7 Wyniki
7.1 Rola białka MCPIP1 w procesach wzrostu, unaczynienia i progresji
7.1.3 Aktywność RNazy białka MCPIP1 reguluje unaczynienie guzów w
W celu zbadania poziomu unaczynienia guzów nowotworowych z różnym poziomem białka MCPIP1, przeanalizowano poziom białka CD31 będącego markerem komórek śródbłonka. Wykazano, że guzy grupy z wyciszeniem białka MCPIP1, posiadały bardzo dobrze rozwinięte unaczynienie (Ryc. 7.6. A). Guzy te, charakteryzował znaczący wzrost ilości komórek pozytywnych dla antygenu CD31 oraz funkcjonalnych naczyń posiadających światło naczynia, w porównaniu z grupą kontrolną (Ryc. 7.6. B). Dodatkowo, za pomocą oprogramowania ImageJ zmierzono powierzchnię naczyń i zaobserwowano, że w guzach z obniżonym poziomem białka MCPIP1 powierzchnia naczyń była prawie trzykrotnie wyższa niż w guzach kontrolnych (Ryc. 7.6. C).
Rycina 7.6. Wpływ wyciszenia białka MCPIP1 na poziom CD31 in vivo. A, Reprezentatywne zdjęcia tkanek nowotworowych po barwieniu CD31 - markera naczyń krwionośnych, po podaniu podskórnym komórek Caki-1 shCtrl i z obniżonym poziomem białka MCPIP1 Caki-1 shMCPIP1. B, Wykres przedstawiający ilość funkcjonalnych (zawierających światło naczynia) naczyń krwionośnych CD31 . C, Wykres przedstawiający powierzchnię światła naczyń CD31 . Do badania wykorzystano 12 myszy szczepu NOD-SCID, gdzie n=6 na grupę. Wyniki przedstawiono jako średnia ± SEM, wartości p zostały obliczone przy pomocy testu t-Studenta.
Wykorzystanie myszy szczepu Foxn1nu/Foxn1nu ze względu na brak sierści, pozwoliło na monitorowanie rozwoju unaczynienia w czasie wzrostu guzów. Guzy poddano analizie przy pomocy ultrasonografu 3D i zaobserwowano, że w trakcie wzrostu, znacznie lepiej rozwijało się unaczynienie w guzach z niskim poziomem MCPIP1 w porównaniu z kontrolą (Ryc. 7.7. A, B).
66
Wyniki te, potwierdzono za pomocą barwień immunofluorescencyjnych dla CD31. W trakcie wzrostu guzów, zdecydowanie więcej naczyń krwionośnych zaobserwować można było w guzach shMCPIP1 (Ryc. 7.7. C).
Rycina 7.7. Wpływ wyciszenia białka MCPIP1 na rozwój unaczynienia in vivo. A, Unaczynienie guzów mierzone przy pomocy ultrasonografii wysokiej rozdzielczości. B, Reprezentatywne zdjęcia wykonane za pomocą ultrasonografu VEVO2100 gdzie kolorem czerwonym są zaznaczone funkcjonalne naczynia krwionośne, a biała przerywana linia oznacza granice guza. Do badania wykorzystano 12 myszy szczepu Foxn1nu/Foxn1nu, Caki-1 shCtrl, n=5; Caki-1 shMCPIP1, n=10. C, Immunofluorescencyjne barwienie CD31 tkanek nowotworowych. Reprezentatywne zdjęcia rozwoju unaczynienia po 21, 28, 35 i 41 dniach od podania podskórnego komórek Caki-1 z wyciszeniem białka MCPIP1. Do badania wykorzystano 8 myszy szczepu NOD-SCID, gdzie n=4 na grupę. Wyniki przedstawiono jako średnia ± SEM, wartości p zostały obliczone przy pomocy testu t-Studenta.
Barwienie immunohistochemiczne CD31 tkanek z nadekspresją formy dzikiej i pozbawionej funkcji RNazy białka MCPIP1 i wskazało, jak istotna jest funkcja enzymatyczna białka MCPIP1 w komórkach nowotworowych dla rozwoju unaczynienia in vivo (Ryc. 7.8. A). Guzy utworzone przez komórki Caki-1 z nieaktywną formą białka MCPIP1 (pLIXD141N) charakteryzowały się najlepiej rozwiniętym unaczynieniem, podobnie, jak guzy z obniżonym poziomem MCPIP1 (Ryc. 7.8. A, B). Natomiast, wysoki poziom MCPIP1 w przypadku komórek Caki-1 nie
67
powodował zmian w ilości funkcjonalnych naczyń krwionośnych w porównaniu z kontrolą (Ryc. 7.8. A, B).
