Analiza bioinformatyczna sekwencji fragmentów DNA specyficznych dla DNA genomowego

5. WYNIKI

5.1. Identyfikacja fragmentów DNA specyficznych dla DNA genomowego męskiego i żeńskiego Pellia

5.1.3. Analiza bioinformatyczna sekwencji fragmentów DNA specyficznych dla DNA genomowego

DNA genomowego żeńskiego i męskiego P.endiviifolia sp B hodowanej in vitro

Fragmenty DNA ulegające specyficznej amplifikacji na DNA genomowym żeńskim i męskim wątrobowca P.endiviifolia sp B hodowanego in vitro poddano analizom bioinformatycznym z wykorzystaniem zestawu programów blast dostępnych na stronie internetowej NCBI oraz programu RepeatMasker dostępnego na stronie http://repeatmasker.org.

• Analiza sekwencji fragmentu DNA Z_333pz

W wyniku eksperymentu RDA uzyskano sekwencję DNA długości 333nt:

GATCCTATTTGGAGGGAAAATAATGATATTGGTAGGAGGATTTTGACAAGTGTTGCCAATTTTGCAATTTGGGA GTTGTACGGACATTATTCAAGCGAGTCTTAAGAGTTCGATGATATGGTCACATGTCAAAGTGATGAAACTATAT GAAAACATGCAAATGAAGACGTTAGAAGGTAAACATTATTGCAACGTAATATCAATTCTGACTTTTGCTCTTAA GCGTGTAAGGTGGACAATTTGAGTGAGGTTGACTACTCCTAGGGTAAGCATGTATTGAACAACAAAATTTCAA TAATTGCCTTCTGAAAATAAGAGAGGGAAGAGTGGATC

Analiza na poziomie nukleotydowym z wykorzystaniem algorytmu blastn nie wykazała znaczącego podobieństwa do znanych sekwencji nukleotydowych zdeponowanych w bazie

78 | S t r o n a

danych GenBank. Zastosowanie algorytmu blastx umożliwiło przetłumaczenie sekwencji nukleotydowej na sześć potencjalnych ramek odczytu oraz porównanie uzyskanych sekwencji aminokwasowych do sekwencji białkowych zdeponowanych w bazie danych GenBank. Wyniki tej analizy przedstawiono w tabeli 5-1, przy czym jako kryterium jakości dopasowania przyjęto najniższą wartość E-value.

Tabela 5-1. Wyniki analizy bioinformatycznej dla fragmentu DNA długości 333nt z wykorzystaniem algorytmu blastx. E-value = wartość E.

Fragment DNA Z_333pz

blastx Gene ID %* E-value

Hipotetyczne białko SORBIDRAFT_02g042016

Sorghum bicolor ^{gi|242051190|gb|EER99860|} ⁴⁴ ^2e-07

Hipotetyczne białko AP9_D05.1

Arabidopsis lyrata subsp. petraea ^{gi|169647206|gb|ACA61624|} ⁴³ ^3e-06

Hipotetyczna helikaza Arabidopsis thaliana gi|4585936|gb|AAD25596| 48 3e-06 Helikaza helitronu Phytophthora infestans T30-4 gi|9461885|gb|EEY60735| 42 4e-06

*procent podobieństwa analizowanej sekwencji względem sekwencji z bazy danych GenBank.

• Analiza sekwencji fragmentów DNA Z_363pz, Z_474pz

W wyniku eksperymentu RDA uzyskano sekwencję DNA długości 363nt:

GATCCAAATCACCTTATGGCTTGATAACGTAATGAATGAATATTTTTCTGACAAAGTGTCTTTAACTTCCATCAT TCAGGGTTTTATGGTTAGAGTGTCTTGGAGGTGCATTTTTCCATGATAAAATACAATGTTCAATGTGTGCAGAC CCTTTATCCTTGAAGTTGCCACCGTGACTATCTATCTGCACGGTCAACGAAGGTCTATTTATTGGTGTGGAGAA CAAACACACCACTAGTAGTACCTTGTGACCAATAGTATGAGAAAAATCCCTTTATCAAGATGACATAGAGAGA AATGCCATGGAGGATTATGCAGCTAAGTCAAAACCCATTGTGGACTGGCAATACCTTCCTTTGGATC

oraz sekwencję DNA o długości 474nt:

