Absorpcja światła i jej opis ilościowy

W celu dokładnego opisu procesu absorpcji, odwołując się do korpuskularnej natury światła wykorzystanej przez Einsteina do wyjaśnienia zjawiska fotoelektrycznego ze-wnętrznego, oddziaływanie światła z materią rozpatrywać będziemy jako oddziaływanie fotonów z pojedynczymi atomami tworzącymi ośrodek. W tym ujęciu światło należy traktować jako strumień fotonów, czyli cząstek o zerowej masie niosących kwant ener-gii promieniowania świetlnego. Energia pojedynczego fotonu jest bezpośrednio związa-na z częstotliwością drgań promieniowania elektromagnetycznego i może być opisazwiąza-na następująca zależnością:

λ

ν h^c

h

E= = , (131)

gdzie h jest stałą Plancka (h = 6,6260693 10–34 Js), a ν częstotliwością promieniowania.

Zgodnie z zasadami mechaniki kwantowej obiekty materialne możemy traktować jako zbiór atomów o określonej strukturze elektronowej, która odpowiada za ich oddziaływanie ze światłem. W warunkach stacjonarnych każdy atom posiada tylko

pewne określone wartości energii, które mogą przyjmować związane elektrony. Elektrony te posiadają ujemne wartości energii, które są znacznie mniejsze niż war-tość energii elektronów swobodnych o dodatniej energii. Widzimy zatem, iż aby elektron związany stał się elektronem swobodnym musimy dostarczyć mu dodatko-wej energii.

Absorpcja energii świetlnej prowadzi do wzbudzenia atomów do wyższego stanu energetycznego, co zachodzi po spełnieniu tzw. warunku rezonansu, czyli możliwa jest jedynie absorpcja fotonów o energii dopasowanej do różnicy energii pomiędzy stanem podstawowym a wzbudzonym atomu. W wyniku wzbudzenia dojść może do różnych reakcji, np. do wytworzenia ciepła, zainicjowania reakcji fotochemicznych czy też luminescencji. Wzbudzenie atomów ośrodka możemy uzyskać na drodze che-micznej, elektrycznej, mechanicznej lub za pomocą promieniowania tycznego. Substancje posiadające zdolność absorpcji promieniowania elektromagne-tycznego nazywamy chromoforami. W przypadku tkanek do głównych absorberów zaliczyć można min. oksyhemoglobinę (O2Hb), dezoksyhemoglobinę (Hb), wodę oraz melaninę, białka zawarte w kolagenie i elastynie, DNA oraz kwasy tłuszczowe [11].

Zdolność różnych obiektów fizycznych do absorpcji promieniowania elektroma-gnetycznego zależy od wielu czynników, głównie od struktury atomowej danego ośrodka, grubości warstwy absorbującej, długości fali, temperatury czy stężenia. W różnych ośrodkach obserwuje się pewne charakterystyczne dla nich cechy absorp-cji. Gazy jednoatomowe absorbują promieniowanie bardzo selektywnie, dla ściśle określonych długości fal. Przy absorpcji przez cząstki występują zazwyczaj pasma absorpcji, czyli zespoły wielu bliskich linii widmowych będące rezultatem wzajemne-go nakładania się wzbudzeń stanów elektronowych, oscylacyjnych i rotacyjnych czą-stek. W cieczach i ciałach stałych dyskretna struktura pasm absorpcyjnych najczęściej nie jest obserwowana.

Wielkości fizyczne, które opisują ilościowo zjawiska absorpcji i transmisji nazwa-no absorbancją (osłabieniem) i transmitancją ( pochłanianiem, współczynnikiem transmisji) [10].

TransmitancjaT, podobnie, jak już to było omawiane wcześniej, oznacza stosunek

natężenia Iwyj. wiązki promieniowania przepuszczonego przez próbkę do natężenia I0

wiązki padającej: 0 . I I T = ^wyj lub 100 0 . [%]= × I I T ^wyj . (132)

Wielkość ta będzie miała wartość maksymalną T = 1 (T_[%] = 100%), gdy światło bę-dzie przechodzić przez próbkę niepochłaniającą światła, podczas gdy osiągnie wartość minimalną T = 0, gdy światło zostanie całkowicie pochłonięte przez badaną próbkę.

Transmitancja nie jest funkcją pozwalającą na określenie prostoliniowej zależności stężenia substancji pochłaniającej światło. Umożliwia to jednak inna wielkość opisu-jąca pochłaniane światła – absorbancja.

