Test tworzenia się rozgałęzień w hodowli komórek endotelialnych

5 Cel pracy doktorskiej

6.2 Metody

6.2.11 Test tworzenia się rozgałęzień w hodowli komórek endotelialnych

nowotworowych na rozwój unaczynienia in vitro, analizowano zachowanie komórek endotelialnych HMEC-1 wysianych na warstwę Matrigelu. Płytki 96-dołkowe były pokrywane Matrigelem w ilości 50 μl bez dodatku czynników wzrostu i inkubowane przez 30 minut w 37ᵒC aby zestalić Matrigel. Na warstwę Matrigelu wysiewano 10 000 komórek HMEC-1 w 200μl medium warunkowanym z komórek Caki-1 shCtrl lub shMCPIP1. Komórki inkubowano przez 4 godziny w 37ᵒC i 5%CO2, 95% wilgotności.

Następnie, komórki wybarwiano barwnikiem przyżyciowym Kalceina AM (1μmol/L).

Zdjęcia poszczególnych dołków wykonywano przy pomocy odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego Olympus IX50 (Olympus) z użyciem suchego obiektywu 4x.

Rozwój sieci unaczynienia i tworzenie punktów rozgałęzień analizowano przy pomocy oprogramowania ImageJ i dodatku Angiogenesis Analyzer (Carpentier G., Angiogenesis Analyzer for ImageJ; dostępnych online:

http://imagej.nih.gov/ij/macros/toolstes/Angiogenesis%20Analyzer.txt).

6.2.12 Test fibrynowy

Test fibrynowy został zaprojektowany do badań nad angiogenezą in vitro i polega na współhodowli komórek endotelialnych wysianych na kulki lateksowe, w macierzy trójwymiarowej z komórkami nowotworowymi Caki-1. Kulki lateksowe, po przygotowaniu wg zaleceń producenta, aktywowano przepłukując ciepłą pożywką hodowlaną. Linię komórkową HMEC-1 trypsynizowano, następnie wirowano (5 minut, 1200 rpm), osad zawieszano w pożywce i komórki liczono w komorze Burkera.

Odpowiednią ilość komórek mieszano z zawiesiną kulek lateksowych tak aby na jedną kulkę przypadało 400 komórek endotelialnych. Taką mieszaninę inkubowano 6 godzin w inkubatorze (37ᵒC, 5%CO2, 95% wilgotności), mieszając ją co 20 minut tak, by zapewnić odpowiednie pokrycie kulek komórkami. Po tym czasie, zawiesinę przeniesiono do butelki hodowlanej T-25cm² i zostawiono na noc w inkubatorze, by komórki niezwiązane z kulkami przyczepiły się do dna naczynia.

Poprzez rozpuszczenie fibrynogenu (2mg/ml) w pożywce hodowlanej z dodatkiem 0,5% BSA przygotowywano żel fibrynowy. Do roztworu fibrynogenu, dodawano przepłukaną zawiesinę kulek lateksowych opłaszczonych komórkami endotelialnymi. Na płytkę 24-dołkową dodano po 0,625U/ml roztworu trombiny a następnie mieszaninę fibrynogenu z kulkami. Całość wymieszano kilkukrotnie przez pipetowanie tak, by nie utworzyć bąbelków. Aby przyspieszyć polimeryzację, płytkę umieszczono na 20 minut w inkubatorze. W tym czasie przygotowywano komórki Caki-1 kontrolne (shCtrl) oraz komórki z obniżonym poziomem białka MCPIP1 (shMCPIP1). Komórki te wysiewano następnie na górę spolimeryzowanego żelu w ilości 30 000 komórek na dołek w medium zawierającym 0,5% BSA. Komórki hodowano w inkubatorze i zmieniano medium co 48 godzin. Aby ocenić stopień migracji komórek endotelialnych w żelu fibrynowym i tworzenie tubularnych struktur, przez sześć dni robiono zdjęcia przy pomocy mikroskopu Nikon Eclipse Ti-S (Nikon) z użyciem suchego obiektywu 10x. Do analizy migracji i mierzenia powierzchni zajmowanej przez komórki HMEC-1 użyto oprogramowania ImageJ (NIH, Bethseda).

