NEWSLETTER. W tym wydaniu: GRUDZIEŃ /2021 (nr 46)

(1)

N ^EWS L ^ETTER

GRUDZIEŃ 2021 04/2021 (nr 46)

 Produkty fermentowane i ich prozdrowotne właściwości na przykładzie kimchi i kombuchy - Weronika Witych-Olejnik

 LISTERIA - nowe gatunki, nowe problemy diagnostyczne - Małgorzata Stachowiak

 Substancje antyżywieniowe w paszach roślinnych - Karolina Morawska

 Wykorzystanie płynów w stanie nadkrytycznym w procesie ekstrakcji - Zuzanna Brinkiewicz

 Zmiany w prawodawstwie żywnościowym

 Szkolenia i seminaria

W tym wydaniu:

3 6 12

29

14

17

(2)

(3)

Produkty fermentowane i ich prozdrowotne właściwości na przykładzie kimchi i kombuchy

Weronika Witych-Olejnik

Niechaj wasze pożywienie będzie lekarstwem i lekarstwem waszym - pożywienie.

W myśl tej zasady, której autorem jest Hipo- krates, powstało mnóstwo tekstów nauko- wych, wydawnictw, artykułów czy poradni- ków, szczególnie popularnych m.in. wśród osób, które decydują się wprowadzić do swojej diety tak zwane “kiszonki”, czyli produkty powstałe w wyniku fermentacji. Na fali ogromnej popularności tego rodzaju produk- tów powstały również dedykowane sklepy, restauracje czy stoiska, które specjalizują się w sprzedaży produktów fermentowanych. Do ich asortymentu należą między innymi: zakwasy pitne (najczęściej z buraków; popular- ne są również zakwasy np. z kapusty, selera czy wzbogacane o dodatki wpływające na walory smakowe lub zdrowotne: imbir, acero- lę, chilli, anyż, goździki i inne); kimchi (o róż- nym stopniu ostrości i podobnie jak w przypadku zakwasów - z szeroką gamą dodat- ków), kiszone warzywa (np. kapusta, ogórek, papryka, marchew, kalafior, fasola, chrzan) czy owoce (jabłka, gruszki, morele, cytrusy i wiele innych), grzyby, zboża, herbata czy produkty mleczne - jogurty, kefiry.

Warzywa i owoce fermentowane, czyli kiszonki, nie bez powodu coraz bardziej zysku- ją na popularności. W przeszłości na skalę ich produkcji wpływała głównie cena i do- stępność - kieszenie jest metodą stosunkowo niedrogą i może bardzo korzystnie wpły- nąć na smak potrawy oraz na jej termin przy- datności do spożycia. Co więcej, jest to me- toda niedroga - stąd zapisała się ona w tradycji wielu kuchni świata, będąc przy tym czynnością znaną ludzkości od wieków - wywodzi się prawdopodobnie z Azji, gdzie było praktykowane 2000 lat temu. Na tereny Eu-

ropy kiszenie zostało przeniesione właśnie z Chin. Same zaś warzywa i owoce, często łatwiej dostępne niż np. mięso, stanowiły podstawę diety ludzi po okresie łowiectwa i zbieractwa, kiedy to ludzie nauczyli się uprawiać rośliny. I choć wiele warzyw bywało traktowane jako pożywienie ubogich, czy wręcz niegodne człowieka i przeznaczone jedynie dla zwierząt, z czasem podziały te uległy zatarciu - najważniejsza stała się nie dostępność danych warzyw czy owoców, ale ich właściwości zdrowotne i smakowe.

Wraz upływem lat i z poprawą sytuacji ekonomicznej rodzin i całych państw, do kiszenia zaczęto używać coraz szerszej gamy składników, nie utożsamiając już tej czynno- ści z “żywnością dla ubogich”. Ponadto, warzywa czy owoce rzadko są wykluczane z diety ze względu na aspekty kulturowe czy religijne, w przeciwieństwie na przykład do mięsa, stąd popularność fermentowania owoców i warzyw nie jest ograniczona takimi aspektami. W związku z coraz większą rze- szą warzyw, owoców, grzybów, czy nawet niektórych gatunków mięs i ryb, nadających się do kiszenia, produktami fermentowanymi zaczęło interesować się coraz więcej osób,

(4)

również w skali przemysłowej. Kiszonki trafiły zatem na stoły, stały się produktem pożąda- nym i cenionym - nie tylko ze względu na smak, ale przede wszystkim pozytywny wpływ na organizm.

Kiszonka, gdy tylko jest prawidłowo wyko- nana i zabezpieczona, zwiększa pobieranie suchej masy, ograniczając przy tym straty cukrów oraz innych składników pokarmo- wych, i przede wszystkim stymuluje rozwój bakterii fermentacji mlekowej. Do innych wła- ściwości produktów powstałych w wyniku fermentacji, można zaliczyć ich wysokie podo- bieństwo terapeutyczno-lecznicze do probio- tyków.

Probiotyki są to bakterie naturalnego mi- krobiomu, które wywołują wielokierunkowe pozytywne działania dla organizmu człowie- ka, zarówno miejscowe jak i ogólnoustrojo- we. Są to także produkty bądź preparaty, któ- re posiadają żywe drobnoustroje stanowiące właściwości probiotyczne. Są to przede wszystkim bakterie z rodzaju Lactobacillus oraz bakterie Bifidobacterium z grupy bakterii kwasu mlekowego. Ich wspólną cechą jest zdolność beztlenowego rozkładu węglowoda- nów na drodze fermentacji mlekowej. Oprócz nich, do bakterii kwasu mlekowego zaliczane są także inne mikroorganizmy z rodzaju Lac- tococcus, Pediococcu, Streptococcus, Leuco- nostoc, czy Enterococcus. Udowodnione działanie w badaniach klinicznych wykazuje między innymi Lacidophilus – stosowany jest przy wrzodziejącym zapaleniu jelita oraz przy zaburzeniach motorycznych jelit, a np. Strep- tococcus thermophilus stosowany jest w celu zapobiegania biegunce związanej ze stoso- waniem antybiotyków.^.Probiotyki są szeroko doceniane zarówno w medycynie konwencjo- nalnej jak i niekonwencjonalnej, a ich obec- ność w produktach spożywczych zazwyczaj znacznie podnosi ich wartość w oczach kon- sumentów. Stąd działanie probiotyczne jest często wymieniane jako jedne z najważniej- szych właściwości kiszonek.

Co ciekawe, metody kiszenia warzyw i owoców są różne w zależności od regionu i dostępnych surowców. Na przykład w Azji czy w Afryce składniki poddawane kiszeniu (na przykład owoc mango) najczęściej najpierw są krojone i kiszone w słonej zalewie, a następnie odsączane i przyprawiane; w In- diach czy Pakistanie, przed krojeniem (na przykładzie limety kwaśnej) owoce najpierw zanurzane są w gorącej wodzie, następnie krojone i kiszone, a potem podsuszane na słońcu i przyprawione. Na Białorusi czy Ukrai- nie często kiszone są jabłka i pomidory, z wy- korzystaniem zalewy. Kiszenie warzyw i owo- ców w Polsce kojarzy się głównie z bigosem, kapustą i ogórkami.

Na świecie, jedną z najbardziej znanych potraw kiszonych jest kimchi, czyli kiszona kapusta pekińska z dodatkami, wywodząca się z Korei. Kiszone liście kapusty dodawane bywają w Korei niemal do wszystkich posił- ków, z wyłączeniem deserów, i zyskują coraz większą popularność - w wielu państwach można znaleźć np. burgery czy zupy z dodat- kiem kimchi. Wg raportu Global Kimchi Mar- ket 2020-2024 globalny rynek kimchi ma szansę na wzrost nawet o 8% w okresie mię- dzy 2020 a 2024, co ukazuje że danie to, mi- mo wieloletniej tradycji, nie osiągnęło jeszcze szczytu swojej popularności. Kimchi doceniane jest za korzystny rozkład makroskładników - niską zawartość tłuszczu i wysoką zawar- tość błonnika, smak oraz niskie koszty produkcji.

Czas fermentowania kimchi nie jest ściśle określony - do liści kapusty pekińskiej (lub rzadziej, rzodkwi lub innych warzyw), dodawane są ostre przyprawy i sól. W efekcie po- wstaje potrawa bogata w witaminy A, B1, B2;

ponadto żelazo, wapń i żywe kultury bakterii (z rodziny Lactobacillaceae), pozytywnie wpływające na trawienie i ogólne funkcjono- wanie organizmu - takie, jak obecne są w zsiadłym mleku. Poprawnie ukiszone kimchi może zawierać nawet 4-krotnie więcej bakterii probiotycznych w przeliczeniu na 1 gram, w porównaniu do jogurtu.

(5)

Jak piszą autorowie tekstu Kefir pod lupą, mikrobiota kefiru pozytywnie wpływa na zdrowie człowieka głównie dzięki obecności droż- dzy i bakterii - czyli żywych organizmów. Stąd też, między innymi, produkty powstałe w wyniku fermentacji - kiszonki, jogurty, zakwasy - określane są mianem “produktów żywych”.

Ich “żywotność” jest widoczna zarówno pod mikroskopem, jak i gołym okiem - na przykład poprawnie ukiszone warzywa w słoiku, pod wpływem wstrząsu, mogą gazować - a dzieje się tak pod wpływem wytwarzania przez bak- terię dwutlenku węgla. Entuzjaści kiszonek czasem umyślnie podgrzewają słoiki lub wstrząsają nimi przed otwarciem, by uzyskać podobny efekt.

