Charakterystyka końców 5’ i 3’ cDNA wyselekcjonowanych mRNA w eksperymencie RDA-cDNA

SMART

RACE Amplification Kit (Clontech)

W celu charakterystyki końców 5’ i 3’ cDNA wyselekcjonowanych fragmentów mRNA metodą RDA-cDNA wykorzystano zestaw SMART^TM RACE Amplification Kit firmy Clontech. Amplifikacja właściwych końców cDNA przeprowadzana jest dwuetapowo. W pierwszym etapie RNA całkowity, wolny od zanieczyszczeń genomowym DNA, przepisywany jest na cDNA. W drugim, metodą PCR, amplifikuje się odpowiednio koniec 5’ lub 3’ cDNA. Technologia SMART (ang. Switching Mechanism At 5' end of RNA Transcript – mechanizm przełączenia matrycy na końcu 5’ transkryptu RNA) wykorzystująca oligonukleotyd SMART II™A pozwala na tworzenie kompletnych cDNA w reakcji odwrotnej transkrypcji, bez konieczności ligowania adaptorów i syntezy drugiej nici. Jest to możliwe dzięki współdziałaniu oligonukleotydu SMART oraz odwrotnej transkryptazy. Wiele enzymów typu odwrotnej transkryptazy wykazuje aktywność terminalnej transferazy po osiągnięciu końca matrycy RNA, dodając 3-5 reszt głównie dC (deoksycytydyny) do końca 3’ pierwszej nici cDNA. Oligonukleotyd SMART II™A posiada na swym 3’ końcu ciąg 3 reszt dG (deoksyguanozyny), który przyłącza się do końca 3’ cDNA, bogatego w reszty dC, służąc tym samym jako przedłużenie matrycy dla reakcji odwrotnej transkrypcji (mechanizm przełączenia matrycy). Odwrotna transkryptaza przełączając matrycę z mRNA na oligonukleotyd SMART, generuje kompletny cDNA, będący kopią oryginalnej cząsteczki RNA, zakończony sekwencją oligonukleotydu SMART. Co ważne, aktywność dołączenia reszt dC przez odwrotną transkryptazę jest najbardziej efektywna, gdy enzym dotrze do końca matrycy RNA, dlatego sekwencja SMART jest zazwyczaj dodawana tylko do kompletnej długości cząsteczek cDNA. Proces ten gwarantuje, że korzystanie z wysokiej jakości RNA doprowadzi do utworzenia zbioru cząsteczek cDNA o maksymalnej długości końców 5’wyjściowego mRNA. Zestaw firmy Clontech zawiera protokół do syntezy cDNA dwóch odrębnych populacji cDNA: 5'-RACE-Ready cDNA i 3'-RACE-Ready cDNA. cDNA dla eksperymentów 5’RACE syntetyzowany jest przy użyciu startera 5’RACE CDS Primer A (5’-CDS) oraz powyżej opisanego oligonukleotydu SMART. 5’RACE CDS Primer A,

63 | S t r o n a

zbudowany z reszt dT, jest starterem dla odwrotnej transkryptazy. Ponadto na swoim końcu 3’ posiada dwie zdegenerowane reszty nukleotydowe (jedną czterokrotnie, drugą trzykrotnie), które umożliwiają jego hybrydyzację z początkiem ogona poliA, eliminując tym samym heterogenność końców 3’, którą wprowadza zwyczajny starter oligo(dT). Mechanizm metody 5’RACE przedstawia schemat 4-3.

Schemat 4-3. Przebieg postępowania w eksperymencie 5’RACE. GSP1 i GSP2 (ang. Gene Specific Primer) – startery genowo specyficzne 1 i 2, LongUP i ShortUP – startery uniwersalne komplementarne do sekwencji adaptora SMART II A (Clontech, zmodyfikowany).

cDNA dla eksperymentów 3’RACE syntetyzowany jest przy użyciu startera 3’RACE CDS Primer A (3’-CDS), charakteryzującego się takim samym zdegenerowaniem końca 3’ jak starter 5’-CDS oraz dołączoną sekwencją SMART na jego 5’ końcu. Mechanizm metody 3’RACE przedstawia schemat 4-4.

64 | S t r o n a

Schemat 4-4. Przebieg postępowania w eksperymencie 3’RACE. GSP1 i GSP2 (ang. Gene Specific Primer)

– startery genowo specyficzne 1 i 2, LongUP i ShortUP – startery uniwersalne komplementarne do sekwencji adaptora SMART II A (Clontech, zmodyfikowany).

Technologia SMART pozwala na poznanie końców 5’ i 3’ cDNA zawierającego, odpowiednio na końcu 5’ lub 3’, sekwencję oligonukleotydu SMART. Dzięki temu w reakcji RACE-PCR wykorzystuje się uniwersalny zestaw starterów – Universal Primer Mix A (UPM) hybrydyzujący z sekwencją SMART oraz starter genowo specyficzny (ang. GSP1, Gene Specific Primer 1). Dla zwiększenia specyficzności reakcji przeprowadza się drugą rundę RACE-PCR z wewnętrznym starterem genowo specyficznym (ang. GSP2, Gene Specific Primer 2) oraz z wewnętrznym starterem uniwersalnymi – Nested Universal Primer A (NUP) hybrydyzującym z wewnętrzną sekwencją oligonukleotydu SMART.