6.2.13 Test immunoenzymatyczny ELISA (ang.

Enzyme Linked Immunosorbent Assay)

Ocena ilościowa poziomu białek sekrecyjnych uwalnianych do pożywki hodowlanej, została przeprowadzona przy użyciu testów immunoenzymatycznych typu ELISA. Oznaczenie poziomu IL-6, IL-8 oraz VEGF przeprowadzono zgodnie z protokołem producenta oraz znormalizowano do poziomu białka całkowitego pochodzącego z lizatów komórkowych z których zebrane zostało medium warunkowane. Poziom czynnika SDF-1 wydzielanego przez ludzkie komórki

nowotworowe do mysiego osocza oznaczono według protokołu producenta.

Absorbancja była mierzona przy długości 450 nm wraz z referencją o długości 540 nm przy użyciu czytnika mikropłytek Tecan Spectra Fluor Plus. Doświadczenie wykonano w trzech niezależnych powtórzeniach w tryplikacie.

6.2.14 Analiza poziomu białek przy pomocy macierzy białkowych

Poziom fosforylowanych kinaz w materiale od pacjentów z ccRCC oraz w komórkach Caki-1 po 7-dniowej stymulacji SU11274, sunitinibem lub sorafenibem został zbadany przy pomocy zestawu macierzy białkowych Proteome Profiler Human Phospho-Kinase Array Kit, według protokołu producenta. Komórki Caki-1 przepłukano zimnym buforem PBS, lizowano przy pomocy dołączonego do zestawu buforu lizującego (Lysis buffer 6) i inkubowano 30 minut na lodzie. W przypadku próbek klinicznych, zamrożony kawałek tkanki został zalany buforem lizującym (400 μl), a następnie homogenizowany homogenizatorem ręcznym. Lizaty następnie wirowano przez 5 minut, 15 000g w 4ᵒC. Dalej przeprowadzono pomiar ilości białka w lizacie przy pomocy metody BSA i na każdy zestaw membran nałożono po 600 μg lizatu. Chemiluminescencja była mierzona po 10 minutach inkubacji membran z substratem Chemi Reagent Mix znajdującym się w zestawie przy użyciu urządzenia ChemiDoc. Wartości densytometryczne każdego duplikatu kropek obecnych na membranie były mierzone przy pomocy oprogramowania Image Lab 5.2.1.

6.2.15 Barwienie fioletem krystalicznym

Komórki linii Caki-1 oraz Caki-2 po 96 godzinnej stymulacji SU11274, sunitinibem lub sorafenibem zostały przepłukane buforem PBS i utrwalone 5 minut w temperaturze pokojowej 100% metanolem. Po ściągnięciu metanolu komórki barwiono 20% roztworem fioletu krystalicznego w metanolu (20 minut, temperatura pokojowa). Następnie, każdy dołek przepłukiwano co najmniej 3 razy buforem PBS.

Wysuszone płytki analizowano przy użyciu mikroskopu Nikon Eclipse Ti-S z suchymi obiektywami 10x, 20x oraz 40x. Do analizy długości i powierzchni komórek użyto oprogramowania ImageJ.

