Angiogeneza (neowaskularyzacja) w procesie rozwoju nowotworu

Angiogeneza jest procesem tworzenia się nowych naczyń krwionośnych z już istniejących. W warunkach fizjologicznych zachodzi przede wszystkim w rozwoju embrionalnym razem z waskulogenezą (tworzeniem naczyń de novo), oraz w trakcie gojenia się ran czy regeneracji endometrium w trakcie cyklu miesięcznego u kobiet (35). Angiogeneza jest też krytycznym krokiem podczas przemiany łagodnego nowotworu w złośliwy, gdy zostaje zachwiana równowaga między czynnikami stymulującymi, a hamującymi rozwój unaczynienia (36). Gwałtownie dzielące się komórki nowotworowe do swojego wzrostu potrzebują tlenu i substancji odżywczych dostarczonych z krwią. Małe skupiska komórek nowotworowych, nie przekraczające 2 mm³, pobierają tlen na drodze dyfuzji z okolicznych naczyń krwionośnych (37,38).

20

Rozrost tkanki nowotworowej powoduje hipoksję i kwasicę, poprzez brak usuwania resztek przemiany materii, co prowadzi do aktywacji czynników HIFα (37).

Istnieją trzy formy HIFα z czego najlepiej poznanymi są HIF1α i HIF2α, które działają podobnie w odpowiedzi na zmiany stężenia tlenu (39). Co ciekawe, wykazano, że w przypadku ccRCC to właśnie poziom izoformy HIF2α jest krytycznym czynnikiem stymulującym wzrost i rozwój guzów VHL-/-, a jej zahamowanie powoduje znaczące spowolnienie wzrostu guzów in vivo (40–43). W raku nerki obarczonym mutacją genu VHL, HIFα jest akumulowany nawet w warunkach normoksji i powoduje wzmożoną ekspresję czynników proangiogennych: PDGFβ, czynnika wzrostu hepatocytów (ang. Hepatocyte growth factor, HGF), angiopoetyny-2, epidermalnego czynnika wzrostu (ang. Epidermal growth factor, EGF), oraz głównego stymulatora neowaskularyzacji – VEGF (30,43–45).

Do rodziny VEGF należy 6 czynników (od A do E oraz czynnik wzrostu łożyska - PlGF), z których VEGFA jest najlepiej poznanym. W wyniku alternatywnego składania, powstają izoformy różniące się ilością aminokwasów w łańcuchu polipeptydowym, które cechuje różne powinowactwo do heparyny i biodostępność.

VEGFA działa przez wiązanie się do jednego ze swoich receptorów (ang, VEGF receptor, VEGFR1, VEGFR2) znajdujących się na powierzchni komórek śródbłonka i aktywacji dalszych ścieżek przekazu sygnału (46,47).

4.2.2 Etapy angiogenezy

W wyniku martwicy i niedotlenienia, w komórkach nowotworowych dochodzi do przełączenia angiogennego (ang. angiogenic switch). Przełączenie to powoduje niekontrolowaną produkcję wcześniej wymienionych czynników proangiogennych, które wiążąc się ze swoimi receptorami na komórkach śródbłonka, aktywują kinazy białkowe i powodują wzrost przepuszczalności naczyń oraz redystrybucję międzykomórkowych białek adhezyjnych m.in. CD31 czy VE-kadheryny (Ryc. 4.2. A) (36,47).

VE-kadheryna tworzy połaczenia pomiędzy komórkami endotelialnymi zapewniając integralność śródbłonka (48,49). Komórki nowotworowe wydzielają czynnik VEGFA, który łączy się ze swoim receptorem na powierzchni komórki endotelialnej. Następnie, dochodzi do autofosforylacji receptora VEGF i przeniesienia reszty fosforanowej z VEGFR2 przez kinazy Src, PAK, kinazę ogniskowo-adhezyjną (ang. Focal andhesion kinase, FAK) oraz substrat 1 toksyny botulinowej C3 związany z Ras (ang. Ras-related C3 botulinum toxin substrate 1, Rac1) na VE-kadherynę (50).

Fosforylowana VE-kadheryna ulega internalizacji i translokacji w inne miejsce, bądź

21

degradacji co prowadzi do destabilizacji połączeń międzykomórkowych, rearanżacji cytoszkieletu i w konsekwencji zwiększonej przepuszczalności naczyń (48–50). Co więcej, wykazano, że nie tylko stymulacja VEGF powoduje osłabienie połączeń komórkowych, ale również wydzielane przez komórki nowotworowe metaloproteinazy (ang. Metalloproteinase, MMP), zwłaszcza MMP2 oraz MMP9 (51). W tym przypadku jednak nie dochodzi do fosforylacji i internalizacji VE-kadheryny, a odcięcia jej zewnątrzkomórkowej domeny i destabilizacji połączeń komórka-komórka (51,52).

Metaloproteinazy biorą również udział w degradacji macierzy zewnątrzkomórkowej co przyczynia się do proliferacji i migracji komórek endotelialnych (ECs) (35).

Rozwojowi guza towarzyszy przewlekły stan zapalny i napływ komórek układu odpornościowego. Wykazano, że nadekspresja VEGF powoduje wzrost czynnika SDF-1 co z kolei wpływa na rekrutację komórek mieloidalnych posiadających na powierzchni receptor dla chemokin 4 (ang. Chemokine receptor 4, CXCR4) (53).

