Mapowanie chemiczne struktury drugorzędowej OxyS RNA

2.6.1. Projektowanie i testowanie modyfikowanego startera DNA/LNA

Metoda mikromacierzy izoenergetycznych jest nową metodą badania struktury drugorzędowej RNA, dlatego warto potwierdzić wyniki dzięki niej uzyskane za pomocą dodatkowych eksperymentów, tym bardziej, że struktura drugorzędowa OxyS RNA nie była wcześniej zbyt intensywnie badana. Zdecydowano się więc przeprowadzić mapowanie

chemiczne, z wykorzystaniem modyfikacji ketoksalem,

1-cykloheksylo-3-(2-morfolinoetylo)karbodiimidem (CMCT) oraz bezwodnikiem kwasu N-metyloizotidowego (NMIA). Opublikowana struktura OxyS RNA została zaproponowana jedynie na podstawie mapowania chemicznego z użyciem siarczanu dimetylu (DMS). Ponadto, z mapowania uzyskano tylko częściowe informacje, gdyż zastosowano wówczas starter ulokowany powyżej spinki III. Zatem uzyskano obraz mapowania zaledwie około 70 reszt nukleotydowych od końca 5’, tracąc tym samym sporą część informacji strukturalnych (97). Można przypuszczać, że użyto starter przesunięty bliżej środka cząsteczki, przed spinkę III, gdyż napotkano na problemy podobne do tych, które zostały opisane w niniejszej pracy w przypadku DsrA RNA. Mianowicie, ze względu na wysoką stabilność termodynamiczną terminalnej spinki, niemożliwe było przyłączenie w tym rejonie startera DNA. Po udanych eksperymentach z modyfikowanym starterem DNA/LNA dla DsrA RNA, postanowiono zaprojektować również modyfikowany starter dla OxyS RNA i dzięki temu odczytać więcej informacji o cząsteczce niż udało się to Altuvi i współpracownikom (97). Zaprojektowano dwa startery komplementarne do spinki III (172). Pierwszy z nich (OxyS-3, 5’AGCGGATCCTGGAGATCCGCAA) był starterem DNA, o długości 22 nukleotydów. Natomiast drugi (OxyS-LNA, 5’AGcGgATCcTgGaGaTCCG) był modyfikowanym starterem DNA-LNA o takiej samej sekwencji jak starter DNA, ale skrócony o 3 nukleotydy od końca 3’ i zawierał w sześciu pozycjach nukleotydy typu LNA (zaznaczone małymi literami i kolorem czerwonym). Projektując modyfikowany starter starano się uzyskać bardziej korzystną wartość energii swobodnej dla tworzonego przez niego dupleksu z OxyS RNA niż wynosi ona dla spinki III. Podczas projektowania kierowano się pomocniczo takimi samymi parametrami termodynamicznymi jak w przypadku startera DsrA-LNA (rozdział III.1.6.1). Po zsyntetyzowaniu chemicznym starterów sprawdzono ich zdolność przyłączania się do OxyS RNA. W tym celu OxyS RNA inkubowano z starterami o rosnących stężeniach, po czym

przeprowadzano rozdział elektroforetyczny w temperaturze 4°C w warunkach niedenaturujących (Rysunek 41).

A B

Rysunek 41. (A) Analiza tworzenia się kompleksu OxyS RNA/starter DNA-LNA. Rozdział prowadzono w 8%

żelu poliakrylamidowym w warunkach natywnych w 4^oC. (B) Zależność frakcji związanej w stosunku do stężenia startera, która posłużyła do oznaczenia stałej dysocjacji dupleksu OxyS RNA/starter DNA-LNA.

Przeprowadzony eksperyment potwierdził przypuszczenia, że starter DNA nie jest w stanie stworzyć dupleksu ze stabilnym strukturalnie końcem 3’ OxyS RNA. Nawet przy dziesięciokrotny molowym nadmiarze startera DNA nie otrzymuje się dupleksów z RNA. Zastosowanie startera DNA-LNA również i w tym przypadku zakończyło się sukcesem. Starter ten wiąże się bardzo wydajnie z RNA, ze stałą dysocjacji równą 66 nM. Użycie równomolowych ilości startera w stosunku do RNA skutkuje uzyskaniem niemalże 100% RNA związanego ze starterem DNA-LNA.

