Białko MCPIP1 jako regulator procesów zapalnych i nowotworzenia

Zapalenie stanowi kluczowy element w ochronie organizmu przed patogenami, a także podczas regeneracji tkanek, gojeniu ran i utrzymaniu homeostazy. Ze względu na podobieństwo zachodzących procesów i zaangażowanie tych samych komórek i szlaków metabolicznych biorących udział w chronicznym zapaleniu, nowotwór jest nazywany raną, która nigdy się nie goi w której toczą się ciągłe procesy zapalne i przebudowa tkanek (154). Zapalenie pełni główną rolę w tworzeniu mikrośrodowiska sprzyjającego wzrostowi guza, w efekcie promując angiogenezę i powstawanie odległych przerzutów (155). Co więcej, przewlekłe zapalenie obserwowane między innymi w wątrobie towarzyszące wrzodom żołądka, niealkoholowemu stłuszczeniu wątroby, czy fibrozie może bezpośrednio wpływać na powstawanie nowotworu (156–158). Oddziaływanie między makrofagami, neutrofilami limfocytami, komórkami podścieliska, fibroblastami i komórkami nowotworowymi, zachodzi przy udziale wielu czynników w tym interleukin, oraz metaloproteinaz (159). Jednym z głównych modulatorów odpowiedzi zapalnej w obrębie nowotworu jest czynnik transkrypcyjny NF-κB (ang. Nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells), który reguluje ekspresję cytokin prozapalnych i czynników wzrostu wydzielanych przez komórki układu

35

odpornościowego oraz podścieliska, modulując ekspresję wielu genów zaangażowanych w rozwój nowotworu i unaczynienie (160).

Proces zapalny reguluje inwazję, EMT i migrację na kilku poziomach.

Wydzielane cytokiny TNF oraz IL-1β indukują ekspresję czynników transkrypcyjnych Twist i Slug (161). Komórki mieloidalne wpływają na produkcję metaloproteinaz i degradację macierzy zewnątrzkomórkowej (162). Produkcja IL-6 powoduje aktywację ścieżki sygnalizacyjnej czynnika transkrypcyjnego STAT3 i ekspresję genów zaangażowanych w angiogenezę, transformację nowotworową, przeżywalność i dalszą produkcję cytokin (163). Większość komórek układu odpornościowego stymuluje także napływ subpopulacji fibroblastów związanych z rakiem (ang. Cancer-associated fibroblasts, CAFs), które stanowią składową mikrośrodowiska guza sprzyjając wzrostowi komórek nowotworowych, nasilają angiogenezę i przebudowę macierzy zewnątrzkomórkowej. Dodatkowo, CAFs regulują infiltrację komórek mieloidalnych i limfocytów T i produkują czynniki zaangażowane w różnicowanie komórek odpornościowych (164). Obecne w dużych ilościach w obrębie nowotworu makrofagi, także produkują cytokiny m.in. IL-17, która nasila produkowanie innych interleukin: IL-1β, IL-6 czy IL-8 oraz TNFα. To z kolei zwiększa napływ neutrofili i komórek śródbłonka w obręb guza (165). Makrofagi swoiste dla guza (ang. Tumor-associated macrophages, TAM) wydzielają m.in. czynniki o działaniu angiogennym oraz główny induktor EMT – TGFβ (166).

Przewlekły stan zapalny predysponuje do rozwoju nowotworu i towarzyszy wszystkim jego etapom, począwszy od inicjacji aż po tworzenie odległych przerzutów.

Jednym z regulatorów stan zapalnego jest białko indukowane przez czynnik MCP-1 (ang. Monocyte Chemoattractant Protein-1-Induced Protein, MCPIP1). Białko to jest zaangażowane w degradację transkryptów prozapalnych cytokin, takich jak 1β, IL-2 czy IL-6 (167–169). Ostatnie badania wskazują na rolę białka MCPIP1 w rozwoju wielu typów nowotworów, w tym jasnokomórkowego raka nerki.