GATCCAAATGAGTGTTCTTACAAAACAAACTCTCTCTCCTTGCACATGCCTCATTTGTCTCATGTAACCATCCAA GTTGAGTTACAAAGGCTTTGGTGGATAGTGAGGTAAGAAACGCCTATGTGTGTTGCGCCCCTCTCGCTTTGCTT TCTTTTGTGATCTCCTCCAACTATGGTAGTCAAGTTGTTTGTGCACCTACACGGGCTCCTCCTTTGCGCTCCCTT CTGTGTAGTCCATCAACTCTTGGCTATTGAGGTCCTTGAACCTTCCGCTCCCGTCTCACACAACACACTCTTGAG ACTCCACCAACTATCAATTTCAAAGTTTAGTGATTCACAATTTGGCAATGAAGTTGTAAAATTCCTAGGGCTAT CTAGTGTGCAGGAATTGAATGCTATTCTAAATAAGGATTGGCAAACCACCACTTGGCATCCACGAGGGTATAA ACTTTGTGCGAAACATCAAAATTGGATC

Analizy zarówno na poziomie nukleotydowym, jak i aminokwasowym z wykorzystaniem programów blast nie wykazały żadnego podobieństwa do znanych sekwencji nukleotydowych i białkowych zdeponowanych w bazie danych GenBank. Również zastosowanie programu RepeatMasker nie wskazało na obecność sekwencji repetytywnych w obrębie badanych sekwencji.

• Analiza sekwencji fragmentu DNA M_451pz

W wyniku eksperymentu RDA uzyskano sekwencję DNA długości 451nt:

GATCCACTGCCGCCTGCACAGGCAGTCAAGGTTAGCACTGATGAGTTGAAGCGGGCATTCGATCTCGCTTCAG AAGACGCGAACGGCCTGATAACGGCTGAGATCCGGCTCGATGGGAAGAATGAAGCCGGCGCATATGCGGCCA ATCTGCCCTCAAGCTTCTTTGCCTCTGGGGGGCAGGGTCAGAGAATTCGCCTCTCGACACCGATAGGCGAACTA ACCGTACCTGCCGGTATGTTCGCGAAGAGTGATCTGACTGGCGCGGAGGATGTCGAGCTGCCTGTCGGCACCG CCGATCTCTCGAGTCTGGACAGCAAGCTGAAGGAGAAGATTGGCAGCCATCCGGTCGTTGAGCTGACCGCCAA GGTCGGCGATACCGTTCTCGCCTGGAACAATCCCGGCGCTCCGGTTACGGTGTCGGTGAAGTACGCCCTTGCAC AGGGTGAGGATC

79 | S t r o n a

Analiza na poziomie nukleotydowym z wykorzystaniem algorytmu blastn nie wykazała znaczącego podobieństwa do znanych sekwencji nukleotydowych zdeponowanych w bazie danych GenBank. Zastosowanie algorytmu blastx umożliwiło przetłumaczenie sekwencji nukleotydowej na sześć potencjalnych ramek odczytu oraz porównanie uzyskanych sekwencji aminokwasowych do sekwencji białkowych zdeponowanych w bazie danych GenBank. Wyniki tej analizy przedstawiono w tabeli 5-2, przy czym jako kryterium jakości dopasowania przyjęto najniższą wartość E-value.

Tabela 5-2. Wyniki analizy bioinformatycznej dla fragmentu DNA długości 451nt z wykorzystaniem algorytmu blastx. E-value = wartość E.

Fragment DNA M_451pz

blastx Gene ID %* E-value

Ksylanaza 5 Paenibacillus sp. W-61 gi|27227837|gb|BAC45001| 37 7e-16 Białko warstwy powierzchniowej

Paenibacillus sp. JDR-2 ^gi|^251798262^|gb|^YP_003012993^| ³⁶ ^6e-15

Endo-1,4-beta-ksylanaza Paenibacillus sp. JDR-2 gi|251794257|gb|YP_003008988| 35 4e-14

*procent podobieństwa analizowanej sekwencji względem sekwencji z bazy danych GenBank.

