Analiza bioinformatyczna genu i białka z rodziny Rab oraz jego potencjalna funkcja w plechach

Z wyjściowego fragmentu cDNA długości 229nt otrzymano cDNA długości 1 330nt, w obrębie którego określono otwartą ramkę odczytu długości 217aa. Analiza porównawcza przewidzianej sekwencji białkowej wykazała 77-92% podobieństwo do białek z rodziny Rab innych gatunków roślin. Poniżej w tabeli 6-2 przedstawiono porównanie szczegółów budowy genów kodujących białka Rab wybranych gatunków roślin (na podstawie danych dostępnych w bazie GenBank; 18.10.10) względem genu wątrobowca P. endiviifolia sp B. W porównaniu wykorzystano dane dotyczące genów uwzględnionych w rozdziale WYNIKI, punt 5.5.2.

Tabela 6-2. Porównanie budowy niektórych genów kodujących białka z rodziny Rab wybranych gatunków roślin. (-) oznacza brak danego elementu w genie.

Gen z rodziny RAB Selaginella moellendorffii Arabidopsis thaliana Oryza sativa Physcomitrella patens Pellia endiviifolia sp B cDNA [nt] 949 1 084 1 123 1 532 1 330 CDS [nt] 654 654 654 651 654 5’UTR [nt] 133 128 184 351 272 Egzon 1 [nt] 351 349 402 288 490 Intron 1 [nt] 106 163 602 232 1 150 Egzon 2 [nt] 469 574 722 229 845 Intron 2 [nt] 63 - - 581 - Egzon 3 [nt] 129 - - 1 017 - 3’UTR [nt] 162 141 292 531 409 Białko [aa] 217 217 217 216 217

Kodon STOP TGA TGA TAG TAA TGA

Z powyższego porównania wynika, że zidentyfikowany gen wątrobowca jest bardziej podobny do genu rzodkiewnika oraz ryżu, zarówno jeśli wziąć po uwagę liczbę egzonów genu oraz aminokwasów budujących prawdopodobne białko. Przewidziana sekwencja aminokwasowa zawiera motywy niezbędne do wiązania GTP/GDP oraz efektorów:

129 | S t r o n a

• motyw G1 (tzw. pętla P, GDSGVGKS, 21-27 aa) wiążący jony Mg²⁺ oraz reszty fosforanowe;

• motyw G3 (WDTAGQ, 57-61 aa), w którym sekwencja DXXG oddziałuje z γ -fosforanem GTP;

• motyw G4 (GNKSD, 115-119 aa), w którym sekwencja NKXD to region rozpoznający specyficznie reszty fosforanowe;

• motyw G5 (ETSAL, 150-155 aa), w którym sekwencja ETSA oddziałuje z resztą kwasu asparaginowego motywu G4.

Motywy te wspólnie odpowiedzialne są za wiązanie GTP i GDP oraz hydrolizę GTP. Biologiczna funkcja białek G silnie zależy od ich modyfikacji potranslacyjnych. Rodziny białek Ras, Rho i Rab zawierają charakterystyczną sekwencję na swym C-końcu, która podlega modyfikacjom decydującym o ich komórkowej lokalizacji i interakcji z efektorem. Większość białek Rab posiada dwie reszty cysteiny w rożnych motywach (XXCC, XCXC, CCXX, CCXXX, XCCX, gdzie X reprezentuje jakikolwiek aminokwas), do których dołączane są reszty geranylowe (Agarwal i in. 2009). W przypadku białka P.endiviifolia sp B reszty te są również obecne (GCCS, 213-216 aa).

Analizy RT-PCR fragmentu cDNA długości 229nt, stanowiącego fragment transkryptu genu kodującego białko z rodziny Rab P.endiviifolia sp B, wykazały jego amplifikację wyłącznie na matrycach cDNA z plech męskich, zarówno hodowanych in vitro, jak i zebranych z terenu (rozdział WYNIKI, punkt 5.2.3, zdjęcie 5-17). Można więc wywnioskować, iż zidentyfikowany gen kodujący białko Rab ulega specyficznej ekspresji w plechach męskich P.endiviifolia sp B. Ponieważ fragment transkryptu tego genu ulegał również amplifikacji na cDNA plech pochodzących z hodowli in vitro nie wytwarzających plemni, nie można jednoznacznie stwierdzić, iż jest on bezpośrednio zaangażowany w proces wytwarzania plemni u tego wątrobowca.

Białka Rab stanowią ogromną rodzinę białek wiążących GTP, regulujących ruch pęcherzykowy między określonymi przedziałami komórkowymi, ścieżek endo- i egzocytozy w komórkach eukariotycznych. Białka te są zachowawcze ewolucyjnie i wykazują dużą homologię od drożdży po ssaki i rośliny. Ostatnie doniesienia sugerują, że białka Rab regulują specyficzność i ukierunkowanie transportu pęcherzyków z kompartymentu wyjściowego do docelowego. Wiadomo również, że Rab GTPazy mogą pełnić różne funkcje, które mogą się zazębiać z innymi, tymi pełnionymi przez innych członków tej rodziny. Tak więc jedno białko Rab może odgrywać kluczową rolę w transporcie pęcherzykowym między retikulum endoplazmatycznym a aparatem Golgiego, jak również w procesach sekrecji, czy

utrzymaniu polarności komórek roślinnych (Bischoff i in. 1999). Dla przykładu, gen NtRAB2