4.12.1. Synteza 5'-RACE-Ready cDNA i 3'-RACE-Ready cDNA

Reakcje odwrotnej transkrypcji dla przygotowania 5’- i 3’-RACE-ready cDNA przeprowadzono na RNA całkowitym, wolnym od zanieczyszczeń genomowym DNA, izolowanym z plech męskich wytwarzających plemnie Pellia endiviifolia sp. B. Materiał roślinny pochodził z hodowli in vitro lub z terenu: Kopanina k. Poznania.

65 | S t r o n a

Do reakcji dodano:

Zawartość probówek doprowadzono do końcowej objętości 5µl wodą wolną od RNaz, wymieszano delikatnie pipetując, zwirowano, po czym inkubowano w 65^oC przez 2 min. Następnie próby schładzano na lodzie przez 2 min. zwirowano i schładzano na lodzie przez kolejne 2 min. Do każdej probówki dodano: 2µ l 5x bufor dla odwrotnej transkryptazy, 1µl DTT (20mM), 1µl dNTP (10mM każdy) oraz 200U odwrotnej transkryptazy SuperScriptIII™ (Invitrogen). Zawartość probówek wymieszano delikatne pipetując, krótko zwirowano i umieszczono w bloku grzejnym w temperaturze 37°C, po czym przestawiono temperaturę na 50°C. Po osiągnięciu temperatury 50°C, próbę inkubowano 1.5 godziny z lekkim mieszaniem, a następnie 10 min. w temperaturze 55°C. Reakcję zakończono przez inaktywację enzymu inkubując próbę 15 min. w 70°C. Po reakcji odwrotnej transkrypcji próby rozcieńczono przez dodanie do każdej z nich 100µl Tricine-EDTA.

4.12.2. Amplifikacja końców 5’ i 3’ cDNA w reakcji RACE-PCR

W celu amplifikacji końców 5’ i 3’ cDNA, przeprowadzono pierwszą rundę RACE-PCR. Przygotowano mieszaninę reakcyjną zawierającą: 2.5µl 10x bufor Adventage 2 PCR, 0.5µl dNTP [10mM każdy], 0.5µl 50x Adventage 2 DNA Polymerase Mix, 2.5µl startera uniwersalnego UPM, 0.5µl startera genowo specyficznego 1 (ang. GSP1, Gene Specific Primer 1) w kierunku 5’ lub 3’ [10µM], 1.25µl matrycy 5'-RACE- lub 3'-RACE-Ready cDNA, 17.25µl sterylnej wody. Pierwszą rundę reakcji przeprowadzano według programu RACE:

10µl każdej reakcji sprawdzano podczas elektroforezy w 1.5% żelu agarozowym. 1µl reakcji rozcieńczono przez dodanie 49µl buforu Tricine-EDTA, po czym przeprowadzono drugą rundę RACE-PCR. Przygotowano mieszaninę reakcyjną zawierającą: 2.5µl 10x bufor Advenatge 2 PCR, 0.5µl dNTP [10mM każdy], 0.5µl 50x Adventage 2 DNA Polymerase Mix, 0.5µl wewnętrznego startera uniwersalnego NUP, 0.5µl wewnętrznego startera genowo

5’RACE-ready cDNA 3’RACE-ready cDNA

1µg całkowitego RNA 1µg całkowitego RNA 1µl 5’-CDS Primer A 1µl 3’-CDS Primer A 1µl oligont. SMART II^TM A Denaturacja 95°C 5 min Amplifikacja 5 cykli Denaturacja 94°C 30 s Hybrydyzacja i elongacja 72°C 3 min Amplifikacja 5 cykli Denaturacja ₉₄°C 30 s Hybrydyzacja 70°C 30 s Elongacja 72°C 3 min Amplifikacja 25 cykli Denaturacja 94°C 30 s Hybrydyzacja 68°C 30 s Elongacja 72°C 3 min Elongacja 72°C 10 min Schłodzenie prób 4°C -

66 | S t r o n a

specyficznego 2 (ang. GSP2, Gene Specific Primer 2) w kierunku 5’ lub 3’ [10µM], 1.25µl matrycy będącej rozcieńczonym produktem pierwszej reakcji RACE-PCR, 19.25µl sterylnej wody. Drugą rundę reakcji przeprowadzano według programu NRACE:

Denaturacja 95°C 5 min Amplifikacja 25 cykli Denaturacja 94°C 30 s Hybrydyzacja 68°C 30 s Elongacja ₇₂°C 3 min Elongacja 72°C 10 min Schłodzenie prób 4°C -

10µl każdej reakcji sprawdzano podczas elektroforezy w 1.5% żelu agarozowym. Produkty drugiej rundy RACE-PCR klonowano bezpośrednio lub po elucji DNA z żelu agarozowego jak w punktach 4.6 – 4.8 (METODY) oraz sekwencjonowano (METODY, punkt 4.9).

4.13.Charakterystyka pełnej sekwencji genomowej wyselekcjonowanych