Innym przykładem rozpoznawalnej coraz szerzej na świecie kiszonki jest kombucha - funkcjonalna herbata. Kombucha (Kombucza) jest to coraz bardziej popularny napój, o słodko kwaśnym smaku. Jest on określany jako orzeźwiający i musujący. Po- chodzi z północno-wschodnich Chin (Mandżurii). Nazwa napoju wywodzi się z połączenia dwóch słów: Kombu (jest to imię lekarza koreańskiego, który sprowadził napój w roku 414 n.e. do Japonii i rozpowszechnił stosowanie go w leczeniu problemów tra- wiennych) i Cha, które w języku japońskim

’napój’. Napój ten otrzymywany jest w wyniku fermentacji osłodzonej herbaty przez bakterie kwasu octowego oraz poprzez symbiotyczną kulturę drożdży, tzw. SCOBY (Symbiotic Cul- tures of Bacteria and Yeasts). Kompozycja ta zależy od warunków geograficznych oraz kli- matycznych, tak samo jak od gatunków droż- dży oraz bakterii dostępnych w danym miejscu. Właściwy dobór drobnoustrojów ma znaczenie kluczowe - ich rolą jest bowiem hamo- wanie wzrostu niekorzystnych bakterii, stano- wiących potencjalne zanieczyszczenie.

Do produkcji kombuchy wykorzystywane są różnego rodzaju herbaty takie jak zielona czy czarna, czerwona, a także żółta. Najpo- pularniejszymi, a zarazem najbardziej trady- cyjnymi składnikami są jednak właśnie trady-

cyjna herbata czarna oraz cukier biały (sacharoza) - niosą one prozdrowotne działa- nie napoju oraz gwarantują właściwy skład produktu gotowego. Pozytywne działanie na organizm człowieka mają związki bioaktywne oraz kwas mlekowy jak i glukuronowy, które powstają podczas fermentacji naparu słodkiej herbaty. Opisywany napój jest bogaty także w witaminy (B1, B2, B6, B12 i C), związki mineralne (Cu, Fr, Mn, Ni i Zn), a także w biolo- gicznie aktywne substancje które pochodzące z herbaty, enzymy hydrolityczne i związki poli- fenolowe. Źródła podają, iż kombucha wykazuje również działania przeciwutleniające, przeciwgrzybicze, detoksykacyjne, chemopre- wencyjne, antymikrobiologiczne jak i ogólno- wzmacniające. Obniża także ciśnienie krwi, a także redukuje poziom cholesterolu. Dzięki wysokiej zawartości kwasu glukuronowego kombuchę stosuje się przy oczyszczaniu wą- troby z toksyn. Pozytywne działania kombuchy nie są jednak ugruntowane przez badania naukowe. Napój ten powinien być tak więc wykorzystywany jedynie jako uzupełnienie diety w składniki bioaktywne, napój odżywczy.

Bardzo ważnym aspektem jest odpowiednie przechowywanie napojów fermentowanych, tak aby utrzymane było odpowiednie pH (wpływa ono w znacznym stopniu na jakość tak kombuchy, jak i innych produktów fermentowanych). Powinno wynosić ono od 2.5

÷ 3.5. Tak niskie pH jest możliwe do osiągnię- cia m.in. z zawartości kwasu octowego (związek ten odpowiedzialny jest za działanie

(6)

LISTERIA - nowe gatunki, nowe problemy diagnostyczne Małgorzata Stachowiak

przeciwbakteryjne, jednocześnie hamuje wzrost drożdży i grzybów). W ten sposób za- pewniona jest ochrona napoju przed produ- kowaniem niekorzystnych związków, które stanowiłyby zanieczyszczenie. Zbyt wysokie pH może przyczynić się do degradacji polife- noli oraz wpływać negatywnie na stabilność chemiczną antocyjanów. Antocyjany, zaliczane do flawonoidów, są odpowiedzialne za właściwości przeciwutleniające - wykazują one bowiem zdolność neutralizowania wol- nych rodników. Produkty fermentowane zale- ca się przechowywać bez ekspozycji na pro- mienie słoneczne, w miejscu suchym i chłod- nym, aby utrzymać stabilność produktu i jego właściwości.

Oprócz właściwego przechowywania pro- duktów fermentowanych, w związku z ich za- wartością, należy przykładać ogromną wagę do stałej kontroli ich wartości odżywczej i wpływu przechowywania na jakość produktu. Niekiedy w procesie fermentacji uaktyw-

niają się na przykład mniej pożądane odmia- ny drożdży, istnieją również inne czynniki, które należy kontrolować - na przykład waga produktów czy stosunek ilości masy suchej do mokrej. Badaniami mikrobiologicznymi produktów kiszonych, jak i badaniem ich war- tości odżywczych, pH, parametrów organo- leptycznych czy fizykochemicznych, zajmuje się firma J. S. Hamilton - regularnie i wg ści- słych wytycznych analizując aktualność ety- kiet produktów i ich realne właściwości. Waż- nym elementem tych badań są badania prze- chowalnicze, które określają między innymi prawdziwość określonej daty trwałości danego produktu i analizują czy zmiany senso- ryczne nie powodują utraty akceptowalnej jakości czy negatywnego wpływu na zdrowie konsumenta. Przy produktach, określanych jako “żywe”, jest to szczególnie istotne, stąd dokładna, powtarzalna analiza jest zapewnie- niem bezpieczeństwa produktów.

Rodzaj Listeria składa się obecnie z 21 gatunków i 6 podgatunków które można po- dzielić na dwa odrębne klady: sensu stricto i sensu lato. Klad sensu stricto reprezentują gatunki: L. monocytogenes, L. innocua, L. ivanovii, w tym subsp. ivanovii i londoniensis, L. seeligeri, L. marthii i L. welshimeri.

Gatunki Listeria sensu stricto tworzą ścisłą monofiletyczną grupę w obrębie rodzaju Li- steria ze zdolnością do ruchu i wzrostu w niskiej temperaturze. Pozostałe gatunki nale- żą do kladu Listeria sensu lato: L grayi, w tym subsp. grayi i murrayi, L. fleischmannii, w tym subsp. fleischmannii i coloradonen- sis, L. floridensis, L. aquatica, L. costaricen-

sis, L. goaensis, L. thailandensis, L. valentina, L. newyorkensis, L. cornellensis, L. roco- urtiae, L. weihenstephanensis, L. grandensis, L. riparia, L. booriae. Ostatnim zgłoszonym gatunkiem Listeria jest L. valentina, gatunek sensu lato, opublikowany 5 października 2020 roku. Podział na te dwie grupy opiera się na pokrewieństwie gatunków do L. monocytogenes, która jest pierwszym sklasyfiko- wanym gatunkiem Listeria a przede wszystkim jest ważnym patogenem przenoszonym przez żywność. Przypadki i ogniska chorób u ludzi spowodowane przez ten drobnoustrój mają znaczący wpływ ekonomiczny na spo- łeczeństwo i przemysł spożywczy. Ponadto

(7)

przemysł spożywczy, jak również agencje regulacyjne na całym świecie wykonują dużą liczbę badań próbek żywności i próbek śro- dowiskowych na obecność L. monocytogenes i Listeria spp.; dlatego też sprzedaż ze- stawów do badań stanowi istotny dochód dla wielu firm a dla laboratorium mikrobiologicz- nego wygodne narzędzie analityczne. Co ważne, wykrywanie gatunków Listeria jest często wykorzystywane przez przemysł spo- żywczy jako marker do wykrywania warun- ków umożliwiających obecność, wzrost i utrzymywanie się L. monocytogenes w żyw- ności i środowisku produkcji. Dlatego też, identyfikacja nowych gatunków Listeria i zmiany w taksonomii Listeria mogą mieć zna- czący wpływ na przemysł spożywczy i produ- centów zestawów biochemicznych.

W niniejszym artykule opisano sposoby identyfikacji pięciu nowych gatunków wyizolowanych z próbek gleby i wody do nawadniania w Stanach Zjednoczonych. Uzyskane infor- macje pomogły w ocenie dotychczasowego toku postępowania.

1. Materiał do badań

Z próbek środowiskowych uzyskano 27 izolatów które wstępnie zidentyfikowano jako Listeria, ale nie można ich było sklasyfikować do konkretnego gatunku. Namnażanie i izola- cję Listeria przeprowadzono zgodnie z wy- tycznymi FDA BAM rozdział 10. Próbki gleby i wody namnażano w bulionie BLEB (Buffered Listeria Enrichment Broth) z dodat- kiem suplementów (Listeria Selective Supple- ment,). Po 24 i 48 h inkubacji w 30 ⁰C, za po- mocą sterylnej ezy pobrano materiał z bulio-

nu BLEB i przesiano na zmodyfikowany Oxford Listeria Selective Agar (MOX) i R&F Listeria monocytogenes Chromogenic Plating Medium (LMCPM). Płytki MOX i LMCPM in- kubowano odpowiednio w temperaturze 30 i 35 °C przez 48 godzin. Przypuszczalne kolonie Listeria zawieszano w bulionie mózgowo - sercowym (Brain Heart Infusion BHI i poddano wstępnej identyfikacji stosując metodykę do amplifikacji PCR i sekwencjonowania czę- ści genu sigB. Kodowane przez gen sigB, białko, chroni bakterie przed czynnikami stre- sowymi np. niskim odczynem pH, niskimi tem- peraturami, szokiem osmotycznym, głodem.

