Wydział Biochemii, Biofizyki i Biotechnologii

1

Wydział Biochemii, Biofizyki i Biotechnologii

Rola białka MCPIP1 w procesach wzrostu, unaczynienia i progresji nowotworowej

jasnokomórkowego raka nerki

Paulina Marona

Rozprawa doktorska wykonana pod opieką

Dr hab. Katarzyny Miękus

W Zakładzie Biochemii Ogólnej,

Wydziału Biochemii, Biofizyki i Biotechnologii Uniwersytetu Jagiellońskiego

Recenzenci:

Dr hab. Anna Żaczek

Prof. dr hab. n. med. Piotr Widłak

Kraków 2020

2

Pracę dedykuję Rodzicom i Dziadkowi

3

Szczególnie pragnę podziękować Pani Promotor dr hab. Katarzynie Miękus za jej nieustające wsparcie, cenne wskazówki zarówno merytoryczne jak i praktyczne i pomoc w rozwiązywaniu problemów nie tylko badawczych, a także za możliwość realizacji badań zawartych w niniejszej rozprawie doktorskiej.

Pragnę podziękować Pani prof. dr hab. Jolancie Jurze za cenne uwagi i pomoc oraz za możliwość pracy w Zakładzie Biochemii Ogólnej i stworzenie dobrej i kreatywnej atmosfery pracy.

Dziękuję bardzo Pani dr hab. Annie Żaczek i Panu prof. dr hab. n. med.

Piotrowi Widłakowi za podjęcie się recenzji niniejszej pracy oraz wszystkie cenne uwagi i komentarze.

Dziękuję wszystkim koleżankom i kolegom z Zakładu z którymi miałam okazję współpracować, przede wszystkim Judycie oraz Oliwii, a także Beacie, Magdzie, Piotrkowi, Mateuszowi, Natalii, Róży, Jurkowi, Agacie, Darkowi – za pomoc w wykonywaniu doświadczeń, ciekawe dyskusje i miłą atmosferę.

Dziękuję koleżankom i kolegom z innych Zakładów Wydziału Biochemii, Biofizyki i Biotechnologii za wszelką pomoc.

Rodzicom, Rodzinie i Przyjaciołom serdecznie dziękuję za ich wsparcie w realizacji swojej pasji, dobre słowa i wiarę we mnie.

4

FINANSOWANIE

Badania wykonane w ramach rozprawy doktorskiej były współfinansowane ze środków Narodowego Centrum Nauki, w ramach projektu Preludium 13: „Rola

Sonata 5: „Analiza molekularna progresji jasnokomórkowego raka nerki w

Autorka rozprawy doktorskiej jest stypendystką programów: Etiuda 6 przyznanym przez Narodowe Centrum Nauki – UMO-2018/28/T/NZ5/00347, stypendium START 2018 przyznanym przez

Wydział Biochemii, Biofizyki i Biotechnologii Uniwersytetu Jagiellońskiego był

członkiem Konsorcjum, które uzyskało status Krajowego Naukowego

5

Spis treści

1 Rozwinięcie skrótów ... 8

2 Streszczenie ... 11

3 Summary ... 13

4 Wstęp teoretyczny ... 15

4.1 Jasnokomórkowy rak nerki ... 15

4.1.1 Epidemiologia i obraz histologiczny raka nerki ... 15

4.1.2 Podłoże genetyczne jasnokomórkowego raka nerki ... 16

4.1.3 Mutacje genu VHL w jasnokomórkowym raku nerki ... 17

4.2 Angiogeneza (neowaskularyzacja) w procesie rozwoju nowotworu ... 19

4.2.1 Charakterystyka procesu angiogenezy ... 19

4.2.2 Etapy angiogenezy ... 20

4.3 Rola receptora c-Met w progresji ccRCC ... 23

4.3.1 Charakterystyka receptora c-Met ... 23

4.3.2 Receptor c-Met w raku nerki ... 26

4.3.3 Znaczenie receptora c-Met w regulacji procesu przejścia epitelialno- mezenchymalnego (EMT) ... 27

4.3.4 Rola receptora c-Met w aktywności migracyjnej i przerzutowaniu ... 30

4.3.5 Terapie jasnokomórkowego raka nerki ... 31

4.3.6 Oporność na inhibitory angiogenezy ... 32

4.3.7 Receptor c-Met, a nabywanie oporności na leki celowane ... 33

4.4 Białko MCPIP1 jako regulator procesów zapalnych i nowotworzenia... 34

4.4.1 Procesy zapalne w chorobie nowotworowej ... 34

4.4.2 Budowa i mechanizm działania białka MCPIP1 ... 35

4.4.3 Regulacja ekspresji białka MCPIP1 ... 37

4.4.4 MCPIP1 jako negatywny regulator stanu zapalnego i strażnik homeostazy ... 38

4.4.5 Rola białka MCPIP1 w rozwoju nowotworu ... 40

5 Cel pracy doktorskiej ... 42

6 Materiały i metody ... 43

6.1 Materiały ... 43

6.1.1 Materiał ludzki ... 43

6.1.2 Materiał zwierzęcy ... 43

6.1.3 Materiał biologiczny... 43

6.1.4 Odczynniki ... 44

6.1.5 Przeciwciała ... 46

6

6.1.6 Startery ... 47

6.2 Metody ... 48

6.2.1 Hodowle komórkowe... 48

6.2.2 Przejściowa transfekcja małym interferującym RNA (siRNA) ... 49

6.2.3 Stabilna transdukcja za pomocą wektorów wirusowych ... 49

6.2.4 Stymulacja komórek ... 50

6.2.5 Analiza mikromacierzy ... 51

6.2.6 Izolacja i analiza poziomu białek metodą western blot ... 51

6.2.7 Ilościowa analiza PCR w czasie rzeczywistym ... 52

6.2.8 Test redukcji MTT ... 53

6.2.9 Test proliferacji ... 54

6.2.10 Test migracji – zarastanie rany ... 54

6.2.11 Test tworzenia się rozgałęzień w hodowli komórek endotelialnych .... 54

6.2.12 Test fibrynowy ... 55

6.2.13 Test immunoenzymatyczny ELISA (ang. Enzyme Linked Immunosorbent Assay) ... 55

6.2.14 Analiza poziomu białek przy pomocy macierzy białkowych ... 56

6.2.15 Barwienie fioletem krystalicznym ... 56

6.2.16 Ocena uśpienia komórek przy pomocy barwienia SA β-gal ... 56

6.2.17 Analiza cyklu komórkowego ... 57

6.2.18 Barwienie immunocytofluorescencyjne komórek ... 57

6.2.19 Badanie wzrostu guzów in vivo ... 57

6.2.20 Obrazowanie za pomocą ultrasonografii wysokiej rozdzielczości ... 59

6.2.21 Analiza krążących komórek nowotworowych przy pomocy cytometrii przepływowej ... 59

6.2.22 Barwienie immunohistofluorescencyjne CD31 skrawków mrożeniowych ... 59

6.2.23 Barwienie immunohistochemiczne preparatów tkankowych ... 60

6.2.24 Analiza statystyczna ... 60

7 Wyniki ... 61

7.1 Rola białka MCPIP1 w procesach wzrostu, unaczynienia i progresji nowotworowej jasnokomórkowego raka nerki ... 61

7.1.1 Niski poziom białka MCPIP1 powoduje zwiększoną proliferację komórek nowotworowych in vitro i przyspiesza wzrost guzów in vivo ... 61

7.1.2 Aktywność RNazy białka MCPIP1 wpływa na szybkość wzrostu guzów w warunkach in vivo ... 63

7.1.3 Aktywność RNazy białka MCPIP1 reguluje unaczynienie guzów w warunkach in vivo ... 65

7

7.1.4 Niski poziom białka MCPIP1 wpływa na destabilizację połączeń międzykomórkowych, aktywną migrację komórek endotelialnych i tworzenie naczyniopodobnych struktur w warunkach in vitro ... 68 7.1.5 Białko MCPIP1 reguluje poziom wydzielanych czynników

proangiogennych w komórkach nowotworowych ... 71 7.1.6 Białko MCPIP1 reguluje proces przerzutowania wpływając na oś SDF- 1/CXCR4 ... 72 7.1.7 Niski poziom MCPIP1 zwiększa aktywność migracyjną i powoduje nabywanie cech mezenchymalnych w komórkach ccRCC ... 75 7.1.8 Aktywność RNazy MCPIP1 reguluje fosforylację receptora c-Met ... 77 7.2 Poziom białka MCPIP1 w próbkach klinicznych pacjentów z ccRCC ... 79 7.3 Poziom białka MCPIP1, a oporność na terapie celowane w

jasnokomórkowym raku nerki ... 82 7.3.1 Sunitinib i sorafenib wpływają na potencjał proliferacyjny i cykl

komórkowy ccRCC ... 82 7.3.2 Stymulacja sunitinibem i sorafenibem wpływa na fenotyp komórek ccRCC i zmienia ich profil białkowy ... 84 7.3.3 Oporność na sunitinib i sorafenib wpływa na progresję ccRCC w warunkach in vivo ... 87 7.3.4 Białko GSK3β reguluje poziom receptora c-Met oraz białka MCPIP1 90 8 Dyskusja ... 92 8.1 Białko MCPIP1 negatywnie reguluje proliferację i żywotność ... 93 8.2 Poziom białka MCPIP1 w komórkach nowotworowych wpływa na

aktywność komórek śródbłonka i angiogenezę ... 95 8.3 Białko MCPIP1 negatywnie reguluje aktywność migracyjną i progresję nowotworu ... 99 8.4 Białko MCPIP1 stanowi czynnik prognostyczny w ccRCC ... 102 8.5 Oporność na sunitinib i sorafenib jest regulowana przez białko MCPIP1 i receptor c-Met ... 104 9 Wnioski końcowe ... 110 10 Bibliografia ... 112

