Analiza struktury drugorzędowej DsrA RNA za pomocą izoenergetycznych mikromacierzy

Wyniki elektroforezy w warunkach niedenaturujących pozwalały przypuszczać, że obrazy hybrydyzacji DsrA RNA do sond na mikromacierzy powinny być zbliżone do siebie we wszystkich warunkach buforowych. Zdecydowano się przeprowadzić hybrydyzacje w różnych warunkach buforowych, co jednocześnie miało na celu sprawdzenie, jaka jest generalna zasada używania buforów w eksperymentach hybrydyzacji. Bufory różniły się między sobą stężeniami chlorku magnezu, które wynosiło od 0 przez 0,2 i 4 do 30 mM oraz chlorku sodu którego stężenie wynosiło 0,2 lub 1 M. Hybrydyzacje prowadzono również w dwóch różnych temperaturach, w 4 i 22°C. Stosowano też różne czasy płukania mikromacierzy po hybrydyzacji wynoszące od 1 do 5 minut. Na rysunku 14 przedstawiono kilka przykładowych wyników hybrydyzacji.

A

0 mM MgCl2 (EDTA) 0,2 mM MgCl2 4 mM MgCl2 30 mM MgCl2

1 M NaCl 1 M NaCl 1 M NaCl 0,2 mM NaCl (bufor VIII) (bufor III) (bufor I) (bufor VII)

0 mM MgCl2 (EDTA) 0,2 mM MgCl2 4 mM MgCl2 0,2 M NaCl 0,2 M NaCl 0,2 M NaCl

(bufor IX) (bufor IV) (bufor II)

B

0 mM MgCl2 (EDTA) 0,2 mM MgCl2 4 mM MgCl2 30 mM MgCl2

1 M NaCl 1 M NaCl 1 M NaCl 0,2 mM NaCl (bufor VIII) (bufor III) (bufor I) (bufor VII)

Rysunek 14. Wybrane wyniki hybrydyzacji DsrA RNA w różnych buforach w temperaturze (A) 4°C oraz (B) 22°C, czas płukania 1 minuta. Macierz drukowana była w następującym układzie: 1 kolumna, 2 sondy w rzędzie, każda sonda po 8 powtórzeń.

14 15 40 43

74 42

Eksperymenty te potwierdziły założenia postawione po przeprowadzeniu elektroforezy w warunkach natywnych. W ich wyniku można stwierdzić, że warunki buforowe nie powodują wyraźnych zmian strukturalnych w cząsteczce. Zaobserwowano, że temperatura prowadzenia hybrydyzacji nie wpływa na wzór otrzymanych sygnałów. Najintensywniejsze są sygnały otrzymane podczas hybrydyzacji przeprowadzonej w buforze I, czyli posiadającym największą siłę jonową (zawiera 1 M NaCl i 4 mM MgCl2). W zależności od użytego buforu intensywność wszystkich sygnałów hybrydyzacyjnych zmienia się w sposób proporcjonalny. Stwierdzono, że dla niższych stężeń jonów cały obraz hybrydyzacyjny jest mniej intensywny. Jeżeli jednak rozpatruje się osobno każdy eksperyment i porównuje ze sobą intensywności sygnałów pochodzące z jednej macierzy, wyniki hybrydyzacji przeprowadzonych w różnych buforach nie różnią się w sposób istotny miedzy sobą. Jakkolwiek, w przypadku użycia buforów o stężeniu jonów poniżej pewnej wartości obserwuje się tylko te dupleksy hybrydyzacyjne, które w warunkach wyższych stężeń jonów występowały w postaci najintensywniejszych sygnałów. Nie można jednak do końca generalizować otrzymanych wyników. Generalna na pewno jest reguła, że im wyższa siła jonowa użytego buforu tym trwalsze dupleksy hybrydyzacyjne. Jednakże należy też pamiętać, że nie zawsze warunki buforowe nie będą miały wpływu na strukturę cząsteczki a zatem także na profil hybrydyzacji. Na przykładzie 5S rRNA z E. coli pokazano, że w zależności od warunków buforowych zmienia się struktura drugorzędowa cząsteczki a zatem i profil hybrydyzacji (22).