Absorbancja A to logarytm dziesiętny odwrotności transmitancji: [%] 100 log 1 log T T A= = . (133)

Wielkość tą, określającą w sposób ilościowy zjawisko absorpcji światła, często okre-śla się również mianem ekstynkcji. Obie powyższe wielkości są bezwymiarowe.

Zjawisko absorpcji jest fundamentem współczesnych technik spektroskopii optycznej, która jest metodą badawczą służącą do określenia składu oraz stężenia roz-cieńczonych związków chemicznych. Ogólnie rzecz biorąc, zgodnie z prawem Beera, absorbancja, czyli pochłanianie światła przez roztwór jest proporcjonalne do stężenia znajdujących się w nim chromoforów.

Do opisu absorpcji w najprostszym przypadku, gdy występuje duże rozcieńczenie i małe natężenie światła, stosuje się prawo Lamberta–Beera. Prawo to odnosi się do substancji absorbujących rozmieszczonych w nieabsorbującym ośrodku.

Absorbancja A wiązki świetlnej przechodzącej przez dany ośrodek jest wówczas

proporcjonalna do stężenia cm znajdujących się tam absorberów oraz drogi optycznej d

przebytej przez fale świetlne w tym ośrodku:

c d a I I A= ^wyj = ⋅ ⋅ 0 . 10 log , (134)

gdzie I0 jest natężeniem światła padającego, Iwyj. to natężenie światła po przejściu przez ośrodek, a jest współczynnikiem właściwym absorpcji, c oznacza stężenie

sub-stancji absorbujących, natomiast d jest odległością pomiędzy punktami wejścia i

wyj-ścia światła w ośrodku. Widzimy zatem, iż dla jednostkowej wartości stężenia sub-stancji absorbującej oraz drogi optycznej przebytej przez światło w badanej próbce absorbancja jest wprost proporcjonalna do współczynnika absorpcji właściwej A = a.

Współczynnik właściwy absorpcji a można określić jako stosunek absorbancji do grubości warstwy absorbującej d wyrażonej w centymetrach i stężenia substancji

ab-sorbującej c wyrażonego w gramach/litr. W konsekwencji współczynnik a jest

wyra-żony w następujących jednostkach: l cm–1g–1.

Jeżeli znane jest stężenie molowe cm (mol/l) substancji absorbującej, wówczas można wyrazić absorbancję A poprzez stężenie molowe:

m wyj d c I I A= =ε⋅ ⋅ 0 . ln , (135)

Współczynnik molowy absorpcjiε to współczynnik zdefiniowany jako

współczyn-nik absorpcji (właściwej) a, ale stężenie substancji absorbującej cm wyrażone jest

w molach/litr, więc w konsekwencji jednostką jest l cm–1 mol–1. Współczynnik molo-wy absorpcji ε, zależy od temperatury, jest wielkością charakterystyczną danej sub-stancji i jest funkcją długości fali. Również w tym przypadku dla jednostkowego

stę-żenia cm oraz drogi optycznej d, absorbancja jest wprost proporcjonalna do molowego

współczynnika absorpcji A = ε.

W praktyce laboratoryjnej często spotykamy się z koniecznością określenia właściwości absorpcyjnych substancji będący mieszaniną różnego rodzaju chromoforów -absorberów. Aby określić absorbancję wieloskładnikowej mieszaniny substancji po-chłaniających światło należy zastosować tzw. prawo addytywności absorpcji, które mówi, iż absorbancja roztworu, w którym znajdują się różne stężenia c1, c2, c3 ... chromoforów, należy dodać absorbancje wszystkich składników tej mieszaniny:

(

ac a c

)

d

(

c c

)

d

A A

A_W = ₁+ ₂+...= _{1 1}+ _{2 2}+... = ε_{1 1[mol/l]}+ε_{2 2[mol/l]}+... . (136) Jeżeli przez dany obiekt np. płytkę płasko-równoległą (lub kuwetę) o grubości d,

wykonaną z materiału o współczynniku absorpcji μ_a i pochłaniającą światło,

przepu-ścimy wiązkę światła o natężeniu I0, wówczas możliwy będzie pomiar natężenia światła I_wyj. po przejściu przez ten obiekt za pomocą detektora (detektor promieniowa-nia zlokalizowany bezpośrednio za płytką w odległości z = d (patrz rys. 3.22).

Praw-dziwa zatem będzie zależność:

d I I a wyj =−μ ⋅ 0 . ln .

Równanie opisujące prawo Bouguera bezpośrednio wynika z zależności opisującej natężenie wiązki świetlnej, która przebyła drogę d w ośrodku o liniowym

współczyn-niku absorpcji μ_a:

d wyj I e ^a

I _.= ₀ ^−μ . (137)

Parametr μa oznacza liniowy współczynnik absorpcji wyrażony w cm-1. Opisuje on straty natężenia światła na jednostkowej drodze na skutek absorpcji. Współczynnik ten można również zdefiniować jako odwrotność grubości warstwy absorbującej, po przebyciu której natężenie światła zmaleje e-krotnie.

