Analiza bioinformatyczna genu i białka HMGbox oraz jego potencjalna funkcja w plechach

Z wyjściowego fragmentu cDNA długości 193nt otrzymano dwa cDNA: krótszy długości 759nt i dłuższy – 1 165nt. W obrębie obu określono identyczną otwartą ramkę odczytu długości 120aa. Analiza porównawcza przewidzianej sekwencji białkowej wykazała 45-48% podobieństwo do białek zawierających domenę HMGbox Physcomitrella patens oraz kilku gatunków grzybów. Poniżej w tabeli 6-3 przedstawiono porównanie szczegółów budowy genów kodujących białka HMGbox mchu oraz wybranych gatunków grzybów (na podstawie danych dostępnych w bazie GenBank; 18.10.10) względem genu wątrobowca P.

endiviifolia sp B. W porównaniu wykorzystano dane dotyczące genów uwzględnionych w

rozdziale WYNIKI, punt 5.5.4.

Tabela 6-3. Porównanie budowy niektórych genów kodujących białko z domeną HMGbox mchu, wątrobowca oraz wybranych gatunków grzybów. (?) oznacza brak danych w bazie GenBank. (-) oznacza brak danego elementu w genie. Liczby oznaczają długości poszczególnych elementów genu.

Gen z rodziny HMG Physcomitrella patens Chaetomium globosum Verticillium albo-atrum Pellia endiviifolia sp B cDNA [nt] 279 291 573 1 165 CDS [nt] 279 291 309 363 5’UTR [nt] ? ? 23 266 Egzon 1 [nt] 207 61 13 342 Intron 1 [nt] 265 54 291 582 Egzon 2 [nt] 73 231 290 212 Intron 2 [nt] - - 56 185 Egzon 3 [nt] - - 270 75 Intron 3 [nt] - - - 432

134 | S t r o n a

Egzon 4 [nt] - - - 584

3’UTR [nt] ? ? 240 584

Białko [aa] 92 96 102 120

Kodon STOP TGA TGA TAA TAA

Z powyższego porównania wynika, że zidentyfikowany gen wątrobowca różni się zdecydowanie od pozostałych wykorzystanych w porównaniu. Jest on najbardziej złożonym strukturalnie genem o największej długości transkryptu oraz największej długości kodowanego białka. Dodatkowo z genu HMG wątrobowca powstają dwa transkrypty o różnej długości, co związane jest z alternatywnym miejscem akceptorowym 3’ w trzecim intronie oraz dwoma preferencyjnie wybieranymi sygnałami poliadenylacji transkryptu. W zależności od tego, które miejsce splicingowe zostanie wybrane, rozpoznawany jest jeden z dwóch sygnałów poliadenylacji: wcześniejszy kiedy egzon 4 jest dłuższy, późniejszy kiedy egzon 4 jest krótszy. Dlatego również w zależności od zdarzenia splicingowego transkrypt powstający z genu HMG ma różną długość rejonu 3’UTR: 129nt w krótszym transkrypcie, 535nt w dłuższym transkrypcie. Ponieważ w obu transkryptach potencjalna ramka odczytu pozostaje niezmieniona, niewykluczone, że długość transkrybowanej cząsteczki mRNA ma wpływ na jej stabilizację. Niestety w obrębie obu transkryptów nie znaleziono potencjalnych sygnałów stabilizacji lub degradacji z użyciem informacji dostępnych w publicznych bazach danych. Istnieje możliwość, że transkrypty Pellia endiviifolia sp B posiadają specyficzne sygnały degradacji lub stabilizacji, które nie są jeszcze scharakteryzowane. Długi 3’UTR może

świadczyć o skierowywaniu tej izoformy na ścieżkę NMD (ang. Nonsense Mediated Decay),

pomimo braku przedwczesnego kodonu stop w komórce (Baker i Parker 2004). Warto nadmienić, że ostatni intron, który podlega alternatywnemu splicingowi, nie zmienia kodowanej ramki odczytu, która kończy się wraz z ostatnim kodonem egzonu poprzedzającego omawiany intron.