Sekwencjonowanie fragmentu sigB, jest po- wszechnie stosowanym narzędziem moleku- larnym do wstępnej charakterystyki różnych izolatów Listeria. Dane z sekwencjonowania sig B wykluczyły przynależność izolatów do istniejących gatunków Listeria.

Dalsza charakterystyka genetyczna i fenotypowa została przeprowadzona przy użyciu czystych kultur wszystkich 27 izolatów.

2. Sekwencjonowanie całego genomu (WBS) i analiza filogenetyczna

Sekwencjonowanie całego genomu (WGS) polega na ustaleniu kolejności wszystkich nu- kleotydów w DNA danego organizmu i porów- nanie z materiałem genetycznego z innych próbek zgromadzonych w bazie danych. Do oceny zgodności wykorzystano analizę obli- czeniową ANI – (średnią tożsamość nukleoty- dową ANI - average nucleotide identity). Obli- czanie ANI zwykle obejmuje fragmentację sekwencji genomu, a następnie wyszukiwanie sekwencji nukleotydowych, dopasowanie i obliczenie tożsamości. Mikroorganizmy nale- żące do tego samego gatunku zwykle wyka- zują między sobą > 95% ANI. Genomy izola- tów porównywano z zestawem 28 genomów referencyjnych Listeria. Analiza wykazała, że żaden z istniejących genomów referencyjnych nie został przypisany do nowych gatunków;

jednakże wszystkie nowe gatunki zostały umieszczone w rodzaju Listeria, co potwierdza, że szczepy na pewno reprezentują nowe

(8)

gatunki Listeria. Analiza ANI wykazała, że 27 izolatów grupowało się w pięć wyraźnych skupisk, co wskazuje, że każde skupisko re- prezentuje nowy gatunek. Trzy z pięciu nowych gatunków (L. farberi, L. immobilis, L. cossartiae subsp. cossartiae i subsp.

cayugensis) grupują się w kladzie sensu stricto, kladzie interesującym dla zdrowia pu- blicznego, ponieważ zawiera on uznane pa- togeny ludzkie i zwierzęce (tj. L. monocytogenes i L. ivanovii). Dwa pozostałe nowe gatunki (L. portnoyi i L. rustica) grupują się w kladzie sensu lato. Do dalszej klasyfikacji gatunkowej izolatów zastosowano dodatkowe metody wspierające ANI między innymi, średnią identyczność aminokwasów (average amino acid identity- AAI) i analizę filogenetyczną genu 16S rRNA. Wartości AAI pomiędzy nowymi gatunkami a najbardziej podobnym genomem referencyjnym Listeria wahały się w granicach 91,0-97,3%. Nato- miast najwyższe podobieństwo sekwencji genu 16S rRNA pomiędzy każdym nowym gatunkiem a referencyjnym gatunkiem Liste- ria wynosi:

- 99,9 % pomiędzy L. cossartiae (zarówno podgatunek cossartiae, jak i subsp. cayugensis) a L. monocytogenes linii I SLCC2376;

- 98,7 % pomiędzy L. farberi a L. monocytogenes linii II SLCC 22479;

- 99,9 % pomiędzy L. immobilis a L. ivanovii subsp. londoniensis.

 99,9 % między L. portnoyi i zarówno szczepami typu L. cornellensis, jak i L. grandensis; oraz

- 100 % między L. rustica i szczepami typu L. cornellensis i L. grandensis.

Chociaż wartości te są wyższe od propo- nowanych 98,7-99,0 %, podobieństwa >99 % między sekwencjami genu 16S rRNA róż- nych gatunków nie są rzadkie, ten wysoki poziom podobieństwa jest również zgodny z wcześniejszymi obserwacjami, że różne gatunki Listeria często wykazują bardzo po- dobne sekwencje genu 16S rRNA. Dane do- tyczące podobieństwa sekwencji 16S rRNA

dla nowych gatunków dodatkowo przema- wiają za umieszczeniem ich w rodzaju Liste- ria. Istnieje też bliskie pokrewieństwo pomię- dzy gatunkami patogennymi i niepatogenny- mi. Chorobotwórcza L. monocytogenes jest najbliższa filogenetycznie z niechorobotwór- czą L. innocua. Natomiast patogenna dla zwierząt L. ivanovii z L. seeligeri, która pomimo posiadanego klastra wirulencji uważana jest za formę niepatogenną.

3. Analiza fenotypowa

Charakterystykę fenotypową przeprowadzono na dziewięciu izolatach, które repre- zentują pięć gatunków i dwa podgatunki. Izo- laty obejmowały: L. farberi, L. portnoyi ,L. rustica ,L. immobilis ,L. cossartiae subsp. cossartiae i subsp. cayugensis. Izolaty te repre- zentowały wszystkie nowe szczepy sensu stricto, jak również dwa dodatkowe izolaty dla L. immobilis i jeden dodatkowy izolat dla L. cossartiae subsp. cossartiae.

Analizy fenotypowe obejmowały:

- ocenę wzrostu w zakresie temperatury oczekiwanej dla Listeria (0-45 °C)

 ocenę fenotypów kolonii na podłożach selektywnych i różnicujących,

- procedury identyfikacji Listeria opisane w FDA BAM, rozdział 10 i ISO EN 11290-1:

2017 (oba dokumenty opisują te same testy);

specyficzne testy przeprowadzone w tym przypadku obejmowały hemolizę, ruchliwość, katalazę, oksydazę, barwienie metodą Gra- ma, redukcję azotanów oraz API Listeria (bioMérieux),

- wzrost w warunkach beztlenowych

- testy biochemiczne zawarte w zestawach API 20E (bioMérieux) i API 50CH (bioMérieux).

Pozytywne i negatywne szczepy kontrolne do analiz fenotypowych obejmowały dobrze scharakteryzowany szczep referencyjny L. monocytogenes 10403S i odpowiednie szczepy dla innych gatunków dostępne z ko- lekcji kultur referencyjnych zgodnie z wyma-

(9)

ganiami norm ISO EN 11290-1: 2017 i ISO 11133: 2014. Obserwacje wzrostu izolatów i kontroli przeprowadzono w temperaturach 4, 22, 30, 37 i 41 °C. Liczba bakterii dla wszystkich siedmiu izolatów reprezentują- cych nowe gatunki sensu stricto wzrosła o co najmniej 7 log po 24 lub 48 godzinach inkubacji w temperaturze pomiędzy 22 a 41 °C, oraz o 2 log po 14 dniach w temperaturze 4 °C. Wszystkie izolaty sensu stricto rosły optymalnie w temperaturze 30 lub 37 °C po 24 h. Dla dwóch izolatów sensu lato, liczba bakterii wzrosła o co najmniej 6 log po 24 i 48 godzinach inkubacji odpowiednio w 22 i 30 °C, oraz ≥ 4 log po 14 dniach w 4 °C.

Morfologię kolonii, hydrolizę eskuliny i aktyw- ność fosfatydyloinozytolu specyficznego dla fosfolipazy C (PI- PLC) oceniano na agarach MOX i LMCPM. Bakterie hydrolizujące esku- linę rosną na agarze MOX w kolorze od sza- rego do czarnego, otoczone czarną aureolą.

LMCPM jest podłożem chromogennym, które wykrywa aktywność PI-P LC poprzez hydroli- zę chromogenu - fosforanu X-inozytolu. Ga- tunki Listeria pozytywne dla PI-PLC rosną się na LMCPM w kolorze niebiesko-czerwonym, a gatunki nie wykazujące aktywności PI-P LC w kolorze białym. Wszystkie kolonie nowych gatunków były czarne, okrągłe, otoczone czarną aureolą i miały zapadnięte centra na MOX oraz były małe, okrągłe, wypukłe i białe na LMCPM. Czernienie na MOX potwierdzi- ło, że wszystkie nowe gatunki hydrolizują eskulinę. Brak niebiesko-zielonych kolonii na LMCPM świadczy o braku aktywności PI-P LC. Tę cechę wykazał tylko szczep referencyjny L. monocytogenes 10403S. Dwa izolaty reprezentujące nowe gatunki sensu lato (L. portnoyi, L. rustica) okazały się bardziej wrażliwe na presję selekcyjną LMCPM w po- równaniu z siedmioma izolatami reprezentu- jącymi trzy nowe gatunki sensu stricto oraz dwoma szczepami kontrolnymi; wzrost był ograniczony do około dziesięciu kolonii w przypadku nowych izolatów sensu lato w porównaniu ze wzrostem nowych gatun- ków sensu stricto oraz szczepów kontrolnych. Ogólnie, nowe gatunki i podgatunki

opisane w niniejszym raporcie nie mogły być rozróżnione na podstawie wyglądu kolonii.

