Instrukcja do ćwiczeń laboratoryjnych

(1)

Pracownia studencka

Katedry Analizy Środowiska

Instrukcja do ćwiczeń laboratoryjnych

„Wykorzystanie technik

chromatograficznych w kontroli

analitycznej jakości wybranych napojów energetyzujących”

Zaawansowana Chemia

Gdańsk, 2021 UNIWERSYTET GDAŃSKI

WYDZIAŁ CHEMII

Ćwiczenie

(2)

1. CEL ĆWICZENIA:

1.1. Oznaczenie zawartości kofeiny (jako produktu głównego) w wybranych napojach energetyzujących z wykorzystaniem techniki HPLC-‐UV

1.2. Analiza jakościowa i ilościowa bisfenolu A (BPA, niebezpiecznego zanieczyszczenia) w wybranym napoju energetyzującym z wykorzystaniem techniki GC-‐FID

W ramach tego ćwiczenia Studenci zapoznają się:

• z budową, zasadą działania i zastosowaniem chromatografu gazowego oraz chromatografu cieczowego;

• różnymi metodami analizy ilościowej stosowanych w technikach chromatograficznych;

• z wybranymi technikami przygotowania próbek do analizy końcowej;

• z reakcją sililowania oraz wstęp do wykorzystania bibliotek widm mas.

2. CZĘŚĆ TEORETYCZNA

Studenci zobowiązani są do zapoznania się z budową i zasadą działania chromatografu cieczowego i gazowego w skrypcie elektronicznym pt. Techniki Separacyjne dostępnym pod

adresem: https://chemia.ug.edu.pl/sites/default/files/_nodes/strona-‐

chemia/33539/files/techniki_separacyjne.pdf

2.1. Kofeina w produktach spożywczych

Struktura chemiczna kofeiny

Kofeina (znana również pod nazwą 1,3,7-‐trimetyloksantyna) jest związkiem chemicznym o masie molowej 194,19 g/mol. W stanie czystym tworzy białe, długie, giętkie kryształy o temperaturze topnienia 237 °C i o gęstości 1,2 g/cm³. Rozpuszcza się w gorącej wodzie, chloroformie i benzenie. Jest gorzka w smaku.

Źródło: https://zdrowie.gazeta.pl/Zdrowie/7,101460,19212711,kofeina-‐

stawia-‐na-‐nogi-‐ale-‐moze-‐zaszkodzic-‐wiele-‐zalezy-‐od.html

(3)

Jest ona alkaloidem, czyli związkiem organicznym pochodzenia roślinnego, zawierającym układ cykliczny z atomami azotu w pierścieniu. Alkaloidy wykazują silne działanie fizjologiczne na organizm człowieka, niejednokrotnie toksyczne.

Kofeina jest głównym alkaloidem nasion krzewu kawowego Coffea arabica, ale występuje także w innych roślinach z rodzin Theace i Sterculiaceae. Znajduje się ona również w liściach herbaty (teina). Znaczne ilości kofeiny znaleźć można również w guaranie (Pasta Guarana), liściach mate (Herba mate) oraz w nasionach kawowca (Theabroma caco L.).

Kofeina do krwi dostaje się z przewodu pokarmowego. Jest wchłaniana już po około 30 -‐ 45 minutach po jej spożyciu. Czas utrzymywania się jej we krwi to w przybliżeniu 4 godziny. W zależności od organizmu może się on wahać od 2 do 10 godzin. Kofeina jest stymulatorem centralnego układu nerwowego, łatwo przenika z krwi do mózgu, a tam ze względu na swoje znaczne podobieństwo w budowie do adenozyny wiąże się z receptorami adenozynowymi i blokuje je. Adenozyna jest substancją naturalnie występującą w organizmie człowieka, która pośredniczy w aktywności mózgu, wpływając na stan snu i czuwania. W konsekwencji podnosi się aktywność dopaminy. Dopamina jest to neuroprzekaźnik, który odpowiada ze większość efektów kawy takich jak poprawę koncentracji, zmniejszenie uczucia senności. Blokowanie receptorów adenozynowych może również wpłynąć na kurczenie się naczyń krwionośnych, co oddziałuje na napięcie naczyń znajdujących się w mózgu, a tym samym zmniejszyć objawy migreny oraz bólów głowy innego pochodzenia. Te właściwości kofeiny wykorzystane zostały przez producentów leków, którzy stosują ja jako istotny składnik leków przeciwbólowych.