4.4.2 Budowa i mechanizm działania białka MCPIP1

Białko MCPIP1, znane również pod nazwą Regnaza-1, składa się z 599 aminokwasów, natomiast jego masa cząsteczkowa wynosi 66 kDa (170). Białko to, kodowane jest przez gen ZC3H12A, znajdujący się na chromosomie 1 i należy do rodziny białek MCPIP, w skład której wchodzą jeszcze trzy izoformy: MCPIP2, MCPIP3 i MCPIP4 (171). Białko MCPIP1 wykazuje budowę domenową która determinuje jego funkcje. Wyróżniamy N-końcową domenę (ang. N-terminal domain, NTD) oddziałującą z domeną PIN i zawierającą domenę wiążącą ubikwitynę (ang.

36

Ubiquitin association domain, UBA), następnie region bogaty w prolinę (ang. Proline rich region, PRR), domenę katalityczną o aktywności RNazy PIN (ang. PilT N-terminal (PIN)-like RNase domain), która determinuje aktywność białka MCPIP1, motyw palca cynkowego typu CCCH (ang. Zinc finger, ZF) który bierze udział w bezpośrednim wiązaniu RNA, region natywnie nieuporządkowany NDR i region bogaty w prolinę oraz konserwatywny region C-końcowy (ang. Conservative c-terminal region, CCR)(Ryc. 4.5.) (168,172–176).

Rycina 4.5. Schemat budowy domenowej białka MCPIP1. Zaadaptowano i zaprojektowano na podstawie (168, 172-176).

Pierwsze doniesienia opisujące białko MCPIP1 pojawiły się w 2006 roku i dotyczyły badań na kardiomiocytach, gdzie wykazano, że aktywność MCP-1 indukuje nieznany czynnik transkrypcyjny o aktywności proapoptotycznej (177). Dalsze badania wskazały, że MCPIP1 może działać jako deubikwitynaza białek z rodziny TRAF (ang. TNF receptor associated factor), w tym TRAF2, TRAF3 oraz TRAF6, a także białek RIP (ang. Receptor-interacting protein) i NEMO (ang. NF-kappa-B essential modulator), czego efektem jest negatywna regulacja szlaków JNK i NF-κB (178). Kolejne Badania wskazały, że MCPIP1 pośredniczy w procesie usuwania ubikwityny z białka NEMO, poprzez współpracę z deubikwitynazą USP10 (ang.

Ubiquiting specific peptidase 10) (179).

Jednak główną i najlepiej poznaną funkcją białka MCPIP1 jest degradacja transkryptów wielu prozapalnych cytokin i negatywna regulacja stanu zapalnego dzięki aktywności RNazy. Mechanizm działania endonukleazy MCPIP1 polega na rozpoznawaniu i wiązaniu się do II-rzędowych struktur mRNA typu „spinki do włosów”

w rejonie 3’UTR (ang. Untranslated region) i ich destabilizacji (172). Dodatkowo wykazano, że MCPIP1 rozpoznaje trzynukleotydowy motyw pętli struktury spinki:

pirymidyna-puryna-pirymidyna (YRY) (180). Inne badania sugerują jednak, że obecność motywu YRY nie jest niezbędna do rozpoznania i degradacji mRNA przez MCPIP1. Przykładami takich transkryptów jest IL-2, BIRC3 (ang. Baculoviral IAP Repeat Containing 3) czy BCL2L1 (ang. Bcl-2-like protein 1) (167,181). Co ciekawe,