Rycina 7.8. Wpływ nadekspresji białka MCPIP1 na poziom CD31. A, Reprezentatywne zdjęcia przedstawiające wynik barwienia immunohistochemicznego dla CD31 na tkankach nowotworowych po podaniu podskórnym komórek Caki-1 z nadekspresją formy dzikiej (pLIX MCPIP1) lub zmutowanej (pLIX D141N) białka MCPIP1. B, Wykres przedstawiający średnią powierzchnię naczyń o średnicy ≥ 200μm. Do badania wykorzystano 12 myszy szczepu NOD-SCID, gdzie n=4 na grupę. Wyniki przedstawiono jako średnia ± SEM, wartości p zostały obliczone przy pomocy testu t-Studenta.
Dalsza analiza unaczynienia, w guzach utworzonych przez komórki Caki-2 w modelu Foxn1nu/Foxn1nu potwierdziła, że unaczynienie rozwijało się najlepiej w grupie z formą zmutowaną białka MCPIP1 w porównaniu z kontrolą (pLIX PURO) (Ryc. 7.9.
A, B). Co ciekawe, w tym modelu najsłabsze unaczynienie występowało wśród guzów z nadekspresją funkcjonalnej, dzikiej formy MCPIP1 (Ryc. 7.9. A, B), co wskazało, że zarówno poziom białka MCPIP1 jak i jego aktywność RNazy, w komórkach nowotworowych, miały istotny wpływ na rozwój nowych naczyń krwionośnych w obrębie guza.
Rycina 7.9. Wpływ nadekspresji białka MCPIP1 na rozwój unaczynienia in vivo. A, Unaczynienie guzów mierzone przy pomocy ultrasonografii wysokiej rozdzielczości. B, Reprezentatywne zdjęcia USG guzów utworzonych przez komórki Caki-2 z nadekspresją formy dzikiej lub zmutowanej białka MCPIP1. Do badania wykorzystano 9 myszy szczepu Foxn1nu/Foxn1nu, gdzie n=3 na grupę. Wyniki przedstawiono jako średnia ± SEM, wartości p zostały obliczone przy pomocy testu t-Studenta.
68
7.1.4 Niski poziom białka MCPIP1 wpływa na destabilizację połączeń międzykomórkowych, aktywną migrację komórek endotelialnych i tworzenie naczyniopodobnych struktur w warunkach in vitro
Kolejnym etapem badań było poszukiwanie mechanizmów odpowiedzialnych za zaobserwowany w badaniach in vivo wpływ braku aktywnego białka MCPIP1 na wzrost guzów i rozwój ich unaczynienia. W celu wyjaśnienia uzyskanych wyników, w pierwszej kolejności analizowano potencjalne oddziaływanie komórek ccRCC na komórki endotelialne. Oceniono zdolność do migracji komórek endotelialnych w żelu fibrynowym w trakcie współhodowli z komórkami ccRCC. W teście tym, opłaszczające kulki lateksowe, komórki endotelialne HMEC-1 zostały poddane wpływowi komórek nowotworowych Caki-1 kontrolnych (shCtrl) oraz z obniżonym poziomem białka MCPIP1 (shMCPIP1) znajdujących się na powierzchni żelu fibrynowego (Ryc. 7.10.
A, B). Zaobserwowano, że komórki endotelialne pod wpływem komórek Caki-1 shMCPIP1 zaczęły wykształcać naczyniopodobne struktury (tubule), podczas gdy hodowla HMEC-1 z nowotworowymi komórkami kontrolnymi posiadała tych struktur istotnie mniej (Ryc. 7.10. A). Przeanalizowano obszar migracji komórek HMEC-1 i okazało się, że jest on znacząco większy pod wpływem hodowli z komórkami z niskim poziomem MCPIP1 w porównaniu z hodowlą w obecności nowotworowych komórek kontrolnych (Ryc. 7.10. B). Aby sprawdzić, czy pożywka hodowlana zebrana znad komórek nowotworowych (tzw. medium warunkowane) może wpływać na ilość tworzących się rozgałęzień między komórkami endotelialnymi, komórki HMEC-1 wysiano w Matrigelu, a następnie stymulowano zebranym medium warunkowanym.