8

1 Rozwinięcie skrótów

Akt (ang. Protein Kinase B) – kinaza białkowa Akt AP-1 (ang. Activator Protein 1) - Czynnik transkrypcyjny BAP1 (ang. BRCA1 associated protein-1)

BCA (ang. Bicinchonic acid) – kwas bicynchoniowy

BSA (ang. Bovine serum albumin) – albumina z surowicy wołowej CBP (ang. CREB binding protein) – białko wiążące CREB

ccRCC (ang. Clear cell renal cell carcinoma) – jasnokomórkowy rak nerki

CD31 (ang. Cluster of differentiation 31, PECAM- Platelet endothelial cell adhesion molecule) antygen różnicowania komórkowego 31, cząsteczka adhezji komórkowej płytek I śródbłonka

c/EBP β (ang. CCAAT/enhancer binding protein b) – białko wiążące sekwencję CCAATβ cDNA (ang. Complementary DNA) – komplementarny DNA

CDK (ang. Cyklin-dependent kinase) – kinaza zależna od cyklin

Ct (ang. Cycle treshold) – numer cyklu reakcji qPCR w którym fluorescencja emitowana przez próbkę osiągnęła wartość progową

CTC (ang. Circulating tumor cells) – krążące komórki nowotworowe CSC (ang.Cancer stem cells) - nowotworowe komórki macierzyste

CXCL (ang. CXC Ligand) - chemokina o motywie Cysteina-Aminokwas-Cysteina CXCR4 (ang. Chemokine receptor 4) – receptor dla chemokin 4

DAPI (ang. 4’-6-diamidino-2-phenylindole) – 4'-6-diamidyno-2-fenyloindol DMSO (ang. Dimethyl sulfoxide) – dimetylosulfotlenek

DNA (ang. Deoxyrybonucleic acid) – kwas deoksyrybonukleinowy

dNTP (ang. Deoxynucleosides triphosphate) - trifosforany deoksyrybonukleozydów EC (ang. Endothelial cell) – komórka endotelialna

e-kadheryna (ang. Epithelial cadherin)

EDTA (ang. Ethylenediaminetetraacetic Acid) - Kwas etylenodiaminotetraoctowy EF2 (ang. Elongation factor-2) – czynnik elongacyjny-2

EGF (ang. Epidermal Growth Factor) - Epidermalny czynnik wzrostu

ELISA (ang. Enzyme-linked immunosorbent assay) – test immunoenzymatyczny Elk-1 (ang. ETS domain-containing protein 1)

EMT (ang. Epithelial-mesenchymal transition) - przejście epitelialno-mezenchymalne

EpCAM (ang. Epithelial cell adhesion molecule) – cząsteczka adhezji komórek nabłonkowych EPO Erytropoetyna

ERK (ang. Extracellular Signal-Regulated Kinase) - Kinazy białkowe aktywowane czynnikami zewnątrzkomórkowymi

FAK (ang. Focal adhesion kinase) – kinaza ogniskowo-adhezyjna FBS (ang. Fetal bovine serum) – bydlęca surowica płodowa

9

GAB1 (ang. GRB2-associated binding protein 1) – białko oddziałujące z GRB2

GAPDH (ang. Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase) – dehydrogenaza aldehydu 3- fosfoglicerynowego

GFP (ang. Green fluorescent protein) – zielone białko fluorescencyjne GLUT-1 (ang. Glucose transporter 1) – transporter glukozy

GSK3β (ang. Glycogen synthase kinase 3 beta) – kinaza syntazy glikogenowej

GRB2 (ang. Growth factor receptor-bound protein 2) – białko wiążące receptor dla czynnika wzrostu typu 2)

HGF (ang. Hepatocyte growth factor) – czynnik wzrostu hepatocytów HIF (ang. Hypoxia-inducible factor) – czynnik indukowany przez hipoksję HMEC-1 (ang. Human microvascular endothelial cells)

HUVEC (ang. Human umbilical vein endothelial cells)

HRE (ang. Hypoxia responsive elelments) – element odpowiedzi na hipoksję HRP (ang. Horseradish peroxidase) – peroksydaza chrzanowa

IKK (ang. IκB Kinase) - Kompleks o aktywności kinazy dla IκB IκB Inhibitor κB

IL (ang. Interleukin) – interleukina INF Interferon

LIF (ang. Leukemia inhibitory factor) – czynnik hamujący białaczkę LPS (ang. Lipopolisaccharide) - Lipopolisacharyd

MAPK (ang. Mitogen-activated protein kinases) – kinazy białkowe aktywowane mitogenami MCP-1 (ang. Monocyte Chemoattractant Protein-1) - Czynnik chemotaktyczny monocytów 1 MCPIP1 (ang. Monocyte Chemoattractant Protein-1 Induced Protein 1) - Białko indukowane przez czynnik MCP-1

MET (ang. Mesenchymal-epithelial transition) - przejście mezenchymalno-epitelialne MMP (ang. Matrix Metalloproteinase) - Metaloproteinaza macierzy zewnątrzkomórkowej mRNA (ang. Messenger RNA) – matrycowy RNA

mTOR (ang. Mammalian Target Of Rapamycin) - Ssaczy cel Rapamycyny n-kadheryna (ang. Neural cadherin)

NF-κB (ang. Nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells) – czynnik jądrowy oddziałujący ze wzmacniaczem sekwencji lekkiego łańcucha immunoglobuliny w aktywowanych limfocytach B

PAK (ang. P21-activated kinase) – kinaza aktywowana p21

PBS (ang. Phosphate buffered saline) – zbuforowany roztwór soli fizjologicznej PCR (ang. Polymerase chain reaction) - łańcuchowa reakcja polimerazy PDGF (ang. Platelet-derived growth factor) - Płytkopochodny czynnik wzrostu PI3K (ang. Phosphatidylinositol 3-kinase) - 3-kinaza fosfatydyloinozytolu

PIN (ang. PilT N- Terminus) - Domena homologiczna do N-terminalnego fragmentu białka PilT

10

Rac1 (ang. Ras-related C3 botulinum toxin substrate 1) – substrat toksyny botulinowej C3 związany z Ras

RAS (ang. Rat sarcoma viral homolog) RB1 (ang. Retinoblastoma) - siatkówczak

qRT PCR (ang. Quantitative reverse transcriptase PCR) – ilościowa RT-PCR w czasie rzeczywistym RNA (ang. Rybonucleic acid) – kwas rybonukleinowy

RNaza Rybonukleaza

RT (ang. Reverse transcription) – odwrotna transkrypcja

RTK (ang. Tyrosine kinase receptor) – receptor o właściwościach kinazy tyrozynowej

SDF1 (ang. Stromal cell-derived factor-1 alpha) – czynnik-1 alfa pochodzenia podścieliskowego SD (ang. Standard deviation) – odchylenie standardowe próby

SEM (ang. Standard error of mean) – błąd standardowy próby siRNA (ang. Short interfering RNA) – małe interferujące RNA SOS (ang. Son of Sevenless)

STAT3 (ang. Signal transducer and activator of transcription 3) TBS (ang. Tris buffered saline) – bufor trisowy

TCF (ang. T-cell factor) – czynnik transkrypcyjny komórek T

TEMED (ang. Tetramethylethylenediamine) – N,N,N’,N’-tetrametyloetylenodiamina TGF (ang. Transforming growth factor) – transformujący czynnik wzrostu

TKI (ang. Tyrosine kinase inhibitor) – inhibitor receptorów o właściwości kinazy tyrozynowej TNF α (ang. Tumor necrosis factor-αlpha) – czynnik martwicy nowotworów alfa

UTR (ang. Untranslated region) – obszar mRNA nie ulegający translacji

VEGF (ang. Vascular endothelial growth factor) – czynnik wzrostu śródbłonka naczyniowego VE-kadheryna (ang. Vascular endothelial cadherin)

VEGF-R1 (ang. VEGF receptor-1) – receptor 1 czynnika VEGF, inaczej FLT1 VEGF-R2 (ang. VEGF receptor-2) – receptor 2 czynnika VEGF

VHL Białko von Hippel-Lindau

ZEB (ang. Zinc finger E-box binding homeobox) ZO-1 (ang. Zonula occludens-1)

11

2 Streszczenie

Nowotwory nerki dotykają co roku prawie 300 tysięcy osób, a 120 tysięcy umiera z powodu tej choroby. Najczęściej spotykanym typem jest jasnokomórkowy rak nerki który stanowi ok. 80% wszystkich przypadków. Ze względu na brak typowych objawów w pierwszych stadiach, w chwili wykrycia choroby przerzuty stwierdza się już u jednej trzeciej pacjentów, a szanse na przeżycie dramatycznie maleją. Obecnie najczęściej stosowanym leczeniem jest wycięcie guza z fragmentem bądź całą nerką, a następnie chemio- lub radioterapia, które wiążą się z licznymi skutkami ubocznymi.