130 | S t r o n a

tkankach o podniesionych wymaganiach aktywności sekrecyjnej. Transkrypty tego genu nie zostały natomiast wykryte w pełni rozwiniętych tkankach, jak np. liście. Białko NtRab2 odgrywa decydującą rolę w transporcie między retikulum endoplazmatycznym a aparatem Golgiego, co ma związek z prawidłowym wzrostem łagiewki pyłkowej. Dominująca negatywna mutacja genu NtRAB2, która utrzymuje to białko w nieaktywnej formie ze związanym GDP, powoduje zahamowanie transportu białek niezbędnych do wzrostu łagiewki, tym samym blokując jej elongację (Cheung i in. 2002). Z kolei białko Rab11 tytoniu zostało zlokalizowane przede wszystkim w regionie wierzchołka łagiewki pyłkowej, który prawie wyłącznie wypełniony jest przez pęcherzyki transportowe. Mutant genu kodującego białko Rab11 wykazał ograniczony wzrost łagiewki pyłkowej oraz obniżoną płodność. Właściwa regulacja aktywności GTPazy Rab11 jest kluczowa dla transportu pęcherzykowego skupionego w szczycie łagiewki pyłkowej oraz dla wzrostu łagiewki pyłkowej, a tym samym białko rozstrzyga o sukcesie reprodukcyjnym tytoniu (de Graaf i in. 2006). Istnieją więc geny kodujące białka Rab, które odgrywają kluczową rolę w procesie rozwoju i wzrostu gametofitu męskiego roślin okrytozalążkowych. Również u A.thaliana zidentyfikowano białka Rab biorące udział w rozwoju łagiewki pyłkowej. Gen RABA4D ulega specyficznej ekspresji w kiełkującym pyłku i jest niezbędny dla prawidłowej regulacji wzrostu łagiewki pyłkowej u rzodkiewnika. Całkowita inaktywacja tego genu prowadzi do zaburzenia polarnego wzrostu i zmienionego wzoru wzrostu ściany komórkowej in vitro, podczas gdy in vivo utrata jego aktywności powoduje zaburzenia wzrostu łagiewki oraz zmniejszoną efektywność kierowania jej w stronę okienka zalążka. Innym białkiem Arabidopsis zlokalizowanym w wierzchołkach rosnących łagiewek pyłkowych oraz włośnikach jest RabA4b, blisko spokrewnione z RabA4D oraz podobne do białka Rab11 tytoniu. Jest ono ważnym białkiem regulującym polarny wzrost zarówno łagiewki, jak i włośników (Szumlanski i Nielsen 2009). W słupkach roślin kwiatowych łagiewki pyłkowe wydłużają się kierunkowo od znamienia do zalążka, by dostarczyć komórki plemnikowe wymagane do podwójnego zapłodnienia. Łagiewki wydłużają się poprzez wzrost wierzchołkowy, w którym nowe składniki błony są włączane do plazmalemmy, a obfite ilości materiałów budujących ścianę komórkową ulegają sekrecji przy końcu łagiewki, by wesprzeć jej wzrost. Niezwykle wydajny system transportu pęcherzyków najwyraźniej leży u podłoża szybkiego wzrostu łagiewki. Intensywny cytoplazmatyczny strumień transportuje ogromną liczbę pęcherzyków wydzielniczych do wierzchołkowego regionu wydłużającej się łagiewki pyłkowej. Pęcherzyki te gromadzą się w dużej gęstości na samym koniuszku łagiewki, gotowe do fuzji z błoną komórkową. Niosą one złożone polisacharydy i glikoproteiny dla rozwoju ściany komórkowej, a także dostarczają szeroki zakres białek błony komórkowej, ściany komórkowej oraz białek sekrecyjnych, łącznie z

131 | S t r o n a

możliwymi cząsteczkami sygnałowymi, czy enzymami hydrolitycznymi (Cheung i in. 2002). Dlatego białka Rab nie tylko są ważne dla samego wzrostu łagiewki pyłkowej, ale również najprawdopodobniej determinują zdolność fuzji błon komórkowych łagiewki i woreczka zalążkowego oraz precyzują błony docelowe, poprzez działanie jako molekularne przełączniki i regulatory składników budujących błonę komórkową (Jürgens i Geldner 2002).

Istnieje więc możliwość, że zidentyfikowany gen P.endiviifolia sp B kodujący białko z rodziny Rab pełni ważną funkcję w procesie formowania plemników tego wątrobowca. Nie należy zapominać, że gen ten znajduje się tylko w genomie męskim P.endiviifolia sp B. Co prawda w przypadku wątrobowców gametofit męski stanowi cała roślina, w porównaniu ze zredukowanym do kilku komórek gametofitem roślin okrytonasiennych. Jednakże plemniki wątrobowców, podobnie jak łagiewki pyłkowe, charakteryzują się spolaryzowaną budową komórkową. Niewykluczone więc, że również u wątrobowców białka Rab odgrywają ważne role w trakcie organizacji oraz utrzymania budowy komórek plemników. Ponadto istnieją pewne dane związane z obecnością białek Ypt/Rab w organellach ruchu u glonów Volvox

carteri i Chlamydomonas reinchardtii. Analizy typu western wykazały obecność kilku białek

Ypt równomiernie rozmieszczonych wzdłuż całej długości wici (Huber i in. 1996). Być może rola białek Ypt/Rab związana jest z umożliwianiem specyficznych interakcji między różnymi białkami błony komórkowej wici oraz zapewnieniem dotarcia ruchliwych komórek do miejsca docelowego, którym w przypadku plemników wątrobowców jest komórka jajowa rodni.

6.2.3. Analiza bioinformatyczna genu i białka TS oraz jego potencjalna funkcja w plechach