37

analiza przeprowadzona w 2018 roku pokazała, że MCPIP1 może rozpoznawać kilka rodzajów pętli w regionie 3’UTR oraz jednoniciowy RNA (ang. Single stranded RNA, ssRNA) (172). Prawdopodobnie, białko MCPIP1 ulega także homooligomeryzacji w obecności substratu. Wiązanie mRNA zachodzi poprzez dwie związane domenami PIN cząsteczki MCPIP1 (dimer), które łączą się, w obecności substratu mRNA z kolejnym dimerem tworząc pierścieniowy tetramer (172). Obecność aktywnej domeny PIN jest niezbędna do degradacji mRNA, natomiast wiązanie MCPIP1 z helikazą UPF1 (ang. Upframeshift 1) powoduje oddziaływanie domeny NTD z domeną PIN zwiększając aktywność enzymatyczną białka (180). Analiza krystalograficzna potwierdziła, że domena PIN determinuje funkcje białka MCPIP1, wskazała także które aminokwasy są niezbędne do zachowania aktywności enzymatycznej. Dodatnio naładowane reszty kwasu asparaginowego znajdujące się w obrębie domeny PIN:

D141, D225, D226 oraz D244 oddziałują z ujemnie naładowanymi grupami fosforanowymi mRNA (173). Mutageneza ukierunkowana powodująca pojedynczą mutację poprzez zmianę kwasu asparaginowego w pozycji 141 na asparaginę (D141N) prowadziła do powstania nieaktywnego enzymatycznie białka MCPIP1 (168,169). Wykazano także, że do degradacji mRNA przez MCPIP1, niezbędny jest fragment około 20 nukleotydów między kodonem STOP, a strukturą spinki, w regionie terminacji translacji (180). Substratami dla białka MCPIP1 są m. in. IL-1β, IL-6, IL-8, c-Rel, Ox40 czy Gata3 (167–169,182) oraz białko wiążące sekwencję CCAATβ (ang.

CCAAT/enhancer binding protein b, c/EBPβ) czyli czynnik transkrypcyjny kontrolujący szerokie spektrum genów (183). Podobieństwo w strukturze „spinki” prekursorowych cząteczek mikroRNA (pre-miRNA) z regionami 3’UTR transkryptów rozpoznawanych przez MCPIP1, czynią je potencjalnym substratem dla jego aktywności RNazy.

Rzeczywiście, wykazano, że MCPIP1 negatywnie reguluje dojrzewanie wielu miRNA, w tym miR-21, miR-155, miR-135b, miR-200 czy miR-146a, działając jako antagonista dla białka Dicer (175,180).

4.4.3 Regulacja ekspresji białka MCPIP1

Ze względu na szerokie spektrum działania białka MCPIP1 i udział w utrzymaniu homeostazy, jego ekspresja jest ściśle kontrolowana zarówno na poziomie transkrypcyjnym jak i translacyjnym.

Ekspresja genu ZC3H12A jest szybko indukowana po stymulacji: MCP-1 (w monocytach krwi obwodowej, ludzkich komórkach śródbłonka żyły pępowinowej (ang.

Human umbilical vein endothelial cells, HUVEC) czy mysich fibroblastach zarodkowych 3T3-L1) (184–186), IL-1β (w makrofagach, linii komórkowej raka wątroby HepG2 oraz liniach komórkowych THP-1 i U937) (169,171,187,188),

38

lipopolisacharydem (w makrofagach) (169,171), TNFα (liniach THP-1 i U937 oraz pierwotnych mysich hepatocytach) (169,171) czy IL-17 (w pierwotnych keratynocytach mysich i ludzkich) (189,190). Dodatkowo, w odpowiedzi na rozpoznanie wzorców molekularnych związanych z patogenami (and. Pathogen-associated molecular patterns, PAMP) przez receptory TLR (ang. Toll-like receptor), dochodzi do ekspresji MCPIP1 w ludzkich makrofagach pochodzenia monocytarnego (191). Wykazano także, że aktywacja NF-κB, zwiększa ekspresję MCPIP1 pod wpływem stymulacji IL-1β. Podobnie czynniki Elk-1 (ang. ETS domain-containing protein 1) i SRF (ang. Serum response factor), biorą udział w indukcji MCPIP1 po stymulacji LPS i IL-1β (192). Co ciekawe, sam transkrypt MCPIP1 tworzy pętlę w rejonie 3’UTR której obecność powoduje, że staje się substratem dla własnego białka.