(a) (b)

Rys. 3.22. Schemat ilościowego pomiaru absorpcji światła: (a) pomiar koncepcyjny, (b) praktyczna realizacja (opis w treści)

Należy pamiętać jednak, że absorpcja promieniowania przez dane ciało ma cha-rakter ściśle selektywny tzn. ma miejsce dla określonych długości fali promieniowa-nia, co ma związek z warunkiem rezonansu, zatem współczynnik absorpcji charakte-ryzujący związki chemiczne jest wielkością dyspersyjną μ_a = f (λ). Jeżeli stężenie mierzonej substancji jest równomierne w całej próbce, to współczynnik ten można zdefiniować jako iloczyn stężenia c [mol/l] i charakterystycznego dla danej substancji

molowego współczynnika absorpcji ε [l mol–1cm–1].

Wielkość 1/μa nazywa się średnią drogą swobodną δ_a przebytą przez foton przed aktem absorpcji i można dzięki niej wyznaczyć głębokość wnikania promieniowania świetlnego do ośrodka. Średnia droga swobodna przebyta przed aktem absorpcji jest to odległość przebyta przez foton w warstwie badanej substancji, po przejściu której natężenie światła zmniejszy się e razy. Dla przykładu w oknie optycznym 600–900 nm

dla tkanek pozbawionych melaniny wynosi ona od 3 do 6 mm.W przypadku światła ultrafioletowego głębokość penetracji wynosi około 0,5 do 1,5 mm, a w zakresie zie-leni i żółci około 1 do 3 mm.

Na efektywność absorpcji światła najistotniejszy wpływ ma grubość poszcze-gólnych warstw badanego ośrodka oraz występowanie w nim substancji absorbu-jących. W przypadku tkanek in vivo bierze się również pod uwagę gęstość sieci

naczyń krwionośnych oraz wielkość przepływu krwi, zawartość wody oraz obec-ność barwników w strukturach tkankowych. W mikroskali, na zdolobec-ność absorpcji światła w układach najistotniejszy wpływ mają: aminokwasy, kwasy nukleinowe, melanina, hemoglobina, bilirubina, związki sterydowe, rodopsyna i inne fotoak-ceptory. Większość z nich skutecznie pochłania promieniowanie ultrafioletowe, pozostałe zaś promieniowanie widzialne (hemoglobina, melanina, rodopsyna, cy-tochromy), a niektóre podczerwone. Również organizmy roślinne i bakteryjne zawierają chromofory. Szczególnie bogate w substancje absorbujące są organizmy fotosyntezujące.

Substancje posiadające zdolność absorpcji promieniowania elektromagnetyczne-go nazywamy chromoforami.

Zjawisko absorpcji światła w sposób ilościowo opisać można za pomocą okre-ślenia transmitancji oraz absorbancji.

Współczynnik właściwy absorpcji a można określić jako stosunek absorbancji do grubości warstwy absorbującej d, wyrażonej w centymetrach i stężenia substancji

absorbującej c, wyrażonego w gramach/ litr. W konsekwencji współczynnik a jest

wyrażony w następujących jednostkach l cm^–1g^–1.

Współczynnik molowy absorpcji ε to współczynnik zdefiniowany jak

absorbu-jącej cm wyrażone jest w molach/litr, więc w konsekwencji jego jednostką jest l cm–1 mol–1.

Liniowy współczynnik absorpcji wyrażony w cm–1. Opisuje on straty natężenia światła na jednostkowej drodze na skutek absorpcji. Współczynnik ten można również zdefiniować jako odwrotność grubości warstwy absorbującej, po prze-byciu której natężenie światła zmaleje e-krotnie. Jeżeli stężenie mierzonej

sub-stancji jest równomierne w całej próbce, to współczynnik ten można zdefiniować jako iloczyn stężenia c[mol/l] i charakterystycznego dla danej substancji

molo-wego współczynnika absorpcji ε [l mol–1cm–1].

W zależności od tego czy stężenie substancji absorbującej jest wyrażone w g/l lub też mol/l, we wzorach opisujących absorbancję stosuje się odpowiednio właści-wy współczynnik absorpcji lub molowłaści-wy współczynnik absorpcji.