6.2.16 Ocena uśpienia komórek przy pomocy barwienia SA β-gal

Komórki Caki-1 zostały wysiane na płytkę 24-dołkową z umieszczonymi na dnie szkiełkami podstawowymi. Po 7-dniowej stymulacji SU11274, sunitinibem lub sorafenibem komórki zostały wybarwione przy pomocy zestawu SA β-gal Staining Kit według protokołu producenta. Po odpłukaniu pożywki, komórki zostały utrwalone przy użyciu Fixative Solution w temperaturze pokojowej. Następnie dodano β-gal Staining Solution, a płytki zabezpieczono parafilmem i inkubowano przez noc w suchym

inkubatorze z temperaturą 37ᵒC. Następnego dnia wyjęto szkiełka z wybarwionymi komórkami i zaklejono przy pomocy medium do preparatów wodnych (Glycergel Mounting Medium). Zdjęcia szkiełek zrobiono przy pomocy mikroskopu fluorescencyjnego Leica DM6 B (Leica Microsystems) z użyciem suchego obiektywu 10x i oprogramowania Leica LAS X.

6.2.17 Analiza cyklu komórkowego

Po siedmiodniowym traktowaniu komórek ccRCC SU11274, sunitinibem lub sorafenibem, komórki odczepiono od naczynia hodowlanego przy pomocy akutazy i policzono. 100 000 komórek utrwalono w zimnym 70% etanolu przez 30 minut w 4ᵒC.

Następnie, komórki zostały zwirowane przez 3 minuty w 3 000 rpm, przepłukane buforem PBS i ponownie zwirowane w tych samych warunkach. Dalej, osad zawieszono w 250 μl roztworu barwiącego (zawierającego 1μl jodku propidyny (50mg/ml) i 25 μl Rnazy A (100mg/ml) w 10 ml PBS). Próbki inkubowano 30 minut w 37ᵒC. Pomiar wykonano przy użyciu cytometru przepływowego Attune NxT Acousting Focusing wraz z oprogramowaniem Attune v2.4.

6.2.18 Barwienie immunocytofluorescencyjne komórek

W celu analizy immunocytofluorescencyjnej, komórki ccRCC jak i komórki HUVEC zostały wysiane na płytkę 24-dołkową z umieszczonymi na dnie szkiełkami podstawowymi. Po zakończeniu stymulacji (Caki-1 lub Caki-2) lub osiągnięciu pełnej gęstości (HUVEC) komórki utrwalano poprzez 15 minutową inkubację w 4%

paraformaldehydzie w temperaturze pokojowej. Następnie, przeprowadzano permabilizację błony i blokowanie w buforze blokującym (1% BSA, 0,3% Triton X-100 w PBS) w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę. Preparaty inkubowano z przeciwciałami pierwszorzędowymi przez noc w temperaturze 4ᵒC w buforze 1% BSA w PBS. Następnego dnia, po trzykrotnym przepłukaniu roztworem PBS, preparaty inkubowano z przeciwciałami drugorzędowymi Alexa Fluor lub barwnikiem falloidyna (1:1 000) wraz barwnikiem jądrowym Hoechst 33258 (1μg/ml) w 1% BSA w PBS. Po godzinnej inkubacji w ciemności, preparaty przepłukano 3 razy PBS i raz wodą destylowaną i zaklejono medium do barwień fluorescencyjnych. Analizę preparatów prowadzono przy użyciu mikroskopu fluorescencyjnego Leica DM6 B, z suchymi obiektywami 10x i 20x oraz obiektywem immersyjnym 63x. Rozcieńczenia użytych przeciwciał zostały przedstawione w Tabeli 2.

6.2.19 Badanie wzrostu guzów in vivo

Do badania roli białka MCPIP1 we wzroście i progresji guzów wykorzystano sześciotygodniowe samice myszy szczepów Foxn1^nu/Foxn1^nu oraz NOD-SCID, o

upośledzonym układzie odpornościowym. Myszom została podana zawiesina komórek Caki-1 lub Caki-2 ze stabilną nadekspresją (pMX MCPIP1, pLIX MCPIP1), mutacją białka MCPIP1 (pLIX D141N) i właściwymi komórkami kontrolnymi (pMX PURO, pLIX PURO), a także wyciszeniem białka MCPIP1 (shMCPIP1) i kontrolą (shCtrl). Komórki zostały podane podskórnie w okolicę tylnej pachwiny (2 500 000 komórek w 200μl PBS – Caki-1; 5 000 000komórek w 200μl PBS – Caki-2). Myszy z podanymi komórkami w systemie TetON były pojone wodą z dodatkiem doksycykliny oraz sacharozy (1%) przez cały okres trwania doświadczenia. Wzrost guzów był monitorowany przez 6 tygodni (shCtrl, shMCPIP1, pLIX PURO, pLIX MCPIP1, pLIX D141N) lub 8 tygodni (pMX PURO, pMX MCPIP1).