W obrębie przewidzianej sekwencji aminokwasowej zidentyfikowano w pozycji 49-118aa domenę HMGbox wiążącą się z DNA niezależnie od jego sekwencji, charakterystyczną dla białek HMGB. W pozycji 59 sekwencji aminokwasowej znajduje się konserwatywna reszta fenyloalaniny, która jako pierwsza interkaluje między zasady DNA oraz w pozycji 89 konserwatywna reszta tryptofanu, ważna dla prawidłowego zwijania się domeny HMGbox (Bianchi i Agresti 2005). Analizy RT-PCR fragmentu cDNA długości 193nt, stanowiącego fragment transkryptu genu kodującego białko z domeną HMGbox P.endiviifolia sp B, wykazały jego amplifikację wyłącznie na matrycach cDNA z plech męskich z terenu, które wytwarzały plemnie (rozdział WYNIKI, punkt 5.2.3, zdjęcie 5-19). Można więc wywnioskować, iż zidentyfikowany gen ulega specyficznej ekspresji w trakcie procesu tworzenia plemni przez gametofity męskie rosnące w naturalnych warunkach środowiska.

135 | S t r o n a

Dojrzałe, dwuwiciowe plemniki wątrobowców to heliakalnie zwinięte komórki z zlokalizowanym proksymalnie aparatem lokomotorycznym i czterema organellami: dwoma mitochondriami, ciasno upakowanym centralnie ułożonym jądrem, oraz dystalnym plastydem (Renzaglia i in. 2000). Analiza sekwencji aminokwasowej białka z domeną HMGbox

P.endiviifolia sp B z wykorzystaniem programu ProtParam, wykazała wysoce zasadowy

charakter tego białka, o punkcie izoelektrycznym 10.72, porównywalnym z białkami histonowymi odpowiedzialnymi za upakowanie DNA komórek eukariotycznych. Wiadomo, iż domena HMGbox oddziałuje z dwuniciowym DNA, powodując jego zgięcie, modulując strukturę chromatyny i umożliwiając formowanie innych kompleksów nukleoproteinowych. Specyfika tych oddziaływań nie jest zależna od samej sekwencji kwasu deoksyrybonukleinowego, lecz od struktury jaką przyjmuje. Strukturami szczególnie rozpoznawanymi są małe zaokrąglenia (ang. DNA-minicircles), czterobieżne skrzyżowania DNA (ang. four-way junction) oraz superzwinięte rejony DNA. U grochu Pisum sativum wykazano, że miejsca wiązania białek HMGB również zależą od struktury DNA, ale wykazują dodatkowo preferencje do strukturalnie elastycznych rejonów liniowego DNA zawierających deformujące trakty TpT i TpG (Graaser i in. 2007). Ekspresja genu kodującego białko z domeną HMGbox wyłącznie w plechach produkujących plemnie P.endiviifolia sp B może stanowić przesłankę, iż białko to odgrywa ważną rolę w procesie pakowania materiału genetycznego w plemnikach tego wątrobowca. Inną możliwość może stanowić wpływ tego białka na regulację ekspresji genów w plechach męskich P.endiviifolia sp B. Domena HMGbox wykazuje również zdolność do zginania łańcucha DNA, nawet o 90°, co może promować wiązanie wielu innych białek aktywujących proces transkrypcji z danego locus. Białka HMGB posiadają zdolność bezpośredniego oddziaływania z nukleosomem. Co ciekawe białko HMGB1 A.thaliana konkuruje z histonem H1 o miejsce wiązania DNA. Zastąpienie histonu przez to białko może indukować zmianę struktury chromatyny umożliwiając dostęp czynników regulatorowych do ich docelowych miejsc w nukleosomie. Innym sposobem oddziaływań jest przyłączenie białka HMGB do DNA i nagięcie go w taki sposób, żeby promotor i czynnik transkrypcyjny mogły stabilnie oddziaływać ze sobą lub też by promować rekrutację kolejnych białek kompleksu inicjującego transkrypcję (Bianchi i Agresti 2005, Graaser i in. 2007). Członkowie grupy białek HMGB zostali scharakteryzowani nie tylko w wielu roślinach wyższych, ale również u mchu Physcomitrella patens. Oprócz typowych białek lokalizujących w jadrze komórkowym, u mchu po raz pierwszy wśród roślin zidentyfikowano również jedno białko HMGB, które występuje wyłącznie w plastydach (Kullerich i in. 2008).

136 | S t r o n a

Obecność w gametoficie męskim Pellia endiviifolia sp B, wytwarzającym plemnie, białka biorącego udział w remodelowaniu struktury chromatyny lub oddziałującego z czynnikami transkrypcyjnymi jest bardzo prawdopodobna. Takie białko mogłoby działać na kilka sposobów: po pierwsze przez inicjowanie lub wzmacnianie ekspresji genów odpowiedzialnych za podziały i odróżnicowanie komórek parenchymy w komórki, które w rezultacie utworzą plemnie. Inną możliwością może być jego udział w podziałach komórek pierwotnych plemników i w tworzeniu plemników w już rozwiniętej plemni.

137 | S t r o n a