• Analiza sekwencji fragmentu DNA M_282pz

W wyniku eksperymentu RDA uzyskano sekwencję DNA długości 282nt:

GATCCATGATCATTCCGAGCGCTTCCACTACATTACGACGAACCCAATCGCTTGCATCGTTCAATGCGACAACT AATGAAGGAACTGCGGAGGATGCCTTCGAGCCAATCATCCCAAGCACGAACGCAGCGAGCGCTCTGCTGTTCT CTTCCCCTTGATCCAGTACATGAATAAGACCTGGAACAGCTTCTATGCCAGCAGCTTGAAGCCCGTAAGCCGCG CGCTGCGCCGTTAACTTGGAGCCTTCCGCCAGCTCCTTCAGCAATGCCGCCGTACCGGATC

Analiza na poziomie nukleotydowym z wykorzystaniem algorytmu blastn nie wykazała znaczącego podobieństwa do znanych sekwencji nukleotydowych zdeponowanych w bazie danych GenBank. Zastosowanie algorytmu blastx umożliwiło przetłumaczenie sekwencji nukleotydowej na sześć potencjalnych ramek odczytu oraz porównanie uzyskanych sekwencji aminokwasowych do sekwencji białkowych zdeponowanych w bazie danych GenBank. Wyniki tej analizy przedstawiono w tabeli 5-3, przy czym jako kryterium jakości dopasowania przyjęto najniższą wartość E-value.

Tabela 5-3. Wyniki analizy bioinformatycznej dla fragmentu DNA długości 282nt z wykorzystaniem algorytmu blastx. E-value = wartość E.

Fragment DNA M_282pz

blastx Gene ID %* E-value

Dioksygenaza fitynylo-CoA

Paenibacillus sp. JDR-2 ^gi|^251797225^|gb|^YP_003011956^| ⁷³ ^9e-32

Białko zawierające domenę HEAT

Geobacillus sp. Y412MC10 ^gi|^261406520^|gb|^YP_003242761^| ⁵⁰ ^4e-18

Białko zawierające domenę HEAT

Microcystis aeruginosa NIES-843 ^gi|^166363530^|gb|^YP_001655803^| ⁴² ^7e-08

*procent podobieństwa analizowanej sekwencji względem sekwencji z bazy danych GenBank.

• Analiza sekwencji fragmentu DNA M_462pz

80 | S t r o n a GATCCATTGGACCAAGCATGCGGCTAATCCGATCTTTCGCGCCGACCCTGCAAGCCGATGGGAGCAGCAGAAG GTTACCGCGTGCCAGGTCGTCAAACACGACGACTGGTATGTCATGTTCTATATCGGATTCGAAGATGTGAATAC GGCTCGTATCGGAATTGCCCGTTCACGCGACGGAACCGGCAGCTGGGAGCGGTTGCCGGTCAATCCCATTCTG TCTCCCGGGAAAGGCAAATGGGATGGGGAAACATGCTATAAGCCTTTCGCCATCTACGAAGGCGACCGCAATG ACATTGACTGCTTTGGCAAATGTGCTTCAACAAAGTGGCAGCGAGTCACGAAATGAGTCATCTATCCGTAAAG GTGATTATTATGATTTGTTATCCCGTTACGCGAGAAGCCATTATCGGAAGCGAGTTGATGGCACGGCCTTTCAT TGGCTGGATGAGAATCTGGATC

Analiza na poziomie nukleotydowym z wykorzystaniem algorytmu blastn nie wykazała znaczącego podobieństwa do znanych sekwencji nukleotydowych zdeponowanych w bazie danych GenBank. Zastosowanie algorytmu blastx umożliwiło przetłumaczenie sekwencji nukleotydowej na sześć potencjalnych ramek odczytu oraz porównanie uzyskanych sekwencji aminokwasowych do sekwencji białkowych zdeponowanych w bazie danych GenBank. Wyniki tej analizy przedstawiono w tabeli 5-4, przy czym jako kryterium jakości dopasowania przyjęto najniższą wartość E-value.

Tabela 5-4. Wyniki analizy bioinformatycznej dla fragmentu DNA długości 462nt z wykorzystaniem algorytmu blastx. E-value = wartość E.

Fragment DNA M_462pz

blastx Gene ID %* E-value

Domniemana lipoproteina Bacteroides fragilis 638R gi|301164242|gb|CBW23800| 61 1e-29 Hydrolaza glikozydowa rodzina 32

Clostridium hathewayi DSM 13479 ^gi|^266624617^|gb|^ZP_06117552^| ⁵¹ ^2e-23

*procent podobieństwa analizowanej sekwencji względem sekwencji z bazy danych GenBank.