Do badania wpływu oporności na SU11274, sunitinib i sorafenib wykorzystano sześciotygodniowe samice myszy szczepu NOD-SCID. Myszom zostały podane komórki Caki-1 przygotowane w następujący sposób. Komórki wysiewano na duże butelki T-75 cm² w gęstości ok. 60%, po 24 godzinach do pożywki hodowlanej dodawano DMSO, SU11274, sunitinib lub sorafenib (stężenia podano w podpunkcie 6.2.3 Stymulacja komórek) i hodowano przez kolejne 3 tygodnie. Co 48 godzin medium było zmieniane na świeże, komórki rozsiewano co 7 dni na nowe butelki. Po okresie 21 dni nastąpiła 7 dniowa przerwa w stymulacji w celu namnożenia komórek, po której wznowiono stymulację przez kolejny tydzień. Następnie zbierano i liczono komórki oporne. Sześciotygodniowym samicom szczepu NOD-SCID podawano zawiesinę komórek Caki-1^GFP (kontrolne - traktowane DMSO oraz oporne na SU11274, sunitinib lub sorafenib) zmieszanych w stosunku 1:1 z dzikimi komórkami Caki-1. Wzrost guzów był monitorowany przez 6 tygodni. Schemat doświadczenia został przedstawiony na rycinie 6.1.

Rycina 6.1. Schemat doświadczeń in vivo z użyciem opornych komórek Caki-1. A.

Schemat otrzymania opornych komórek Caki-1 GFP B. Schemat iniekcji podskórnej. Oporne komórki Caki-1 GFP mieszano w stosunku 1:1 z dzikimi komórkami Caki-1. Taką mieszaninę w PBS wstrzykiwano podskórnie do czterech grup myszy szczepu NOD-SCID.

Wzrost guzów był mierzony przy pomocy suwmiarki 2 razy w tygodniu a otrzymane wartości przeliczono wg wzoru: objętość = szerokość x głębokość². Dodatkowo, w przypadku myszy szczepu Foxn1^nu/Foxn1^nu wykonywano pomiary metodą ultrasonografii wysokiej rozdzielczości 3D (raz w tygodniu). Po zakończeniu

wysiewanie

doświadczeń zwierzęta poddano eutanazji, a tkankę nowotworową, płuca i krew pobrano do dalszych analiz. Guzy nowotworowe podzielono, połowa została poddana analizie histologicznej lub immunohistologicznej, z drugiej połowy wyizolowano RNA oraz białko.

6.2.20 Obrazowanie za pomocą ultrasonografii wysokiej rozdzielczości

Obrazowanie wzrostu guza i rozwoju naczyń krwionośnych w jego obrębie wykonano za pomocą ultrasonografu 3D wysokiej rozdzielczości VEVO2100 (VisualSonics) z głowicą z funkcją PowerDoppler dzięki której można monitorować unaczynienie. Pomiary wykonywano na myszach szczepu Foxn1^nu/Foxn1^nu, które pozbawione były sierści. Przed pomiarem zwierzęta były usypiane wziewnie za pomocą 2% izofluranu (przepływ powietrza 0,5 L/min). Wyniki były analizowane w trybie 3D przy pomocy oprogramowania VEVO 2100.