Nowe gatunki zostały także ocenione pod względem ich zdolności do redukcji azota- nów zgodnie z metodami BAM/ISO. Żaden z izolatów reprezentujących nowe gatunki sensu stricto nie redukował azotanów; izolaty reprezentujące nowe gatunki sensu lato re- dukowały azotany, co było widoczne w postaci zmiany koloru na czerwony po dodaniu odczynników NIT1 i NIT2 (kwasu sulfanilo- wego i N, N-dimetylo-α-naftyloaminy). Żaden z nowych gatunków nie redukował azotynów, o czym świadczy zmiana barwy wzbogaco- nych azotynów na czerwoną po połączeniu z NIT1 i NIT2. Ruchliwość oceniano w dwóch temperaturach, 25 i 37 °C. W temperaturze 25 °C ruchliwość obserwowano mikroskopo- wo oraz poprzez inokulację podłoża do badania ruchliwości (Motility test medium MTM;

Becton Dickinson). Wśród nowych gatunków sensu stricto, izolaty reprezentujące L. cossartiae subsp. cossartiae, L. cossartiae subsp. cayugensis i L. farberi, wraz z kontro- lą L. monocytogenes, wykazywały typowe cechy ruchliwości w temperaturze 25 °C (tj.

parasolowaty wzór wzrostu w MTM). Trzy izolaty reprezentujące nowy gatunek sensu stricto L. immobilis nie wykazywały ruchliwo- ści w temperaturze 25 °C. Nowe gatunki sensu lato i kontrolny L. booriae były również nieruchliwe w 25 °C, co jest cechą wspólną dla wszystkich opisanych do tej pory gatun- ków sensu lato z wyjątkiem L. grayi. L. co- staricensis jest opisywany jako ruchliwy, ale tylko w 37 °C. Żaden z izolatów nowego gatunku ani szczepów kontrolnych nie był ruchliwy w temperaturze 37 °C. Biorąc pod uwagę, że wszystkie obecnie opisane gatunki sensu stricto wykazują ruchliwość w temperaturze 25 °C, przeprowadzono dalszą analizę wstępnych genomów wszystkich dziewięciu izolatów reprezentujących L. immobilis. Geny związane z ruchliwością nie zostały wykryte u żadnego z dziewięciu izola- tów L. immobilis, co potwierdza wyniki analiz fenotypowych.

(10)

Barwienie metodą Grama, aktywność ok- sydazy, aktywność katalazy, hemolizę β i wzrost w warunkach beztlenowych przeprowadzono na koloniach wyizolowanych ze świeżych hodowli na agarze BHI. Wszystkie izolaty nowych gatunków są Gram- dodatni- mi krótkimi pałeczkami, są oksydazo-ujemne, katalazo-dodatnie, i rosną w warunkach beztlenowych. Hemolizę oceniano na agarze z krwią owczą. L. monocytogenes 10403S i L. booriae FSL A5-0281T stanowiły odpowiednio kontrolę pozytywną i negatywną.

Wszystkie dziewięć izolatów reprezentują- cych pięć nowych gatunków oraz szczep kontrolny L. booriae były niehemolityczne, nie zaobserwowano lizy erytrocytów wokół kolonii. Tylko L. monocytogenes był hemolityczny. Analizy Listeria API przeprowadzono zgodnie z instrukcjami producenta (bioMérieux). Kody numeryczne oceniano przy użyciu bazy danych apiweb (bioMérieux wersja 2.0, apiweb wersja 1.4.0). L. farberi wygenerował profil numeryczny (7510), który jest uważany za bardzo dobrą identyfikację gatunkową; został on jednak zidentyfikowany jako L. innocua. Profil numeryczny dla L. immobilis (3330) został zidentyfikowany jako L. ivanovii, chociaż z wartością T <1, ze względu na negatywne wyniki dla glukozo-1- fosforanu (zarówno L. ivanovii subsp. jak i L. ivanovii subsp. londoniensis fermentują glukozo-1-fosforan). Dodatkowo, brak hemo- lizy u L. immobilis sprawia, że identyfikacja L. ivanovii jest wątpliwa, ponieważ L. ivanovii jest hemolityczny. Wartość T jest oszacowa- niem, jak bardzo profil liczbowy odpowiada

typowej reakcji dla gatunku. Wartość T <1 oznacza jedną lub więcej nieprawidłowych reakcji biochemicznych dla danego gatunku.

W przypadku L. cossartiae subsp. cossartiae uzyskano ten sam profil numeryczny API (6110), który wcześniej podawano dla L. marthii; ponieważ L. marthii nie jest uwzględniony w bazie danych API web od 29 października 2020 r., rzeczywistym przypisa- nym gatunkiem był L. monocytogenes (wartość T <1). L. cossartiae subsp. cayugensis o profilu numerycznym API (6130) zo- stał zidentyfikowany jako L. grayi, ale rów- nież z wartością T <1. L. cossartiae subsp.

cossartiae i subsp. cayugensis generowały różne profile numeryczne z powodu różnic w zdolności do fermentacji rybozy (6110 vs.

6130). Nowe gatunki sensu lato (L. portnoyi i L. rustica) wygenerowały ten sam profil numeryczny API Listeria, 2710, który nie za- pewnia akceptowalnej identyfikacji do pozio- mu gatunku; kod ten został również wcze- śniej podany dla L. weihenstephanensis. Po- dobnie jak wszystkie inne obecnie opisane gatunki sensu lato, z wyjątkiem L. grayi, za- równo L. portnoyi jak i L. rustica są negatywne dla Listeria API DIM (Differentiation of L. innocua and L. monocytogenes), który jest oparty na aktywności d- arylamidazy. Podsu- mowanie wyników znajduje się w Tabeli 1

Tabela 1. Wyniki analiz API Listeria

(11)

Izolaty poddano dalszej charakterystyce przy użyciu zestawów API CH50 i API 20E, którą przeprowadzono zgodnie z instrukcjami producenta (bioMérieux). Reakcje zawarte w API CH50 pozwalały na fenotypowe różni- cowanie: L. cossartiae subsp. cayugensis od L. marthii, L. farberi od L. innocua oraz L. portnoyi i L. rustica od siebie, jak również od L. weihenstephanensis.

3. Dodatkowe testy

Izolaty sprawdzono pod kątem obecności genów wirulencji. Analiza genomów wyklu- czyła obecność genów wirulencji (prfA, plcA, hly, mpl, actA i plcB) oraz genów kodujących białka powierzchniowe: internaliny inIA i inIB odpowiedzialne za przyleganie i wnikanie do komórek jelitowych gospodarza. Brak tych genów potwierdza, że nowe gatunki nie są patogenne i nie ma potrzeby badania zjadli- wości na modelu zwierzęcym (np. badanie zjadliwości na myszach). Ponadto przeprowadzono testy serotypowania za pomocą procedury analizy serotypów L. monocytogenes metodą multiplex PCR. Wykrycie ge- nu ORF2110 specyficznego dla serotypu 4b, 4d i 4e L. monocytogenes u L. ferberi może błędnie klasyfikować ten gatunek jako L. monocytogenes.

4. Znaczenie praktyczne

W artykule opisano metody identyfikacji pięciu nowych gatunków Listeria, w tym trzech nowe gatunków zaklasyfikowanych do kladu Listeria określanego przez niektórych jako "sensu stricto”, co odzwierciedla fakt, że grupa ta składa się z gatunków Listeria najbardziej zbliżonych do L. monocytogenes,

znanego patogenu przenoszonego drogą po- karmową. Wykrycie gatunków innych niż L. monocytogenes sensu stricto jest uważa- ne za wskaźnik zwiększonego ryzyka skaże- nia L. monocytogenes. Wyniki tego badania pozwoliły na zidentyfikowanie kilku cech ga- tunkowych Listeria o znaczeniu praktycznym, w tym - odkrycie nieruchliwego gatunku sensu stricto (L. immobilis), co sprawia, że ru- chliwość nie jest już fenotypem charaktery- stycznym dla tego kladu;

- cechy fenotypowe L. farberi i L. cossartiae, które sprawiają, że gatunki te są trudne do odróżnienia odpowiednio od L. innocua i L.

marthii;

- obecność sekwencji ORF2110 w genomie L. farberi, co może spowodować błędną kla- syfikację tego gatunku jako L. monocytogenes serovar 4b przy użyciu wcześniej opisa- nego testu serotypowania molekularnego - zmniejszony wzrost lub brak wzrostu nowych, opisanych tu gatunków sensu lato w temperaturach inkubacji powyżej 30 °C, co może zmniejszyć lub uniemożliwić odzyska- nie tych gatunków przy użyciu obecnie stosowanych standardowych metod, które obej- mują inkubację w temperaturach 35 i 37 °C.

Uzyskane wyniki potwierdzają potrzebę aktualizacji metod fenotypowych stosowanych do identyfikacji izolatów Listeria, w szczególności klasycznych testów obecnie stosowanych w metodach referencyjnych.

Aktualizacja ma zapobiec błędnej identyfikacji. Ponadto, do wykrywania gatunków Liste- ria często stosuje się szybkie metody, dlatego ważne będzie włączenie przedstawicieli tych nowych gatunków sensu stricto do pa- neli biochemicznych.

(12)

Na pastwiskach, łąkach oraz polach wy- stępuje wiele gatunków roślin, które oprócz zawartości niezbędnych składników pokar- mowych obniżają wartość pokarmową pasz i stanowią źródło substancji szkodliwych dla zdrowia zwierząt, można je sklasyfikować na podstawie ich zróżnicowanej budowy oraz w jaki sposób powstały w roślinie. Wyróżnia- my związki przemiany materii pierwotnej, któ- re mają charakter budulcowy, odżywczy, energetyczny oraz zapasowy dla rośliny. Peł- nią podstawowe funkcje biologiczne, nie- zbędne i konieczne do prawidłowego rozwoju organizmu, pozytywnie wpływające na zdrowie ludzi oraz zwierząt. Zaliczamy do nich:

węglowodany, białka, tłuszcze, witaminy, sole mineralne a nawet kwasy nukleinowe. Dru- ga grupa o charakterze antyodżywczym oraz toksycznym to związki wtórne, powstają na skutek złożonych procesów biochemicznych.