W celu termodynamicznej analizy oddziaływań OxyS RNA/starter DNA-LNA przeprowadzono eksperymenty topnienia UV. Do badań tych wykorzystano zsyntetyzowany chemicznie fragment OxyS RNA reprezentujący spinkę III (reszty nukleotydowe 91-110). W celu obniżenia temperatury topnienia do możliwej do zarejestrowania używano bufor o 5 mM stężeniu chlorku sodu. Dla spinki III uzyskano temperaturę topnienia 78,4°C, potwierdzającą wysoką jej stabilność termodynamiczną i zarazem niedostępność dla startera DNA. Obliczona temperatura topnienia dla nieobserwowalnego kompleksu RNA reprezentujący spinkę III/starter DNA wynosiłaby 52,1°C, czyli zdecydowanie za mało, aby konkurować z korzystniejszą termodynamicznie spinką III. Zgodnie z założeniami dla kompleksu RNA reprezentujący spinkę III/starter DNA-LNA uzyskano temperaturę topnienia wyższą niż temperatura topnienia spinki wynoszącą 84,9°C. Ponadto zaobserwowano, że kompleks RNA/DNA-LNA topnieje w sposób dwustanowy, korelacja temperatury topnienia (Tm) ze stężeniem użytego RNA i startera dowodzi, że topnieniu ulega dupleks a nie spinka.

2.6.2. Mapowanie chemiczne OxyS RNA

Po pomyślnych doświadczeniach z wydłużaniem startera DNA-LNA na matrycy DsrA RNA przez odwrotną transkryptazę Superscript III z dużymi nadziejami przeprowadzono analogiczny eksperyment na matrycy OxyS RNA. Doświadczenie zakończyło się powodzeniem, ponownie okazało się, że odwrotna transkryptaza Superscript III rozpoznaje modyfikowany starter przyłączony do RNA i efektywnie przeprowadza jego wydłużanie dając produkt pełnej długości. Oczywiście w reakcji kontrolnej, gdzie użyto starter DNA nie

otrzymano żadnego produktu. Eksperyment potwierdził uniwersalność

starterów/oligonukleotydów zawierających modyfikowane nukleotydy typu LNA oraz ich niezwykłą przydatność w sytuacjach, gdy konieczne jest zhybrydyzowanie oligonukleotydu, a ze względów strukturalnych i termodynamicznych nie jest to wykonalne z użyciem standardowych oligonukleotydów DNA.

Przeprowadzono mapowanie chemiczne OxyS RNA, wykorzystując jako odczynniki modyfikujące ketoksal, CMCT i NMIA. Dzięki zastosowaniu modyfikowanego startera OxyS-LNA z sukcesem przeprowadzono eksperymenty mapowania chemicznego (Rysunek 42). W celu lepszej analizy wyniku mapowania 5’-końcowego fragmentu cząsteczki, przeprowadzano również reakcje odwrotnej transkrypcji z użyciem dodatkowego startera zaprojektowanego dla środkowej części OxyS RNA. Ze względu na mniejszą stabilność termodynamiczną tego rejonu z powodzeniem stosowano standardowy starter DNA (OxySśr-3). Wyniki otrzymane z użyciem tego startera były zgodne z wynikami otrzymanymi z wykorzystaniem startera DNA-LNA (wyniki nie są pokazane).