6.2.21 Analiza krążących komórek nowotworowych przy pomocy cytometrii przepływowej

Ilość krążących we krwi komórek nowotworowych Caki-1 transdukowanych wektorem lentiwirusowym GFP kontrolnych oraz z wyciszeniem białka MCPIP1, została oceniona przy pomocy metod cytometrii przepływowej. 6 tygodni po podaniu komórek nowotworowych do myszy szczepu NOD-SCID wyizolowano ich krew obwodową i analizowano ilość komórek pozytywnych dla GFP. Krew została poddana lizie w celu usunięcia erytrocytów przy pomocy buforu lizującego High-Yeld Lyse Fixative-Free Lysing Solution (30 minut, temperatura pokojowa), rozcieńczona 100 razy w buforze PBS i 10 ml każdej próbki zostało poddane analizie cytometrem przepływowym Attune NxT Acousting Focusing wraz z oprogramowaniem Attunev2.4.

6.2.22 Barwienie immunohistofluorescencyjne CD31 skrawków mrożeniowych

Aby przygotować mrożeniowe preparaty histologiczne, tkankę utrwalono w roztworze 4% paraformaldehydu przez 4 godziny w temperaturze pokojowej, po przepłukaniu w buforze PBS, tkanki przeniesiono do 30% roztworu sacharozy i inkubowano przez noc w 4ᵒC. Następnie, tkanki ponownie przepłukano w buforze PBS oraz zatopiono w medium do zamrażania O.C.T. (ang. Optimal Cutting Temperature Embedding Medium). Preparaty krojono przy użyciu kriostatu na skrawki o grubości 9 μm.

9 μm skrawki tkanki umieszczone na pokrytych poli-L-lizyną szkiełkach zostały wyjęte z -80ᵒC i rozmrożone w temperaturze pokojowej. Po uwodnieniu w buforze PBS, preparaty permeabilizowano (0,1% Triton X-100 w PBS) 20 minut i blokowano (5% BSA, 2% odtłuszczone mleko w PBS) przez kolejną godzinę w temperaturze

pokojowej. Próbki tkankowe obrysowano pisakiem PAP PEN tworzącym hydrofobową barierę dookoła skrawka. Następnie, preparaty inkubowano przez noc z przeciwciałami pierwszorzędowymi przygotowanymi w 1% BSA w PBS, w 4ᵒC.

Następnego dnia, po trzykrotnym przepłukaniu roztworem PBS, preparaty inkubowano z przeciwciałami drugorzędowymi Alexa Fluor wraz barwnikiem jądrowym Hoechst 33258 (1μg/ml) w 1% BSA w PBS. Po godzinnej inkubacji w ciemności, preparaty przepłukano 3 razy PBS i raz wodą destylowaną i zaklejono medium do barwień fluorescencyjnych. Analizę preparatów prowadzono przy użyciu mikroskopu fluorescencyjnego Leica DM6 B, z suchymi obiektywami 10x i 20x oraz obiektywem immersyjnym 63x. Rozcieńczenia użytych przeciwciał zostały przedstawione w Tabeli 2.

6.2.23 Barwienie immunohistochemiczne preparatów tkankowych

Barwienie hematoksyliną i eozyną zostało wykorzystane by ocenić morfologię tkanki. W tym celu usuwano parafinę i uwadniano preparaty parafinowe.

Odzyskiwanie antygenu przeprowadzano poprzez inkubację w 95ᵒC buforze cytrynianowym przez 30 minut. Preparaty schładzano i przepłukiwano w buforze PBS.

Preparaty barwiono hematoksyliną, a następnie dobarwiano eozyną. Do barwienia unaczynienia użyto króliczego poliklonalnego przeciwciała anty-CD31 (1:50, Abcam) oraz zestawu EnVision Detection Systems Peroxidase/DAB, Rabbit/Mouse (Dako) zgodnie z protokołem producenta. Szkiełka zaklejano medium do preparatów bezwodnych. Analizę prowadzono przy użyciu mikroskopu odwróconego Leica DMI6000B wyposażonego w kamerę CCD Leica DFC360 FX (Leica Microsystems).