Ich obecność nie jest przypadkowa, najczę- ściej związana jest z pełnieniem różnych funkcji biologicznych w roślinie. Te związki, które obecne są w tkankach roślinnych sta- nowią swoisty mechanizm obronny oraz spełniają funkcję podporową. Pomagają ro- ślinom nabyć oraz utrzymać odpowiednią for- mę, kształt i strukturę co pomaga zabezpie- czyć roślinę przed urazami mechanicznymi podczas niesprzyjających warunków pogodo- wych. Rośliny posiadają również drugą grupę substancji antyodżywczych o charakterze trującym. Pozwalają uchronić ją i zabezpie- czyć od ataków grzybów, pleśni, bakterii oraz zwierząt. Wśród tych zróżnicowanych pro- duktów przemiany materii wyróżniamy: feno- le, flawonoidy, kumarynę, saponiny i glukozydy. Do ważnych i szkodliwych substancji

wtórnych należą również pochodne azotu i siarki tj. alkaloidy i związki cyjanogenne.

Działania antyodżywcze mogą jednak wywie- rać także niektóre związki zaliczane do substancji pierwotnych, na przykład pewne wę- glowodany. Zawartość związków antyodżyw- czych w roślinach jest uzależniona od rodzaju, stężenia, a także miejsca (części rośliny) występowania substancji aktywnych. Na ich zawartość w roślinie ma wpływ rodzaj gleby i jej właściwości, klimat, metody uprawy itp.

Substancje te w mniejszym lub większym stopniu działają szkodliwie na organizm zwierzęcy. Spożywane w małych ilościach zazwyczaj nie są szkodliwe. Związki toksyczne wytwarzane przez rośliny mogą być pobierane przez zwierzęta przypadkowo lub pobierane wraz z codzienną dawką pokar- mową co skutkuje ich kumulacją w organizmie. Spożywanie ich nadmiernej ilości przez zwierzęta może być spowodowane źle do- branymi gatunkami roślin w paszy lub jej złym przechowywaniem. Skutkiem może być obniżenie produktywności zwierząt oraz ne- gatywny wpływ na jakość produkowanego surowca. Przykładem może być produkcja mleka. Zwierzęta w okresie wiosenno-letnim przebywają na pastwisku gdzie pobierają

Substancje antyżywieniowe w paszach roślinnych

Karolina Morawska

(13)

świeże rośliny pastwiskowe o dużej różno- rodności gatunkowej, a w sezonie jesienno- zimowym ich dieta zamienia się w spożywa- nie kiszonki i sianokiszonki składowanych w różnych warunkach środowiskowych.

Pomimo negatywnego wpływu substancji antyżywieniowych na organizm ludzki oraz zwierzęcy człowiek wraz z upływem czasu i wzrostem cywilizacji wytworzył mechanizmy i sposoby na wykluczenie ich z codziennej diety. Tam gdzie ich ilości są niewielkie czło- wiek jest w stanie dokonać obróbki roślin tak aby nadawały się do spożycia. Do takich za- biegów należą: zmiana struktury fizycznej, obróbka za pomocą wody, ciśnienia, temperatury. Wszystko to prowadzi do zmiany za- wartości związków antyżywieniowych i powoduje zwiększenie przydatności do spożycia roślin w których substancje antyodżywcze są zawarte. W warunkach domowych uzdatnia- nie produktów spożywczych sprowadza się do takich czynności jak: gotowanie, smaże- nie, pieczenie oraz mechaniczne oddzielanie i usuwanie części roślin, które mają niższą wartość pokarmową bądź wyższą zawartość substancji antyodżywczych (łuszczenie, mie- lenie). W przypadku obróbki przemysłowej produktów spożywczych czy też pasz proce- sy te opierają się na ekstradowaniu i ekspan- dowaniu. Polega to na odpowiednim działa- niu wilgotności, temperatury oraz ciśnienia.

Warto też wspomnieć, że rośliny przez czło- wieka są również selekcjonowane oraz udo- skonalane tak, aby produkty z nich wytwo- rzone były gotowe i zdatne do spożycia przez człowieka i zwierzęta. Minusem takiej ludzkiej ingerencji jest fakt, że rośliny zostają pozbawione swoich naturalnych barier i ochrony. Są słabe, mniej odporne i bardziej narażone na ataki oraz warunki środowisko- we.

Charakterystyka najważniejszych sub- stancji antyodżywczych:

Polisachardydy nieskrobiowe - wchodzą w skład włókna pokarmowego. Za antyżywie- niowe działanie w przewodzie pokarmowym

odpowiedzialne są rozpuszczalne w wodzie frakcje arabinoksylanów zawartych w ziarnie pszenicy i pszenżyta oraz β-glukanów obec- nych w ziarnie jęczmienia. Powodują powsta- wanie w przewodzie pokarmowym roztworów o dużej lepkości, powoduje to zagęszczenie treści pokarmowej co w konsekwencji ograni- cza trawienie i wchłanianie substancji pokar- mowych. U przeżuwaczy podlegają one czę- ściowemu rozkładowi przez mikroorganizmy w żwaczu (bakterie i pierwotniaki). Na ich działanie najbardziej narażone są zwierzęta młode, ponieważ nie mają dostatecznie i w pełni rozwiniętego przewodu pokarmowego. Skutkiem pobierania polisacharydów nie- skrobiowych z paszą jest m.in. obniżenie przyrostów dziennych masy ciała.

Inhibitory proteaz - głównie trypsyny, są substancjami białkowymi, hamują aktywność enzymów wydzielanych przez trzustkę, które odpowiedzialne są za trawienie białek. Efek- tem tego jest niepełne wykorzystywanie ami- nokwasów, co w konsekwencji prowadzi do wolniejszego wzrostu zwierząt. Występują głównie w roślinach strączkowych.

Lektyny – to również substancje białkowe.

Wpływają niekorzystnie na układ krwionośny i pokarmowy (uszkodzenia kosmków jelitowych). Ponadto powodują biegunki i hamują wzrost zwierząt. Ich obecność to głównie ro- śliny strączkowe ( duża ilość w fasoli).

Aminokwasy toksyczne – występują w sta- nie wolnym, nie wchodzą w skład białek. Bu- dowę mają podobną do aminokwasów wy- stępujących w organizmie ludzkim i zwierzę- cym co powoduje, że mogą je wypierać i za- miast nich wchodzić w pewne przemiany w organizmie zwierząt a to skutkować może zaburzeniem procesów fizjologicznych.

Substancje fenolowe – Stanowią liczną i zróżnicowaną grupę, w roślinie reprezento- wane są przez fitoestrogeny, taniny i saponiny. Fitoestrogeny – rośliny wytwarzają je jako produkty metaboliczne oraz w reakcji na nie- korzystne warunki środowiskowe np. atak przez grzyby lub pleśnie . Występują m.in.

(14)

w częściach zielonych koniczyny i lucerny, soi, słoneczniku. Ich nadmierne spożycie wpływa na wskaźniki płodności stada i licz- nych schorzeń związanych z układem roz- rodczym zwłaszcza u samic. Taniny – obni- żają strawność białek i nadają roślinom cha- rakterystyczny cierpki smak przez co pasza staje się mało atrakcyjna dla zwierząt.

W większych ilościach występują w nasionach sorgo, rzepaku, bobu oraz jęczmienia.

Saponiny - w wodnych roztworach mają wła- ściwości emulgujące i pianotwórcze. Po do- staniu się do krwi mogą powodować hemoli- zę krwinek. Znajdują się w lucernie, koniczy- nie, owsie, soi

Fityniany - estry inozytolu z kwasem fos- forowym. Zawarty w nich fosfor nie jest przy- swajalny dla zwierząt jednożołądkowych. Łą- czą się z metalami dwuwartościowymi takimi jak: cynk, miedź, żelazo, magnes przez co czynią je nieprzyswajalne dla organizmu.

Glukozynolany - to glukozydy zawierające siarkę. Występują w roślinach z rodziny krzy- żowych m.in. w rzepaku i kapuście. Same w sobie nie są szkodliwe. Jednak powstałe w wyniku ich trawienia metabolity (goitryna) mają już działanie szkodliwe. Wpływają negatywnie na wątrobę i nerki oraz gospodarkę jodem (blokują wychwytywanie tego pier- wiastka przez tarczycę). Najlepszym prze-

znaczeniem żywieniowym dla śrut i maku- chów rzepakowych są mieszanki paszowe dla bydła i owiec, ponieważ ta grupa zwierząt wykazuje największą tolerancję na obecność glukozynolanów oraz produktów ich degradacji ze względu na wysoką neutralizację toksycznych produktów ich rozpadu w żwaczu.

Glukozydy cyjanogenne - związki te w procesie hydrolizy uwalniają toksyczny cy- janowodór. Są niebezpieczne dla przeżuwa- czy, ponieważ mikroorganizmy zasiedlające żwacz powodują ich szybki rozkład. Wystę- pują przede wszystkim w nasionach roślin strączkowych, trawach i nasionach lnu.

Alkaloidy - organiczne zasady zawierające azot i wywodzące się z aminokwasów. Wy- stępują przede wszystkim w nasionach soi i łubinu, nadając paszy nieprzyjemny, gorzki smak. Ich działanie jest bardzo zróżnicowa- ne. Niektóre z nich są silnie toksyczne a ich skrajnymi szkodliwymi efektami mogą być zaburzenia systemu nerwowego (drgawki mięśni, problemy z oddychaniem, zaburzenia ze strony układu pokarmowego – wymioty, biegunki). Mają również wpływ na smakowi- tość paszy ze względu na gorzki smak. Alka- loidy potrafią się przedostać do mleka zwie- rzęcia przez co również do organizmu czło- wieka.