Dodatkowo, dla lepszego zobrazowania komórki śródbłonka wybarwiono kalceiną.
Wykazano, że po stymulacji medium warunkowanym znad komórek Caki-1 shMCPIP1 wzrasta ilość rozgałęzień pomiędzy komórkami HMEC-1 tworząc lepiej rozbudowaną i zorganizowaną sieć (Ryc. 7.10. C, doświadczenie przeprowadzone przez dr hab. Katarzynę Miękus, natomiast przeanalizowane przez P. Maronę).
69
Rycina 7.10. Efekt wyciszenia białka MCPIP1 w komórkach ccRCC na komórki endotelialne HMEC-1. A, Wykres przedstawiający procent naczyniopodobnych struktur utworzonych przez komórki HMEC-1 w przeliczeniu na wszystkie kulki lateksowe. Komórki HMEC-1 hodowano w żelu fibrynowym w ko-kulturze z komórkami Caki-1 shCtrl lub shMCPIP1. Po prawej, reprezentatywne zdjęcia kulek lateksowych, strzałkami zaznaczono naczyniopodobne struktury, w które formują się komórki HMEC-1. B, Wykres przedstawiający średnią powierzchnię migracji komórek HMEC-1 w żelu fibrynowym. Po prawej, reprezentatywne zdjęcia kulek z zaznaczoną białą linią granicą migrujących komórek. C, Wykres średniej ilości rozgałęzień utworzonych przez komórki HMEC-1 hodowanych w Matrigelu i stymulowanych medium kondycjonowanym znad komórek Caki-1 po wyciszeniu białka MCPIP1. Pod wykresem reprezentatywne zdjęcia wybarwionych kalceiną komórek HMEC-1. Wyniki przedstawiono jako średnia ± SD, wartości p zostały obliczone przy pomocy testu t-Studenta.
Przepuszczalność naczyń jest regulowana przez wiele różnych białek, z których VE-kadheryna pełni jedną z bardziej istotnych funkcji. VE-kadheryna znajduje się na powierzchni komórek śródbłonka. W wyniku stymulacji komórek czynnikami proangiogennymi dochodzi do fosforylacji i internalizacji VE-kadheryny, przez co integralność połączeń jest zaburzona, a komórki zaczynają migrować (48–50). 3-godzinna stymulacja komórek endotelialnych HUVEC medium warunkowanym znad komórek Caki-1 oraz Caki-2 z wyciszonym białkiem MCPIP1 spowodowała znaczący wzrost fosforylacji VE-kadheryny bez zmian w jej całkowitym poziomie, względem kontroli (Ryc. 7.11. A). Odwrotną sytuację można było zaobserwować po stymulacji medium znad komórek z nadekspresją funkcjonalnej formy MCPIP1. Poziom fosforylacji VE-kadheryny w komórkach HUVEC po stymulacji medium warunkowanym znad komórek ccRCC z nadekspresją MCPIP1 był niższy, niż w komórkach stymulowanych medium znad kontrolnych komórek ccRCC. Poziom aktywacji VE-kaheryny w komórkach HUVEC stymulowanych medium znad dwóch różnych linii ccRCC, Caki-1 jak i Caki-2 był podobny (Ryc. 7.11. A). W celu oceny
70
wpływu medium kondycjonowanego znad komórek nowotworowych na integralność warstwy komórek endotelialnych oraz lokalizację VE-kadheryny wykonano barwienie immunofluorescencyjne komórek HUVEC (Ryc. 7.11. B). Media izolowane znad komórek z wyciszonym białkiem MCPIP1 (Caki-1 i Caki-2) powodowały utratę połączeń komórkowych i internalizację VE-kadheryny z błony komórkowej do wnętrza komórki (zaznaczono strzałkami) w porównaniu z kontrolą. Natomiast, po stymulacji medium znad komórek po nadekspresji MCPIP1 nie obserwowano zmian w wyglądzie komórek i zmian w lokalizacji VE-kadheryny względem kontroli (Ryc. 7.11.
B). Otrzymane wyniki wykazały, że poziom białka MCPIP1 w komórkach nowotworowych wpływa na wydzielanie przez nie czynników zaangażowanych w aktywację komórek endotelialnych, fosforylację VE-kadheryny i tracenie kontaktów komórka-komórka.