Zdjęcia analizowano za pomocą oprogramowani Leica LAS X.

6.2.24 Analiza statystyczna

Wszystkie doświadczenia in vitro były przeprowadzone co najmniej trzy razy.

Ilość użytych w poszczególnych doświadczeniach zwierząt lub próbek klinicznych została przedstawiona w podpisach do rycin. Wyniki przedstawiono jako średnia ± SD, z wyjątkiem niektórych doświadczeń z użyciem zwierząt, gdzie wyniki przedstawiono jako średnia ± SEM. Do przygotowania wykresów i analizy statystycznej użyto oprogramowania GraphPad Prism 7, poza wykresem okrągłości/powierzchni komórek, który przygotowano w programie Origin 2019b. Do porównania dwóch grup badawczych użyto niesparowanego testu t-Studenta (unpaired two-tailed t-test). W przypadku trzech lub więcej grup użyto jedno- lub dwukierunkowego testu ANOVA z testem post hoc Bonferroni. Wartości p są oznaczone gwiazdkami na wykresach gdzie (*, P < 0.05; **, P < 0.01; ***, P < 0.001;

****, P < 0.0001 vs kontrola).

7 Wyniki

7.1 Rola białka MCPIP1 w procesach wzrostu, unaczynienia i progresji nowotworowej jasnokomórkowego raka nerki

Jasnokomórkowy rak nerki jest najczęściej występującym typem raka nerki tworzącym silnie unaczynione guzy. Proces zapalny jest kluczowym elementem rozwoju nowotworu, jednak jego regulacja jest słabo poznana. Białko MCPIP1, jest kluczowym modulatorem zaangażowanym w kontrolę stanu zapalnego i utrzymanie homeostazy, a także, może odgrywać ważną rolę w rozwoju nowotworu. W pierwszym etapie badań sprawdzono: i) jak zmiana poziomu lub aktywności białka MCPIP1 w komórkach ccRCC, wpłynie na proliferację i rozwój guzów in vivo, ii) czy poziom białka MCPIP1 w komórkach ccRCC wpłynie na aktywność komórek endotelialnych i rozwój unaczynienia, iii) czy poziom lub aktywność RNazy białka MCPIP1 reguluje aktywność migracyjną komórek nowotworowych, proces przejścia epitelialno-mezenchymalnego oraz tworzenie się przerzutów w warunkach in vivo.

7.1.1 Niski poziom białka MCPIP1 powoduje zwiększoną proliferację komórek nowotworowych in vitro i przyspiesza wzrost guzów in vivo

Do oceny przejściowego obniżenia poziomu białka MCPIP1 w komórkach nowotworowych, wykorzystano sześć różnych siRNA (nazwane kolejno 1-6) wyciszających MCPIP1, wraz z dwoma siRNA kontrolnymi (z niską oraz średnią zawartością reszt GC). Wykazano najwyższą wydajność transfekcji siRNA-4, -5 oraz -6 (Ryc. 7.1. A). Następnie, wykorzystano sekwencje siRNA4 oraz siRNA5 na podstawie których, otrzymano wektory lentiwirusowe nazwane odpowiednio shMCPIP1#4 oraz shMCPIP1#5, z których nr 5 wykazywał lepszą skuteczność w obniżeniu poziomu MCPIP1 (Ryc. 7.1. B). Do dalszych analiz wykorzystano shMCPIP1#5, które dla uproszczenia, w dalszej części pracy, nazwano shMCPIP1.

Komórki Caki-1 i Caki-2 zostały poddane transdukcji, a po kilkudniowej selekcji puromycyną sprawdzono poziom transkryptu i białka MCPIP1. Zaobserwowano 20-50% spadek ilości transkryptu MCPIP1 w zależności od badanej linii komórkowej (Ryc. 7.1. C, E), oraz obniżenie poziomu białka MCPIP1 o ponad 50% w stosunku do kontroli (shCtrl) w obu liniach (Ryc. 7.1. D, F).