W efekcie dochodzi do sprzężenia zwrotnego i negatywnej regulacji poziomu MCPIP1 (169). Dodatkowe badania pokazały, że poziom transkryptu MCPIP1 jest także regulowany przez miR-9 w komórkach mikrogleju i ludzkich chondrocytach (193,194).

Na poziomie potranslacyjnym, regulacja poziomu białka MCPIP1 polega na jego fosforylacji i degradacji proteasomalnej. Wykazano, że pod wpływem stymulacji IL-1β następuje aktywacja kinazy inhibitora NF-κB (IKK), która z kolei powoduje fosforylację MCPIP1 w pozycji S435 i 439, ubikwitynację i w efekcie degradację przez proteasom (195). Nieco inny mechanizm degradacji MCPIP1 przedstawiono w limfocytach T, gdzie aktywacja receptorów TCR prowadzi do cięcia białka MCPIP1 w pozycji R111 pomiędzy domenami NTD i PIN, przez parakaspazę MALT-1 (ang.

Mucosa-associated lymphoid tissue lymphoma translocation protein 1) (196).

4.4.4 MCPIP1 jako negatywny regulator stanu zapalnego i strażnik homeostazy

Białko MCPIP1 jest uważane przede wszystkim za negatywny regulator stanu zapalnego ze względu na jego aktywność RNazy wobec transkryptów cytokin prozapalnych. Jego wysoką ekspresję obserwować można przede wszystkim w komórkach układu odpornościowego takich jak makrofagi, gdzie degraduje mRNA takich cytokin jak IL-6 i IL-12b (po indukcji receptorów TLR), a także transkryptów zaangażowanych w aktywację limfocytów T i TREG, takich jak c-Rel, Icos, Ox40 i IL-2 (168,196). Co więcej, wykazano, że MCPIP1 hamuje ekspresję IL-6, IκBNS i IκBζ zaangażowanych w proces różnicowania limfocytów Th17 (180,197). Kolejne badania wskazały na rolę MCPIP1 w negatywnej regulacji szlaku IL-17, który bierze udział w odpowiedzi na infekcje grzybiczne oraz chorobach autoimmunologicznych w tym w łuszczycy, poprzez degradację mRNA receptorów IL-17Ra i IL-17Rc (190). Z kolei badania naszej grupy przedstawiają rolę białka MCPIP1 w regulowaniu stanu

39

zapalnego indukowanego promieniowaniem UVB (198). Dalsze wyniki potwierdziły, że podwyższenie poziomu MCPIP1 w ludzkich keratynocytach powoduje obniżenie stanu zapalnego w skórze działając na ścieżkę IL-36/IL-36R (199). Myszy charakteryzujące się brakiem ZC3H12A w naskórku rozwijały różnego rodzaju choroby skórne i trudno gojące się rany (200). Jak ważna jest rola białka MCPIP1 w procesach zapalnych obrazują badania z udziałem myszy pozbawionych genu ZC3H12A w całym organizmie, które rozwijają ogólnoustrojowe zapalenie, splenomegalię, podwyższoną produkcję cytokin i upośledzenie narządów limfoidalnych co w konsekwencji prowadziło do przedwczesnej śmierci do 12 tygodnia życia (201). Badania in vivo z udziałem zwierząt z delecją MCPIP1 w limfocytach T prowadziło do aktywacji zarówno komórek T jak i B oraz indukcji choroby autoimmunologicznej (196). Co ciekawe, MCPIP1 negatywnie reguluje ścieżkę sygnałową NF-κB, zaangażowaną w indukcję genów odpowiedzi zapalnej, na zasadzie sprzężenia zwrotnego (176). Podobne obserwacje poczyniono po stymulacji LPS i TNFα, gdzie MCPIP1 hamował aktywację NF-κB i AP-1, przez co pośrednio wpływał na szereg procesów komórkowych takich jak proliferacja czy różnicowanie (176,178).