Spożywanie kofeiny może spowodować ogólne polepszenie koordynacji organizmu oraz poprawienie koncentracji. Jednakże zbyt duża dawka kofeiny może mieć negatywny wpływ na funkcjonowanie organizmu powodując uczucie zmęczenia lub zaburzenia koordynacji ruchowej. Dawki powyżej 2000 mg mogą również powodować bezsenność, drżenie mięśni lub przyśpieszenie oddechu. Częste picie napojów, których składnikiem jest kofeina może także przyczynić się do podniesienia się ciśnienia tętniczego krwi, a tym samym przyśpieszenia bicia serca, gdyż powoduje ona uwalniania się kortyzolu i adrenaliny, które są odpowiedzialne za występowanie takich efektów. Kofeina również posiada właściwości moczopędne, powoduje zwiększenie wydzielania kwasu żołądkowego oraz prowadzi do przyśpieszenia metabolizmu.

2.2. Bisfenol A (BPA) jako zanieczyszczenie produktów spożywczych

Struktura chemiczna bisfenolu A (BPA)

Bisfenol A (BPA) jest substancją niebezpieczną o największej rocznej produkcji. W większości używany jest przy produkcji syntetycznych tworzyw z grupy poliwęglanów (twardych, przezroczystych, o dużej odporności termicznej i mechanicznej) oraz żywic epoksydowych. Żywice te używane są m.in. do powlekania puszek konserwowych i rur kanalizacyjnych, tworzą powłoki budowlane o dużej wytrzymałości, w tym posadzki, meble i panele. BPA znaleźć można w takich

(4)

przedmiotach codziennego użytku jak płyty DVD, sprzęt elektroniczny, zabawki, papier termalny wykorzystywany jako paragony, przybory kuchenne i wiele innych. W związku z tym, jesteśmy narażeni na tę substancję z wielu stron. Wykrywany jest powszechnie w krwi i moczu ludzie, bez względu na wiek czy płeć.

Związek ten zaliczany jest do substancji endokrynnie czynnych (ang. ECD – Endocrine Distrupting Compounds), które swoją budową przypominają naturalne hormony i destabilizują naturalne procesy poprzez zarówno stymulacje, jak i inhibicje działania układu hormonalnego. To przekłada się na problemy z rozmnażaniem, rozwojem, zmniejszoną odpornością czy otyłością.

BPA jest obecnie niedozwolony w produkcji butelek dla niemowląt i dzieci. Do 2020 jego zwartości w paragonach powinna być nie większa niż 0,02%. W produktach spożywczych znajduje się z powodu przedostawania się w opakowań, bądź też pochodzi z surowców lub dostaje się w trakcie ich przetwarzania. Największe stężenia wykrywane są w jedzeniu puszkowanym, w szczególności w puszkach zawierających kwaśne i bogate w tłuszcze pokarmy.

Przykładowe stężenia BPA w różnych produktach (w tym napojach) i materiałach można znaleźć w następujących pozycjach:

-‐ Occurrence of bisphenol A and its effects on the human body, Elżbieta Włodarczyk, Arch Physiother Glob Res 19 (2015) 13-‐26

-‐ Determination of BPA, BPB, BPF, BADGE and BFDGE in canned Energy drinks by molecularly imprinted polymer cleaning up and UPLC with fluorescence detection, Pasquale Gallo, Ilaria Di Marco Pisciottano, Francesco Esposito, Evelina Fasano, Gelsomina Scognamiglio, Gustavo Damiano Mita, Teresa Cirillo, Food Chemistry 220 (2017) 406–412

-‐ Raport: Survey of Bisphenol A in Canned Drink Products, Bureau of Chemical Safety Food Directorate Health Products and Food Branch, 2009