Rycina 7.1. Poziom MCPIP1 w komórkach ccRCC po transfekcji i transdukcji. A, Reprezentatywny wynik western blot na komórkach Caki-1 po przejściowym wyciszeniu białka MCPIP1 za pomocą siRNA, z α-tubuliną jako kontrolą ilościową B, Reprezentatywny wynik western blot na komórkach Caki-1 po stabilnym wyciszeniu białka MCPIP1 wektorami lentiwirusowymi, z α-tubuliną jako kontrolą ilościową. C, Poziom mRNA MCPIP1 po stabilnej transdukcji komórek Caki-1 wektorami lentiwirusowymi D, Reprezentatywny wynik western blot na komórkach Caki-1 po wyciszeniu białka MCPIP1 z α-tubuliną jako kontrolą ilościową.

E, Poziom mRNA MCPIP1 po stabilnej transdukcji komórek Caki-2 wektorami lentiwirusowymi F, Reprezentatywny wynik western blot na komórkach Caki-2 po wyciszeniu białka MCPIP1 z α-tubuliną jako kontrolą ilościową. Wyniki przedstawiono jako średnia ± SD z trzech niezależnych doświadczeń, wartości p zostały obliczone przy pomocy testu t-Studenta.

Aby określić, czy wyciszenie białka MCPIP1 wpływa na żywotność i proliferację komórek, komórki linii Caki-1 i Caki-2 hodowano przez okres 4 dni, po czym wykonano test redukcji MTT oraz test proliferacji. Wykazano, że obniżenie poziomu białka MCPIP1 w obu liniach powoduje istotny wzrost żywotności i potencjału proliferacyjnego komórek nowotworowych (Ryc. 7.2. A, B). Największa różnica pomiędzy kontrolą, a wyciszeniem białka MCPIP1 była widoczna po 96 godzinach co sugerowało, że dalsza hodowla mogłaby pogłębić zaobserwowane różnice.

Rycina 7.2. Wpływ obniżenia poziomu białka MCPIP1 na proliferację i żywotność komórek ccRCC. A i B, Test redukcji MTT (żywotność) i analiza proliferacji komórek linii

Caki-63

1 (A) i Caki-2 (B) po 96 godzinnej hodowli. Wyniki przedstawiono jako średnia ± SD z trzech niezależnych doświadczeń, wartości p zostały obliczone przy pomocy testu t-Studenta.

Aby potwierdzić wyniki uzyskane w hodowlach in vitro, wskazujące na znaczenie białka MCPIP1 w proliferacji komórek ccRCC, wykorzystano modele zwierzęce. Kontrolne komórki ccRCC (Caki-1 shCtrl) oraz komórki z niskim poziomem MCPIP1 (Caki-1 shMCPIP1) podano podskórnie do myszy z upośledzonym układem odporności szczepu NOD-SCID. Użycie myszy immunokompetentnych, pozbawionych komórek T oraz B było niezbędne, żeby ludzkie komórki nowotworowe nie zostały odrzucone przez organizm gospodarza. Pomiary wzrostu guzów były wykonywane co tydzień, przez okres 6 tygodni. Wykazano, że już po dwóch tygodniach od podania, komórki z obniżonym poziomem MCPIP1 rosły szybciej tworząc większe guzy (Ryc. 7.3. A). Po zakończeniu doświadczenia różnica w objętości była znacząca, podobnie waga guzów była około trzykrotnie większa w grupie traktowanej komórkami shMCPIP1 w porównaniu z kontrolą (Ryc. 7.3. B).

Dodatkowo, na przekroju poprzecznym guzów wybarwionych hematoksyliną i eozyną widać było znaczącą różnicę wielkości, guzy kontrolne charakteryzowały się małym przekrojem w porównaniu do guzów tworzonych przez komórki Caki-1 shMCPIP1 (Ryc. 7.3. C).