Wykorzystanie płynów w stanie nadkrytycznym w procesie ekstrakcji

Zuzanna Brinkiewicz

Płyny w stanie nadkrytycznym

O płynie w stanie nadkrytycznym mówimy wtedy, gdy jego temperatura oraz ciśnienie są wyższe niż krytyczne wartości tych para- metrów. Istnieje zatem punkt nazywany punktem krytycznym, po przekroczeniu któ- rego zanika granica między fazą ciekłą, a fa-

zą gazową. W wyniku tego otrzymuje się jed- ną fazę, która wykazuje właściwości pośred- nie gazu i cieczy. Dojściu płynu do punktu nadkrytycznego towarzyszą powolne, stop- niowe zmiany jego właściwości.

Istnieje wiele procesów wykorzystujących płyny nadkrytyczne, z uwagi na zależność

(15)

ich właściwości od parametrów proceso- wych. Są to m. in. ekstrakcja, frakcjonowa- nie.

Właściwości płynów w stanie nadkrytycz- nym

Płyny w stanie nadkrytycznych charaktery- zują się lepkością zbliżoną do lepkości ga- zów, natomiast gęstością zbliżoną do gęsto- ści cieczy. Mają wysoką dyfuzyjność oraz zmienną siłę rozpuszczalności, która związa- na jest z ciśnieniem i temperaturą składnika.

Wraz ze wzrostem temperatury zdolność rozpuszczania płynu rośnie, dlatego zdolność ta może być łatwo kontrolowana. Tabela 1.

przedstawia porównanie współczynników dyfuzji, gęstości oraz lepkości płynów nadkrytycznych, z wartościami dla cieczy oraz ga- zów.

W porównaniu do gazów płyny nadkrytyczne cechują się mniejszą dyfuzyjnością oraz wyższą gęstością. Natomiast jeśli chodzi o fazę ciekłą, to płyny nadkrytyczne mają o kilka rzędów wielkości niższy współczynnik dyfuzyjności, niższą gęstość oraz niższą lep- kość. Dzięki tym właściwościom proces transportu masy zachodzi dużo bardziej efektywnie.

Duży wpływ gęstości na siłę rozpuszczania powoduje, że płyny nadkrytyczne z powodze-

niem są wykorzystywane w procesach eks- trakcyjnych oraz chromatograficznych.

Głównym aspektem, na który zwraca się uwagę przy badaniach płynów nadkrytycznych jest ich mobilność, która jest oceniana bardzo wysoko. Z jednej strony rozpuszczal- ność w płynach nadkrytycznych można po- równywać do rozpuszczalności w fazie cie- kłej, drugiej strony zdolność do penetracji

jest zbliżona do własności transportowych gazów. Dzięki temu proces ekstrakcji przy wykorzystaniu płynów nadkrytycznych jest procesem dużo bardziej efektywnym niż kla- syczna ekstrakcja cieczowa. Jednocześnie istnieje możliwość sterowania parametrami procesu w taki sposób, aby uzyskać określo- ną selektywność. Można więc stwierdzić, że zmiana właściwości fizykochemicznych pły- nów nadkrytycznych może wpływać na kine- tykę oraz dynamikę procesu ekstrakcji.

Zastosowanie płynów w stanie nadkry- tycznym

Do procesu ekstrakcji nadkrytycznej stosuje się rozpuszczalniki, które mają wysoką masę cząsteczkową, wysoką polarność oraz duży zakres temperatur krytycznych. W więk- szości przypadków płyny nadkrytyczne to rozpuszczalniki niepolarne, dzięki czemu le- piej rozpuszczają substancje niepolarne.

Problemem są substancje zjonizowane, tj.

takie, w których obecne są zdysocjowane grupy kwasowe i zasadowe oraz sole mineralne – na ogół są nierozpuszczalne w płynie nadkrytycznym.

Wiele substancji w stanie nadkrytycznym wykazuje dobre właściwości rozpuszczające, jednak ze względu na wysokie ciśnienia i temperatury stanu krytycznego praktyczne zastosowanie w procesie ekstrakcji znalazło tylko kilka z nich. Obecnie najczęściej stoso- wanym płynem nadkrytycznym jest ditlenek węgla. Dzięki swoim specyficznym właści- wościom jest głównym rozpuszczalnikiem w przemyśle spożywczym. Charakteryzuje się małą lepkością, wysoką dyfuzyjnością, dużą lotnością oraz brakiem korozyjności.

Dodatkowo ma stosunkowo niskie parametry krytyczne (304,2 K, 7,38 MPa), jest niepalny i nietoksyczny. Po procesie ekstrakcji jego usuwanie jest proste, a z fizjologicznego punktu widzenia jest nieszkodliwy. Jego zastosowanie pozwala na uzyskanie z surowca wszystkich pożądanych składników dzięki dogłębnej penetracji substratu. To, co ważne z ekonomicznego punktu widzenia to fakt, że Tabela 1. Rząd wielkości współczynników

dyfuzji (D), gęstości (ρ) i lepkości (η) gazów, cieczy i płynów nadkrytycznych

(16)

jest on niedrogi i łatwy do pozyskania, ponie- waż jako składnik występuje w powietrzu.

Jako płyny nadkrytyczne swoje zastosowanie znalazły również inne substancje, któ- re dość łatwo jest wprowadzić w stan nadkry- tyczny. Woda nadkrytyczna wykorzystywana jako medium reakcyjne w procesach upłyn- niania materiałów węglowych i gum kauczu- kowych oraz przy utylizacji toksycznych od- padów i ścieków. W chromatografii nadkrytycznej heksafluorek siarki znalazł zastosowanie jako faza ruchoma podczas analizy alkoholi czy kwasów karboksylowych. Często wykorzystuje się takie media jak: toluen, cy- kloheksan oraz alkohole.

Proces ekstrakcji

Proces ekstrakcji to dyfuzyjny proces wy- miany masy, który polega na przeprowadze- niu danej substancji lub grup związków che- micznych z jednej fazy (ciało stałe lub ciecz), w której jest ona zawieszona lub rozpuszczo- na do drugiej fazy. W ten sposób wyodręb- niamy ją w postaci roztworu od pozostałych składników. Można zatem wyróżnić ekstrak- cję ciała stałego cieczą lub klasyczną eks- trakcję ciecz-ciecz. W obu przypadkach pod- stawą fizykochemiczną procesu jest wystę- powanie różnicy rozpuszczalności substancji wydzielanej i zanieczyszczeń. Gdy mamy do czynienia z cieczą ekstrakcja polega na prze- niesieniu składnika z jednego roztworu do drugiego. W przypadku ciała stałego, proces ekstrakcji polega na rozpuszczeniu wybrane- go składnika w cieczy, a następnie oddziele- niu roztworu od pozostałych nierozpuszczal- nych składników. Wydzielany składnik prze- chodzi z fazy ekstrahowanej do rozpuszczalnika dzięki istnieniu różnicy stężeń. Proces ten zachodzi, aż do momentu osiągnięcia stanu równowagi.

Ekstrakcja nadkrytyczna (SFE) jest szcze- gólnym rodzajem procesu ekstrakcji. W tym przypadku rozpuszczalnikiem jest płyn w stanie nadkrytycznym (znajdujący się powyżej temperatury i ciśnienia krytycznego), który

posiada bardzo dobre własności penetracyj- ne i transportowe.

Wady, zalety, zastosowania

Proces ekstrakcji nadkrytycznej posiada wiele zalet:

 może być stosowany do związków wrażli- wych na wysoką temperaturę,

 charakteryzuje się wysoką selektywno- ścią,

 brak pozostawiania śladów, dzięki łatwe- mu usuwaniu ekstrahenta,

 niski koszt ditlenku węgla oraz jego do- stępność,

 istnieje możliwość bezpośredniej analizy ekstraktu (np. wykorzystując proces chromatografii gazowej),

 można łatwo łączyć z innymi technikami (np. chromatografią).

W zależności od ciśnienia oraz temperatury można w prosty i skuteczny sposób regu- lować rozpuszczalność poszczególnych składników co świadczy o wysokiej selektyw- ności procesu. Ekstrakcję nadkrytyczną moż- na prowadzić w niskiej temperaturze, dzięki czemu istnieje możliwość stosowania jej do związków wrażliwych na wysoką temperatu- rę, ponieważ nie dochodzi do degeneracji pozyskiwanych składników. Do zalet zalicza się również wykorzystywanie nietoksycznych rozpuszczalników co skutkuje całkowitą czy- stością chemiczną substancji. Istotną kwe- stią, która wpływa na efektywność procesu jest możliwość całkowitego wydzielenia rozpuszczalnika z ekstraktu. Dodatkowo, podczas wydzielania wyekstrahowanych substancji istnieje możliwość ich frakcjonowania.

Substancje nie są zagrożone utlenieniem, ponieważ ekstrakcja przebiega bez dostępu powietrza (otrzymany produkt nie ma szans ulegać jakimkolwiek przemianom oksydacyj- nym). Mamy do czynienia z wysoką penetra- cją rozpuszczalnika w głąb struktury surowca, co przekłada się na wysoką selektywność procesu. Dodatkową zaletą jest możliwość prowadzenia procesu z zastosowaniem re- cyrkulacji, co wpływa na obniżenie kosztów.