Ze względu na wysoki stopień unaczynienia guzów, w stadium zaawansowanym, terapia opiera się na nowych lekach antyangiogennych blokujących receptory niektórych kinaz tyrozynowych. Niestety, taka forma terapii nie jest w pełni satysfakcjonująca ponieważ wydłuża czas przeżycia chorych jedynie o kilka miesięcy co więcej, nowotwór bardzo szybko wykształca oporność na stosowane leki.

ccRCC tworzy guzy silnie unaczynione, ze względu na częste mutacje genu supresorowego von Hippel-Lindau i nadmierne wydzielanie czynników proangiogennych. Nabywanie przez komórki umiejętności do opuszczania pierwotnego ogniska, aktywnej migracji i osiedlania się w odległych narządach, warunkowana jest wieloma czynnikami m. in. stopniem unaczynienia, obecnością komórek układu immunologicznego, a także nabieraniem przez komórki epitelialne właściwości i fenotypu komórek mezenchymalnych. Istotną rolę, zarówno w procesie angiogenezy jak i przejścia epitelialno-mezenchymalnego pełni receptor c-Met, ponieważ stymuluje proliferację i hamuje apoptozę oraz reguluje szereg czynników odpowiedzialnych za przerzutowanie.

Procesy zapalne odgrywają bardzo ważną rolę w procesie wzrostu i rozwoju nowotworu. Jednym z modulatorów odpowiedzi zapalnej jest białko MCPIP1, kodowane przez gen ZC3H12A. Białko to zaangażowane jest w negatywną regulację stanu zapalnego dzięki aktywności RNazy, która pozwala na degradację transkryptów cytokin prozapalnych. Rosnąca liczba publikacji naukowych sugeruje, że białko MCPIP1 może istotnie wpływać na rozwój nowotworu, poprzez pośrednią lub bezpośrednią regulację czynników zaangażowanych w procesy wzrostu, proliferacji czy śmierci komórkowej. Co więcej, wykazano że poziom MCPIP1 w tkance nowotworowej jest znacząco niższy w porównaniu z otaczającą zdrową, a także może regulować poziom czynników proangiogennych takich jak VEGF czy HIF.

Celem niniejszej pracy doktorskiej było określenie roli białka MCPIP1 w procesach wzrostu, unaczynienia i progresji jasnokomórkowego raka nerki, a także

12

jego wpływ na nabieranie przez komórki nowotworowe oporności na leki celowane sunitinib i sorafenib.

W pierwszym etapie badań wykorzystano linie komórkowe Caki-1 oraz Caki-2 z obniżonym poziomem białka MCPIP1, a także ze stabilną nadekspresją dzikiej lub zmutowanej formy MCPIP1. Wykazano, że niski poziom białka MCPIP1 lub zahamowanie jego aktywności RNazy prowadzi do zwiększenia potencjału proliferacyjnego komórek nowotworowych oraz przyspieszenia wzrostu guzów in vivo. Dodatkowo, brak białka MCPIP1 wpływa na wzrost ilości funkcjonalnych naczyń krwionośnych w porównaniu z kontrolą. Nadekspresja dzikiej formy MCPIP1 spowalnia wzrost guzów i zmniejsza unaczynienie in vivo. W toku doświadczeń wykazano również, że od poziomu białka MCPIP1 w komórkach nowotworowych zależy aktywacja komórek endotelialnych. Zarówno komórki ccRCC z wyciszeniem jak i mutacją w domenie RNazowej MCPIP1 wydzielają zdecydowanie więcej czynników proangiogennych w porównaniu z komórkami kontrolnymi czy z nadekspresją dzikiej formy MCPIP1, co w konsekwencji wpływa na rozluźnianie połączeń komórkowych przez internalizację VE-kadheryny i aktywuje komórki endotelialne do migracji. Równocześnie, po obniżeniu aktywności MCPIP1, dochodzi do zwiększenia ekspresji genów CXCR4, SDF-1 czy c-Met, odpowiedzialnych za podziały komórkowe i przerzutowanie. Co istotne, nadekspresja MCPIP1 zmniejsza ilość powstających przerzutów oraz hamuje proces EMT.

Analizując próbki kliniczne pacjentów w różnym stadium zaawansowania ccRCC wykazano, że razem z obniżającym się poziomem białka MCPIP1 w kolejnych stadiach choroby, rośnie poziom receptora c-Met oraz innych białek zaangażowanych w progresję nowotworową.

W ostatnim etapie badań zaobserwowano, że mechanizm oporności na leki sunitinib i sorafenib może polegać na podwyższeniu aktywności receptora c-Met z jednoczesnym obniżeniem poziomu białka MCPIP1, co zwiększa agresywność komórek nowotworowych, ilość przerzutów oraz zmienia ich fenotyp.

Podsumowując, białko MCPIP1 może być markerem zaawansowania choroby nowotworowej oraz pełnić kluczową rolę w rozwoju ccRCC, poprzez kontrolę procesu proliferacji, progresji oraz wydzielania czynników proangiogennych. Uzyskane wyniki wskazały także na zależną regulację białka MCPIP1 i receptora c-Met oraz ich wpływ na lekooporność komórek ccRCC. Biorąc pod uwagę wyniki przedstawione w niniejszej pracy i opublikowane przez inne zespoły badawcze, można zasugerować, że MCPIP1 może być uniwersalnym białkiem supresorowym.

13

3 Summary

Every year, kidney cancers affect nearly 300 000 people, and 120 000 die of this disease. The most common type is clear cell renal cell carcinoma (ccRCC) which comprises 80% of all cases. Due to the lack of typical symptoms in the first stages, at the time of diagnosis, metastases are found in one-third of patients, and the chances of survival are dramatically reduced. Currently, the most commonly used treatment is tumor excision with partial or total nefrectomy, followed by chemo- or radiotherapy, which are associated with numerous side effects. Due to high level of tumor vasculature, therapy of more advanced stages of ccRCC is based on new antiangiogenic drugs, which inhibit multiple tyrosine kinase receptors such as VEGFR or PDGFR. Treatment with small molecules showed in approximately 38% of patients significant tumor control. However, despite of the efficacy of therapy, ccRCC often develops drug resistance, and the majority of patients who receive such treatment exhibit progressive disease after one year.

Formation of new blood vessels is a critical step during tumorigenesis and metastatic spread. ccRCC develops highly vascularized tumors due to common mutation in von Hippel-Lindau gene and overexpression of proangiogenic factors. The ccRCC ability to leave primary site, active migration and settle in distant organs, is orchestrated by many factors such as angiogenesis, presence of immune cells and acquisition of the properties of more aggressive, mesenchymal phenotype. C-Met receptor plays an important role in both angiogenesis and epithelial to mesenchymal transition. It stimulates proliferation, inhibits apoptosis and regulates a number of factors responsible for metastasis.

Inflammatory processes play a significant role in ccRCC growth and development. One of the negative modulators of the inflammatory response is the MCPIP1 protein, encoded by the ZC3H12A gene. MCPIP1 acts as an endonuclease due to RNase activity, which allows degradation of mRNA coding proinflammatory cytokines. Recent reports suggests that the MCPIP1 protein may significantly affect tumor development through direct or indirect regulation of factors involved in the processes of growth, proliferation or cell death. Moreover, it has been shown that MCPIP1 affects expression of proangiogenic factors such as VEGF or HIFs, and its level in tumor is lower than in adjacent healthy tissue.

The main aim of doctoral dissertation research was to determine the role of MCPIP1 protein in the processes of growth, vascularization and progression of clear

14

cell renal cell carcinoma, as well as its effect on acquiring resistance to targeted drugs sunitinib and sorafenib.

In the first stage of the study, Caki-1 and Caki-2 cell lines with downregulation of MCPIP1 protein, as well as with stable overexpression of the wild type MCPIP1 and mutation in PIN domain which completely abolishes endonuclease activity were used.

The following work demonstrates that low level of MCPIP1 or inhibition of its RNase activity lead to an increase in the proliferative potential of tumor cells and tumor growth in vivo. In addition, lack of MCPIP1 protein increases the number of functional blood vessels compared to control. In contrast, overexpression of the MCPIP1 slows tumor growth and reduces vascularization in vivo. Conducted experiments showed that activation of endothelial cells depends on the level of MCPIP1 protein in cancer cells.

Both, inhibition and mutation of MCPIP1 in ccRCC increased secretion of proangiogenic factors such as IL-6, IL-8 and VEGF compared to control or MCPIP1 overexpressed cells. In consequence, this leads to internalization of VE-cadherin, relaxation of cell-cell junctions and activation of endothelial cells migratory potential.

Concominantly, MCPIP1 level affects the expression of CXCR4, SDF-1 and c-Met genes, which are responsible for cell division and metastasis. Importantly, MCPIP1 overexpression reduces the number of lung micrometastases and inhibits the EMT process.

Further analysis of clinical samples of patients at various stages of ccRCC, has shown that MCPIP1 protein level decreases with cancer progression. Furthermore, the level of c-Met receptor and other factors involved in cancer progression increase with successive stages of the disease.

In the last part of the study, it was observed that therapy with small molecules such as sunitinib and sorafenib increases the aggressiveness of cancer cells and amount of lung metastases. Moreover, elevated phosphorylation of c-Met receptor with simultaneous decrease in the level of MCPIP1 may be a potential mechanism of resistance to sunitinib and sorafenib treatment.