• Analiza sekwencji fragmentu DNA M_314pz

W wyniku eksperymentu RDA uzyskano sekwencję DNA długości 314nt:

GATCCGTACGGATTGGTTGGATAAATTGGGACTGCAGGCGCCGAGAACGATGGACGATGTCCTGGCGATCTCG AAGGCGTTTACAGAGCGGGACCCTGACGGCAACGGCCTAAAGGACACTTTCGGTCTCGCCATCACGAAGGACT TGTGGGGAAGTGCAATGGGCTTAGAGGGGTTCATGGCCGGCTACGGGGCTTATCCGAACATCTGGCTGCAGGA CTCGTCGGGTAAGCTCGTATATGGCAGTGTTCAGCACGAAATGAAACAAGCGCTTCGAGCGCTTCAAACGATG TACAAAAACGGCGAGTTGGATC

Analiza na poziomie nukleotydowym z wykorzystaniem algorytmu blastn nie wykazała znaczącego podobieństwa do znanych sekwencji nukleotydowych zdeponowanych w bazie danych GenBank. Zastosowanie algorytmu blastx umożliwiło przetłumaczenie sekwencji nukleotydowej na sześć potencjalnych ramek odczytu oraz porównanie uzyskanych sekwencji aminokwasowych do sekwencji białkowych zdeponowanych w bazie danych GenBank. Wyniki tej analizy przedstawiono w tabeli 5-5, przy czym jako kryterium jakości dopasowania przyjęto najniższą wartość E-value.

Tabela 5-5. Wyniki analizy bioinformatycznej dla fragmentu DNA długości 314nt z wykorzystaniem algorytmu blastx. E-value = wartość E.

Fragment DNA M_314pz

blastx Gene ID %* E-value

pozakomórkowe białko wiążące substancje rozpuszczalne

– rodzina1, Geobacillus sp.Y412MC10 ^gi|^261407109^|gb|^YP_003243350^| ⁷² ^1e-38 pozakomórkowe białko wiążące substancje rozpuszczalne

– rodzina1, Clostridium cellulolyticum H10 ^gi|^220928679^|gb|^YP_002505588^| ⁶⁵ ^1e-33

81 | S t r o n a

• Analiza sekwencji fragmentu DNA M_270pz

W wyniku eksperymentu RDA uzyskano sekwencję DNA długości 270nt:

GATCCCTACTTGCAGAAGATGAACGTGACCTTGGCTTCCGGCGACCTTCCGGACATCATTCCGGTCAATGCCAC CCAGCTGAAGCAGCTGGCCGACTCGAACCAGATCGAGGATATGACGGATTTGTACGAGAAGTACGCTTCTCCT CTGCTCAAGGAAATTCTCTCCGAGGAAGGTTCAGGGCCGTTCGATGCCGCGACGTTCGACGGAAGACTTATGG CCATTCCGCAGACGGGTTCATCGATCGAACAAGCGCAGTTCATCTGGATC

Analiza na poziomie nukleotydowym z wykorzystaniem algorytmu blastn nie wykazała znaczącego podobieństwa do znanych sekwencji nukleotydowych zdeponowanych w bazie danych GenBank. Zastosowanie algorytmu blastx umożliwiło przetłumaczenie sekwencji nukleotydowej na sześć potencjalnych ramek odczytu oraz porównanie uzyskanych sekwencji aminokwasowych do sekwencji białkowych zdeponowanych w bazie danych GenBank. Wyniki tej analizy przedstawiono w tabeli 5-6, przy czym jako kryterium jakości dopasowania przyjęto najniższą wartość E-value.

Tabela 5-6. Wyniki analizy bioinformatycznej dla fragmentu DNA długości 270nt z wykorzystaniem algorytmu blastx. E-value = wartość E.

Fragment DNA M_270pz

blastx Gene ID %* E-value

pozakomórkowe białko wiążące substancje rozpuszczalne

– rodzina1, Paenibacillus sp. JDR-2 ^gi|^251798249^|gb|^YP_003012980^| ⁵⁶ ^2e-23 pozakomórkowe białko wiążące substancje rozpuszczalne

– rodzina1, Clostridium cellulolyticum H10 ^gi|^220928679^|gb|^YP_002505588^| ⁵⁶ ^1e-22

*procent podobieństwa analizowanej sekwencji względem sekwencji z bazy danych GenBank.