Rycina 7.11. Wpływ różnego poziomu białka MCPIP1 w komórkach ccRCC na VE-kadherynę. A, Reprezentatywny wynik western blot dla VE-kadheryny (forma całkowita i fosforylowana) w komórkach HUVEC po 3 godzinnej stymulacji medium kondycjonowanym znad komórek Caki-1 lub Caki-2 z wyciszeniem bądź nadekspresją białka MCPIP1, z α-tubuliną jako kontrolą ilościową. B, Reprezentatywne zdjęcia komórek HUVEC po barwieniu immunofluorescencyjnym dla VE-kadheryny po 3 godzinnej stymulacji medium kondycjonowanym znad komórek Caki-1 lub Caki-2 z różnym poziomem białka MCPIP1.
Strzałkami zaznaczono przerwy w ciągłości warstwy komórek.
71
7.1.5 Białko MCPIP1 reguluje poziom wydzielanych czynników proangiogennych w komórkach nowotworowych
Hipoksja jest jednym z czynników promujących angiogenezę. W celu sprawdzenia czy poziom i aktywność białka MCPIP1 w komórkach ccRCC reguluje wydzielanie czynników proangiogennych, wpływających na komórki endotelialne, komórki linii Caki-1 i Caki-2, kontrolne (shCtrl) oraz z obniżonym poziomem MCPIP1 (shMCPIP1), inkubowano w warunkach normoksji (21% O2) lub hipoksji (0,5% O2) przez 48 godzin. Po tym czasie sprawdzono ekspresję i ilość wydzielonych białek proangiogennych, takich jak VEGF, IL-6 oraz IL-8 (Ryc. 7.12. A-C). Za pomocą reakcji PCR w czasie rzeczywistym wykazano istotny wzrost poziomu transkryptów dla IL-6, IL-8 i VEGF w komórkach z wyciszonym poziomem MCPIP1. Obserwowany wzrost ekspresji był szczególnie istotny w warunkach hipoksji dla obu badanych linii. W warunkach normoksji, wyższy poziom transkryptów badanych czynników proangiogennych charakteryzował również komórki linii Caki-2 z wyciszonym poziomem MCPIP1. (Ryc. 7.12. A-C). Podobne różnice obserwowano w poziomie wydzielanych białek, gdzie w warunkach hipoksji gwałtownie rosło wydzielanie badanych czynników proangiogennych do pożywki przez komórki z wyciszonym białkiem MCPIP1 (Ryc. 7.12. A-C).
Rycina 7.12. Poziom czynników proangiogennych w komórkach ccRCC z wyciszeniem MCPIP1. Komórki linii Caki-1 oraz Caki-2 z obniżonym poziomem białka MCPIP1 hodowano
72
przez 48 godzin w warunkach hipoksji i normoksji. Poziom mRNA IL8 (A), VEGF (B), i IL6 (C), został zmierzony przy pomocy reakcji PCR w czasie rzeczywistym. Poziom mRNA próbek Caki shCtrl w warunkach normoksji został przyrównany do 1. Poziom wydzialanych czynników został zmierzony przy pomocy testu immunoenzymatycznego ELISA. Wyniki przedstawiono jako średnia ± SD, gdzie n=3. Wartości p zostały obliczone przy pomocy testu t-Studenta.
Białko MCPIP1 rozpoznaje i degraduje transkrypty dla wielu cytokin w tym IL-6 oraz IL-8 (182,187). Dlatego, kolejnym krokiem było sprawdzenie czy w komórkach ccRCC białko MCPIP1, dzięki swojej aktywności RNazy, może regulować poziom czynników proangiogennych. W tym celu wykorzystano komórki ccRCC z nadekspresją (pLIX MCPIP1) i mutacją białka MCPIP1 (pLIX D141N) (Ryc. 7.13. A, B). Wykazano, że w warunkach hipoksji, komórki z nieaktywnym białkiem MCPIP1 (pLIXD141N) posiadały najwięcej transkryptów dla analizowanych czynników oraz wydzielały najwięcej białek sekrecyjnych do pożywki, w porównaniu z komórkami kontrolnymi czy z nadekspresją MCPIP1 (Ryc. 7.13. A, B). Nadekspresja MCPIP1 powodowała jedynie nieznaczny (nieistotny statystycznie) spadek poziomu transkryptów i białek sekrecyjnych wydzielanych do pożywki względem komórek kontrolnych (pLIX PURO) (Ryc. 7.13. A, B).