In summary, the MCPIP1 protein can be one of the factors modulating tumor development and marker of ccRCC progression. MCPIP1 controls cell proliferation, migration and secretion of proangiogenic factors. Furthermore, dependent regulation of MCPIP1 protein and c-Met receptor and their effect on drug resistance has been proven during research. Considering the results presented in this dissertation and published by other researchers, it is plausible that MCPIP1 may act as universal tumor suppressor.

15

4 Wstęp teoretyczny

4.1 Jasnokomórkowy rak nerki

4.1.1 Epidemiologia i obraz histologiczny raka nerki

Rak nerki (ang. Renal Cell Carcinoma, RCC), wywodzi się z komórek epitelialnych kanalików nerkowych i jest najczęstszym nowotworem nerek (ok. 90% wszystkich przypadków), znajdującym się w pierwszej dziesiątce najczęściej diagnozowanych nowotworów złośliwych (1,2). Odsetek zachorowań na raka nerki wzrósł o 30% w ciągu ostatnich 20 lat, co może być spowodowane zmianą trybu życia jak również udoskonaleniem metod obrazowania i diagnostyki. Według klasyfikacji histologicznej wyróżnić można kilka różnych typów (3,4):

• Jasnokomórkowy rak nerki (ok. 80% przypadków)

• Rak brodawkowaty (10-15% przypadków)

• Rak chromofobowy (5% przypadków)

• Rak z cewek zbiorczych (1-2% przypadków)

• Rak sarkomatoidalny (1% przypadków)

• Niesklasyfikowany rak nerki

Wymienione rodzaje raka nerki różnią się etiologią, molekularnym charakterem zmian prowadzących do powstania nowotworu, przebiegiem oraz agresywnością (2,5,6). Jasnokomórkowy rak nerki (ang. Clear cell renal cell carcinoma, ccRCC), który jest najczęstszym i bardzo agresywnym typem RCC, występuje zazwyczaj w korze nerki, makroskopowo ma wygląd żółtawych nacieków z występującymi miejscami nekrotycznymi i krwotocznymi, a jego komórki charakteryzują się jasną cytoplazmą, przez nagromadzenie dużej ilości lipidów (5). Prawidłowa klasyfikacja histologiczna jest niezwykle istotna dla oceny prognozy oraz dobrania właściwej terapii leczniczej (7). Dowiedziono, że wykrycie choroby we wczesnych stadiach zaawansowania klinicznego znacząco zwiększa odsetek przeżyć pięcioletnich, natomiast szanse na przeżycie pacjentów w ostatnich stadiach choroby, wiążących się z wysokim stopniem inwazji i obecnością przerzutów, maleją prawie trzykrotnie.

Ocena rokowania dokonywana jest zazwyczaj na podstawie klasyfikacji TNM, gdzie T - oznacza opis wielkość guza pierwotnego i inwazję okolicznych żył, N – oznacza zajęcie okolicznych węzłów chłonnych, a M – oznacza obecność odległych przerzutów (3).

Niezależną klasyfikacją histologiczną jest skala Fuhrman, gdzie ocenie poddawane są jądra komórkowe (8,9):

• Stadium 1 - Okrągłe jądra o średnicy ok. 10 μm, bez lub z bardzo małym jąderkiem

16

• Stadium 2 - Nieco nieregularne, średnica ok. 15 μm, jąderko widoczne przy powiększeniu 400x

• Stadium 3 - Średnio lub bardzo nieregularne kontury jąder, średnica ok. 20 μm, z dużym jąderkiem widocznym pod powiększeniem 100x

• Stadium 4 - Jądro podobne do stadium 3, często komórki wielojądrzaste, z dużymi fragmentami chromatyny

Co roku wykrywanych jest ok. 300 tysięcy nowych przypadków ccRCC, a 120 tysięcy osób umiera z powodu tej choroby (2,5). Wysoka śmiertelność spowodowana jest zwykle zbyt późną diagnostyką. W początkowych stadiach nie występuje klasyczna triada objawów: ból w okolicy lędźwiowej, wyczuwalny guz i krwiomocz. Z tego względu, nowotwór często wykrywany jest przez przypadek podczas badań obrazowych, zazwyczaj z współistniejącymi przerzutami. Ryzyko choroby rośnie wraz z wiekiem, a szczyt zachorowań przypada między szóstą i siódmą dekadą życia, dodatkowo predyspozycje rodzinne zwiększają ryzyko wystąpienia około dwukrotnie (4). Mężczyźni zapadają na ten nowotwór prawie dwukrotnie częściej niż kobiety (5).

4.1.2 Podłoże genetyczne jasnokomórkowego raka nerki

Czynnikami zwiększającymi ryzyko zapadalności na jasnokomórkowego raka nerki są m. in. palenie papierosów, otyłość czy nadciśnienie tętnicze oraz predyspozycje genetyczne. Analiza genomowa oraz analiza transkryptomu setek próbek od pacjentów ze zdiagnozowanym ccRCC wykazała, że najczęściej występującą zmianą genetyczną w jasnokomórkowym raku nerki jest delecja chromosomu 3p (10,11). Te same badania wykazały utratę heterozygotyczności 3p (ang. Loss of heterozygosity, LOH) u ponad 90% przebadanych przypadków (10,11).

Większość zaobserwowanych zmian na chromosomie 3p obejmowała delecje, mutacje lub metylacje. Supresorami nowotworzenia okazały się 4 najbardziej zmutowane geny: PBRM1, BAP1, SETD2 oraz VHL znajdujące się blisko siebie na chromosomie 3p (10,11). PBRM1, SETD2 i BAP1 pełnią funkcję modulatorów chromatyny oraz histonów (12). Natomiast VHL jest niezwykle istotnym regulatorem angiogenezy i czynników indukowanych przez hipoksję (ang. Hypoxia inducible factors, HIFs) (12). Co ciekawe, mediana przeżycia pacjentów z mutacją genu BAP1 była zdecydowanie niższa w porównaniu z pacjentami z mutacją genu PBRM1 (13).

Inne zmiany genetyczne, obserwowane w 28% przypadków ccRCC, to utrata fragmentów chromosomów 6q, 8p12, 9p21-22, 10q (4,6) oraz mutacje genu TP53 oraz genów ścieżki sygnalizacyjnej PI3K-Akt-mTOR (10,11). Dodatkowo, często występujące mutacje genu MTOR prowadzą do aktywacji wielu ścieżek zaangażowanych m.in. w proliferację, angiogenezę i metabolizm komórek.

17

Powyższe badania podkreślają jak istotna, oprócz oceny histologicznej jest charakterystyka molekularna zmian w celu odpowiedniej klasyfikacji pacjentów i zaproponowania najbardziej efektywnej terapii.

4.1.3 Mutacje genu VHL w jasnokomórkowym raku nerki

Białko von Hippel-Lindau (VHL), kodowane przez gen VHL, jest kluczowym modulatorem odpowiedzi komórki na niedobór tlenu - hipoksję. Gen VHL jest zaliczany do genów supresorowych, a jego mutacje sprzyjają powstawaniu silnie unaczynionych nowotworów (14). Ekspresja genu VHL występuje we wszystkich tkankach i tak jak wspomniano w poprzednim akapicie, jego locus znajduje się na ramieniu krótkim chromosomu 3p25-26. Natomiast białko VHL wykazuje specyficzność tkankową, największa jego ilość występuje kolejno w nerkach, wątrobie i trzustce (15).

Główną funkcją białka VHL jest regulacja poziomu czynnika transkrypcyjnego HIF1α. Działanie VHL polega na tworzeniu kompleksu VBC, razem z elonginą B i C, kulliną i acetylotransferazą SSAT2, który posiada aktywność ligazy E3 ubikwityny i rozpoznaje substrat, którym jest czynnik transkrypcyjny HIF1α (po hydroksylacji proliny) (14,16–18). W wyniku tego HIF1α jest ubikwitynowany, a następnie ulega degradacji w proteasomie. W sytuacji niedoboru tlenu lub mutacji VHL kompleks VBC nie rozpoznaje białka HIF1α, którego poziom gwałtownie rośnie. Następnie, HIF1α jest stabilizowany i przeniesiony z cytoplazmy do jądra komórkowego, gdzie łączy się z drugim, niewrażliwym na poziom tlenu, białkiem HIF1β oraz białkami CBP i p300 (14,16–18). Cały kompleks wiąże się z sekwencją HRE co powoduje ekspresję genów zaangażowanych w odpowiedzi na hipoksję takich jak: czynnik wzrostu śródbłonka naczyniowego (ang. Vascular endothelial growth factor, VEGF), transporter glukozy 1 (ang. Glucose transporter 1, GLUT-1), płytkopochodny czynnik wzrostu (ang.

Platelet-derived growth factor, PDGF), transformujący czynnik wzrostu alfa (ang.

Transforming growth factor alpha, TGFα), czynnik-1 alfa pochodzenia podścieliskowego (ang. Stromal-derived growth factor 1, SDF-1) czy erytropoetyna (EPO) (Rycina 4.1.) (14,19–22). Wiele ścieżek sygnałowych zaangażowanych w rozwój nowotworów jest także aktywowanych hipoksją m.in. ścieżka PI3K-Akt-mTOR, Ras-Raf-ERK czy HGF-c-Met (6,23–25)

Zespół von Hippel-Lindau (VHL) jest schorzeniem dziedziczonym autosomalnie dominująco, znacząco zwiększającym ryzyko zachorowania na jasnokomórkowego raka nerki (26). Najczęstszymi mutacjami prowadzącymi do choroby VHL są przesuwające ramkę odczytu delecje i insercje oraz mutacje zmiany

18

sensu genu VHL, które prowadzą do powstania niefunkcjonalnego produktu (27).