Oprócz regulacji procesów zapalnych, białko MCPIP1 jest również zaangażowane w procesy fizjologiczne takie jak adipogeneza, angiogeneza czy różnicowanie. Badania prowadzone na linii 3T3-L1 sugerują, że nadekspresja MCPIP1 zaburza adipogenezę przez degradację transkryptu c/EBPβ i obniżenie PPARγ, które niezbędne są podczas różnicowania pre-adipocytów do dojrzałych adipocytów (202,203). Z kolei inna grupa, przedstawiła przeciwstawne wyniki, gdzie wysoki poziom MCPIP1, aktywuje czynniki transkrypcyjne c/EBPα, c/EBPβ i c/EBPδ (184).

Szereg prac naukowych pokazuje rolę białka MCPIP1 w różnicowaniu wielu typów komórek. Podczas biogenezy osteoklastów wykazano, że stymulacja MCP-1 ludzkich monocytów szpiku kostnego powodowała różnicowanie do prekursorów osteoklastów za pośrednictwem MCPIP1 (204). Delecja MCPIP1 w keratynocytach powodowała utratę kontroli nad ich proliferacją i różnicowaniem co rozwijało lokalny stan zapalny i choroby skóry (200). Inne badania pokazały, że mysie MSC posiadające nadekspresję MCPIP1 posiadały wyższy poziom transkryptów Nkx2.5, Gata-4, Myl-2 i Myh6 w porównaniu z kontrolą i rozpoczynały różnicowanie kardiomiogenne (205). Dodatkowo, białko MCPIP1 indukowało różnicowanie ludzkich monocytów w komórki o fenotypie endotelialnym promując w ten sposób angiogenezę (185).

40

Pierwsze doniesienia dotyczące udziału MCPIP1 w angiogenezie pojawiły się w 2008 roku, gdzie wykazano, że indukcja MCPIP1 w komórkach HUVEC za pomocą MCP-1 powodowała formowanie struktur przypominających kapilary. Przejściowe wyciszenie MCPIP1, przy pomocy specyficznych siRNA, hamowało ekspresję genów zaangażowanych w angiogenezę: VEGF i HIF1α (206). Dalsze badania tego samego zespołu potwierdziły rolę MCPIP1 w indukcji angiogenezy, pokazując mechanizm bazujący na rozpoznawaniu przez MCPIP1 dwóch miRNA zaangażowanych w hamowanie angiogenezy: miR20b oraz miR34a, które tłumią translację odpowiednio HIF1α i SIRT-1 (ang. Silent information regulator) (207). Wykorzystane w badaniach komórki HUVEC z mutacją D141N nie były w stanie tworzyć tubularnych struktur, a poziom obu miRNA nie ulegał zmianie co wskazało, na istotną rolę aktywności RNazy MCPIP1 w kontroli angiogenezy (207). Kolejne doniesienia wykazały, że mezenchymalne komórki macierzyste (ang. Mesenchymal stem cells MSC) pochodzące z mysiego szpiku kostnego transdukowane wektorem retrowirusowym z nadekspresją MCPIP1 zaczynały różnicować w komórki endotelialne, tworzące struktury kapilarne z dużą ilością rozgałęzień. Dodatkowo, podwyższony poziom MCPIP1 korelował z wyższym poziomem markerów związanych z angiogenezą, w tym vWF, Tie-2 czy VE-kadheryną (205). Co ciekawe, ze względu na swoją aktywność enzymatyczną względem transkryptu IL-8, można zasugerować, że MCPIP1 negatywnie kontroluje rozwój unaczynienia (182).

