcy swoich

genów genów

 Różnica polega na tym, że jeden gen (lub Różnica polega na tym, że jeden gen (lub kilka genów) został im dodany przez

kilka genów) został im dodany przez naukowców

naukowców

 Np. transgeniczna kukurydza Bt zawiera Np. transgeniczna kukurydza Bt zawiera białko trujące dla larw owadów

białko trujące dla larw owadów

(45)

A co nie jest inżynierią A co nie jest inżynierią

genetyczną?

 Inżynieria embrionalna (np. klonowanie) Inżynieria embrionalna (np. klonowanie)

 Tworzenie nowych form organizmów przez Tworzenie nowych form organizmów przez selekcję

selekcję

(46)

Podstawowe techniki Podstawowe techniki

inżynierii genetycznej:

 Izolacja DNA ze źródeł naturalnych Izolacja DNA ze źródeł naturalnych

 komórki i tkankikomórki i tkanki

 mikroorganizmy hodowane w laboratorium i mikroorganizmy hodowane w laboratorium i występujące naturalnie

występujące naturalnie

 antyczny DNAantyczny DNA

 cDNA – izolacja RNA i przepisanie na cDNA – izolacja RNA i przepisanie na DNA DNA

 Chemiczna synteza DNA Chemiczna synteza DNA de novo de novo

(47)

Wektory do klonowania DNA Wektory do klonowania DNA

 Umożliwiają utrzymanie DNA Umożliwiają utrzymanie DNA

wprowadzonego do komórek i ekspresję wprowadzonego do komórek i ekspresję genu genu

 wektory autonomiczne – zdolne do wektory autonomiczne – zdolne do

samodzielnej replikacji (np. plazmidy, wirusy) samodzielnej replikacji (np. plazmidy, wirusy)

 wektory integracyjne: „wklejająwektory integracyjne: „wklejają”” DNA do DNA do chromosomu gospodarza

chromosomu gospodarza

(48)

INŻYNIERIA GENETYCZNA INŻYNIERIA GENETYCZNA

KLONOWANIE – POCZĄTEK LAT 70TYCH – enzymy restrykcyjne, ligaza i wektory i transformacja

• PLAZMID PLUS DNA z XENOPUS czy SSAKÓW

•1973 – Akademia Nauk USA poproszona o zbadanie niebezpieczeństw nowej technologii

•1974 „Moratorium Letter” w czasopiśmie Science podpisali późniejsi Nobliści Paul Berg i James Watson i wielu innych „by dobrowolnie wstrzymać badania z rekombinowanych DNA do momentu, kiedy potencjalne zagrożenia przez takich cząsteczek zostaną lepiej ustalone lub do czasu

opracowania odpowiednich metod zapobiegających ich rozprzestrzenieniu”

(49)

Pierwszy sukces GMO Pierwszy sukces GMO

 Ludzka insulina z bakterii: Ludzka insulina z bakterii:

gen człowieka produkuje insulinę w gen człowieka produkuje insulinę w Escherichia coli

Escherichia coli

Zalety: taniej, bez zagrożeń wirusami Zalety: taniej, bez zagrożeń wirusami

zwierzęcymi, trzustki już niepotrzebne

(50)

GMO dla medycyny GMO dla medycyny

 Testy diagnostyczne: np. AIDS, HBV Testy diagnostyczne: np. AIDS, HBV

 leki: AIDS, nowotwory leki: AIDS, nowotwory

 Szczepionki Szczepionki

 Zwierzęce modele ludzkich chorób Zwierzęce modele ludzkich chorób

 Komórkowe modele ludzkich chorób: od Komórkowe modele ludzkich chorób: od pacjenta przez IPS

pacjenta przez IPS

(51)

GMO a odbiór społeczny GMO a odbiór społeczny

 Akceptacja GMO dla medycyny Akceptacja GMO dla medycyny

 Lęki przed GMO w rolnictwie Lęki przed GMO w rolnictwie

(52)

„ „ Naturalne Naturalne ” ” rośliny – współczesny rośliny – współczesny pomidor ma geny od:

pomidor ma geny od:

L. esculentum cerasiforme (oporność na grzyby, temperaturę, L. esculentum cerasiforme (oporność na grzyby, temperaturę,

wilgotność) wilgotność)

 L. peruvianum – dużo wit. C, oporność na wiele szkodnikówL. peruvianum – dużo wit. C, oporność na wiele szkodników

 L. pimpinellifolium – lepsza barwa, mniej kwaśny, więcej L. pimpinellifolium – lepsza barwa, mniej kwaśny, więcej witamin i soli mineralnych

witamin i soli mineralnych

 L. cheesmani –oporność na zasolenie, możliwość zbiorów L. cheesmani –oporność na zasolenie, możliwość zbiorów mechanicznych

mechanicznych

 L. cheesmani –oporność na suszęL. cheesmani –oporność na suszę

 L. pennellii –oporność na suszęL. pennellii –oporność na suszę

 L. parviflorum – lepsza barwa, bardziej słodkiL. parviflorum – lepsza barwa, bardziej słodki

 L. hirsutum – oporność na chorobyL. hirsutum – oporność na choroby

(53)