Większość pacjentów dziedziczy zmienioną kopię genu od jednego z rodziców, ale ok. 20% przypadków jest spowodowanych spontaniczną mutacją zazwyczaj w fazie wczesnej embriogenezy (28). Zmiana drugiego allelu nabywana jest spontanicznie w trakcie życia, co w efekcie prowadzi do ujawnienia zespołu VHL, powstawania cyst i zmian nowotworowych. Mutacja germinalna jednego allelu, a następnie somatyczna drugiego jest określana jako utrata heterozygotyczności (29). Hipermetylacja w promotorze genu VHL także powoduje jego inaktywację i jest obserwowana od 5 do 20% przypadków ccRCC (6).

Rycina 4.1. Schemat ilustrujący działanie białka VHL w warunkach normalnego poziomu tlenu (normoksja), głodu tlenowego (hipoksja) oraz przy mutacji genu VHL.

Zaadaptowano i zaprojektowano na podstawie (14-22).

Przy zespole VHL obserwuje się większą predyspozycję do nowotworów nerek (przede wszystkim ccRCC), nadnerczy, siatkówki czy móżdżku, dodatkowo ich objawy pojawiają się wcześniej, niż u osób nieobarczonych zespołem von Hippel- Lindau (30). Kliniczna klasyfikacja choroby von Hippel-Lindau obejmuje 2 główne grupy, z których każda wiąże się z inną etiologią i predyspozycją do konkretnego rodzaju nowotworu. Grupa pierwsza charakteryzuje się głównie mutacjami nonsensownym i delecjami VHL oraz niskim ryzykiem wystąpienia guza

19

chromochłonnego, natomiast grupa druga mutacją zmiany sensu genu VHL i wysoką predyspozycją rozwinięcia guza chromochłonnego (30,31). Dodatkowo grupę drugą dzieli się na 3 podtypy 2A, 2B i 2C. Chorzy z typem 1 i 2B są obarczeni wysokim ryzykiem zachorowania na jasnokomórkowego raka nerki, natomiast pacjenci z typem 2A posiadają niskie predyspozycje do ccRCC (30,31). W komórkach epitelialnych kanalików nerkowych pacjentów z zespołem VHL rozwijają się zmiany nienowotworowe i łagodne zmiany nowotworowe w postaci cyst i torbieli, które z czasem przekształcają się w zmiany złośliwe. Inaktywacja VHL, akumulacja HIFα w warunkach normoksji i hipoksji oraz ekspresja czynników proangiogennych powodują, że rozwijające się guzy są ekstremalnie unaczynione, przez co stosowanie inhibitorów angiogenezy stało się głównym celem terapeutycznym w ccRCC. Kolejną ważną cechą czynników HIFα i białka VHL w komórkach ccRCC jest regulacja poziomu cykliny D1 która wraz z kinazami zależnymi od cyklin (ang. Cyclin dependent kinase, Cdk) cdk4 i cdk6 stymuluje proliferację komórek nowotworowych (32,33).

Linie komórkowe RCC, negatywne względem genu VHL charakteryzowały się wysokim poziomem cykliny D1 oraz brakiem zdolności do wyjścia z cyklu komórkowego. Przywrócenie normalnego poziomu VHL w warunkach doświadczalnych powoduje zatrzymanie cyklu komórkowego i areszt w fazie G0 (32,33). Co ciekawe, niektóre dane literaturowe sugerują, że hipoksja wraz z czynnikami HIF hamują proliferację poprzez aktywację białka Rb, utratę Cdk i obniżenie poziomu cyklin (34), jednak w przypadku komórek raka nerki z defektem genu VHL, które zasadniczo są niewrażliwe na zmiany stężenia tlenu, sytuacja wydaje się odwrotna.

4.2 Angiogeneza (neowaskularyzacja) w procesie rozwoju nowotworu 4.2.1 Charakterystyka procesu angiogenezy

Angiogeneza jest procesem tworzenia się nowych naczyń krwionośnych z już istniejących. W warunkach fizjologicznych zachodzi przede wszystkim w rozwoju embrionalnym razem z waskulogenezą (tworzeniem naczyń de novo), oraz w trakcie gojenia się ran czy regeneracji endometrium w trakcie cyklu miesięcznego u kobiet (35). Angiogeneza jest też krytycznym krokiem podczas przemiany łagodnego nowotworu w złośliwy, gdy zostaje zachwiana równowaga między czynnikami stymulującymi, a hamującymi rozwój unaczynienia (36). Gwałtownie dzielące się komórki nowotworowe do swojego wzrostu potrzebują tlenu i substancji odżywczych dostarczonych z krwią. Małe skupiska komórek nowotworowych, nie przekraczające 2 mm³, pobierają tlen na drodze dyfuzji z okolicznych naczyń krwionośnych (37,38).

20

Rozrost tkanki nowotworowej powoduje hipoksję i kwasicę, poprzez brak usuwania resztek przemiany materii, co prowadzi do aktywacji czynników HIFα (37).

Istnieją trzy formy HIFα z czego najlepiej poznanymi są HIF1α i HIF2α, które działają podobnie w odpowiedzi na zmiany stężenia tlenu (39). Co ciekawe, wykazano, że w przypadku ccRCC to właśnie poziom izoformy HIF2α jest krytycznym czynnikiem stymulującym wzrost i rozwój guzów VHL-/-, a jej zahamowanie powoduje znaczące spowolnienie wzrostu guzów in vivo (40–43). W raku nerki obarczonym mutacją genu VHL, HIFα jest akumulowany nawet w warunkach normoksji i powoduje wzmożoną ekspresję czynników proangiogennych: PDGFβ, czynnika wzrostu hepatocytów (ang. Hepatocyte growth factor, HGF), angiopoetyny-2, epidermalnego czynnika wzrostu (ang. Epidermal growth factor, EGF), oraz głównego stymulatora neowaskularyzacji – VEGF (30,43–45).

Do rodziny VEGF należy 6 czynników (od A do E oraz czynnik wzrostu łożyska - PlGF), z których VEGFA jest najlepiej poznanym. W wyniku alternatywnego składania, powstają izoformy różniące się ilością aminokwasów w łańcuchu polipeptydowym, które cechuje różne powinowactwo do heparyny i biodostępność.

VEGFA działa przez wiązanie się do jednego ze swoich receptorów (ang, VEGF receptor, VEGFR1, VEGFR2) znajdujących się na powierzchni komórek śródbłonka i aktywacji dalszych ścieżek przekazu sygnału (46,47).

4.2.2 Etapy angiogenezy

W wyniku martwicy i niedotlenienia, w komórkach nowotworowych dochodzi do przełączenia angiogennego (ang. angiogenic switch). Przełączenie to powoduje niekontrolowaną produkcję wcześniej wymienionych czynników proangiogennych, które wiążąc się ze swoimi receptorami na komórkach śródbłonka, aktywują kinazy białkowe i powodują wzrost przepuszczalności naczyń oraz redystrybucję międzykomórkowych białek adhezyjnych m.in. CD31 czy VE-kadheryny (Ryc. 4.2. A) (36,47).

VE-kadheryna tworzy połaczenia pomiędzy komórkami endotelialnymi zapewniając integralność śródbłonka (48,49). Komórki nowotworowe wydzielają czynnik VEGFA, który łączy się ze swoim receptorem na powierzchni komórki endotelialnej. Następnie, dochodzi do autofosforylacji receptora VEGF i przeniesienia reszty fosforanowej z VEGFR2 przez kinazy Src, PAK, kinazę ogniskowo-adhezyjną (ang. Focal andhesion kinase, FAK) oraz substrat 1 toksyny botulinowej C3 związany z Ras (ang. Ras-related C3 botulinum toxin substrate 1, Rac1) na VE-kadherynę (50).

Fosforylowana VE-kadheryna ulega internalizacji i translokacji w inne miejsce, bądź

21

degradacji co prowadzi do destabilizacji połączeń międzykomórkowych, rearanżacji cytoszkieletu i w konsekwencji zwiększonej przepuszczalności naczyń (48–50). Co więcej, wykazano, że nie tylko stymulacja VEGF powoduje osłabienie połączeń komórkowych, ale również wydzielane przez komórki nowotworowe metaloproteinazy (ang. Metalloproteinase, MMP), zwłaszcza MMP2 oraz MMP9 (51). W tym przypadku jednak nie dochodzi do fosforylacji i internalizacji VE-kadheryny, a odcięcia jej zewnątrzkomórkowej domeny i destabilizacji połączeń komórka-komórka (51,52).

Metaloproteinazy biorą również udział w degradacji macierzy zewnątrzkomórkowej co przyczynia się do proliferacji i migracji komórek endotelialnych (ECs) (35).

Rozwojowi guza towarzyszy przewlekły stan zapalny i napływ komórek układu odpornościowego. Wykazano, że nadekspresja VEGF powoduje wzrost czynnika SDF-1 co z kolei wpływa na rekrutację komórek mieloidalnych posiadających na powierzchni receptor dla chemokin 4 (ang. Chemokine receptor 4, CXCR4) (53).