• Analiza sekwencji fragmentów DNA M_306pz, M_498pz

W wyniku eksperymentu RDA uzyskano sekwencję DNA długości 306nt:

GATCCGAAAAAGTACATTTACGACTTGTGGTCAGCGAAGATGGGCTTGAATACCATTCCGAATAAGCCAGTCA CTTCTGGGCCTTCTTATTCTACTTGGACTGCGGCCACACTCGCTGTAGCCGTGTCCAAGAATTCGCCGCTGACG CTAGCCGATCTGGGCAGAGCGTTTCTCGATTCGCAGTTTTTCAATAACAAGGCCATCTATGAAGCGCTCCAAAC CGTGGCCAATATCGGCGTAAGCTTTATACAGGCGGATCTGGAGAACGCGATCAGCGAAATGCTGACCGATCTT GCCGACGGGATC

oraz sekwencję DNA o długości 498nt:

GATCCGCTTGTCATGGCGTGGCTGAATGCGCAGACGAATCTGATGGATTCGCTTCGCTACCTGGTGGAGAATG AAATCATGCAGCACGGCGTTCGGAATCTGCAGATGTTTATTCCGATGGAGCGGGCGGGCATTCAAGGCCAGGG TCAGGGACAAGGACATGCTGCATCATTCTCTAGCCCAGTGGCGGCTACAGCTGAGGAAGTTGGACAAGCACCA GAGGCAGAGGAAGCCGCGGAATTCGTGGGCGATGCTGGAGCGGCCGACCACGAGGACACATTATACGATAGC CAAGATGAAGTGGACGATGAGGATATTGAAGCTTGGAGTTAGTAGGTCGTGGTAACACTGAGTAACTCCGAGT ATCACCGAATATCACGAAGGCTTACTTGGTGACACTCGGTAATACCAAGTCGTGCCAAGTAACACTAGGTAAC ACCAAGTAATACCTGCCGATGCTCAGGCCTTGCTCGGTAATGCCTAGTCATGCCGAGGATC

Podobieństwo niektórych sekwencji uzyskanych w wyniku eksperymentu RDA do sekwencji bakteryjnych okazało się zaskakujące. Do dnia dzisiejszego nie ma danych na

82 | S t r o n a

temat pełnej sekwencji genomowej jakiegokolwiek przedstawiciela wątrobowców, dlatego nie można wykluczyć, iż w genomie tych organizmów występują geny o dużym podobieństwie do genów prokariotycznych. Nie możemy również wykluczyć możliwości, że w przestrzeniach międzykomórkowych plech P.endiviifolia sp B znajdują się niezidentyfikowane do tej pory bakterie, które wybiórczo nadal przebywają w roślinach wprowadzonych do hodowli in vitro. Innym wytłumaczeniem obecności fragmentów DNA płciowo-specyficznych w DNA izolowanym tylko z plech hodowanych in vitro jest możliwość zachodzenia rearanżacji genomowych przez lata prowadzenia hodowli wątrobowców in vitro.

5.2.RDA-cDNA – różnicowa analiza cDNA

W celu identyfikacji genów odpowiedzialnych za powstawanie organów rozmnażania generatywnego wątrobowca P.endiviifolia sp B zastosowano technikę RDA-cDNA. Technika ta, opisana po raz pierwszy przez Hubanka i Schatza w 1994 roku, stanowi adaptację metody RDA opracowanej przez Lisitsyna w 1993 roku. Metoda RDA-cDNA umożliwia identyfikację transkryptów genów ulegających specyficznej ekspresji w puli cDNA testowanego, a nie występujących w drugiej puli cDNA – eliminującego, bądź też transkryptów genów różniących się zdecydowanie poziomem ekspresji w obu pulach. W przypadku badań opisanych w niniejszej pracy jako pulę testowaną wykorzystano dwuniciowy cDNA uzyskany z gametofitów męskich wytwarzających plemnie P.endiviifolia sp B, natomiast pulę eliminującą stanowił dwuniciowy cDNA uzyskany z gametofitów

żeńskich wytwarzających rodnie P.endiviifolia sp B.

W dokumencie Różnicowa analiza sekwencji genomowych gametofitu męskiego i żeńskiego oraz genów ulegających specyficznej ekspresji w gametoficie męskim wątrobowca Pellia endiviifolia subspecies B (Stron 79-84)