3.5.2. Luminescencja

Absorpcja energii świetlnej przez dany ośrodek prowadzić może do wzbudzenia atomów do wyższego stanu energetycznego, czego konsekwencją mogą być efekty termiczne, fotochemiczne, bądź też w niektórych przypadkach luminescencja. Zgodnie z definicją Wawiłowa: „luminescencja jest emisją promieniowania elektromagnetycz-nego o natężeniu większym od natężenia promieniowania cieplelektromagnetycz-nego w danej tempera-turze i czasie trwania dłuższym od okresu emitowanej fali świetlnej” [11, 12]. Może

się zatem zdarzyć, że pod wpływem zaabsorbowanego promieniowania dojdzie do emisji kwantu promieniowania elektromagnetycznego przy przechodzeniu elektronu ze stanu wzbudzonego do stanu o niższej energii.

Przejścia energetyczne w cząstce po zaabsorbowaniu energii świetlnej mogą być zo-brazowane za pomocą diagramu Jabłońskiego1 (patrz rys. 3.23). Struktura energetycz-na cząsteczki jest opisaenergetycz-na przez jej konfigurację elektronową, która oprócz podstawo-wego stanu singletopodstawo-wego S₀ scharakteryzowana jest również zwykle przez kilka wyższych energetycznie stanów singletowych S1 o antyrównolegle ustawionych spi-nach elektronów na powłoce oraz stany trypletowe o równolegle ustawionych spispi-nach elektronów. Przejścia pomiędzy stanami singletowymi i trypletowymi są mało praw-dopodobne.

Każda cząstka w ramach określonej konfiguracji elektronowej może posiadać różne stany oscylacyjne, które wynikają z drgań atomów w tej cząstce. Atom, któ-__________

1 Aleksander Jabłoński (1898–1980) – polski fizyk, profesor Uniwersytetu Mikołaja Kopernika w To-runiu, opisał zjawisko luminescencji w oparciu o graficzne diagramy, które obecnie są powszechnie wykorzystywane w nauce do opisu tego procesu.

ry zaabsorbował foton rezonansowy, czyli o energii dopasowanej do różnicy ener-getycznej pomiędzy stanem podstawowym S₀ a dowolnym stanem oscylacyjnym elektronowego stanu wzbudzenia S1, ulega wzbudzeniu czyli ekscytacji. W przy-padku form pierścieniowych cząsteczek organicznych (np. jak porfiryny) energia wzbudzenia ze stanu podstawowego (S0) do pierwszego wzbudzonego stanu sin-gletowego (S₁) odpowiada długościom fal z zakresu ultrafioletu i światła widzial-nego (300–800 nm).

Po czasie relaksacji ciało traci część uzyskanego nadmiaru energii podczas prze-chodzenia do najniższego stanu oscylacyjnego należącego do danego poziomu elek-tronowego. Następnie, w sposób bezpromienisty molekuła może przejść na najniżej położony stan wzbudzenia S1.

Gdy zostanie wyemitowany foton o energii hν = ES1 – ES0, to elektron powraca na jeden z poziomów oscylacyjnych stanu podstawowego. Ten rodzaj powrotu atomu do stanu równowagi poprzez emisję promieniowania świetlnego określamy mianem fluore-scencji. W ośrodku składającym się ze zbioru wielu atomów część zaabsorbowanej energii

przekształcana jest na ciepło lub inicjuje inne procesy, które w konsekwencji prowadzą do tego, że remitowany foton ma mniejszą energię niż foton zaabsorbowany. Z tego też po-wodu promieniowanie wyemitowane w procesie fluorescencji jest zawsze przesunięte w kierunku fal dłuższych niż długość fali promieniowania wzbudzającego.

Rys. 3.23. Diagram Jabłońskiego: S₀ – singletowy stan podstawowy, S₁ – singletowy stan wzbudzony,

T1 –trypletowy stan wzbudzony, linie ciągłe – przejścia promieniste, linie przerywane – przejścia,

F – fluorescencja, P – fosforescencja, IC – konwersja wewnętrzna, ICS – wewnętrzne przejście interkombinacyjne singlet–tryplet

Prawo, które mówi, że długość fali promieniowania fluorescencyjnego jest zawsze większa od długości fali promieniowania wzbudzającego fluorescencję nazywane jest prawem Stokesa. Czas zaniku fluorescencji nie przekracza kilku nanosekund.