Metody „tradycyjne” a GMO

Krzyżowanie i odkrzyżowanie (6- 8 pokoleń) x

x x

Mutageneza przez naświetlanie

(54)

Cechy GMO Cechy GMO

 Oporność na: herbicydy Oporność na: herbicydy

 Owady (Bt ) Owady (Bt )

 Wirusy itp. Wirusy itp.

 Zmiany wartości odżywczej (Złoty ryż = Zmiany wartości odżywczej (Złoty ryż = prowitamina A)

prowitamina A)

 Cechy użytkowe inne (kolor, smak, Cechy użytkowe inne (kolor, smak, trwałość)

trwałość)

 Produkcja leków Produkcja leków

(55)

Co jest na polu i na Co jest na polu i na

rynku rynku

 Głównie: bawełna, kukurydza, soja, Głównie: bawełna, kukurydza, soja, rzepak, papaja, buraki cukrowe

rzepak, papaja, buraki cukrowe

 Najwięcej w 14 krajach – USA, Meksyk, Najwięcej w 14 krajach – USA, Meksyk, Kanada, Hiszpania, Rumunia, Chiny,

Kanada, Hiszpania, Rumunia, Chiny, Indie, Filipiny, Australia, RPA, Brazylia, Indie, Filipiny, Australia, RPA, Brazylia,

Paragwaj i Argentyna Paragwaj i Argentyna

 Mniej – Honduras, Kolumbia, Francja, Mniej – Honduras, Kolumbia, Francja, RFN, Czechy i Słowacja

RFN, Czechy i Słowacja

(56)

Co jest na polu i na Co jest na polu i na

rynku rynku

 Ryż (Iran), rzepak (Kanada, USA) Ryż (Iran), rzepak (Kanada, USA)

 USA: kabaczek, papaja i lucerna USA: kabaczek, papaja i lucerna

 Papaja – USA głównie GMO – oporność Papaja – USA głównie GMO – oporność na wirus zwany PRSV, który

na wirus zwany PRSV, który

zdewastował plantacje na Hawajach zdewastował plantacje na Hawajach

 goździk Moonshadow goździk Moonshadow

(57)

Dalsze cele ulepszania:

 plonyplony

 Kontrola dojrzewaniaKontrola dojrzewania

 Oporność na chorobyOporność na choroby

 Oporność na szkodniki (owady)Oporność na szkodniki (owady)

 Oporność na herbicydy (kontrola populacji Oporność na herbicydy (kontrola populacji chwastów)

chwastów)

 Pokrój (budowa) roślinPokrój (budowa) roślin

 Oporność na suszę, mróz, zasolenie glebyOporność na suszę, mróz, zasolenie gleby

 Produkcja farmaceutyków itp..Produkcja farmaceutyków itp..

(58)

Ziemniaki Amflora Ziemniaki Amflora

 Zmiana proporcji amylozy Zmiana proporcji amylozy i amylopektyny

i amylopektyny

 Cel: wykorzystanie w Cel: wykorzystanie w przemyśle do produkcji przemyśle do produkcji klejów

klejów

 2014: ziemniaki oporne 2014: ziemniaki oporne na zarazę ziemniaczaną na zarazę ziemniaczaną (przeniesiony gen

(przeniesiony gen pochodzi z odmiany pochodzi z odmiany ziemniaków naturalnie ziemniaków naturalnie odpornych)

odpornych)

(59)

Dlaczego się boimy – a Dlaczego się boimy – a

może raczej czego?

 Zagrożenia dla ludzi Zagrożenia dla ludzi

 Zagrożenia dla środowiska Zagrożenia dla środowiska

 Ale tak naprawdę jaki procent Ale tak naprawdę jaki procent

społeczeństwa wie co to jest GMO? Bo społeczeństwa wie co to jest GMO? Bo

DNA jest we wszystkim co jemy DNA jest we wszystkim co jemy

 Oznakowanie: powyżej 0.9% i bardzo Oznakowanie: powyżej 0.9% i bardzo ostre przepisy

ostre przepisy

(60)

Ustawy – wynik ramowego Ustawy – wynik ramowego

stanowiska rządu z marca stanowiska rządu z marca

2006 r.

 Ustawa z 22 06 Ustawa z 22 06 2006 (wchodzi 2006 (wchodzi

sierpień 2008) – sierpień 2008) –

zakaz importu pasz zakaz importu pasz

GMO;

 śruta sojowa – śruta sojowa –

Polska importuje 1.8 Polska importuje 1.8

mln pasz rocznie;

większość GMO większość GMO

 O nasiennictwie z 27. O nasiennictwie z 27.