Na podstawie eksperymentów przeprowadzonych dla cząsteczki DsrA RNA stwierdzono jednak, że aby możliwa była detekcja dupleksu hybrydyzacyjnego niezbędne jest zachowanie pewnych warunków jonowych tzn., jeżeli zachowa się wysokie stężenie chlorku sodu równe 1 M, można całkowicie pominąć jony magnezu w buforze. Jeżeli jednak zmniejszy się stężenie chlorku sodu do 200 mM wówczas należy zachować co najmniej 4 mM stężenie jonów magnezu. Z tego powodu po przeprowadzeniu hybrydyzacji w buforze IV lub IX uzyskuje się średniej lub słabej intensywności dupleksy hybrydyzacyjne i to tylko z tymi z sondami, dla których w innych buforach dupleksy te dają najintensywniejsze sygnały (Rysunek 14). Jeśli chodzi o czasy przemywania mikromacierzy po hybrydyzacji zdecydowano się w dalszych eksperymentach pozostać przy 1 minucie, gdyż dłuższe płukanie nie zmieniało obrazu hybrydyzacji, a jedynie powodowało stopniowe odmywanie RNA od sond począwszy od tych, z którymi było ono związane najsłabiej.

Wyniki przeprowadzonych eksperymentów mikromacierzowych dla DsrA RNA, otrzymane na podstawie wielu powtórzeń w różnych warunkach hybrydyzacyjnych,

uśredniono i zestawiono w tabeli 6 oraz zaznaczono na rysunku 15. Potwierdziły one wcześniejsze doniesienia literaturowe dotyczące obecności i struktury spinki rejonu I i III (83, 87, 166). Nie zaobserwowano tworzenia się dupleksów hybrydyzacyjnych w obrębie trzonów spinek I i III. Zaobserwowano silne wiązanie w pozycji 13 i 14 czyli w pętli spinki pierwszej, jak również w pozycji 74 pokazującej dostępność również pętli spinki III. Co do tych

stabilnych elementów strukturalnych można stwierdzić, że metoda mapowania

mikromacierzowego dostarczyła wyników zgodnych z założeniami tej metody. W rejonach dwuniciowych trzonów spinek brak hybrydyzacji z sondami, natomiast w rejonach jednoniciowych pętli obserwuje się tworzenie dupleksów hybrydyzacyjnych. W obrębie jednoniciowym pętli obserwuje się często wiązanie sondy do tylko jednej części pętli. Jest to związane ze strukturą pętli oraz jej sekwencją i zostało również zaobserwowane na modelowych strukturach spinkowych RNA (167). Miejsca hybrydyzacji w obrębie rejonu

środkowego (rejon spinki II) nie przyniosły wyniku, który pozwoliłby na jednoznaczne

rozstrzygnięcie sporu dotyczącego poprawności któreś ze struktur proponowanych w literaturze (83, 87, 166). Zaobserwowano silne wiązanie się sond w pozycjach 31, 36, 42, 43 oraz średniej intensywności w pozycjach 40 lub 47 DsrA RNA. W przypadku pozycji 40 i 47 pojawia się problem wynikający z tego, że wiąże się z nimi ta sama sonda (sonda 37), dlatego trudno jest jednoznacznie rozstrzygnąć, do której z nich, czy może do obydwu, wiąże się komplementarna sonda. Jeżeli poprawną strukturą DsrA RNA miałaby być najbardziej korzystna termodynamicznie, czyli zaproponowana przez Sledejski wówczas hybrydyzacja sond w pozycjach 42 i 43 pokazywałyby dostępność pętli apikalnej spinki II. Jakkolwiek, struktura Sledejski nie tłumaczy dostępność do hybrydyzacji pozycji 36, która w proponowanej strukturze 15-1 (Rysunek 15, struktura 1) zlokalizowana jest w rejonie dwuniciowym. Wiązanie w pozycji 31 DsrA RNA można wyjaśnić tym, że występuje ono na przeciwko wybrzuszenia jednostronnego, ale wówczas pozostaje pytanie: dlaczego nie obserwuje się dostępności dla sondy w miejscu wybrzuszenia czyli w pozycji 53 ? Próba dopasowania wyników mapowania mikromacierzowego do modelu DsrA RNA zaproponowanego przez Lease i Belfort (Rysunek 15-2) również nie da się całkiem wytłumaczyć. W modelu tym proponuje się występowanie rejonu jednoniciowego pomiędzy resztą nukleotydową 23 a 34, zatem rejon ten powinien być dostępny do hybrydyzacji. Niestety na całym tym odcinku obserwuje się hybrydyzację tylko w pozycji 31 DsrA RNA, zatem rodzi się wątpliwość czy rzeczywiście odcinek ten na całej długości nie jest zaangażowany w jakiegoś typu oddziaływania. Zastanawiająca pozostaje również pozycja 36, umieszczona w tym modelu w rejonie dwuniciowym. Model struktury drugorzędowej DsrA

RNA zaproponowany przez Rolle (Rysunek 15-3) różni się od modelu Lease i Belfort tylko apikalnym fragmentem spinki II. W modelu tym pozycje 42 i 43 pozostają w pętli apikalnej spinki II, a pozycja 31 występuje na przeciwko jednostronnego wybrzuszenia. Dostępna dla sond pozycja 36 proponowana jest tutaj w rejonie jednoniciowym. Jednakże zarówno nukleotydy w pozycji 40 jak i 47 zaangażowane są w oddziaływania typu Watson-Crick z komplementarną resztą nukleotydową.