W przypadku, gdy energia wzbudzonej cząsteczki jest przekazywana otoczeniu w wyniku zderzeń z innymi molekułami, następuje konwersja wewnętrzna, czyli

bez-promienisty (bez emisji promieniowania świetlnego) zanik poziomu wzbudzonego. Efektywność i wydajność tego procesu zmniejsza się wraz ze wzrostem przerwy ener-getycznej pomiędzy poziomem wzbudzonym a podstawowym. Przejścia singlet–try-plet są mało prawdopodobne, ale nie niemożliwe. Zatem atom może przejść do wła-snego stanu trypletowego lub też przekaże swoją energię innemu atomowi. Proces transferu energii singlet–tryplet określamy mianem wewnętrznej konwersji interkom-binacyjnej (ICS – inter-system crossing), gdyż prowadzi on do zmiany kierunku

spinów elektronów. Emisję fotonu przy przejściu ze stanu trypletowego do stanu pod-stawowego (singletowego) nazywamy wówczas fosforescencją. W porównaniu z

flu-orescencją, podczas fosforescencji emitowane jest promieniowanie świetlne o długo-ściach fal przesuniętych znacznie dalej w obszar fal dłuższych, a czas jej zaniku jest znacznie dłuższy (o kilka rzędów) niż czas zaniku fluorescencji i wynosi kilka mikro-lub milisekund.

Oba rodzaje reemisji promieniowania świetlnego przez wzbudzone atomy cząstki, czyli fluorescencję oraz fosforescencję, określamy mianem luminescencji. Ze względu na sposób wzbudzenia wyróżniamy kilka rodzajów luminescencji:

– fotoluminescencja – wywołana promieniowaniem elektromagnetycznym, np. la-serem lub promieniowaniem lampy halogenowej, ksenonowej, deuterowej lub innej,

– elektroluminescencja – wywołana polem elektrycznym, np. przy przepływie elektronów w złączu p–n,

– chemiluminescencja – świecenie następuje w wyniku wzbudzenia reakcjami chemicznymi,

– bioluminescencja – wywołana procesami biologicznymi,

– radioluminescencja – wywołana promieniowaniem jonizującym,

– rentgenoluminescencja – świecenie następuje w wyniku wzbudzenia promie-niami X,

– tryboluminescencja – występuje w wyniku wzbudzenia siłami tarcia i elektro-statycznymi,

– sonoluminescencja – wywołana falami ultradźwiękowymi, – katodoluminescencja – wzbudzenie strumieniem elektronów,

– elektrochemiluminescencja – wywołana procesami chemicznymi i polem elek-trycznym [13].

W przypadku, gdy energia fotonu wyemitowanego przez atom różni się od energii zaabsorbowanego fotonu, mamy do czynienia ze zjawiskiem Ramana. Jeżeli energia fotonu wyemitowanego promieniowania jest mniejsza niż energia fotonu wzbudzają-cego, wówczas mamy do czynienia z przejściami stokesowskimi. Gdy energia wy-emitowanego fotonu jest większa niż energia fotonu powodującego fotoekscytację, mamy do czynienia z przejściami antystokesowskimi. Zagadnienia te są również opi-sane w rozdziale 4 niniejszego podręcznika: Podstawowe pojęcia fotochemii i

Każda cząsteczka posiada energię elektronową, oscylacyjną i rotacyjną.

Energia elektronowa informuje o położeniu elektronów, rodzajach utworzonych wiązań i odległościach między jądrami atomów.

Energia oscylacyjna związana jest z ruchem molekuł, czyli ich zbliżaniem i odda-laniem się od siebie.

Energia rotacyjna cząsteczki to ruchy obrotowe molekuł.

Jeżeli cząsteczka we wzbudzonym stanie oscylacyjnym, pozbywa się nadmiaru energii wypromieniowując kwant energii świetlnej i powraca do stanu podstawo-wego, wówczas zjawisko to określamy mianem luminescencji.

Fluorescencja zachodzi, gdy emisja promieniowania kończy się jednocześnie z zanikiem wzbudzenia. Natężenie fluorescencji zależy od natężenia światła wzbudzającego oraz budowy chemicznej molekuły. Zachodzi w wyniku przejścia pomiędzy wzbudzonym i podstawowym stanem singletowym.

Fosforescencja charakteryzuje się dłuższym czasem emisji promieniowania po zakończeniu wzbudzenia. Jest to przejście ze wzbudzonego stanu tripletowego do stanu podstawowego.

Zgodnie z prawem Stokes’a długość fali wyemitowanego promieniowania w wyniku utraty części energii przez cząsteczki ulega przesunięciu w kierunku fal dłuższych względem długości fali światła zaabsorbowanego.

Długości fal wyemitowane na drodze fosforescencji są przesunięte znacznie bar-dziej w kierunku dłuższych długości fal w stosunku do promieniowania wzbu-dzającego niż w przypadku fluorescencji.

W dokumencie Optyka biomedyczna : wybrane zagadnienia (Stron 93-101)