Oprócz komórek nowotworowych, także komórki układu odpornościowego, a przede wszystkim makrofagi są istotnym źródłem cytokin i chemokin prozapalnych, które pełnią również istotną funkcję w promocji neowaskularyzacji (54). Dobrze poznaną chemokiną proangiogenną, syntetyzowaną przez komórki nowotworowe, jest IL-8, która aktywuje nie tylko neutrofile, ale również makrofagi, komórki tuczne i komórki endotelialne (54,55). VEGF, IL-8 oraz SDF-1 stymulują komórki endotelialne do migracji przez zdegradowaną macierz otaczającą śródbłonek w stronę gradientu czynników wzrostowych i w ten sposób rozpoczyna się proces kiełkowania (ang.

Sprouting) naczyń krwionośnych (Ryc. 4.2. B). Ważną rolę podczas migracji i kiełkowania naczyń pełnią receptory integrynowe, których ekspresję stymuluje VEGF, czynnik martwicy nowotworów alfa (ang. Tumor necrosis factor alpha,TNF-α) oraz sama IL-8 (37).

Ostatnim etapem angiogenezy nowotworowej jest dojrzewanie powstałych naczyń, w którym biorą udział m.in. czynniki antyangiogenne oraz PDGFβ który stymuluje komórki otaczające komórki śródbłonka, tzw. perycyty, do osiadania i stabilizowania powierzchni nowych naczyń (45,56). Dobrze rozwinięty system naczyń krwionośnych w guzie jest istotną składową procesu przerzutowania, czyli opuszczenia pierwotnego ogniska przez agresywne komórki nowotworowe i migracji z krwioobiegiem w poszukiwaniu nowej niszy (Ryc. 4.2. C).

22

Rycina 4.2. Schemat procesu angiogenezy w obrębie guza nowotworowego.

Zaadaptowano i zaprojektowano na podstawie (36, 37).

Sieć naczyń krwionośnych obecna w guzie nowotworowym ze względu na brak równowagi między czynnikami pro i antyangiogennymi różni się od unaczynienia fizjologicznego. Naczynia krwionośne w guzie tworzą chaotyczny układ, który ciągle ulega przebudowie. Posiada nieregularne, często ślepo zakończone naczynia, z których większość jest niefunkcjonalna oraz charakteryzuje się zwiększoną przepuszczalnością powodującą drobne, lecz liczne krwotoki (38). Naczynia nowotworowe nie dostarczają komórkom guza odpowiedniej ilości tlenu, co skutkuje niedotlenieniem i obumarciem części tkanki. Słaba jakość naczyń krwionośnych jest również spowodowana tym, że budują je oprócz wyspecjalizowanych komórek śródbłonka, także komórki nowotworowe. Zjawisko przejmowania przez agresywne komórki nowotworowe fenotypu i właściwości komórek endotelialnych i formowania de novo sieci tubularnych struktur, połączonych z właściwymi naczyniami krwionośnymi nosi nazwę mimikry naczyniowej (57). Wykazano, iż również komórki ccRCC posiadają zdolność formowania naczynio-podobnych struktur (58–60).

Oprócz typowych receptorów kinaz tyrozynowych takich jak VEGFR czy PDGFR, w proces angiogenezy nowotworowej zaangażowany jest także receptor c- Met. Receptor ten, działając na szereg białek wpływa na stabilizację HIF1α oraz, niezależnie od stężenia tlenu, aktywuje czynniki transkrypcyjne STAT w efekcie stymulując ekspresję VEGF (61). Podobne działanie wykazuje IL-6, która łącząc się parakrynnie lub autokrynnie ze swoim receptorem, fosforyluje białko STAT3 (ang.

Signal transducer and activator of transcription 3), które następnie ulega dimeryzacji i translokacji do jądra. Ścieżka sygnałowa IL-6/STAT3 stymuluje ekspresję VEGF

23

oraz metaloproteinaz MMP2 i MMP9 (62,63). Ekspresję VEGF regulują również receptor CXCR4 wraz ze swoim ligandem SDF1, który jest silnym chemoatraktantem dla endotelialnych komórek progenitorowych migrujących ze szpiku kostnego (64,65).

Wysoki poziom VEGF w guzie jest zazwyczaj złym czynnikiem prognostycznym w wielu typach nowotworów, także w ccRCC i świadczy on o skłonności komórek nowotworowych do progresji i tworzenia przerzutów. Analiza próbek pacjentów w różnych stadiach zaawansowania choroby wykazała, że wraz z progresją ccRCC rośnie ekspresja czynników stymulujących rozwój unaczynienia (66). Ze względu na częste mutacje genu VHL, akumulację HIF oraz nadekspresję wielu stymulatorów angiogenezy, jasnokomórkowy rak nerki tworzy silnie ukrwione guzy i logicznym wydało się wprowadzenie terapii opartych o leki celujące zarówno w sam VEGF jak i receptory kinaz tyrozynowych zaangażowanych w rozwój unaczynienia. Stosowanie inhibitorów kinaz tyrozynowych (ang. Tyrosine kinase inhibitors, TKIs) początkowo daje zadowalające efekty, jednak w trakcie długotrwałej terapii ich skuteczność jest kwestionowana ze względu na wykształcanie na nie mechanizmów oporności.

4.3 Rola receptora c-Met w progresji ccRCC

Rozsiew komórek nowotworowych i powstanie odległego przerzutu jest długotrwałym i wieloetapowym procesem. Niezbędny do tego jest rozwój unaczynienia w obrębie ogniska pierwotnego guza nowotworowego oraz nabycie przez komórkę nowotworową szeregu cech, które pozwolą jej na aktywną migrację, przeżycie w krwioobiegu, a następnie umożliwią przedostanie się przez ścianę naczynia i osiedlenie w nowej niszy. Jednym z dobrze poznanych czynników zaangażowanych w progresję nowotworową, jest receptor c-Met wraz ze swoim ligandem HGF. Nadekspresja lub konstytutywna fosforylacja receptora c-Met prowadzi do aktywacji wielu szlaków przekazu sygnału i w konsekwencji do zwiększonej proliferacji, migracji i inwazyjności komórek nowotworowych (67).

4.3.1 Charakterystyka receptora c-Met

Błonowy receptor c-Met, produkt proto-onkogenu MET, jest obecny głównie na powierzchni komórek epitelialnych, podczas gdy ekspresja jego ligandu, HGF, zachodzi selektywnie, w komórkach pochodzenia mezenchymalnego (67). W warunkach fizjologicznych receptor c-Met bierze udział w embriogenezie i organogenezie, różnicowaniu czy gojeniu ran (68–70). C-Met jest zaliczany do receptorów o aktywności kinazy tyrozynowej i składa się z podjednostki α oraz β połączonych mostkami disiarczkowymi. Podjednostka α znajduje się po zewnętrznej stronie błony komórkowej, natomiast podjednostka β przechodzi przez błonę

24

komórkową i po stronie wewnątrzkomórkowej zawiera kilka miejsc fosforylacji oraz domenę kinazy tyrozynowej (Y1234, Y1235), regulującą aktywność receptora (67,71).

Przyłączenie ligandu HGF, powoduje homodimeryzację receptora i krzyżową fosforylację reszt tyrozynowych Y1234 i Y1235. Następnie, fosforylacji ulegają tyrozyny Y1349 i Y1356, które aktywują pośrednio, przez białko oddziałujące z GRB2 (ang. GRB2-associated-binding protein 1, GAB1), lub bezpośrednio białka: wiążące receptor dla czynnika wzrostu typu 2 (ang. Growth factor receptor-bound protein 2, GRB2), 3-kinazę fosfatydyloinozytolu (ang. Phosphoinositide 3-kinase, PI3K), czynnik transkrypcyjny STAT3 czy kinazy Src oraz SHP2 (ang. Src homology region 2 domain-containing phosphatase-2) (67,70,71). Receptor c-Met może aktywować kilka ścieżek sygnalizacyjnych zaangażowanych w regulację angiogenezy, migracji, różnicowania czy proliferacji. Na skutek aktywacji przez receptor c-Met, białko GRB2 wiąże się z czynnikiem SOS (ang. Son of sevenless), po czym następuje przekaz sygnału na białko Ras (ang. Rat sarcoma viral homolog) oraz RAF i dalsza aktywacja szlaku kinaz MAPK regulujących m.in. proliferację komórek i różnicowanie (72).

Dodatkowo, białko Ras jest czynnikiem aktywującym inne małe GTPazy: Rac1 (ang.

Ras-related C3 botulinum toxin substrate 1) i Cdc42 (ang. Cell division control protein 42 homolog) zaangażowane w rearanżację cytoszkieletu aktynowego, przejście epitelialno-mezenchymalne (ang. Epithelial to mesenchymal transition, EMT) i migrację (73). Z kolei, poprzez aktywację białka PI3K następuje przekaz sygnału na kinazę Akt i mTOR, które w głównej mierze odpowiedzialne są za przeżywalność komórek (74). Jednocześnie z PI3K, kinaza Src aktywuje kinazę ogniskowo- adhezyjną (ang. Focal adhesion kinase, FAK) regulującą ruchliwość i inwazyjność komórek, w odpowiedzi na fosforylację receptora c-Met (75). W końcu, przekaz sygnału z receptora c-Met na czynnik STAT3 powoduje jego dimeryzację i translokację do jądra, gdzie reguluje transkrypcję wielu genów m.in. HIF1α (76) (Ryc.

