5. WYNIKI
5.3. Charakterystyka końców 5’ i 3’ cDNA wyselekcjonowanych transkryptów w eksperymencie
W celu charakterystyki końców 5’ i 3’ cDNA czterech wyselekcjonowanych metodą RDA-cDNA fragmentów transkryptów, ulegających specyficznej amplifikacji na matrycach cDNA pochodzących z plech męskich P.endiviifolia sp B, wykorzystano zestaw SMARTTM RACE Amplification Kit firmy Clontech. Amplifikacje właściwych końców cDNA przeprowadzano w dwóch reakcjach RACE-PCR (METODY, pkt 4.12): w pierwszej z użyciem startera genowo specyficznego GSP1 i startera uniwersalnego UPM, w drugiej z użyciem wewnętrznego startera genowo specyficznego GSP2 i wewnętrznego startera uniwersalnego NUP. Zarówno startery GSP1, jak GSP2 zaprojektowano na podstawie sekwencji fragmentów cDNA uzyskanych w wyniku eksperymentu RDA-cDNA. Na każdym zdjęciu strzałką zaznaczono produkt będący właściwym końcem 5’ lub 3’ badanego
91 | S t r o n a
transkryptu. Dodatkowe produkty reakcji RACE-PCR, które pojawiają się na niektórych zdjęciach żeli agarozowych, stanowią niespecyficzne produkty amplifikacji (co wykazały reakcje sekwencjonowania).
5.3.1. Charakterystyka końców 5’ i 3’ cDNA fragmentu RDA-cDNA długości 273nt
Dla uzyskania pełnej sekwencji cDNA w pierwszym podejściu przeprowadzono reakcje RACE-PCR w celu uzyskania końca 5’ badanego transkryptu. Ponieważ wyjściowa sekwencja fragmentu cDNA nie wykazała podobieństwa do żadnej znanej sekwencji, zarówno na poziomie nukleotydowym, jak i aminokwasowym, w reakcji RACE wykorzystano startery zarówno na nić cDNA uzyskaną w wyniku eksperymentu RDA-cDNA, jak i na nić do niej komplementarną, by sprawdzić która nić stanowi badany transkrypt. Jako wynik otrzymano produkt PCR, wyłącznie przy zastosowaniu startera specyficznego Frd1 i uniwersalnego UPM, długości odpowiednio 1 940pz (zdj. 5.21a). Dodatkowo na podstawie sekwencji końca 5’ uzyskanej w wyniku reakcji sekwencjonowania produktu 5’RACE-PCR, zaprojektowano startery dla drugiego podejścia 5’RACE-PCR w celu sprawdzenia możliwości uzyskania wydłużenia końca 5’ badanego transkryptu. W rezultacie otrzymano produkt PCR długości 403pz (zdj. 5.21b). Następnie przeprowadzono reakcje RACE-PCR w celu uzyskania końca 3’ badanego transkryptu, w wyniku której otrzymano produkt długości 492pz (zdj. 5.21c).
Zdjęcie 5-21. Rozdział elektroforetyczny w 1,5% żelu agarozowym produktów reakcji RACE-PCR dla fragmentu cDNA długości 273nt. a) – produkty 5’RACE-PCR z wykorzystaniem startera specyficznego Frd1 i uniwersalnego UPM. b) – produkty drugiego podejścia 5’RACE-PCR z wykorzystaniem startera specyficznego 5TUA2 i uniwersalnego UPM. c) – produkty 3’RACE-PCR z wykorzystaniem startera specyficznego Rrd1 i uniwersalnego UPM. Amplifikację prowadzono wg programu RACE (METODY, pkt 4.12.2.). Ścieżki 1 – produkty amplifikacji RACE-PCR, ścieżki 2 – kontrole negatywne reakcji PCR (bez matrycy).
5.3.2. Charakterystyka końców 5’ i 3’ cDNA fragmentu RDA-cDNA długości 229nt
wykazującego podobieństwo do roślinnych genów kodujących białka Rab
Dla uzyskania pełnej sekwencji cDNA w pierwszym podejściu przeprowadzono reakcje RACE-PCR w celu uzyskania końca 5’ badanego transkryptu. Jako wynik otrzymano produkt PCR długości odpowiednio 601pz (zdj. 5-22a). Dodatkowo na podstawie sekwencji końca 5’
92 | S t r o n a
uzyskanej w wyniku reakcji sekwencjonowania produktu 5’RACE-PCR, zaprojektowano startery dla drugiego podejścia 5’RACE-PCR w celu sprawdzenia możliwości uzyskania wydłużenia końca 5’ badanego transkryptu. W rezultacie otrzymano produkty PCR długości 214pz i 130 pz (zdj.5-22b). Następnie przeprowadzono reakcje RACE-PCR w celu uzyskania końca 3’ badanego transkryptu, w wyniku której otrzymano produkty w zakresie ~300 do ~600pz (zdj. 5-22c).
Zdjęcie 5-22. Rozdział elektroforetyczny w 1,5% żelu agarozowym produktów reakcji RACE-PCR dla fragmentu cDNA długości 229nt. (a) – produkty 5’RACE-PCR z wykorzystaniem startera specyficznego 5N_RAB1 i uniwersalnego NUP. (b) – produkty drugiego podejścia 5’RACE-PCR z wykorzystaniem startera specyficznego 5N_RAB2 i uniwersalnego NUP. (c) – produkty 3’RACE-PCR z wykorzystaniem startera specyficznego 3N_RAB2 i uniwersalnego NUP. Amplifikację prowadzono wg programu NRACE (METODY, pkt 4.12.2.). Ścieżki 1 – produkty amplifikacji RACE-PCR, ścieżki 2 – kontrole negatywne reakcji PCR (bez matrycy).