04. 2006 04. 2006

 Zakaz wpisu GMO Zakaz wpisu GMO na listę odmian

na listę odmian

 zakaz obrotu zakaz obrotu

materiałem siewnym materiałem siewnym

 Utrudnienia dla naukiUtrudnienia dla nauki

(61)

Śruta GMO zła, a kurczak Śruta GMO zła, a kurczak

karmiony nią dobry?

 Efekt zakazu importu pasz GMO: Efekt zakazu importu pasz GMO:

 Nie ma zakazu importu zwierząt Nie ma zakazu importu zwierząt

karmionych takimi paszami; bo nie są karmionych takimi paszami; bo nie są

GMO; będą tańsze niż zwierzęta GMO; będą tańsze niż zwierzęta

karmione w Polsce drogimi paszami non- karmione w Polsce drogimi paszami non- GMO GMO

 Efekt: zdrożeje polskie mięso, i będziemy Efekt: zdrożeje polskie mięso, i będziemy

kupować importowane, karmione GMO

(62)

Argumenty przeciwników Argumenty przeciwników GMO GMO

 „ „ nie możemy przewidzieć wszystkich nie możemy przewidzieć wszystkich skutków

skutków ” ”

 Protokół z Cartageny: zasada Protokół z Cartageny: zasada

przezorności czyli precautionary principl przezorności czyli precautionary principl e e ” ”

 Ataki na „zmowę koncernów Ataki na „zmowę koncernów ” ” (min. (min.

Sawicki z PO) Sawicki z PO)

 Fałszywki ( wirus HIV, itp.) Fałszywki ( wirus HIV, itp.)

(63)

Co to jest prawda?

 Brak rozróżnienia pomiędzy danymi Brak rozróżnienia pomiędzy danymi naukowymi a plotkami z internetu

naukowymi a plotkami z internetu

 Specyfika mediów Specyfika mediów

(64)

Genetycznie modyfikowane Genetycznie modyfikowane

zwierzęta zwierzęta

 Szybko rosnące świnie Szybko rosnące świnie

 Szybko rosnące łososie Szybko rosnące łososie

 Świnie genetycznie manipulowane w ten Świnie genetycznie manipulowane w ten sposób, by mogły być dawcami organów sposób, by mogły być dawcami organów

dla człowieka

(65)

Effect of Gene Therapy on Visual Effect of Gene Therapy on Visual

Function in Leber

Function in Leber’’s Congenital s Congenital Amaurosis

Amaurosis

terapia genowa nie prowadząca do terapia genowa nie prowadząca do

dziedziczenia wprowadzanego genu dziedziczenia wprowadzanego genu

 The New England Journal of Medicine, 358, 2008.The New England Journal of Medicine, 358, 2008.

 J.W.Bainbridge i 24 współautorów z Institute of Ophtalmology, J.W.Bainbridge i 24 współautorów z Institute of Ophtalmology, University College, London

University College, London

 Stosując wektor adenowirusowy wprowadzili do Stosując wektor adenowirusowy wprowadzili do siatkówki prawidłowy gen

siatkówki prawidłowy gen RPE65.RPE65.

 Trzech pacjentów (wiek 17 – 23 lata) odzyskało Trzech pacjentów (wiek 17 – 23 lata) odzyskało

wzrok w operowanym oku (drugiego nie operowano).

 Po 12 miesiącach od zabiegu nie stwierdzono Po 12 miesiącach od zabiegu nie stwierdzono objawów ubocznych.

objawów ubocznych.

(66)

Problemy GMO Problemy GMO

 Glifosat jest produkowany przez firmę Monsanto, w ten sposób utrzymuje Glifosat jest produkowany przez firmę Monsanto, w ten sposób utrzymuje się monopol na ochronę roślin GMO

się monopol na ochronę roślin GMO

 Gen oporności na glifosat (z bakterii) mogą przenosić się na chwasty i na Gen oporności na glifosat (z bakterii) mogą przenosić się na chwasty i na non-GMO

non-GMO

 Gen toksyny Bt-resistance (z bakterii Bacillus thuringensis) : jak wyżejGen toksyny Bt-resistance (z bakterii Bacillus thuringensis) : jak wyżej

 Problem z utrzymaniem czystości upraw non-GMOProblem z utrzymaniem czystości upraw non-GMO

 Owady potrafią się uodpornić na toksynę BtOwady potrafią się uodpornić na toksynę Bt

 Duże uprawy GMO zmieniają nieco skład szkodników (roślin i owadów)Duże uprawy GMO zmieniają nieco skład szkodników (roślin i owadów)