Rycina 7.13. Poziom czynników proangiogennych w komórkach ccRCC z nadekspresją MCPIP1. A, Poziom mRNA czynników proangiogennych w komórkach Caki-1 z formą dziką (pLIX MCPIP1) i zmutowaną (pLIX D141N) białka MCPIP1. Poziom mRNA próbek Caki-1 pLIX PURO w warunkach normoksji został przyrównany do 1. B, Poziom wydzielniczych czynników został zmierzony testem immunoenzymatycznym ELISA. Wyniki przedstawiono jako średnia
± SD, gdzie n=3. Wartości p zostały obliczone przy pomocy testu t-Studenta.
7.1.6 Białko MCPIP1 reguluje proces przerzutowania wpływając na oś SDF-1/CXCR4
Jednym z czynników wpływającym na zwiększona ekspresje VEGF jest SDF-1 wraz ze swoim receptorem CXCR4. SDF-SDF-1 i VEGF mogą indukować rozwój unaczynienia w guzach, a oś SDF-1-CXCR4 wpływa na zwiększenie inwazyjności
73
komórek nowotworowych i tworzenie przerzutów w wielu typach nowotworów (64,65,84). Dlatego, w kolejnych doświadczeniach sprawdzono poziom tych czynników w komórkach ccRCC z różnym poziomem białka MCPIP1.
Zaobserwowano znacząco zwiększony poziom SDF-1 w komórkach Caki-1 z obniżonym poziomem białka MCPIP1, podobnie, poziom transkryptu dla CXCR4 był dwukrotnie wyższy w komórkach Caki-1 shMCPIP1 w porównaniu z kontrolą (Ryc.
7.14. A). Następnie, sprawdzono poziom SDF-1 w komórkach z nadekspresją MCPIP1 i nieaktywną formą MCPIP1, pozbawioną aktywności Rnazy i wykazano, że pod wpływem nadekspresji MCPIP1 poziom mRNA dla SDF-1 istotnie obniża się (Ryc. 7.14. A, trzeci wykres). Podobne wyniki otrzymano dla drugiej z badanych linii komórkowych ccRCC, Caki-2, zarówno po wyciszeniu, jak i nadekspresji MCPIP1 (Ryc. 7.14. B). Dodatkowo, sprawdzono poziom mRNA dla SDF-1 i CXCR4 w guzach otrzymanych po podskórnym podaniu do myszy komórek ccRCC. Zaobserwowano wzrost, zarówno SDF-1 jak i CXCR4 w grupie guzów z wyciszeniem białka MCPIP1 (Ryc. 7.14. C). Następnie, zbadano poziom wydzielonego ludzkiego SDF-1 do osocza myszy i zaobserwowano jego wyższe stężenie w osoczu myszy, którym podano komórki Caki-1 shMCPIP1 (Ryc. 7.14. D).
Rycina 7.14. Białko MCPIP1 reguluje oś SDF1-CXCR4. A, Poziom ekspresji mRNA dla SDF-1 i CXCR4 w komórkach Caki-1 z wyciszeniem lub nadekspresją formy dzikiej (pLIX MCPIP1) lub zmutowanej (pLIX D141N) białka MCPIP1. B, Poziom ekspresji mRNA dla SDF-1 i CXCR4 w komórkach Caki-2 z wyciszeniem lub nadekspresją formy dzikiej (pLIX MCPIPSDF-1) lub zmutowanej (pLIX D141N) białka MCPIP1. C, Poziom ekspresji mRNA dla SDF-1 i CXCR4 w guzach został zmierzony przy pomocy reakcji PCR w czasie rzeczywistym. Do doświadczenia użyto 15 myszy szczepu Foxn1nu/Foxn1nu, Caki-1 shCtrl, n=5; Caki-1 shMCPIP1, n=10. D, Poziom wydzielonego do osocza SDF-1 u myszy szczepu Foxn1nu/Foxn1nu, mierzony przy pomocy testu immunoenzymatycznego ELISA. Wyniki in vitro przedstawiono jako średnia ± SD, natomiast in vivo jako średnia ± SEM, wartości p zostały obliczone przy pomocy testu t-Studenta.