5.3.3. Charakterystyka końców 5’ i 3’ cDNA fragmentu RDA-cDNA długości 243nt
Dla uzyskania pełnej sekwencji cDNA w pierwszym podejściu przeprowadzono reakcje RACE-PCR w celu uzyskania końca 5’ badanego transkryptu. Ponieważ wyjściowa sekwencja fragmentu cDNA nie wykazała podobieństwa do żadnej znanej sekwencji, zarówno na poziomie nukleotydowym, jak i aminokwasowym, w reakcji RACE wykorzystano startery zarówno na nić cDNA uzyskaną w wyniku eksperymentu RDA-cDNA, jak i na nić do niej komplementarną, by sprawdzić która nić stanowi badany transkrypt. Jako wynik otrzymano produkt PCR, wyłącznie przy zastosowaniu startera specyficznego Rrd2 i uniwersalnego UPM, długości 354pz (zdj. 5-23a). Dodatkowo na podstawie sekwencji końca 5’ uzyskanej w wyniku reakcji sekwencjonowania produktu 5’RACE-PCR, zaprojektowano startery dla drugiego podejścia 5’RACE-PCR w celu sprawdzenia możliwości uzyskania wydłużenia końca 5’ badanego transkryptu. W rezultacie otrzymano produkt PCR długości 1 183pz (zdj. 5-23b). Następnie przeprowadzono reakcje RACE-PCR w celu uzyskania końca 3’ badanego transkryptu, w wyniku której otrzymano produkt długości 1 407pz (zdj. 5.23c).
93 | S t r o n a
Zdjęcie 5-23. Rozdział elektroforetyczny w 1,5% żelu agarozowym produktów reakcji RACE-PCR dla fragmentu cDNA długości 243nt. (a) – produkty 5’RACE-PCR z wykorzystaniem startera specyficznego 3N_2SP2 i uniwersalnego NUP. (b) – produkty drugiego podejścia 5’RACE-PCR z wykorzystaniem startera specyficznego Nst1 i uniwersalnego NUP. (c) – produkty 3’RACE-PCR z wykorzystaniem startera specyficznego 5N_2SP1 i uniwersalnego NUP. Amplifikację prowadzono wg programu NRACE (METODY, pkt 4.12.2.). Ścieżki 1 – produkty amplifikacji RACE-PCR, ścieżki 2 – kontrole negatywne reakcji PCR (bez matrycy).
5.3.4. Charakterystyka końców 5’ i 3’ cDNA fragmentu RDA-cDNA długości 196nt
Dla uzyskania pełnej sekwencji cDNA w pierwszym podejściu przeprowadzono reakcje RACE-PCR w celu uzyskania końca 5’ badanego transkryptu. Ponieważ wyjściowa sekwencja fragmentu cDNA nie wykazała podobieństwa do żadnej znanej sekwencji, zarówno na poziomie nukleotydowym, jak i aminokwasowym, w reakcji RACE wykorzystano startery zarówno na nić cDNA uzyskaną w wyniku eksperymentu RDA-cDNA, jak i na nić do niej komplementarną, by sprawdzić która nić stanowi badany transkrypt. Jako wynik otrzymano produkty PCR, wyłącznie przy zastosowaniu startera specyficznego 5’N_HMG2 i uniwersalnego NUP, w zakresie ~200 – 300pz oraz z (zdj. 5.24a). Właściwym produktem okazał się fragment długości 271pz. Dodatkowo na podstawie sekwencji końca 5’ uzyskanej w wyniku reakcji sekwencjonowania produktu 5’RACE-PCR, zaprojektowano startery dla drugiego podejścia 5’RACE-PCR w celu sprawdzenia możliwości uzyskania wydłużenia końca 5’ badanego transkryptu. W rezultacie otrzymano produkt PCR długości 151pz (zdj. 5-24b). Następnie przeprowadzono reakcje RACE-PCR w celu uzyskania końca 3’ badanego transkryptu, w wyniku której otrzymano produkty w zakresie ~250 – 1 000 pz (zdj. 5.24c). Właściwymi produktami okazały się fragmenty długości 863pz oraz 444pz.
Zdjęcie 5-24. Rozdział elektroforetyczny w 1,5% żelu agarozowym produktów reakcji RACE-PCR dla fragmentu cDNA długości 193nt. (a) – produkty 5’RACE-PCR z wykorzystaniem startera specyficznego
94 | S t r o n a
5’N_HMG2 i uniwersalnego NUP. (b) – produkty drugiego podejścia 5’RACE-PCR z wykorzystaniem startera specyficznego 2_N_5’HMG2 i uniwersalnego NUP. (c) – produkty 3’RACE-PCR z wykorzystaniem startera specyficznego 3’N_HMG2 i uniwersalnego NUP. Amplifikację prowadzono wg programu NRACE (METODY, pkt 4.12.2.). Ścieżki 1 – produkty amplifikacji RACE-PCR, ścieżki 2 – kontrole negatywne reakcji PCR (bez matrycy).
W celu udowodnienia, że amplifikowane końce 5’ i 3’ cDNA pochodzą z jednego transkryptu przeprowadzono reakcje amplifikacji pełnej długości sekwencji cDNA, których wyniki przedstawiono w rozdziale 5.6.