(17)

Zmiany w prawodawstwie żywnościowym Małgorzata Krzepkowska

Proces ekstrakcji posiada też pewne wady:

 Wysokie nakłady energetyczne związane ze sprężaniem rozpuszczalnika.

 Ograniczone rozpowszechnienie aparatury, ze względu na konieczność zastosowania wysokociśnieniowej aparatury (wysokie koszty).

Zastosowania:

Proces ekstrakcji nadkrytycznej w dużym stopniu wykorzystywany jest do oznaczeń zanieczyszczeń środowiska. Inne dziedziny wykorzystujące tą technikę to przemysł oraz analiza żywności.

W przemyśle spożywczym ekstrakcja pły- nami nadkrytycznymi jest wykorzystywana m.in. do ekstrakcji chmielu, redukcji zawarto- ści alkoholu czy dekofeinacji kawy. Prowa- dzone są również liczne badania nad innymi zastosowaniami tego procesu tj. ekstrakcja naturalnych barwników (β-karoten, astaksan- tan), usuwanie tłuszczu zwierzęcego np.

z mleka, ekstrakcja aromatów i smaków (owoce cytrusowe) czy deodoryzacja tłusz- czu i oleju. Istnieje też wiele zastosowań SFE w przetwórstwie żywności. Niektóre z nich przedstawia poniższa tabela.

Ważnym aspektem jest wydajność prowa- dzonego procesu. W przypadku olejów ro- ślinnych inne techniki pozwalają uzyskać za- ledwie 60-80% całkowitej zawartości substancji w materiale. Ekstrakcja nadkrytyczna z użyciem ditlenku węgla pozwala osiągać wydajność aż na poziomie 95%!

Tabela 2. Przykłady zastosowania ekstrakcji nadkrytycznej w przemyśle spożywczym

Proces Surowce Patenty

Dekofeinacja Kawa, herbata Niemcy, USA Deodoryzacja Olej roślinny, tłuszcz

zwierzęcy, olej drożdży browarniczych

Niemcy, USA, Austria Frakcjonowanie Olej z wątroby dorszów, mieszaniny glicerydów Holandia

Oczyszczanie

olejów Usuwanie kwasów

tłuszczowych Niemcy, USA Odzyskiwanie

aromatu Przyprawy, chmiel, tytoń, kawa

USA, Kanada, Niemcy, Francja,

Wielka Brytania Odzyskiwanie

olejów Soja, rzepak, kakao,

cytryna, słonecznik Niemcy, Austria Odzyskiwanie

barwników Warzywa Niemcy

Usuwanie

białek, cukrów Substancje organiczne Patent WO 95/01221, 1994 Usuwanie

nikotyny Tytoń Niemcy, USA

Zmiany w prawodawstwie żywnościowym Znakowanie

Sprostowanie do rozporządzenia Parlamen- tu Europejskiego i Rady (UE) nr 1169/2011 z dnia 25 października 2011 r. w sprawie przekazywania konsumen- tom informacji na temat żywności, zmiany rozporządzeń Parlamentu Europej-

skiego i Rady (WE) nr 1924/2006 i (WE) nr 1925/2006 oraz uchylenia dyrektywy Komisji 87/250/EWG, dyrektywy Rady 90/496/EWG, dyrektywy Komisji 1999/10/WE, dyrektywy 2000/13/WE Parlamentu Europejskiego i Rady, dyrek- tyw Komisji 2002/67/WE i 2008/5/WE oraz rozporządzenia Komisji (WE) nr 608/2004

(18)

Substancje dodatkowe

Sprostowanie do rozporządzenia Komisji (UE) 2021/1156 z dnia 13 lipca 2021 r.

zmieniającego załącznik II do rozporzą- dzenia Parlamentu Europejskiego i Rady (WE) nr 1333/2008 oraz załącznik do rozporządzenia Komisji (UE) nr 231/2012 w odniesieniu do glikozydów stewiolowych (E 960) i rebaudiozydu M wytwa- rzanych w drodze enzymatycznej modyfi- kacji glikozydów stewiolowych ze stewii Aromaty

Rozporządzenie Komisji (UE) 2021/1532 z dnia 17 września 2021 r. zmieniające załącznik I do rozporządzenia Parlamen- tu Europejskiego i Rady (WE) nr 1334/2008 w odniesieniu do włączenia 3- (1-((3,5-dimetyloizoksazol-4-ilo)metylo)- 1H-pirazol-4-ilo)-1-(3-hydroksybenzylo) imidazolidino-2,4-dionu do unijnego wy- kazu substancji aromatycznych1532 Rozporządzenie Komisji (UE) 2021/1916 z

dnia 3 listopada 2021 r. zmieniające za- łącznik I do rozporządzenia Parlamentu Europejskiego i Rady (WE) nr 1334/2008 w odniesieniu do włączenia kwasu 4- amino-5-(3-(izopropyloamino)-2,2-

dimetylo-3-oksopropoksy)-2-

metylochinolino-3-karboksylowego do unijnego wykazu środków aromatyzują- cych

Rozporządzenie Komisji (UE) 2021/1917 z dnia 3 listopada 2021 r. zmieniające za- łącznik I do rozporządzenia Parlamentu Europejskiego i Rady (WE) nr 1334/2008 w odniesieniu do włączenia 2-(4- metylofenoksy)-N-(1H-pirazol-3-ilo)-N- (tiofen-2-ylometylo)acetamidu do unijne- go wykazu środków aromatyzujących Miary

Obwieszczenie Marszałka Sejmu Rzeczypo- spolitej Polskiej z dnia 14 października 2021 r. w sprawie ogłoszenia jednolitego

tekstu ustawy - Prawo o miarach (Dz.U.2021.2068)

Pochodzenie towarów

Rozporządzenie delegowane Komisji (UE) 2021/1934 z dnia 30 lipca 2021 r. zmie- niające rozporządzenie delegowane (UE) 2015/2446 w odniesieniu do niektórych przepisów dotyczących pochodzenia to- warów

Mięso na użytek własny

Obwieszczenie Ministra Rolnictwa i Rozwoju Wsi z dnia 18 października 2021 r.

w sprawie ogłoszenia jednolitego tekstu rozporządzenia Ministra Rolnictwa i Roz- woju Wsi w sprawie wymagań weteryna- ryjnych przy produkcji mięsa przeznaczo- nego na użytek własny (Dz.U.2021.2059) Zboża

Decyzja Rady (UE) 2021/1787 z dnia 5 paź- dziernika 2021 r. w sprawie stanowiska, jakie ma być przyjęte w imieniu Unii Eu- ropejskiej w ramach Międzynarodowej Rady Zbożowej w odniesieniu do zmiany definicji terminu „zboże” lub „zboża”

w Konwencji o handlu zbożem z 1995 r.

Owoce, warzywa

Rozporządzenie delegowane Komisji (UE) 2021/1890 z dnia 2 sierpnia 2021 r.

zmieniające rozporządzenie wykonawcze (UE) nr 543/2011 w zakresie norm handlowych w sektorze owoców i wa- rzyw

Rozporządzenie wykonawcze Komisji (UE) 2021/1926 z dnia 5 listopada 2021 r. za- twierdzające kontrole zgodności z nor- mami handlowymi w odniesieniu do owo- ców i warzyw przeprowadzane przez Zjednoczone Królestwo oraz zmieniające rozporządzenie wykonawcze (UE) nr 543/2011 ustanawiające szczegółowe zasady stosowania rozporządzenia Rady

(19)

(WE) nr 1234/2007 w odniesieniu do sektora owoców i warzyw oraz sektora prze- tworzonych owoców i warzyw

Pomidory

Rozporządzenie wykonawcze Komisji (UE) 2021/1809 z dnia 13 października 2021 r.

zmieniające rozporządzenie wykonawcze (UE) 2020/1191 ustanawiające środki w celu zapobiegania wprowadzaniu do Unii i rozprzestrzenianiu się w niej wirusa brunatnej wyboistości owoców pomidora (ToBRFV)

Napoje spirytusowe

Rozporządzenie delegowane Komisji (UE) 2021/1465 z dnia 6 lipca 2021 r. zmienia- jące rozporządzenie Parlamentu Europej- skiego i Rady (UE) 2019/787 w zakresie definicji odniesień do nazw prawnych na- pojów spirytusowych lub oznaczeń geograficznych napojów spirytusowych i ich stosowania w opisie, prezentacji i etykietowaniu napojów spirytusowych innych niż te, których przedmiotowe odniesienia dotyczą

Sprostowanie do rozporządzenia Parlamentu Europejskiego i Rady (UE) 2019/787 z dnia 17 kwietnia 2019 r. w sprawie definicji, opisu, prezentacji i etykietowania napojów spirytusowych, stosowania nazw napojów spirytusowych w prezentacji i etykietowaniu innych środków spożyw- czych, ochrony oznaczeń geograficznych napojów spirytusowych, wykorzystywania alkoholu etylowego i destylatów pochodzenia rolniczego w napojach alkoholo- wych, a także uchylającego rozporządze- nie (WE) nr 110/2008

Oznaczenia geograficzne napojów spirytu- sowych

Rozporządzenia wykonawcze Komisji reje- strujące oznaczenie geograficzne napoju spi- rytusowego na podstawie art. 30 ust. 2 rozpo- rządzenia Parlamentu Europejskiego i Rady

(UE) 2019/787:

„Madarasi birspálinka” - Rozporządzenie wy- konawcze Komisji (UE) 2021/1687 Wino

zmieniające rozporządzenie wykonawcze (UE) 2020/600 w odniesieniu do od- stępstw od rozporządzenia wykonawczego (UE) 2016/1150 w celu przeciwdziała- nia kryzysowi spowodowanemu pande- mią COVID-19 w sektorze wina

w sprawie sprostowania rozporządzenia wykonawczego (UE) 2020/600 w odniesieniu do odstępstwa od rozporządzenia wykonawczego (UE) 2016/1150 odnoszą- cego się do zmian w krajowych programach wsparcia w sektorze wina

w sprawie sprostowania rozporządzenia wykonawczego (UE) 2021/78 w odniesieniu do odstępstwa od rozporządzenia wykonawczego (UE) 2016/1150, wprowa- dzonego rozporządzeniem wykonawczym (UE) 2020/600, odnoszącego się do zmian w krajowych programach wsparcia w sektorze wina

Rozporządzenie delegowane Komisji (UE) 2021/2026 z dnia 13 września 2021 r.

zmieniające rozporządzenie delegowane (UE) 2020/592 w odniesieniu do pewnych tymczasowych odstępstw od rozporzą- dzenia Parlamentu Europejskiego i Rady (UE) nr 1308/2013 w celu przeciwdziała- niu zakłóceniom na rynku w sektorze wina spowodowanym pandemią COVID-19 i okresu stosowania tych odstępstw

Rozporządzenie delegowane Komisji (UE) 2021/2027 z dnia 13 września 2021 r.

zmieniające rozporządzenie delegowane

(20)

(UE) 2020/884 w odniesieniu do od- stępstw od rozporządzenia delegowane- go (UE) 2016/1149 w celu przeciwdziała- nia kryzysowi spowodowanemu pande- mią COVID-19 w sektorze wina, oraz zmieniające rozporządzenie delegowane (UE) 2016/1149

Rozporządzenie Parlamentu Europejskiego i Rady (UE) 2021/2117 z dnia 2 grudnia 2021 r. zmieniające rozporządzenia (UE) nr 1308/2013 ustanawiające wspólną or- ganizację rynków produktów rolnych, (UE) nr 1151/2012 w sprawie systemów jakości produktów rolnych i środków spo- żywczych, (UE) nr 251/2014 w sprawie definicji, opisu, prezentacji, etykietowania i ochrony oznaczeń geograficznych aro- matyzowanych produktów sektora wina i (UE) nr 228/2013 ustanawiające szcze- gólne środki w dziedzinie rolnictwa na rzecz regionów najbardziej oddalonych w Unii Europejskiej

Oliwa z oliwek

Decyzja Rady (UE) 2021/2025 z dnia 15 listopada 2021 r. w sprawie stanowiska, jakie ma być zajęte w imieniu Unii Europejskiej w ramach Rady Członków Międzynarodo- wej Rady ds. Oliwy z Oliwek w odniesieniu do normy handlowej mającej zastosowanie do oliwy z oliwek i oliwy z wytło- czyn z oliwek

Suplementy diety

Rozporządzenie Ministra Zdrowia z dnia 18 listopada 2021 r. zmieniające rozporzą- dzenie w sprawie składu oraz oznakowa- nia suplementów diety (Dz.U.2021.2236) GMO

Rozporządzenie Ministra Klimatu i Środowi- ska z dnia 19 października 2021 r. w sprawie wzoru wniosku o wydanie zezwolenia na zamierzone uwolnienie organizmu genetycznie zmodyfikowanego do środowiska (Dz.U.2021.2035)

Rozporządzenie Ministra Klimatu i Środowi- ska z dnia 10 listopada 2021 r. w sprawie sposobu przeprowadzania oceny zagro- żenia dla zdrowia ludzi i dla środowiska w przypadku zamierzonego uwolnienia GMO do środowiska lub wprowadzenia do obrotu (Dz.U.2021.2102)

Decyzja wykonawcza Komisji (UE) 2021/1999 z dnia 15 listopada 2021 r. r.

zmieniająca decyzję wykonawczą (UE) 2016/1215 w odniesieniu do posiadacza zezwolenia na wprowadzanie do obrotu produktów zawierających genetycznie zmodyfikowaną soję FG72, składających się z niej lub z niej wyprodukowanych oraz jego przedstawiciela w Unii

Rozporządzenie Ministra Klimatu i Środowi- ska z dnia 24 listopada 2021 r. zmieniają- ce rozporządzenie w sprawie wzoru wniosku o wydanie zezwolenia na wprowadzenie do obrotu produktu GMO (Dz.U.2021.2239)

Nowe składniki żywności / novel food Zezwolenie na wprowadzenie na rynek ja- ko nowej żywności zgodnie z rozporządze- niem Parlamentu Europejskiego i Rady (UE) 2015/2283 oraz zmieniające rozporządzenie wykonawcze Komisji (UE) 2017/2470

suszonych owoców Synsepalum dulcificum - Rozporządzenie wykonawcze Komisji (UE) 2021/1974

mrożonej, suszonej i sproszkowanej postaci szarańczy wędrownej (Locusta migrato- ria) - Rozporządzenie wykonawcze Ko- misji (UE) 2021/1975

3-fukozylolaktozy (3-FL) - Rozporządzenie wykonawcze Komisji (UE) 2021/2029 proszku z pieczarek z witaminą D2 - Rozpo-

rządzenie wykonawcze Komisji (UE) 2021/2079

fruktoboranu wapnia - Rozporządzenie wyko-

(21)

nawcze Komisji (UE) 2021/2129 Produkty ekologiczne

Rozporządzenie delegowane Komisji (UE) 2021/1691 z dnia 12 lipca 2021 r. zmie- niające załącznik II do rozporządzenia Parlamentu Europejskiego i Rady (UE) 2018/848 w odniesieniu do wymogów do- tyczących zachowania dokumentacji przez podmioty prowadzące produkcję ekologiczną

Rozporządzenie delegowane Komisji (UE) 2021/1697 z dnia 13 lipca 2021 r. zmie- niające rozporządzenie Parlamentu Euro- pejskiego i Rady (UE) 2018/848 w odniesieniu do kryteriów uznania organów kontrolnych i jednostek certyfikujących wła- ściwych do przeprowadzania kontroli pro- duktów ekologicznych w państwach trze- cich oraz kryteriów cofnięcia uznania tych organów i jednostek certyfikujących

Rozporządzenie delegowane Komisji (UE) 2021/1698 z dnia 13 lipca 2021 r. uzupeł- niające rozporządzenie Parlamentu Euro- pejskiego i Rady (UE) 2018/848 o wymo- gi proceduralne dotyczące uznawania or- ganów kontrolnych i jednostek certyfikują- cych właściwych do przeprowadzania kontroli podmiotów i grup podmiotów cer- tyfikowanych jako ekologiczne oraz pro- duktów ekologicznych w państwach trze- cich, a także o zasady nadzoru nad nimi i ich kontroli oraz innych działań, które mają być prowadzone przez te organy kontrolne i jednostki certyfikujące

Rozporządzenie wykonawcze Komisji (UE) 2021/1921 z dnia 4 listopada 2021 r.

w sprawie sprostowania chorwackiej wersji językowej rozporządzenia wykonawczego (UE) 2020/464 ustanawiającego szczegółowe zasady dotyczące stosowania rozporządzenia Parlamentu Europej- skiego i Rady (UE) 2018/848, w odniesieniu do dokumentów niezbędnych w celu uznania z mocą wsteczną okresów do celów konwersji, produkcji produktów

ekologicznych oraz informacji, które mają być dostarczane przez państwa człon- kowskie

Rozporządzenie wykonawcze Komisji (UE) 2021/1935 z dnia 8 listopada 2021 r.

zmieniające rozporządzenie wykonawcze (UE) 2019/723 w odniesieniu do informacji i danych dotyczących produkcji ekolo- gicznej oraz znakowania produktów ekologicznych przekazywanych za pomocą wzoru formularza

Odpady

Decyzja wykonawcza Komisji (UE) 2021/1752 z dnia 1 października 2021 r.

ustanawiająca zasady stosowania dyrektywy Parlamentu Europejskiego i Rady (UE) 2019/904 w odniesieniu do oblicza- nia, weryfikacji i zgłaszania danych doty- czących selektywnej zbiórki odpadów bę- dących jednorazowymi butelkami na na- poje z tworzyw sztucznych

Ustawa z dnia 17 listopada 2021 r. o zmianie ustawy o odpadach oraz niektórych innych ustaw (Dz.U.2021.2151)

Rozporządzenie Ministra Klimatu i Środowi- ska z dnia 26 listopada 2021 r. w sprawie unieszkodliwiania oraz magazynowania odpadów medycznych i odpadów wetery- naryjnych (Dz.U.2021.2245)

Produkty uboczne pochodzenia zwierzęce- go

Rozporządzenie Komisji (UE) 2021/1891 z dnia 26 października 2021 r. zmieniają- ce załączniki XIV i XV do rozporządzenia (UE) nr 142/2011 w odniesieniu do przy- wozu do Unii i tranzytu przez jej teryto- rium produktów ubocznych pochodzenia zwierzęcego i produktów pochodnych Rozporządzenie Komisji (UE) 2021/1973

z dnia 12 listopada 2021 r. w sprawie sprostowania niemieckiej wersji językowej rozporządzenia (UE) nr 142/2011 w spra-