74
Jednym z czynników transkrypcyjnych regulujących poziom ekspresji SDF-1 jest c/EBPβ, który z kolei jest degradowany przez białko MCPIP1 (183,215). Ze względu na to, zdecydowano sprawdzić czy białko MCPIP1 w sposób pośredni, przez c/EBPβ, może regulować poziom SDF-1. Wykazano, że zarówno poziom transkryptu jak i białka c/EBPβ w komórkach Caki-1 z wyciszeniem MCPIP1 był dwukrotnie wyższy niż w komórkach kontrolnych (Ryc. 7.15. A). Natomiast, w przypadku nadekspresji MCPIP1, poziom c/EBPβ spadał w stosunku do kontroli (Ryc. 7.15. B).
Co ciekawe, najwyższe poziomy były obserwowane w komórkach z mutacją w domenie RNazowej MCPIP1 co potwierdziło, że aktywność RNazy MCPIP1, pośrednio przez c/EBPβ, pełni istotną funkcję w regulacji poziomu białka SDF-1.
Rycina 7.15. Białko MCPIP1 reguluje poziom c/EBPβ. A, Poziom ekspresji c/EBPβ mierzony przy pomocy reakcji PCR w czasie rzeczywistym z EF2 jako genem referencyjnym.
Reprezentatywny wynik western blot dla białka c/EBPβ z α-tubuliną jako kontrolą ilościową, w komórkach Caki-1 z wyciszeniem białka MCPIP1. B, Poziom ekspresji c/EBPβ mierzony przy pomocy reakcji PCR w czasie rzeczywistym z EF2 jako genem referencyjnym.
Reprezentatywny wynik western blot dla białka c/EBPβ z α-tubuliną jako kontrolą ilościową, w komórkach Caki-1 z nadekspresją formy dzikiej lub zmutowanej białka MCPIP1. Wyniki przedstawiono jako średnia ± SD z trzech niezależnych doświadczeń.
Wysoki poziom SDF-1 wiąże się z wysoką inwazyjnością, skłonnością komórek nowotworowych do migracji i przerzutowania. Dlatego, w celu oceny wpływu białka MCPIP1 na potencjał do tworzenia przerzutów przeprowadzono analizę krążących komórek nowotworowych. W tym celu, do myszy szczepu NOD-SCID podano podskórnie ludzkie komórki Caki-1 kontrolne (shCtrl) i z wyciszeniem MCPIP1 (shMCPIP1). Komórki te były dodatkowo transdukowane białkiem zielonej fluorescencji, GFP. Analizie poddano zarówno krew myszy jak i płuca, w których komórki nowotworowe mogły potencjalnie tworzyć przerzuty. Wykazano, że wyciszenie białka MCPIP1 zwiększyło ilość ludzkich krążących komórek nowotworowych w mysim krwioobiegu (Ryc. 7.16. A), a następnie osadzanie się w płucach, co obserwowano przez 6 tygodni trwania doświadczenia (Ryc. 7.16. B). Po zakończeniu doświadczenia, zaobserwowano znacząco wyższą ilość mikroprzerzutów tworzonych przez komórki z obniżonym poziomem białka MCPIP1 w porównaniu z kontrolą (Ryc. 7.16. C). Nadekspresja MCPIP1 powodowała z kolei, spadek ilości mikroprzerzutów w porównaniu z kontrolą (Ryc. 7.16. D).
75
Rycina 7.16. Białko MCPIP1 wpływa na oś SDF-1/CXCR4 oraz proces przerzutowania.
A, Analiza cytometryczna poziomu krążących komórek nowotworowych, po 28, 35 i 41 dniach od podania podskórnego komórek Caki-1 GFP z wyciszeniem białka MCPIP1. B, Poziom ekspresji ludzkiego GAPDH w RNA izolowanym z mysich płuc na przestrzeni 6 tygodni. Do doświadczeń wykorzystano 8 myszy szczepu NOD-SCID, gdzie n=4 na grupę. C, Poziom ekspresji ludzkiego GAPDH obecnego w mysich płucach po 6 tygodniach od podania komórek nowotworowych Caki-1 z wyciszeniem białka MCPIP1. Do doświadczeń wykorzystano 8 myszy szczepu NOD-SCID, gdzie n=4 na grupę oraz 10 myszy szczepu Foxn1nu/Foxn1nu, Caki-1 shCtrl, n=4; Caki-1 shMCPIP1, n=6. D, Poziom ekspresji ludzkiego GAPDH obecnego w mysich płucach po 6 tygodniach od podania komórek nowotworowych Caki-1 z nadekspresją białka MCPIP1. Jako referencję wykorzystano mysi GAPDH. Do doświadczeń wykorzystano 10 myszy szczepu NOD-SCID, Caki-1 pLIX PURO/MCPIP1 n=5 na grupę.