Na podstawie uzyskanych wyników mapowania mikromacierzowego rozważano trzy kolejne możliwości pofałdowania się DsrA RNA. Pierwszą z nich obrazuje struktura 15-4. Uzyskano ją jako strukturę o najniższej wartości energii swobodnej (-31,4 kcal/mol)

wprowadzając do programu RNAstructure 4.6 dane uzyskane z mapowania

mikromacierzowego. Do programu wprowadzono je jako wyniki mapowania chemicznego, gdyż nie posiada on opcji mapowania mikromacierzowego. Ze względu na nowatorski charakter badania struktury RNA metodą mapowania mikromacierzowego żaden z programów komputerowych służących do przewidywania struktury drugorzędowej RNA w oparciu o cechy termodynamiczne RNA nie pozwala w sposób bezpośredni na wprowadzenie do niego tzw. ograniczeń (ang. constraints) uzyskanych podczas hybrydyzacji. Uzyskana struktura jest tą samą strukturą, która jest generowana jako druga w przypadku, gdy nie wprowadza się żadnych danych eksperymentalnych (Rysunek 12B). Zawiera ona spinki I i III przewidywane także dla struktur 15-1, 15-2 i 15-3. Struktura 15-4 jest w zasadzie zgodna z wynikami mapowania mikromacierzowego. Jedyne zastrzeżenia w stosunku do niej dotyczą braku większej ilości wiązań sond w rejonie jednoniciowy, pomiędzy 23 i 38 resztą nukleotydową. Ponieważ fragment ten jest bogaty w A i U, dlatego też zsyntetyzowano specjalnie dedykowane dłuższe sondy heptanukleotydowe. Mimo tego wiązania sond nie obserwowano. Najprostszym wytłumaczeniem takiego zjawiska byłoby uwikłanie się pewnych fragmentów tego rejonu w oddziaływania helikalne. Struktura DsrA RNA pokazana na rysunku 15-4 tworzenia się ich jednak nie przewiduje. Z punktu widzenie termodynamicznego proponowana struktura wydaje się być najbardziej korzystna. Wartość energii swobodnej spinki II wynosi -4,5 kcal/mol, zatem jest bardziej faworyzowana niż w

przypadku dwóch struktur zaproponowanych wcześniej na podstawie danych

eksperymentalnych (2,8 kcal/mol i -2,3 kcal/mol odpowiednio przez Lease i Belfort oraz przez Rolle). Najbardziej zgodna z wynikami mapowania mikromacierzowego wydaje się być struktura DsrA RNA oznaczona, jako 5 na rysunku 15. Struktura ta zawiera te same spinki I i III, których tworzenie proponowane jest przez wszystkie wcześniejsze modele tej cząsteczki (Rysunek 15, struktury 1-3). Natomiast, rejon II zbudowany jest z trzech fragmentów