Oprócz komórek nowotworowych, także komórki układu odpornościowego, a przede wszystkim makrofagi są istotnym źródłem cytokin i chemokin prozapalnych, które pełnią również istotną funkcję w promocji neowaskularyzacji (54). Dobrze poznaną chemokiną proangiogenną, syntetyzowaną przez komórki nowotworowe, jest IL-8, która aktywuje nie tylko neutrofile, ale również makrofagi, komórki tuczne i komórki endotelialne (54,55). VEGF, IL-8 oraz SDF-1 stymulują komórki endotelialne do migracji przez zdegradowaną macierz otaczającą śródbłonek w stronę gradientu czynników wzrostowych i w ten sposób rozpoczyna się proces kiełkowania (ang.

Sprouting) naczyń krwionośnych (Ryc. 4.2. B). Ważną rolę podczas migracji i kiełkowania naczyń pełnią receptory integrynowe, których ekspresję stymuluje VEGF, czynnik martwicy nowotworów alfa (ang. Tumor necrosis factor alpha,TNF-α) oraz sama IL-8 (37).

Ostatnim etapem angiogenezy nowotworowej jest dojrzewanie powstałych naczyń, w którym biorą udział m.in. czynniki antyangiogenne oraz PDGFβ który stymuluje komórki otaczające komórki śródbłonka, tzw. perycyty, do osiadania i stabilizowania powierzchni nowych naczyń (45,56). Dobrze rozwinięty system naczyń krwionośnych w guzie jest istotną składową procesu przerzutowania, czyli opuszczenia pierwotnego ogniska przez agresywne komórki nowotworowe i migracji z krwioobiegiem w poszukiwaniu nowej niszy (Ryc. 4.2. C).

22

Rycina 4.2. Schemat procesu angiogenezy w obrębie guza nowotworowego.

Zaadaptowano i zaprojektowano na podstawie (36, 37).

Sieć naczyń krwionośnych obecna w guzie nowotworowym ze względu na brak równowagi między czynnikami pro i antyangiogennymi różni się od unaczynienia fizjologicznego. Naczynia krwionośne w guzie tworzą chaotyczny układ, który ciągle ulega przebudowie. Posiada nieregularne, często ślepo zakończone naczynia, z których większość jest niefunkcjonalna oraz charakteryzuje się zwiększoną przepuszczalnością powodującą drobne, lecz liczne krwotoki (38). Naczynia nowotworowe nie dostarczają komórkom guza odpowiedniej ilości tlenu, co skutkuje niedotlenieniem i obumarciem części tkanki. Słaba jakość naczyń krwionośnych jest również spowodowana tym, że budują je oprócz wyspecjalizowanych komórek śródbłonka, także komórki nowotworowe. Zjawisko przejmowania przez agresywne komórki nowotworowe fenotypu i właściwości komórek endotelialnych i formowania de novo sieci tubularnych struktur, połączonych z właściwymi naczyniami krwionośnymi nosi nazwę mimikry naczyniowej (57). Wykazano, iż również komórki ccRCC posiadają zdolność formowania naczynio-podobnych struktur (58–60).

Oprócz typowych receptorów kinaz tyrozynowych takich jak VEGFR czy PDGFR, w proces angiogenezy nowotworowej zaangażowany jest także receptor c-Met. Receptor ten, działając na szereg białek wpływa na stabilizację HIF1α oraz, niezależnie od stężenia tlenu, aktywuje czynniki transkrypcyjne STAT w efekcie stymulując ekspresję VEGF (61). Podobne działanie wykazuje IL-6, która łącząc się parakrynnie lub autokrynnie ze swoim receptorem, fosforyluje białko STAT3 (ang.

Signal transducer and activator of transcription 3), które następnie ulega dimeryzacji i translokacji do jądra. Ścieżka sygnałowa IL-6/STAT3 stymuluje ekspresję VEGF

23

oraz metaloproteinaz MMP2 i MMP9 (62,63). Ekspresję VEGF regulują również receptor CXCR4 wraz ze swoim ligandem SDF1, który jest silnym chemoatraktantem dla endotelialnych komórek progenitorowych migrujących ze szpiku kostnego (64,65).

Wysoki poziom VEGF w guzie jest zazwyczaj złym czynnikiem prognostycznym w wielu typach nowotworów, także w ccRCC i świadczy on o skłonności komórek nowotworowych do progresji i tworzenia przerzutów. Analiza próbek pacjentów w różnych stadiach zaawansowania choroby wykazała, że wraz z progresją ccRCC rośnie ekspresja czynników stymulujących rozwój unaczynienia (66). Ze względu na częste mutacje genu VHL, akumulację HIF oraz nadekspresję wielu stymulatorów angiogenezy, jasnokomórkowy rak nerki tworzy silnie ukrwione guzy i logicznym wydało się wprowadzenie terapii opartych o leki celujące zarówno w sam VEGF jak i receptory kinaz tyrozynowych zaangażowanych w rozwój unaczynienia. Stosowanie inhibitorów kinaz tyrozynowych (ang. Tyrosine kinase inhibitors, TKIs) początkowo daje zadowalające efekty, jednak w trakcie długotrwałej terapii ich skuteczność jest kwestionowana ze względu na wykształcanie na nie mechanizmów oporności.