Wyniki przedstawiono jako średnia ± SEM, wartości p zostały obliczone przy pomocy testu t-Studenta.
7.1.7 Niski poziom MCPIP1 zwiększa aktywność migracyjną i powoduje nabywanie cech mezenchymalnych w komórkach ccRCC
Skłonność komórek nowotworowych do tworzenia odległych przerzutów spowodowana jest między innymi ich wyższą aktywnością migracyjną. Aby sprawdzić, czy białko MCPIP1 wpływa na ruchliwość komórek analizowano ścieżki, po których poruszały się losowo wybrane komórki nagrywane przez 16 godzin podczas testu zarastania rany, (Ryc.7.17. A-D). Wykazano, że zarówno w przypadku komórek linii Caki-1 jak i Caki-2, po wyciszeniu białka MCPIP1, komórki poruszały się znacząco szybciej i przebywały 20-40% dłuższą drogę niż komórki kontrolne (Ryc.7.17. E-F).
76
Rycina 7.17. Efekt obniżenia poziomu białka MCPIP1 na aktywność ruchową komórek.
A, B, Reprezentatywne zdjęcia przedstawiające proces zarastania rany w komórkach Caki-1 (A) oraz Caki-2 (B) z wyciszeniem białka MCPIP1. Zdjęcia zrobione w momencie zrobienia rysy, oraz po 8 godzinach trwania doświadczenia. C, D, Mapy przedstawiające ścieżki migracyjne pojedynczych komórek w czasie 16-godzinnego nagrywania. N=18 komórek dla każdego warunku. E, F, Analiza przebytej odległości oraz średnia szybkość komórek w trakcie 16 godzinnego doświadczenia. Wyniki są przedstawione jako średnia z 3 niezależnych doświadczeń z liczbą analizowanych komórek n=100 dla każdego warunku. Wyniki przedstawiono jako średnia ± SD, z trzech niezależnych doświadczeń. Wartości p zostały obliczone przy pomocy testu t-Studenta.
Zmiany w aktywności migracyjnej oznaczają zazwyczaj zmiany w organizacji cytoszkieletu i nabywanie przez komórki fenotypu mezenchymalnego, który charakteryzuje się utratą e-kadheryny i podwyższonym poziomem białek związanych z EMT takich jak wimentyna, n-kadheryna czy β-katenina oraz czynników regulujących EMT np. Snail, Slug,czy bialka Zeb (98). Za pomocą techniki western blot, potwierdzonej dalszą analizą densytometryczną zbadano poziom tych czynników w kontrolnych komórkach ccRCC oraz komórkach z obniżonym poziomem białka MCPIP1. Wykazano, że niski poziom MCPIP1 wpływa na znacząco niższy poziom e-kadheryny i wzrost β-kateniny, wimentyny, a także kinazy Src oraz receptora c-Met, zarówno formy całkowitej jak i fosforylowanej (Ryc. 7.18. A).
Następnie, przeanalizowano poziom mRNA dla czynników transkrypcyjnych Snail i ZEB2 które jednocześnie biorą udział w negatywnej regulacji poziomu e-kadheryny (100). Zaobserwowano wzrost poziomu mRNA dla obu czynników w komórkach ccRCC z wyciszeniem białka MCPIP1 (Ryc. 7.18. B).
77
Rycina 7.18. Efekt obniżenia poziomu białka MCPIP1 na markery EMT. A, Analiza markerów EMT, reprezentatywny wyniki western blot dla komórek Caki-1 oraz Caki-2 po obniżeniu poziomu MCPIP1 z α-tubuliną jako kontrolą ilościową. Po prawej wykresy z analizą densytometryczną dla co najmniej trzech niezależnych doświadczeń. B, Poziom ekspresji mRNA dla genów Snail oraz ZEB2 z EF2 jako referencją w komórkach Caki-1 oraz Caki-2 po wyciszeniu białka MCPIP1, mierzone za pomocą reakcji PCR w czasie rzeczywistym. Wyniki przedstawiono jako średnia ± SD, gdzie n=3. Wartości p zostały obliczone przy pomocy testu t-Studenta.