Jak rozróżnić produkty wolne od BPA? Służą do tego odpowiednie logotypy, które można znaleźć na produktach: jak np. :

(Źródło: https://aquamelior.pl/pl/blog/Bisfenol-‐A-‐BPA-‐co-‐to-‐takiego-‐i-‐dlaczego-‐warto-‐zwrocic-‐na-‐niego-‐uwage/22)

(5)

Praktyczne wskazówki:

1. Produkty z zawartością BPA, w tym głównie plastiki poliwęglanowe, oznaczone są symoblem „PC 7” (PC – plastik poliwęglanowy, polycarbonate plastic) lub umieszczonej cyfrze „7” w trójkącie (co świadczy dotatkowo o możliwości recyklingu).

2. Produkty BPA FREE (wolne od bisfenolu A), przy których tworzeniu wykorzystano np. bezpieczny polipropylen (PP), oznaczone są symbolem „05 PP” znajdującym się w trójkącie (z możliwością recyklingu).

3. CZĘŚĆ EKSPERYMENTALNA

Schemat ogólny wykonania ćwiczenia zamieszczono na poniższym rysunku. Ćwiczenie wykonane zostanie w dwóch podgrupach danego dnia.

Dzień I

Dzień II

Dzień III

3.1.1. Przygotowanie roztworów wzorcowych kofeiny i ich analiza celem wyznaczenia równania

krzywej kalibracyjnej z wykorzystaniem techniki HPLC-‐UV

3.1.2. Przygotowanie napojów energetyzujących i ich analiza z wykorzystaniem techniki HPLC-‐UV, celem

wyznaczenia zawartości kofeiny

4.1.1. Przygotowanie roztworów wzorcowych BPA. Ekstrakcja BPA z napojów energetyzujących (przygotowanie ekstraktów)

Grupa A Grupa B

4.1.2. Analiza przygotowanych roztworów i ekstraktów z wykorzystaniem techniki GC-‐FID

celem oznaczenia w nich BPA

Analiza uzyskanych danych i obróbka wyników (platforma Ms Teams). Test w wersji on-‐line.

(6)

3.1.1. Przygotowanie roztworów wzorcowych kofeiny i ich analiza celem wyznaczenia równania krzywej kalibracyjnej z wykorzystaniem techniki HPLC-‐UV (Dzień I, grupa A i B)

a) Z wodnego roztworu podstawowego kofeiny o stężeniu 5 mg/ml przygotować 5 roztworów roboczych o stężeniu: 50 μg/ml, 25, 20, 15, 10, 5 μg/ml. Do rozcieńczeń używać wody.

b) Dokonać wyboru analitycznej długości fali koniecznej do oznaczania kofeiny z wykorzystaniem detektora UV-‐Vis na podstawie załączanego poniżej widma absorpcji promieniowania UV-‐Vis wodnego roztworu kofeiny o stężeniu 25 μg/ml.

Widmo absorpcji promieniowania UV-‐Vis wodnego roztworu kofeiny

Warunki pracy zastawu HPLC: kolumna HPLC C18, natężenie przepływu fazy ruchomej 1 ml/min, faza ruchoma acetonitryl/woda z dodatkiem TFA (0,0035%, v/v), warunki izokratyczne 15:85, v/v.

c) Na podstawie uzyskanych chromatogramów należy wybrać najbardziej optymalną długość fali i wykonać dwukrotne analizy HPLC roztworów wzorcowych kofeiny o stężeniach 25, 20, 15, 10, 5 μg/ml.

d) Na podstawie odczytanych pól powierzchni wyznaczyć krzywą kalibracyjną.

3.1.2. Przygotowanie napojów energetyzujących i ich analiza z wykorzystaniem techniki HPLC-‐

UV, celem wyznaczenia zawartości kofeiny (Dzień II, grupa A i B)

Zakupione napoje gazowane (typu energetyki czy coca-‐cola) z zawartością kofeiny stosowanie (stopień rozcieńczenia należy dobrać razem z Prowadzącym) rozcieńczyć wodą i odgazować w łaźni ultradźwiękowej przez 10 minut. Wykonać analizy HPLC otrzymanych próbek.