OxyS RNA uległ mapowaniu w następujących pozycjach: 8, 23, 24, 31, 33, 39, 49, 55, 57, 64-69, 71-75, 78, 79 i 81-84. Wyniki mapowanie mikromacierzowego oraz chemicznego okazały się w większości ze sobą zgodne. Obie metody potwierdzają wcześniejsze doniesienia literaturowe, pokazując dostępność pętli apikalnej spinki I, a także dowodzą tworzenia się spinki II. Bardzo dostępny zarówno dla sond jak i odczynników chemicznych stał się rejon pomiędzy spinką II a III, co wskazuje, że nie jest on uwikłany w stabilne oddziaływania drugorzędowe. Patrząc jednak na wyniki kompleksów OxyS z oligonukleotydami o1, o2 i o3 należałoby przypuszczać, że odgrywa on istotną rolę w oddziaływaniach wyższego rzędu. Istnienie takich oddziaływań w strukturze OxyS RNA potwierdzają też wyniki dla izolowanej spinki III, która stała się bardziej dostępna niż wówczas, gdy występowała w cząsteczce pełnej długości.

Rysunek 42. Mapowanie chemiczne OxyS RNA. U, C, G i A oznacza reakcje sekwencjonowania; Un – reakcję

kontrolną bez dodania czynnika modyfikującego, natomiast N, C oraz K odpowiednio reakcje w obecności malejących stężeń NMIA, CMCT oraz ketoksalu.

A B

Rysunek 43. (A) Proponowana struktura OxyS RNA. (B) Struktura OxyS RNA wygenerowana przez program

RNAstrukture po wprowadzeniu danych z mapowania mikromacierzowego oraz chemicznego. Kolorem czerwonym oznaczono miejsca hybrydyzacji do mikromacierzy, dla których wykluczono alternatywne miejsca wiązania, kolorem pomarańczowym zaznaczono miejsca hybrydyzacji, dla których istnieją alternatywne miejsca wiązania. Miejsca modyfikacji chemicznych oznaczono następująco: kwadratem zaznaczono pozycje zmodyfikowane przez CMCT, kółkiem przez NMIA a trójkątem przez ketoksal.

Należy jeszcze nadmienić, że po wprowadzeniu danych zarówno z mapowania chemicznego jak i mikromacierzowego do programu RNAstructure generuje on strukturę nieco odmienną od tej proponowanej w literaturze (Rysunek 43). Struktura 43A, proponowana wcześniej, posiada energię swobodną równą -32,3 kcal/mol. Natomiast, energia

swobodna dla struktury OxyS RNA oznaczonej jako 43B wynosi -33,2 kcal/mol. Struktury różnią się pofałdowaniem fragmentu 14-34, czyli części apikalnej spinki I. Jakkolwiek dla obu struktur jest to spinka, różnica dotyczy wielkości i sekwencji pętli oraz rozkładu niesparowań w rejonie helikalnym graniczącym z pętlą. W obu strukturach w rejonie helikalnym występuje jedno lub dwa dwustronne wybrzuszenia. Należy pamiętać, że zarówno w rejonie pętli, jak i wybrzuszeń należy spodziewać się niekanonicznych oddziaływań, które

program RNAstructure nie zawsze uwzględnia podczas generowania struktur

drugorzędowych RNA. Fragmenty helikalne graniczące z pętlą nie są termodynamicznie trwałe i mogą ulegać rearanżacji zarówno podczas oddziaływania z sondami oligonukleotydowymi mikromacierzy, jak również podczas oddziaływań z mRNA, których ekspresje regulują. Wydaje się, że nie można wykluczyć możliwości, iż obie struktury współistnieją w komórce w pewnej równowadze dynamicznej, w zależności od spełnianej w danym momencie funkcji biologicznej przez OxyS RNA. Podobnie jak sugerowano to dla DsrA RNA, niestabilność termodynamiczna określonych rejonów jest być może konieczna do sprawowanie przez nie funkcji regulatorowych. Zebrane wyniki uzyskane na podstawie mapowania mikromacierzowego i chemicznego wraz z eksperymentami przedstawionymi przez Altuvia i współpracowników, sugerują jednak że bardziej prawdopodobną jest struktura przedstawiona na rysunku 43 A. Z tego powodu w dalszej części rozprawy dyskusja wyników oddziaływań OxyS RNA z innymi biomolekułami prowadzona jest w oparciu o strukturę 43A.