4.3.).

25

Rycina 4.3. Schemat budowy receptora c-Met i szlaki przekazu sygnału aktywowane osią HGF/c-Met. Zaadaptowano i zaprojektowano na podstawie (67).

Tak szerokie spektrum działania receptora c-Met powoduje, że jego nadmierna aktywacja ma bardzo istotny wpływ na rozwój i progresję wielu typów nowotworów. Wykazano, że wzmożona amplifikacja genu MET powoduje nadekspresję białka c-Met i jego konstytutywną fosforylację w nowotworach wątroby, żołądka, piersi, mózgu czy nerki (77–80). Co więcej, oprócz autokrynnej bądź parakrynnej aktywacji zależnej od liganda, może dochodzić do transaktywacji receptora poprzez współdziałanie z innymi receptorami błonowymi m.in. CD44, EGFR, CXCR4 czy receptorami integrynowymi, często bez udziału HGF (67,81–84).

26

Hipoksja także jest jednym z mechanizmów odpowiedzialnych za ekspresję c-Met zarówno w warunkach in vitro oraz in vivo (85). Badania nad rakiem trzustki wykazały, że czynnik transkrypcyjny HIF1α wiążąc się do promotora MET aktywuje jego transkrypcję pod wpływem hipoksji (86). Co więcej, poziom c-Met różni się w obrębie tkanki nowotworowej, obszary guza objęte hipoksją charakteryzują się nadekspresją c-Met w porównaniu z fragmentami z rozwiniętym unaczynieniem (85).

4.3.2 Receptor c-Met w raku nerki

W zdrowej nerce receptor c-Met znajduje się głównie w epitelialnych komórkach kanalików nerkowych i bierze udział w stymulacji tych komórek do tworzenia rozgałęzień kanalików w trakcie rozwoju nerki i jej regeneracji po urazie bądź nefrektomii (87,88).

W 1996 r. po raz pierwszy wykazano, że poziom receptora c-Met rośnie w tkance nowotworowej w porównaniu ze zdrową nerką (89). Natali i wsp. przebadali, za pomocą barwień immunohistochemicznych (IHC), 50 próbek od pacjentów z różnymi typami raka nerki i zaobserwowali wysoki poziom c-Met w 87% próbek nowotworowych, podczas gdy w zdrowej nerce sygnał był bardzo słaby i ograniczony jedynie do kanalików dystalnych (89). Rok później, potwierdzono te wyniki i dodatkowo powiązano wzrastający poziom receptora c-Met z progresją choroby i obecnością przerzutów (90). W stadium 1 i 2 wg skali Fuhrman, receptor c-Met wykryto jedynie w 8 na 17 przypadków, podczas gdy w stadium 3 i 4 aż 20 próbek na 24 było pozytywne dla c-Met (90). Badania prowadzone przez koreańską grupę Choi i wsp. wykazały, że ponad 90% próbek brodawkowatego raka nerki posiadało silny sygnał receptora c-Met podczas barwienia IHC, podczas gdy próbki raka jasnokomórkowego jedynie 45% (91). Brodawkowaty rak nerki (ang. papillary RCC, pRCC) charakteryzuje się częstymi mutacjami w obrębie chromosomu 7, na którym zlokalizowane jest locus genu MET (7q31) (92). Trisomia chromosomu 7 występująca w typie sporadycznym pRCC powoduje zwiększoną ilość kopii MET, co zazwyczaj przekłada się na podwyższoną ilość białka (92). Dodatkowo, zarówno w dziedzicznym jak i sporadycznym pRCC zaobserwować można mutacje typu brak sensu głównie w domenie kinazy tyrozynowej prowadzące do konstytutywnej fosforylacji receptora c- Met, nawet przy braku HGF, i w konsekwencji aktywacji szlaków przekazu sygnału omówionych w poprzednim podrozdziale (80,91,92).

W przypadku ccRCC, Choi i wsp. wykazali, że ekspresja c-Met pozytywnie koreluje ze stopniem zaawansowania choroby wg skali Fuhrman oraz z innymi czynnikami zaangażowanymi w inwazyjność i agresywność nowotworu (91). Inne

27

zespoły potwierdziły, na większej grupie pacjentów, wysoki poziom receptora c-Met w tkance nowotworowej w porównaniu z otaczającą zdrową oraz wzrost ekspresji MET wraz z progresją nowotworową (93,94). Co więcej, receptor c-Met uznano, za negatywny wskaźnik predykcyjny związany z agresywnym fenotypem i niekorzystnym rokowaniem dla pacjenta (93,94). Zwiększająca się ilość kopii genu MET była wykryta w ponad 310 przypadkach na 572 i korelowała z większą objętością guza, zajęciem okolicznych węzłów chłonnych i obecnością odległych przerzutów (93). Dodatkowo, Miyata i wsp. jako pierwsi powiązali fosforylację receptora c-Met na tyrozynie Y1349 ze stadium zaawansowania klinicznego i przeżywalnością (95). W przypadku ccRCC istotną rolę w utrzymaniu konstytutywnej fosforylacji c-Met pełni białko VHL.

Wykazano, że w liniach komórkowych ccRCC z mutacją w genie VHL, receptor c-Met był konstytutywnie aktywowany nawet w przypadku braku ligandu HGF (96).

Natomiast, przywrócenie prawidłowego poziomu VHL w komórkach, powodowało spadek fosforylacji c-Met (96).

4.3.3 Znaczenie receptora c-Met w regulacji procesu przejścia epitelialno- mezenchymalnego (EMT)

Proces EMT charakteryzuje się zmianą fenotypu komórki z epitelialnego na mezenchymalny. W jego wyniku komórka stopniowo traci zdolność do połączeń międzykomórkowych oraz adhezji do błony podstawnej na rzecz zwiększonej ruchliwości i inwazyjności (97,98). Podobnie jak w przypadku angiogenezy, EMT może zachodzić w warunkach fizjologicznych podczas embriogenezy i tworzenia narządów (typ pierwszy EMT) oraz w dorosłym organizmie w trakcie regeneracji, gojenia ran i fibrozy (typ drugi EMT). W takcie rozwoju nowotworu, trzeci typ EMT, jest inicjowany szeregiem czynników m. in. hipoksją, degradacją macierzy zewnątrzkomórkowej czy wydzielaniem cytokin. EMT pełni kluczową rolę w nabywaniu przez ccRCC zdolności do aktywnej migracji i stanowi jeden z podstawowych mechanizmów progresji nowotworowej (98,99).

Komórki epitelialne charakteryzuje obecność różnego rodzaju białek budujących połączenia międzykomórkowe oraz przytwierdzających komórkę do błony podstawnej. W pierwszym etapie EMT zmniejsza się ekspresja białek fenotypu epitelialnego e-kadheryny, ZO-1, cytokeratyny, cząsteczki adhezji komórek nabłonkowych (ang. Epithelial cell adhesion molecule, EpCAM) czy lamininy-1.

Główny składnik obwódek przylegania i najważniejszy marker komórek epitelialnych, e-kadheryna, zastępowana jest przez n-kadherynę (99). E-kadheryna jest zaliczana do białek supresorowych, ponieważ jej spadek związany jest ze wzrostem agresywności nowotworu i gorszymi rokowaniami. Do tej pory odkryto wiele

28

czynników transkrypcyjnych odpowiedzialnych za obniżenie ekspresji e-kadheryny.

Należą do nich białka z rodziny Snail, ZEB czy Twist (100,101). Czynniki te wiążą się z różnym powinowactwem do sekwencji E-box w promotorze genu CDH1 kodującego e-kadherynę hamując jej ekspresję (100). Część badaczy sugeruje, że największe powinowactwo do promotora e-kadheryny ma Snail1, który w warunkach fizjologicznych nie jest obecny w komórkach endotelialnych, występuje natomiast w komórkach nowotworowych pochodzenia nabłonkowego (102). Niedawno wykazano, że Snail1 może być negatywnym czynnikiem prognostycznym w ccRCC wskazującym na możliwość nawrotu choroby po wycięciu guza oraz u pacjentów chorych na raka piersi czy pęcherza moczowego (103–105).

Następnie, dochodzi do utraty połączeń komórka-komórka oraz zmiany polaryzacji apikalno-bazalnej na rzecz polaryzacji tył-przód. Wzrasta także poziom markerów charakterystycznych dla komórek mezenchymalnych: wimentyny, β- kateniny oraz fibronektyny (97–99). W kolejnym etapie dochodzi do rearanżacji cytoszkieletu, przebudowy i polimeryzacji filamentów aktynowych. Komórka zmienia swoją morfologię na podłużną i wrzecionowatą i traci zdolność do zahamowania kontaktowego. W końcowym etapie następuje protruzja, czyli formowanie wypustek cytoplazmatycznych umożliwiających ruch i wydzielanie metaloproteinaz degradujących białka macierzy zewnątrzkomórkowej. Zwiększa się aktywność migracyjna komórek, które stymulowane czynnikami wzrostu przemieszczają się w stronę zwiększającego się gradientu chemoatraktantów. Komórki opuszczają guz pierwotny i przedostają się przez błonę podstawną do naczyń krwionośnych bądź limfatycznych (Ryc. 4.4.) (98,99,101).