4.4.5 Rola białka MCPIP1 w rozwoju nowotworu

Kontrola odpowiedzi immunologicznej, proliferacji komórkowej i różnicowania sprawiła, że białko MCPIP1 stało się obiektem wielu badań dotyczących rozwoju nowotworów. Po raz pierwszy rolę MCPIP1 w raku piersi przedstawiono w 2015 roku, gdzie MCPIP1 stabilizował poziom białka RGS2 (ang. Regulator of G protein signaling 2), którego poziom był zdecydowanie niższy w tkance nowotworowej i linii MCF7 w porównaniu z tkanką prawidłową i normalną linią komórek piersi MCF10A (208). Rok później wykazano niższy poziom MCPIP1 w tkankach nowotworowych w porównaniu ze zdrowymi, który silnie korelował z niską przeżywalnością i gorszymi rokowaniami pacjentek z rakiem piersi (181). Indukowana doksycykliną nadekspresja MCPIP1 w komórkach raka piersi MDA-MB-231 i 4T12 zwiększała apoptozę komórek, gdzie obserwowano wzrost ekspresji kaspazy 3 oraz PARP1, a także obniżało ilość przerzutów w badaniach in vivo w porównaniu z kontrolą. Dodatkowo, MCPIP1 negatywnie regulował szereg antyapoptotycznych genów Bcl2L1, Bcl2A1, Birc3, RelB i Bcl3. Z kolei obniżenie poziomu białka MCPIP1 promowało proliferację komórek nowotworowych (181). Podobne wyniki otrzymano w badaniach nad neuroblastomą,

41

gdzie linie komórkowe ludzkiej neuroblastomy charakteryzowały się znikomym poziomem zarówno transkryptu jak i białka MCPIP1 (209,210). Stabilna nadekspresja MCPIP1 w linii BE(2)-C powodowała znaczący spadek ekspresji MYCN wraz z potencjałem proliferacyjnym oraz żywotnością (210). W komórkach raka trzustki, białko MCPIP1 obniżało poziom miR-200, które jest zaangażowane w regulację EMT (211).

Wyniki naszej grupy wskazały podobnie jak w przypadku raka piersi czy neuroblastomy, że poziom MCPIP1 znacząco spada w tkance nowotworowej w porównaniu z otaczającą zdrową u pacjentów z jasnokomórkowym rakiem nerki (212). Doświadczenia przeprowadzone na linii komórkowej Caki-1 pokazały, że ekspresja MCPIP1 zależy od aktywności proteasomu oraz hipoksji. Co ciekawe, białko MCPIP1 negatywnie regulowało poziom HIF1α oraz HIF2α, a jego nadekspresja powodowała obniżenie transkryptów VEGFA, GLUT1 oraz IL-6 przez co pośrednio kontrolowało rozwój i angiogenezę ccRCC (212). Sekwencjonowanie nowej generacji komórek Caki-1 z nadekspresją dzikiej lub zmutowanej formy MCPIP1 ujawniło zmiany w wielu procesach w tym w cyklu komórkowym, replikacji i naprawie DNA (213). Walidacja wyników RNAseq wykazała, że nadekspresja dzikiej formy białka MCPIP1 powodowała wzrost poziomu białka p21 zaangażowanego w kontrolę cyklu komórkowego oraz spadek genów zaangażowanych w angiogenezę w tym VEGFA, AGR2 czy MMP2 (213). Najnowsza analiza mikromacierzy próbek od pacjentów z ccRCC wykazała spadek genów supresorowych PTEN, RECK i TIMP3 wraz z progresją nowotworu (214). Nadekspresja MCPIP1 w komórkach Caki-1 i Caki-2 powodowała wzrost ich transkryptów in vitro oraz in vivo. Co ciekawe, zaobserwowano, że wysoki poziom MCPIP1 powoduje spadek ekspresji MMP2, MMP9, które dodatkowo są negatywnie regulowane przez TIMP3 i RECK (214).

Powyższe prace sugerują, że białko MCPIP1 może regulować rozwój nowotworów na wielu poziomach, z jednej strony promując ekspresję genów supresorowych i proapoptotycznych, z drugiej degradując transkrypty czynników zaangażowanych w proliferację, angiogenezę.

42