helikalnych oznaczonych IIa, IIb i IIc. Wartość energii swobodnej tej struktury przewidziana przez RNAstructure 4.6 wynosi -24,6 kcal/mol. Całkowicie odmienna jest tutaj budowa fragmentu środkowego (pomiędzy 23 i 58 resztą nukleotydową). Tworzą ją helisa IIa oraz dwie struktury spinkowe oznaczone jako IIb i IIc. Termodynamicznie nie są to bardzo trwałe fragmenty jednak ich trwałość może być zdecydowanie zwiększona poprzez współosiowe oddziaływania warstwowe (ang. coaxial stacking) pomiędzy helisami I i IIa oraz IIa i IIb. Badania modelowe przeprowadzone przez grupę Turnera wykazały, że współosiowe oddziaływania warstwowe, w zależności od sekwencji i orientacji sąsiadujących i oddziałujących par zasad, wzmacniają stabilizację (energię swobodną) RNA o 1-2 kcal/mol dla każdego z oddziaływań współosiowych (168). Dodatkowo, fragmenty helikalne IIa-c tworzą rodzaj trójramiennej pętli (ang. multibranch loop). Badania modelowych RNA wykazały, że tego typu motywy strukturalne zwiększają stabilność termodynamiczną (169). RNAstructure obliczając energię swobodną do proponowanego pofałdowania RNA nie uwzględnia tego typu oddziaływań. Rozważano także możliwość pofałdowania DsrA RNA, jak pokazuje to struktura 15-6 na rysunku 15. W strukturze tej spinki I i III są identyczne, jak na wszystkich dotychczas proponowanych modelach. Odmienny jest rejon środkowy, gdzie oprócz spinki IIb, tworzy się spinka IId. Ponadto, sugeruje się oddziaływanie trzech reszt nukleotydowych z końca 5’ (AAC) z fragmentem 56-58 (UUG) z powstaniem krótkiej helisy IIe. Również w tym przypadku istnieją podstawy strukturalne i termodynamiczne do współosiowych oddziaływań warstwowych spinki I i helisy IIe (być może także spinki III) oraz spinek IIb i IId. Dość „luźny” strukturalnie rejon (fragment 23-25 oraz 50-55) jest szczególnie bogaty w reszty adenozyny i być może mógłby spełniać rolę platformy AA, która w obecności kationów metali mogłaby dodatkowy stabilizować strukturę DsrA RNA (170). Istnienie podobnych oddziaływań z udziałem fragmentów bogatych w reszty adenozyny obserwuje się w strukturze krystalicznej intronu grupy I z Tetrahymena thermophila. W tym przypadku fragment GAAA oddziałując z konserwatywną wewnętrzną pętlą poprzez międzycząsteczkowe oddziaływania warstwowe łączy dwie długie helisy rybozymu (171).

Tabela 6. Uśrednione wyniki hybrydyzacji DsrA RNA pozycja w DsrA nazwa sondy sekwencja penta- lub heptameru sekwencja modyfikowanej sondy nukleotyd parujący się z dodatkowym 3'G przewidziane dG (kcal/mol) dla komplementar-nego wiązania RNA-RNA przewidziane dG (kcal/mol) dla wiązania

modyfikowana sonda-RNA, 100 mM NaCl uśrednione wyniki hybrydyzacji alternatywne miejsce wiązania przewidziane dG (kcal/mol) dla alternatywnego miejsca wiązania RNA-RNA przewidziane dG (kcal/mol) dla alternatywnego miejsca wiązania modyfikowana sonda-RNA, 100 mM NaCl 14 641 GGAAA GGDDDG A -2,9 -9,6 s ^{42/43 -1,4 -4,0} 15 161 AGGAA DGGDDG U -3,6 -10,2 s ^{42/43 -4,4 -9,8} 31 31-7 AAAAAAU DDDDDDU -0,5 -9,7 s 36 36-7 CACUUAA CDCUUDA -4,9 -10,1 s 40 37 AAGCA DDGCDG G -3,4 -10,3 m 42 131 AGAAG DGDDGG G -2,9 -9,6 s ^{13/14 -1,1 -3,3} 43 33 AAGAA DDGDDG C -1,2 -11,4 s ^{13/14 -0,6 -3,9} 47 37 AAGCA DDGCDG U -3,4 -10,3 m 60 225 AUGAA DUGDDG U -1,4 -9,1 w 74 483 CUGAG CUGDGG C -4,6 -12,2 m ^{41/42 -2,4 -4,8}

Jako s, m i w zaznaczono sygnały hybrydyzacji odpowiednio o wysokiej, średniej i słabej intensywności. Jeżeli w alternatywnym miejscu wiązania wpisano dwie następujące po sobie pozycje oddzielone ukośnikiem oznacza to dwa środkowe nukleotydy, w przypadku gdy sonda może wiązać się parzystą liczbą reszt nukleotydowych.

Rysunek 15. Proponowane struktury DsrA RNA z zaznaczonymi miejscami hybrydyzacji (czerwone

prostokąty). Kolorem pomarańczowym zaznaczono dwa możliwe miejsca hybrydyzacji dla sondy 37. Struktury DsrA RNA zaproponowane przez (1) Sledejski (1995), (2) Lease i Belfort (2000) i (3) Rolle (2006). Struktura (4) wygenerowana przez program RNAstructure 4.6 po wprowadzeniu danych z mapowania mikromacierzowego i cechuje się najniższą energią swobodną (struktura optymalna). Struktury (5) i (6) są strukturami suboptymalnymi wygenerowane przez RNAstructure na podstawie otrzymanych wyników hybrydyzacji oraz pewnych manualnych rearanżacji.

1.5.2. Mikromacierzowe mapowanie modelowego fragmentu odpowiadającego rejonowi