Rycina 7.3. Wpływ obniżenia poziomu białka MCPIP1 na wzrost guzów in vivo. A, Pomiar wzrostu guzów przy pomocy suwmiarki wykonywany tygodniowo przez okres 6 tygodni po podaniu podskórnym komórek Caki-1 z obniżonym poziomem białka MCPIP1. B, Waga guzów po zakończeniu doświadczenia. C, Reprezentatywne zdjęcia przekroju guzów, po wybarwieniu hematoksyliną/eozyną. Do badania wykorzystano 30 myszy szczepu NOD-SCID:

Caki-1 shCtrl, n=14; Caki-1 shMCPIP1, n=16. Wyniki przedstawiono jako średnia ± SD, wartości p zostały obliczone przy pomocy testu t-Studenta.

7.1.2 Aktywność RNazy białka MCPIP1 wpływa na szybkość wzrostu guzów w warunkach in vivo

W celu sprawdzenia czy aktywność RNazy MCPIP1 ma znaczenie w procesie wzrostu guza, przygotowano komórki ccRCC z nadekspresją funkcjonalnej formy dzikiej białka MCPIP1 (pLIX MCPIP1) oraz zmutowanej, pozbawionej aktywności

RNazy (pLIX D141N). Indukcja nadekspresji odpowiedniej formy białka MCPIP1 następowała po dodaniu doksycykliny. Najwyższy wzrost poziomu MCPIP1 był obserwowany po 48 godzinach, inkubacji z doksycykliną, zarówno w komórkach Caki-1 (Ryc. 7.4. A) jak i Caki-2 (Ryc.7.4. B). Dodatkowo, najwyższy poziom MCPIPCaki-1 można było zaobserwować w przypadku formy zmutowanej, która została pozbawiona aktywności RNazy (Ryc. 7.4.).

Rycina 7.4. Poziom białka MCPIP1 w komórkach ccRCC po transdukcji lentiwirusowej.

A, Reprezentatywny wynik western blot po nadekspresji formy dzikiej (pLIX MCPIP1) i zmutowanej (pLIX D141N) MCPIP1 w komórkach Caki-1, z α-tubuliną jako kontrolą ilościową.

B, Reprezentatywny wynik western blot po nadekspresji formy dzikiej i zmutowanej MCPIP1 w komórkach Caki-2, z α-tubuliną jako kontrolą ilościową.

Po podaniu komórek Caki-1 pLIX do myszy szczepu NOD-SCID, zaobserwowano najwolniejszy wzrost guzów i najniższą ich wagę w grupie z podwyższonym poziomem białka MCPIP1 (pLIX MCPIP1), podczas gdy komórki kontrolne (pLIX PURO) i z nadekspresją formy zmutowanej (pLIX D141N) rosły podobnie (Ryc. 7.5. A, B). Linia Caki-2 została podana do bezgrasiczych myszy szczepu Foxn1^nu/Foxn1^nu. Komórki linii Caki-2 z nadekspresją białka MCPIP1 zachowywały się podobnie do komórek Caki-1 tworząc najmniejsze guzy. Największe guzy były utworzone przez komórki Caki-2 z mutacją białka MCPIP1 pozbawionego aktywności RNazy (Ryc.7.5. C, D). Wyniki te potwierdziły, że niski poziom białka MCPIP1, lub brak aktywności enzymatycznej białka MCPIP1 przyspiesza wzrost guzów in vivo.

Rycina 7.5. Wpływ aktywności RNazy białka MCPIP1 w komórkach ccRCC na wzrost guzów in vivo. A, Pomiar wzrostu guzów przy pomocy suwmiarki przez okres 6 tygodni po

podaniu podskórnym komórek Caki-1 z nadekspresją dzikiej lub zmutowanej formy białka

W dokumencie Wydział Biochemii, Biofizyki i Biotechnologii (Stron 54-0)