Rycina 4.4. Schemat procesu przejścia epitelialno-mezenchymalego. Zaadaptowano i zaprojektowano na podstawie (97, 98).

29

Przejście epitelialno-mezenchymalne regulowane jest przez wiele szlaków sygnalizacyjnych m.in. TGF-β, Wnt czy Notch, aktywowanych przez mikrośrodowisko nowotworu, stan zapalny, a także hipoksję (106–109).

Receptor c-Met zaangażowany jest w regulację wielu procesów komórkowych biorących udział w inicjacji, progresji i przerzutowaniu nowotworu. Z tego względu, może stanowić nadrzędny modulator czynników biorących udział w EMT.

Aktywacja c-Met angażuje szlaki sygnalizacyjne MAPK, FAK czy PI3K-Akt- mTOR i w sposób pośredni prowadzi do rearanżacji cytoszkieletu i zmiany fenotypu komórki na mezenchymalny, a także zwiększa aktywność ruchową i inwazyjność, czyli reguluje wszystkie procesy charakterystyczne dla EMT (110). Z kolei wykazano, że receptor c-Met bezpośrednio wpływa na aktywację kluczowego szlaku indukującego EMT, czyli Wnt/β-katenina (111). Aktywacja szlaku Wnt przez fosforylację i inaktywację GSK3β, prowadzi do stabilizacji cytoplazmatycznej β- kateniny, która ulega translokacji do jądra, gdzie łączy się z czynnikami transkrypcyjnymi TCF/LEF (107). Powoduje to zwiększoną transkrypcję genów zaangażowanych w progresję i przeżywalność, ale także wyższą ekspresję cykliny D1, VEGF oraz IL-8 dzięki czemu szlak Wnt/β-katenina promuje również proliferację i angiogenezę. Dodatkowo, β-katenina stabilizuje poziom Snail1 przez blokowanie jego fosforylacji i degradacji (107). W przypadku komórek glioblastomy wykazano, że zastosowanie specyficznego inhibitora receptora c-Met - SU11274 powoduje obniżenie ilości β-kateniny w jądrze komórkowym. Natomiast stymulacja HGF spowodowała translokację β-kateniny do jądra wskazując na istotną rolę c-Met w regulacji szlaku Wnt (111). W badaniach nad rakiem piersi wykazano, że współdziałanie receptora c-Met i szlaku Wnt/β-katenina prowadzi do nabierania agresywnego fenotypu i tworzenia przerzutów (112). Co ciekawe, w przypadku hepatocytów, ich stymulacja czynnikiem HGF indukowała translokację β-kateniny do jądra komórkowego, niezależnie od ścieżki Wnt (113).

Oprócz wpływu na szlak Wnt/β-katenina, istnieją również inne mechanizmy aktywujące proces EMT, zależne od receptora c-Met. Badania nad rakiem szyjki macicy wykazały, że receptor c-Met wraz z CXCR4 negatywnie regulują poziom e- kadheryny, natomiast pozytywnie czynnik Slug (84). Wyniki przedstawione przez grupę badaczy z Chin potwierdziły, że receptor c-Met może działać synergistycznie lub addytywnie z CXCR4 aktywując czynnik transkrypcyjny STAT3, który z kolei reguluje ekspresję ZEB1 w raku żołądka (114). Z kolei w raku płuc, wykorzystanie inhibitora c-Met hamowało EMT, poprzez obniżanie poziomu czynnika Snail i

30

podwyższenie e-kadheryny (115). Także wśród pacjentów ze zdiagnozowanym rakiem żołądka, wykazano negatywną korelację pomiędzy receptorem c-Met i e- kadheryną, gdzie niski poziom e-kadheryny i wysoki c-Met był złym czynnikiem prognostycznym (116,117).

4.3.4 Rola receptora c-Met w aktywności migracyjnej i przerzutowaniu

Pomimo nabrania przez komórki nowotworowe nowych cech mających im pomóc w utworzeniu przerzutu, niewiele komórek jest w stanie samodzielnie przeżyć w krwioobiegu, wydostać się z niego i osiedlić w nowej niszy.

Dzięki wysokiej plastyczności i adaptacji do gwałtownie zmieniających się warunków i otaczającego mikrośrodowiska komórki nowotworowe przedostaja się do światła naczynia, przemieszczają z krwią, a następnie osadzaja w odległych naczyniach włosowatych. Fenotyp mezenchymalny pozwala nowotworowym komórkom krążącym (ang. Circulating tumor cells, CTCs) na ucieczkę przed anoikis czyli apoptozą spowodowaną brakiem adhezji do podłoża (118). Po wydostaniu się z krwioobiegu do nowej tkanki, komórki przechodzą proces odwrotny do EMT czyli przejście mezenchymalno-epitelialne (ang. Mesenchymal to epithelial transition MET), który ułatwia osiedlenie się w nowej niszy i formowanie ogniska wtórnego (119).

Jednym z wielu czynników zaangażowanych w tworzenie odległych przerzutów, jest receptor c-Met, który regulując poziom i fosforylację wielu białek w tym Ras i Rac1 oraz kinaz Src i FAK stymuluje ruchliwość komórek nowotworowych (75,120). Jak pokazano w modelu in vivo raka płaskonabłonkowego głowy i szyi, wyciszenie c-Met zmniejszało ruchliwość komórek i ilość przerzutów do węzłów chłonnych (121). Podobne wyniki uzyskano w badaniach nad mięsakiem prążkowanokomórkowym gdzie niski poziom receptorów c-Met i CXCR4 wpływał na zmniejszenie ruchliwości i agresywności komórek (122).

Pojedyncze komórki nowotworowe, po migracji do krwioobiegu, narażone są na stres oksydacyjny i atak ze strony układu immunologicznego. Z tego względu, wykształciły mechanizm pozwalający im przetrwać w niekorzystnym środowisku, polegający na łączeniu się w klastry. Pierwotnie klaster zbudowany jest z różnych typów komórek, zarówno epitelialnych jak i mezenchymalnych oraz komórek wykazujących stadia pośrednie między fenotypem epitelialnym, a mezenchymalnym.

Takie epitelialno-mezenchymalne hybrydy, przechodzą niepełne EMT oraz posiadają markery charakterystyczne zarówno dla nabłonka jak i komórek mezenchymalnych (123). Co więcej, w takich klastrach, komórki nie tracą połączeń komórka-komórka,

31

ale zyskują zdolność do aktywnej, kolektywnej migracji. Po opuszczeniu pierwotnej niszy, do klastra dołączają płytki krwi i komórki podścieliska, które pełnią rolę ochronną oraz wydzielają czynniki wzrostu i chemokiny. Klastry występują rzadziej niż pojedyncze CTCs, natomiast ich potencjał inwazyjny i przerzutowania jest zdecydowanie wyższy. Tworzony przez klaster mikroprzerzut jest także bardziej heterogenny niż przerzut utworzony przez wzrost klonalny pojedynczej komórki, a co za tym idzie bardziej oporny na stosowane terapie (123). Dodatkowo, obecność we krwi klastrów jest negatywnym czynnikiem prognostycznym w wielu typach nowotworów w tym także w raku nerki (124). Co ciekawe, wykazano, że po stymulacji HGF, receptor c-Met aktywuje komórki wątroby do łączenia się w grupy i kolektywnej migracji, a także zwiększa ich inwazyjność przez zwiększenie ekspresji MMP3, MMP9 i MMP10 (125).

4.3.5 Terapie jasnokomórkowego raka nerki

Ze względu na stopień zaawansowania choroby i podłoże genetyczne możemy wyróżnić kilka możliwości terapeutycznych proponowanych pacjentom ze zdiagnozowanym jasnokomórkowym rakiem nerki. Są to: postępowanie chirurgiczne wraz z radioterapią lub farmakoterapia, do której zaliczamy chemioterapię, inhibitory kinazy mTOR oraz inhibitory angiogenezy.

Obecnie, podstawową strategią leczniczą pacjentów z rakiem nerki w postaci ograniczonej jest chirurgiczne usunięcie guza. W zależności od wielkości guza oraz zajęcia okolicznych węzłów chłonnych, operacja wycięcia obejmuje część lub całą nerkę. Dodatkowo, uzupełniająco stosuje się radioterapię w celu usunięcia pozostałych komórek nowotworowych (126,127). Z kolei w przypadku choroby rozsianej stosuje się chemioterapię skojarzoną z interferonem alfa (IFNα). Jednak ze względu na szybkie wykształcanie oporności na cytostatyki terapię tę stosuje się rzadko gdy inne formy leczenia nie dają rezultatów (128).

W przypadku pacjentów w stadiach zaawansowanych, z guzem nieoperowalnym lub choroby rozsianej stosuje się terapie celujące w aktywność kinazy mTOR lub inhibitory angiogenezy. Ze względu na częste mutacje w obrębie genu MTOR obecne w ccRCC, u pacjentów z rakiem nerki niewrażliwych na inhibitory angiogenezy, stosuje się inhibitory blokujące kinazę mTOR – temsirolimus i ewerolimus (129). Leki działają poprzez związanie się z receptorem FKB12, co z kolei hamuje aktywację mTOR. W rezultacie dochodzi do zatrzymania cyklu komórkowego i zahamowania wzrostu guza. Inhibitory stosuje się zarówno w monoterapii jak i terapii łączonej z IFNα. Inhibitory kinazy mTOR, oprócz działania na proliferację komórek,