Wyznaczyć zawartość kofeiny w napojach. Jeżeli pole powierzchni sygnału kofeiny jest większe lub mniejsze niż pola powierzchni sygnałów kofeiny na krzywej kalibracyjnej zaproponować inne rozwiązanie analizy ilościowej.

(7)

3.1. Oznaczanie BPA techniką GC-‐FID

-‐ Przygotowanie roztworów do oznaczeń ilościowych

Z roztworu podstawowego BPA o stężeniu 1 mg/ml (w metanolu) przygotować następujące stężenia (po 1 ml roztworu) 100 ug/ml, 20 ug/ml, 10 ug/ml oraz 2 ug/ml wykorzystując metanol oraz strzykawki mikrolitrowe.

-‐ Przygotowanie próbek do krzywej kalibracyjnej z wykorzystaniem sililowania

Z każdego roztworu pobrać po 100 ul i przenieść do zakręcanej wialki chromatograficznej o objętości 1,5 ml. Rozpuszczalnik odparować w strumieniu azotu. Następnie do każdej wialki dodać odczynnik derywatuzujący (BSTFA +1% TMC w mieszaninie 1:5 z heksanem) w objętości 100 ul. Całość dobrze zakręcić, wymieszać i umieścić w bloczku grzejnym nastawionym na temperaturę 60 °C na czas 20 min. Po ostudzeniu do temperatury pokojowej, każdą z próbek analizować techniką GC/MS. Wykreślić krzywą kalibracyjną jako zależność stężenia (oś x) do pola powierzchni sygnału chromatograficznego BPA.

-‐ Warunki analizy chromatograficznej

Parametr Wartość

Kolumna kapilarna Zb-‐5 (30 m x 0.25 mm x 0.25 um)

Objętość dozowana 1 ul

Temperatura dozowania 300 °C

Temperatura detektora FID 305 °C

Ciśnienie gazu 100 kPa

Dzielenie strumienia 1 min bez dzielenia, następnie ratio 10

Gradient temperatury Temp. początkowa 120 °C, gradient 15 °C do 300 °C

-‐ Ekstrakcja do fazy stałej BPA z próbki napoju energetyzującego

Ekstrakcję przeprowadzić według poniższego schematu wykorzystując kolumienkę Strata-‐X (200 mg, 3 mL). W celach kontrolnych taką samą ekstrakcję przeprowadzić z zastosowaniem wody dejonizowanej jako matrycy bez dodatku analitu (tzw. ślepa próba).

1. Kondycjonowanie 2 ml metanolu 2. Przepłukanie 2 ml wody dejonizowanej

3. Naniesienie próbki napoju o objętości 50 ml na złoże z wykorzystaniem podciśnienia 4. Przepłukanie 3 x 2 ml 50% aq. metanolem

5. Osuszenie kolumienki w podciśnieniu (min. 10 min) 6. Wymywanie 2 x 1 ml metanolu

6. Odparowanie rozpuszczalnika z ekstraktu i przeprowadzenie siliowania jak dla wzorców

(8)

-‐ Obliczenie zawartości BPA w napoju

W celu ilościowego oznaczenia BPA w napoju należy odnaleźć jego sygnał na chromatogramie (znając czas retencji wzorca z krzywej kalibracyjnej) i odczytać pole powierzchni. Znając wzór krzywej kalibracyjnej należy obliczyć stężenie w próbce po derywatyzacji (ug/ml). Jeśli w próbce wody dejonizowanej obecny był BPA, odjąć stężenie od tego w próbce. Znając objętość ekstraktu po sililowaniu (100 ul) i stężenie BPA, obliczyć masę BPA w ekstrakcie. Zakładając 100% odzysk BPA w próbki napoju i znając objętość napoju wziętą do ekstrakcji i masę jaka się w nim znajdowała, obliczyć stężenie BPA w napoju.

Ponadto, z prowadzącym zostanie omówione widmo mas BPA w postaci pochodnej TMS uzyskane techniką GC-‐MS: